APOSTILA PRATICA 2015

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS BIOQUÍMICA – SDE 0024

Material referente às aulas práticas da disciplina de Bioquímica – SDE 0024

Profa: MSc. Milena Bellei Cherene

CAMPOS DOS GOYTACAZES – 2015

Sumário AULA 1 Procedimento De Trabalho No Laboratório Segurança no Laboratório Equipamentos básicos de Laboratório

AULA 2

Reação da ninhidrina

AULA 3

Método do Biureto

AULA 4

Desnaturação de Proteínas

AULA 5

Salting in / Salting out

AULA 6

Efeito do pH na atividade enzimática

AULA 7

Efeito da temperatura na atividade enzimática

AULA 8

Efeito da concentração de substrato na atividade enzimática

AULA 9

Identificação de carboidratos – Benedict, Seliwanoff e Lugol

AULA 10

Identificação de lipídeos (esteroides)

AULA 11

Fermentação alcoólica

Universidade Estácio de Sá

Aluno (a): Curso:

Disciplina: SDE 0024 – Bioquímica Data: ___/___/___

AULA 1 – Esta aula atende aos objetivos do

Plano de Aula 257203 (semana 3) da disciplina

Período:

PROCEDIMENTO DE TRABALHO NO LABORATÓRIO Uma parte de nossas aulas de Bioquímica se desenvolve no laboratório, local

adequado para o trabalho de identificação, separação e determinação da quantidade de substâncias bem como, da preparação e obtenção de novas substâncias. Resultados tais que podem ser utilizados para uma série de estudos, entre estes, para a pesquisa de uma doença. Assim, faz-se necessário que tenhamos pelo menos uma idéia de como é um laboratório, como nele trabalhamos, os cuidados que devemos ter e a aparelhagem básica nele existente.

SEGURANÇA NO LABORATÓRIO. O laboratório é um recinto construído especialmente para a execução de

experiências. Ele deve apresentar instalações de água, gás e eletricidade e deve ser muito bem ventilado e iluminado. A palavra laboratório provém da união de duas palavras latinas: labor = trabalho + oratorium = lugar de reflexão. Assim, o laboratório é um local de muito trabalho e muita concentração. Um laboratório pode tornar-se um lugar muito perigoso, devido ao uso inadequado dos materiais e equipamentos nele existentes. Por isso, é importante que se conheça algumas normas de segurança. A maior parte dos acidentes que podem ocorrer em um laboratório é provocada pelo desconhecimento das seguintes regras básicas de segurança: a) não colocar livros, sacolas, ferramentas, etc., sobre as bancadas ou bancos; b) não comer, beber ou fumar; lave bem as mãos ao deixar o recinto. c) não correr; manter os acessos desimpedidos; d) manter o local sempre limpo e organizado; e) fechar gavetas e armários logo após o uso. f) usar sempre um avental (jaleco) longo e de mangas longas, feito de algodão, pois fibras sintéticas são altamente inflamáveis. Não use saias, bermudas ou calçados abertos. Pessoas que tenham cabelos longos devem mantê-los presos enquanto estiverem no laboratório. Quando for necessário proteger os olhos, é conveniente usar óculos de proteção. Para proteção das mãos, ao trabalhar com produtos corrosivos, devem-se usar luvas de borracha.

É muito perigoso o manuseio de alguns produtos químicos, como inflamáveis (éter, álcool), cancerígenos (benzeno), tóxicos (amônia) e venenosos (cianeto de potássio, sulfato cúprico). Para alertar as pessoas que trabalham nos laboratórios, é conveniente que os produtos contenham símbolos de identificação que seguem normas mundiais. O manuseio de produtos químicos deve ser sempre muito cuidadoso e, para maior segurança, devem-se seguir algumas regras: a) não pegue produtos químicos com as mãos;

b) utilize uma espátula limpa para retirar produtos químicos sólidos dos frascos; lave a espátula e guarde-a imediatamente após utilizá-la; retirar dos frascos apenas a quantidade exata de reagente que irá utilizar; feche os frascos imediatamente após o uso; cuide para não trocar as rolhas dos frascos dos reagentes.; c) não prove o "sabor" de nenhum produto químico, a não ser que haja orientação para isso; d) Feche com cuidado as torneiras de gás, evitando o seu escapamento. e) Não deixe o bico de Bunsen acesso com a chama forte, quando não estiver em uso. f) Não trabalhar com substâncias inflamáveis próximo a bico de gás aceso. g) Certificar-se que a pipeta que está limpa, antes de utilizá-la; Nunca pipete líquidos com a boca. Para a sucção de líquidos utilize bulbos de borracha. h) não pegue com as mãos equipamentos ou vidrarias que foram submetidos a um aquecimento e que ainda podem estar quentes; caso isto seja necessário, o faça com luvas de isolamento térmico. i) não use aparelhos de vidro quebrados ou rachados; j) limpe quaisquer respingos imediatamente, caso ocorram; l) lave as mãos logo após cada experiência; m) em caso de acidentes, procure o responsável pelo laboratório. n) Limpe seu local de trabalho ao finalizar a prática. o) Ao ser designado para trabalhar em um determinado laboratório, é imprescindível o conhecimento da localização dos acessórios de segurança.

Acessórios de segurança Quando estiver trabalhando em

um laboratório, você deve: 1. Localizar os extintores de

incêndio e, verificar a que tipo pertencem e que tipo de fogo podem apagar.

2. Localizar as saídas de emergência.

3. Localizar a caixa de primeiros socorros a verificar os tipos de medicamentos existentes a sua utilização.

4. Localizar a chave geral de eletricidade do laboratório e aprender a desligá-la.

5. Localizar o cobertor antifogo. 6. Localizar o lava-olhos mais

próximo a verificar se está funcionando Adequadamente. 7. Localizar o chuveiro a verificar se

este está funcionando adequadamente.

ACIDENTES

Qualquer acidente deverá ser comunicado imediatamente ao professor, que orientará o melhor procedimento para resolver o problema. Os acidentes mais comuns estão listados abaixo, acompanhados da melhor forma como encaminha-los:

1. Corte ou ferimento, mesmo leve, deverá ser lavado a desinfetado. 2. Queimadura pequena, produzida por fogo ou material quente, deverá ser

tratada com pomada apropriada (picrato de butesin), com vaselina ou com ácido pícrico.

3. Queimadura com ácidos deverá ser lavada com muita água e em seguida com solução diluída de bicarbonato de sódio.

4. Queimadura com álcali (bases) deverá ser lavada com muita água e em seguida com solução diluída de acido acético (vinagre).

5. Ingestão de ácidos - tomar leite de magnésia e procurar um médico. 6. Intoxicação com gases ou vapores - respirar profundamente ao ar livre e

procurar um médico. 7. Em qualquer situação, PROCURE MANTER A CALMA. EQUIPAMENTOS BÁSICOS DE LABORATÓRIO As atividades de laboratório exigem por parte dos alunos e professores não só

o conhecimento das peças e aparelhos utilizados como também o emprego correto de cada um deles. Portanto, antes de mais nada, é necessário que se observe bem cada uma das peças, memorize sua forma e conheça sua utilidade. Apresentamos a seguir o desenho e a função dos equipamentos mais utilizados no

curso de bioquímica:

1) Tubo de ensaio: utilizado principalmente para efetuar reações químicas em pequena escala.

2) Pipeta: equipamento calibrado para

medida precisa de volume de líquidos.

Existem dois tipos de pipeta: pipeta

graduada e volumétrica. A primeira é

utilizada para escoar volumes variáveis

e a segunda para escoar volumes fixos

de líquidos.

3) Erlenmeyer: frasco utilizado para

aquecer líquidos ou para efetuar

titulações.

4) Béquer ou Becher: recipiente com

ou sem graduação, utilizado para o

preparo de soluções, aquecimento de

líquidos, dissoluções de substâncias e

medidas grosseiras de volume.

5) Cilindro graduado ou proveta: frasco

com graduações, destinado a medidas

aproximadas de volume de líquidos.

6) Balão volumétrico: São usados para

medir com precisão um determinado

volume de líquido. Cada um desses

balões apresenta uma graduação

definida.

7) Almofariz e pistilo: Utilizados para a

trituração de diferentes materiais.

8) Bastão de vidro: usado para agitação

e transferência de líquidos.

9) Suporte ou estante: para tubos de

ensaio

10) Pinça de madeira: utilizada para

segurar tubos de ensaio,

principalmente durante o aquecimento.

11) Kitasato: É utilizado no processo de

filtração a vácuo.

12) Suporte universal: usado para

sustentação de peças.

13) Argola: usada como suporte para

funil de vidro ou tela metálica. Prende-

se ao suporte através de uma mufa.

14) Mufa: usada para prender outras

peças ao suporte.

15) Funil: utilizado para transferência

de líquidos de um frasco para outro ou

para efetuar filtrações simples.

16) Funil de Büchner: Acoplado ao

kitasato e provido de papel de filtro, é

utilizado em filtrações a vácuo.

17) Garra: presa ao suporte através da

mufa: serve pare segurar várias outras

peças.

18) Pró-pipete, pêra, embolo de

borracha.

19) 1. Bico de Bunsen: fonte de calor

destinada ao aquecimento de materiais

não inflamáveis. 2. Tela de amianto:

tela metálica contendo amianto,

utilizada para distribuir uniformemente

o calor durante o aquecimento de

recipientes de vidro. 3. Tripé: Usado

como suporte, principalmente de telas

de amianto.

20) Placa de aquecimento e agitação:

Utilizada para aquecimento e/ou

agitação de líquidos.

21) Espátula: É usada comumente para

transferir sólidos de pequenas

quantidades.

22) Pipeta Pasteur: É usada

comumente para transferir líquidos de

pequenas quantidades.

23) Pipetador automático: É usado

comumente para transferir de forma

precisa, volumes pequenos de líquidos.

24) Centrífuga: Utilizada para

separação de substâncias baseadas em

sua densidade.

25) Pissete: Utilizado para armazenar

diferentes líquidos.

MEDIDAS DE VOLUME: Nas aulas práticas do curso de bioquímica os equipamentos mais utilizados para medidas de volume de líquidos são: pipeta e proveta. Em qualquer dos equipamentos, a medida de volume é feita comparando-se o nível do liquido com os traços marcados na superfície dos recipientes. A leitura do nível dos líquidos transparentes deve ser feita na parte inferior do menisco, estando a linha de visão do observador perpendicular à escala graduada, para evitar erro.

TÉCNICA DE UTILIZAÇÃO DE PIPETAS: As pipetas são equipamentos que fornecem medidas precisas de volume, a 20° C, e são

utilizadas para líquidos não tóxicos, não voláteis e não corrosivos. Nunca pipete um

líquido com a boca!!! Existem equipamentos (bulbos de borracha) que auxiliam na

transferência de líquidos com a pipeta.


Aluno (a): Curso:




Período:

REAÇÃO DA NINHIDRINA

Propriedades e Identificação de Aminoácidos

A ninhidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) é um produto químico utilizado para a

detecção e quantificação de aminas primárias, particularmente de aminoácidos.

Aminoácidos quando são aquecidos com ninhidrina reagem e geram um produto de

cor azul escura ou roxa, conhecida como púrpura de Ruhemann. A prolina, que tem

grupo amino substituído (grupo imino) forma um produto de cor amarela. Proteínas e

peptídeos dão também, teste positivo quando submetidos às mesmas condições.

Materiais e Métodos

Materiais:

1. Solução de Ninhidrina 2. Solução de Alanina 3. Solução de Prolina 4. Salina Fisiológica 5. Banho Maria, tubos de ensaio e pipetas

Procedimentos:

Em três tubos de ensaio marcados (A), (B) e (Branco), colocar:

1. Colocar nos três tubos - 2,0 ml da solução de ninhidrina 2. Em (A) - 2,0 ml da solução de alanina; 3. Em (B) - 2,0 ml da solução de prolina; 4. Em (Branco) – 2,0 ml da salina fisiológica (NaCL – 0,8%) 5. Colocar os três tubos em banho fervente durante 5 minutos 6. Comparar os três tubos e anotar e explicar os resultados


Aluno (a): Curso:




Período:

MÉTODO DO BIURETO

Propriedades e Identificação de Proteínas

Existem numerosos métodos na literatura que se prestam para a dosagem de proteínas em materiais biológicos, sendo que a conveniência de utilização de cada um deles deve ser avaliada para cada amostra em questão. Citaremos aqui apenas o método de biureto o qual é simples e bastante utilizados nas dosagens de rotina.

Reação do Biureto O Biureto é o composto formado pelo aquecimento da uréia à 180ºC.

Quando o Biureto é colocado em presença de CuSO4

em solução alcalina, obtém-se um

composto de coloração azul:

Este mesmo tipo de reação colorida ocorre com: • Substâncias que contenham duas carbonilas ligadas diretamente ou através de

um átomo de nitrogênio ou carbono. • Peptídios que contenham no mínimo duas ligações peptídicas • Proteínas em geral.

A formação de complexos corados em presença de CuSO4

em solução alcalina

conservou o nome de Reação de Biureto. É bem verdade que, dependendo da complexidade da proteína e do peptídeo em questão, a cor do produto de reação na presença do reagente do Biureto varia substancialmente: proteínas dão coloração violeta, peptídeos dão coloração rosa. As estruturas cristalinas dos compostos formados são complexas, sendo que algumas já foram identificadas. Nas proteínas, acredita-se que haja a formação de um complexo de coordenação dos íons cúpricos com os elétrons desemparelhados do nitrogênio da ligação peptídica. A reação do Biureto pode ser utilizada para demonstrar a presença de proteínas em

materiais biológicos, como também para quantificá-las, uma vez que o complexo Cu-

proteína apresenta uma absorção máxima a 545 nm; a intensidade da cor depende

exclusivamente da concentração de proteína, já que as ligações peptídicas aparecem

com a mesma freqüência por grama do material a ser analisado. Apesar de não ser um

teste muito sensível (1 a 10 mg de proteína), a reação do Biureto é largamente

utilizada em dosagens rotineiras, pois está menos sujeita a interferência de

contaminantes normalmente presentes nas amostras biológicas.

Materiais necessários Carne de frango, bovina e clara de ovo Solução salina (NaCl 0,9%), 500 mL Reagente de Biureto Solução de alanina Almofariz e pistilo Funil, estante e papel de filtro 03 Bequers com capacidade volumétrica de 250mL e 03 Beckers com capacidade volumétrica de 100mL 03 tubos de ensaio 01 pipeta graduada de 5 mL, 03 pipetas graduadas de 1 mL e 04 pró-pipetes Estante para tubos de ensaio com nove tubos de capacidade volumétrica de cerca de 15mL. Procedimentos -PREPARO DO BIURETO

Para preparar o reativo de biureto, dissolver seqüencialmente em água quente, 6,0g

de tartarato duplo de Na e K.4H

2O; 1,5g de CuSO

4

.5H

2O; 1,25g de KI e 30g de NaOH.

Esperar esfriar e completar o volume até 1000 mL com água destilada. Obs. Solução preparada previamente - PREPAO DAS SOLUÇÕES DE PROTEÍNAS • Pesar 5g de carne de frango, carne de boi e clara de ovo.

• Macerar a carne de boi e de frango em almofariz e pistilo. • Solubilizar este material em 100 mL de solução salina (NaCl 0,9%) separadamente, para criar a solução de ovo, de carne de boi e de frango • Filtrar e coletar, as respectivas soluções, em beckers de capacidade volumétrica de 250 mL. -TÉCNICA DO BIURETO

. Em 03 tubos de ensaio marcados (A), (B) e (Branco), colocar: - nos 03 tubos – 1,0ml do reagente de Biureto Em (A) – 1,0 ml de alanina Em (B) – 1,0 ml de solução de proteínas (escolha uma delas) Em (branco) – 1,0ml de salina fisiológica • Agite e compare a intensidade da cor violácea entre os tubos e, tire as suas

conclusões.


Aluno (a): Curso:




Período:

PROPRIEDADES PROTÉICAS - DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNAS

A maior parte das proteínas em seu estado nativo apresenta-se dobrada em

estruturas tridimensionais definidas. Umas têm a estrutura compacta e globular como a mioglobina, ribonuclease, lisosima; noutras, a estrutura nativa é do tipo bastão (ex. queratina) e ainda em outras a estrutura consiste de porções bastões e globulares como é o caso da miosina. A desnaturação seria então uma mudança na estrutura original ordenada nativa sem alteração da sequência de aminoácidos, isto é, sem alteração da estrutura primária da proteína. A extensão desta mudança não é sempre bem definida. O conceito de desnaturação, portanto, não é absoluto e é aplicável apenas a proteínas cuja estrutura nativa seja ordenada. A desnaturação pode ser causada por uma série de agentes físicos (ex: temperatura) e agentes químicos (ex: ácidos e bases fortes, soluções concentradas de uréia, sais de guanidina, de salicilato, de picrato e detergentes). O grau de mudança que cada um desses agentes pode causar na conformação da proteína pode ser diferente para as diferentes proteínas. A conformação específica e ativa de uma proteína é o resultado de um grande número de interações que têm uma natureza cooperativa. Quando as condições do meio se alteram de modo que, em certos locais da molécula, algumas dessas interações fiquem debilitadas ou mesmo desapareçam pode, como consequência, ocorrer modificação de uma grande parte da estrutura. A desnaturação pode ser ou não um processo reversível; tudo vai depender do grau de alteração que ocorreu na estrutura da proteína. Certos tipos de alterações, como por exemplo, ruptura de ligações covalentes (por exemplo S-S) são consideradas como um processo irreversível.

Não se pode estabelecer ainda com precisão os mecanismos de atuação dos diferentes agentes desnaturantes, mas simplificadamente estes poderiam ser explicados da seguinte maneira: Temperatura

O efeito da temperatura seria promover a destruição de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicos o que levaria a um desenovelamento da molécula; em geral, há coagulação da proteína. A coagulação e precipitação por aquecimento é o meio mais comum de desproteinizar fluidos biológicos e extratos de tecidos. No entanto, a coagulação é um fenômeno secundário à desnaturação já que depende também de fatores como pH, força iônica, constante dielétrica do meio e da natureza dos íons presentes. A coagulação térmica ocorre bem próximo ao pI e é o resultado da agregação molecular que acontece devido à exposição (ao meio externo) de grupos hidrofóbicos e SH que estavam mascarados na estrutura nativa. Ácidos e bases fortes

O tratamento com ácidos e bases fortes leva à alteração da carga líquida da

proteína. Em determinados valores de pH onde haja excesso de cargas positivas ou

negativas, as repulsões coulombianas correspondentes concorrem para desestabilizar

a estrutura compacta da proteína. A conformação nativa das proteínas é estável

apenas numa faixa estreita de valores de pH.

Solventes orgânicos A ação desses solventes vai depender da sua maior ou menor polaridade e, portanto,

da sua capacidade de interagir com certos grupos laterais das proteínas (através de

pontes de hidrogênio ou promovendo ruptura de ligações hidrofóbicas). O efeito

desnaturante desses solventes pode ser diminuído utilizando-se temperaturas baixas,

o que no entanto favorece a insolubilidade da molécula protéica; essa é uma das

técnicas usadas na precipitação de proteínas.

Materiais necessários Soluções de carne de frango, bovina e clara de ovo Solução salina (NaCl 0,9%) Tubos de ensaio e estante para tubos Pipetas graduadas com pêras ou pipetadores automáticos Banho-Maria • Soluções de NaOH (base forte), HCl (ácido forte) e TCA ( ácido fraco), todas estas em uma concentração de 1,0N. Solventes – acetona, éter e etanol.

Procedimentos

Identifique 8 tubos de ensaio e pipete 2ml de solução de proteínas (escolher uma

delas) em cada tubo.

Coloque o primeiro tubo em banho-Maria fervente por 5 minutos (desnaturação

térmica).

Adicione 2 ml das seguintes substâncias aos seguintes tubos:

Tubo 2 – solução de NaOH

Tubo 3 – solução de HCl

Tubo 4 – solução de TCA

Tubo 5 – acetona

Tubo 6 – éter

Tubo 7 – etanol

Tubo 8 – salina fisiológica (controle)

Observe durante este procedimento, a ocorrência de possíveis alterações nas soluções

de proteínas e conclua.


Aluno (a): Curso:




Período:

PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS – SALTING IN / SALTING OUT

Materiais usados:

Solução salina rica em proteína de clara de ovo

Solução saturada de sulfato de amônio (SAS)

Reagente de Biureto

Tubos de ensaio e estante

Pipetas graduadas ou pipetadores automáticos

Centrífuga

Metodologia:

- Salting out

Em um tubo de centrífuga adicione 2ml de solução de clara de ovo e 2ml de solução saturada

de sulfato de amônio.

Centrifugue por 10 minutos na velocidade máxima.

- Salting in

Retire o sobrenadante com cuidado e descarte. Ao precipitado adicione 4ml de água destilada

e agite. Anote as observações.

Caso não ocorra solubilização, lave novamente com salina, descarte o sobrenadante e

adicione novamente 4,0 ml de salina ao precipitado.

Ao sobrenadante, faça o teste do biureto. Anote suas observações.


Aluno (a): Curso:




Período:

CINÉTICA ENZIMÁTICA – EFEITO DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE

SALIVAR

- -Amilase Salivar (EC 3.2.1.1) é uma proteína globular de 58 kDa, presente na saliva

humana. É uma enzima que hidrolisa ligações do tipo 1-4 de carboidratos, como as

encontradas no amido, na dextrina e no glicogênio.

(A)

(B)

Figura 1: (A) estrutura simplificada das ligações químicas que ocorrem no amido1. (B) estrutura da -

amilase salivar humana: a imagem está disponível na página do Protein Data Bank, da estrutura

1SMD.pdb.

Materiais

4 biscoitos cream-cracker

Saliva

Solução de Iodo

Água

Vinagre

Bicarbonato de sódio*

4 placas de Petri

4 pipetas Pasteur

Almofariz (ou garrafa e saco plástico) 4 Mexedores de café 1 cronômetro

1 Disponível em: http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2010/Webb/a-amylase.htm

*Solução de bicarbonato de sódio: adicione 1 colher de café de NaHCO3 em 10 mL de água, misture, deixe decantar e utilize a solução.

Procedimentos

1. Identifique as placas de Petri de acordo com a condição experimental: “controle”, “água”, “vinagre” e “bicarbonato”.

2. Triture 1 biscoito com o almofariz e deposite na placa identificada como “controle”.

3. Mastigue 1 biscoito e deposite em uma das placas, com cuidado para que se forma uma massa homogênea a úmida; repita o procedimento com outros dois biscoitos.

4. Adicione água na amostra de biscoito triturado (“controle”), aos poucos, até obter uma pasta de consistência semelhante à dos biscoitos que foram mastigados. Anote o tempo do cronômetro.

5. Em cada placa, adicione 1 mL de: (a) água (b) vinagre e (c) solução de bicarbonato de sódio e misture bem.

6. Após 30 min, pingue de 3 a 5 gotas de solução de iodo e anote a cor.


Aluno (a): Curso:




Período:

CINÉTICA ENZIMÁTICA – EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA

BROMELINA teste de estabilidade térmica

- Bromelina (EC: 3.4.22.32 ) é uma proteína globular de 33,2 kDa. É uma protease de

cisteína presente no suco de abacaxi que hidrolisa ligações peptídicas, com preferência

para clivagem de ligações peptídicas formadas por Arginina e Lisina, mas podendo

hidrolisar ligações formadas por Alanina, Tirosina e Glicina.

(A)

(B)

Figura 2: (A) Representação esquemática da hidrólise de uma ligação peptídica2. (B) estrutura da

Bromelina obtida por modelagem molecular (1w0q.pdb). A figura foi obtida pelo programa de

visualização de proteínas PyMol.

Materiais

1 pacote de gelatina sem sabor 700 mL de Água 10 mL de Suco de abacaxi 10 tubos de ensaio Béquer (250 mL) Caneta de retroprojetor Estante para tubos 1 pregador para tubos Proveta de 10 mL Pipeta de 2 mL 1 cronômetro ou relógio

2 Disponível em: http://www.studyblue.com/notes/note/n/vi-mechanisms-of-enzyme-action/deck/1815715

Bico de Bunsen ou placa de aquecimento Banho-maria Geladeira

Procedimentos 1. Prepare a gelatina sem sabor: Dissolva um pacote de gelatina sem sabor em 250 mL de água fervente. Após dissolver a gelatina adicione 250 mL de água gelada. 2. Numere os tubos de ensaio, colocando a letra C para o controle e a letra E para as amostras que terão enzima: 1C e 1E; 2C e 2E; . 3C e 3E; . 4C e 4E; . 5C e 5E. 3. Coloque 2 mL de água nos tubos com letra C (controle) e 2 mL de suco de abacaxi nos tubos com letra E (enzima).

4. Os tubos serão mantidos em diferentes temperaturas por 15 minutos, de acordo com a tabela abaixo:

Tubos de ensaio

Conteúdo Tratamento – 15 minutos

1C Água Geladeira (8 °C)

1E Suco de abacaxi Geladeira (8 °C)

2C Água Temperatura ambiente (25 °C)

2E Suco de abacaxi Temperatura ambiente (25 °C)

3C Água Banho-maria (45 °C)

3E Suco de abacaxi Banho-maria (45 °C)

5C* Água Ferver em banho-maria (100 °C)*

5E* Suco de abacaxi Ferver em banho-maria (100 °C)*

* RETIRE OS TUBOS DEPOIS DO AQUECIMENTO UTILIZANDO GARRAS/PREGADORES PARA TUBOS DE ENSAIO!! Não ferva o suco dos tubos 5C e 5E, deixe num banho-maria com água fervente (use bico de Bunsen ou placa de aquecimento): - ferva a água (100 mL de água no béquer de 250 mL) - coloque os tubos 5C e 5E no béquer - mantenha os tubos na água fervente por 5 minutos. 5. Após os 15 min de permanência nas diferentes temperaturas deixe cada um dos tubos em temperatura ambiente por 10 minutos.

6. Utilizando a proveta, coloque 10 mL de gelatina em cada tubo.

7. Agite, com cuidado, os tubos para que a gelatina se misture de forma homogênea à solução contida, inicialmente, no tubo.

8. Coloque os tubos no congelador e aguarde cerca de 20 min (o tempo será o

necessário para a amostra 1C endurecer!). Retire os tubos do congelador e observe o

aspecto da gelatina em cada tubo.


Aluno (a): Curso:




Período:

CINÉTICA ENZIMÁTICA – EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA

BROMELINA.

Materiais

Leite em pó

100 mL de água destilada

3 mL de suco natural de abacaxi

Béquer (250 mL)

1 espátula para pesagem

6 placas de petri

Caneta de retroprojetor

6 Pazinhas de plástico pequenas

1 (ou 2) espátula(s) de plástico

Estante para tubos

1 proveta de 10 mL

1 pipeta de 1 mL

1 Cronômetro ou relógio

Balança

Procedimentos

1. Anote nas tampas das placas de petri as condições experimentais com os seguintes códigos: use números para identificar a quantidade de leite utilizada (ver item 2) e a letra C para as amostras Controle (onde será adicionado apenas água) e E para as amostras que terão Enzimas (onde será adicionado o suco de abacaxi): 6C e 6E 7C e 7E 8C e 8E 9C e 9E 10C e

10E

2. Utilizando as placas de petri, pese o leite em pó: 6, 7, 8, 9 e 10 gramas nas respectivas placas. As placas 6C e 6E conterão 6 gramas de leite cada; 7C e 7E, terão 9 gramas, etc. 3. Com o auxílio de uma proveta, coloque 9 mL de água em cada placa. Misture bem, com cuidado para não derramar o leite ou a água, utilizando a espátula de plástico, até

que se forme uma massa homogênea. Tampe a placa. Atenção: As placas devem ficar tampadas durante todas as etapas do experimento.

4. Adicione 1 mL de água nas placas identificadas como controle (C) e misture bem. Acione o cronômetro na primeira adição e anote o tempo no qual foi feita cada adição.

5. Adicione 1 mL de suco de abacaxi nas placas identificadas como enzimas (E), misture bem e anote o tempo de cada adição.

6. A cada 5 minutos, passe a pazinha de plástico pequena no fundo de cada uma das placas e observe a consistência do leite. Se você perceber que a linha de separação feita no meio da placa demora a voltar a fechar, passe a medir o tempo a cada 1 minuto!

7. Quando formar uma canaleta na massa de leite, que não retorna à sua posição inicial, vamos considerar como o fim da reação. Anote o tempo necessário para isso ocorrer em cada uma das placas. Atenção: o padrão de separação da massa deve ser o mesmo para todas as amostras. Não é possível determinar a quantidade de produto formado na reação, mas se considerarmos um mesmo padrão para o final da reação, podemos dizer que a quantidade de produto é muito semelhante nas diferentes condições e pode ser considerado como “igual” para fins de cálculo de velocidade de reação. - Anote o tempo de reação para cada amostra em uma tabela. - Calcule a velocidade de reação como sendo o inverso do tempo (1/tempo). - Faça um gráfico da velocidade de reação em função da concentração de substrato.

Concentração de Substrato (g) Tempo de reação (min) Velocidade da reação (1/min)


Aluno (a): Curso:




Período:

IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS – BENEDICT, SELIWANOFF E LUGOL

Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas baseadas

principalmente na natureza química de seu radical R, os glicídios apresentam

estruturas muito parecidas entre si o que torna quase impossível identificá-los de per

se. Neste caso, o que se faz é caracterizar grupos de glicídios utilizando suas

propriedades químicas comuns.

As reações utilizadas nesta prática estão baseadas principalmente em 2 dessas

propriedades:

• Desidratação de glicídios em presença de ácidos minerais fortes

• Poder redutor

1) Desidratação de glicídios em presença de ácidos minerais fortes

Hexoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas, respectivamente a

hidroximetilfurfural e furfural; esses compostos são capazes de se condensar com

substâncias fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia, etc. Os complexos

formados são, algumas vezes, coloridos a utilizados para a caracterização de certos

grupos glicídicos.

Neste caso, situam-se: Reação de Seliwanoff e reação de Bial.

Reação de Seliwanoff

Teste de diferenciação entre aldoses e cetoses.

A reação é feita com resorcinol em meio ácido (HCl), à quente. As cetohexoses dão um

produto de coloração vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses

correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que as cetohexoses

são desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses

fornecem apenas um produto de cor rosa pálido.

2) Poder Redutor

Os açúcares contêm grupos aldeídos a cetonas capazes de reduzir sais de metais

pesados; desses são mais usados os sais de Cu2+

. O princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam Cu2+

é sua dissolução em meio alcalino, em presença de ácidos orgânicos - como o ácido

cítrico e o ácido tartárico - capazes de formar complexos. Também podem ser

empregados outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido lático, ácido trihidroxiglutárico

ou um ácido sacárico. Ácidos sacáricos são os produtos da oxidação da carbonila

aldeídica e do grupamento álcool primário dos glicídios, sendo portanto ácidos

dicarboxílicos. A reação de formação do complexo ocorre, em geral, em meio

fortemente alcalino a isto promove profundas modificações na estrutura do açúcar. Os

açúcares de per se apresentam poder redutor diferente sobre o íon Cu2+; isto significa

que dois tipos de hexoses, em uma mesma concentração, fornecem quantidades

diferentes de óxido cuproso (produto final da redução). De qualquer forma, os

métodos podem ser adaptados de modo a se tornarem reprodutíveis e a haver

proporcionalidade entre a quantidade de Cu2O produzido e a concentração de glicídio

presente dentro de um certo limite (ou certa faixa de concentrações). A quantidade de

íons cobre reduzida pelos diferentes glicídios é função do pH, da temperatura, da

concentração e dos tipos de glicídios e íons orgânicos complexantes. Há diversos

métodos para a determinação do teor de Cu2O como, por exemplo, gravimetria e

colorimetria. No último caso, o Cu2O formado é dissolvido em excesso de reagente

como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-molibdato, formando-se um

complexo de cor azul.

Este procedimento é muito adequado para a verificação de glicídios em materiais

biológicos.

Dentre os testes baseados no poder redutor dos glicídios, pode-se destacar os testes

de Trommer, Tollens, Benedict e de Barfoed modificado.

Teste de Benedict - O reagente consiste de uma solução onde está presente o íon Cu2+

(Cu (OH)2) em meio com Na2SO4. Na presença de um açúcar redutor e submetido a

alta temperatura o íon Cu2+ (cúprico) é reduzido a íon Cu+ (cuproso), formando assim

um precipitado de cor vermelho tijolo.

Cu (OH)2 + calor + açúcar redutor → Cu2O (precipitado vermelho tijolo)

3) Identificação de polissacarídeos

O iodo em solução produz reação colorida com polissacarídeos. Com o amido produz

cor azul e, com o glicogênio produz cor vermelha.

Materiais


Pipetas volumétricas ou pipetadores automáticos

Banho-Maria

Soluções de glicídeos 0,1M: glicose, sacarose e frutose

Solução de amido 1,5%

Sucos de laranja e de banana

Reagentes de Seliwanoff, Benedit e Lugol

Procedimentos

Prepare 3 séries (uma para cada teste) de 8 tubos de ensaio.

- Teste de Seliwanoff

Pipete em cada um dos 8 tubos 0,5ml das seguintes amostras:

1- Glicose

2- Sacarose

3- Frutose

4- Amido

5- Suco de laranja

6- Suco de banana

7- Água (controle)

Adicione 2ml do reagente de Seliwanoff em todos os tubos.

Ferva em banho-Maria por 10min. Observe durante este procedimento, a ocorrência

de possíveis alterações e anote os resultados.

- Teste de Benedict

Pipete em cada um dos 8 tubos 0,5ml das seguintes amostras:

1- Glicose

2- Sacarose

3- Frutose

4- Amido

5- Suco de laranja

6- Suco de banana

7- Água (controle)

Adicione 1ml do reagente de Benedict em todos os tubos.

Ferva em banho-Maria por 1min. Observe durante este procedimento, a ocorrência de

possíveis alterações e anote os resultados.

- Teste do Lugol

Pipete em cada um dos 8 tubos 2ml das seguintes amostras:

1- Glicose

2- Sacarose

3- Frutose

4- Amido

5- Suco de laranja

6- Suco de banana

7- Água (controle)

Adicione 2 gotas do reagente de Lugol em todos os tubos e homogeneizar.

Observe durante este procedimento, a ocorrência de possíveis alterações e anote os

resultados.


Aluno (a): Curso:




Período:

IDENTIFICAÇÃO DE ESTERÓIDES (LIPÍDEOS)

Os lipídeos, como substâncias hidrofóbicas, são solúveis em solventes orgânicos relativamente apolares (Clorofórmio, éter, álcool, acetato de etila, tetracloreto de carbono, etc ou combinação destes). Na matéria orgânica eles se depositam em gotículas ou se adsorvem a moléculas protéicas ou polímeros glicídicos. Assim para sua purificação e/ou identificação torna-se necessária a sua prévia extração dos alimentos. O colesterol na presença de ácido sulfúrico é desidratado a colestadieno, o qual possui

cor vermelha (reação de Salkowski). Esta reação é comum aos esteróides que como o

colesterol possuem dupla ligação entre os carbonos 5 e 6 (exemplo ergosterol).

Materiais necessários 1 ovo. Solução salina 100 mL. 02 Bequers com capacidade volumétrica de 100mL. Funil e bastão de vidro. Proveta com capacidade volumétrica de 100mL. Éter etílico 100 mL. Erlenmeyer com capacidade volumétrica de 100mL Estante para tubos de ensaio e 03 tubos de ensaio. Solução concentrada de ácido sulfúrico (H

2SO

4).

Pipetas volumétricas ou pipetadores automáticos Pissete com água destilada. Óleo de soja e óleo mineral.

Procedimentos - Reação de salkowski. Preparo de extrato étereo de gema de ovo: • Diluir uma gema de ovo em becher de 100 mL com 10 mL de salina e misturar com o auxílio de bastão de vidro. Com a ajuda de um funil, transferir o conteúdo do becher para uma proveta com capacidade volumétrica de 50 mL • Ainda com o auxílio do funil, completar o volume da proveta com éter etílico gelado. Vedar a proveta e agitar vigorosamente (10 segundos). • Deixar descansar por cerca de 30 minutos. Identifique 3 tubos de ensaio. Em cada tubo pipete 1ml das seguintes amostras:

1- Extrato etéreo de gema 2- Óleo de soja 3- Óleo mineral

Inclinar o tubo e adicionar VAGAROSAMENTE pela parede interna do tubo 0,5 mL de ácido sulfúrico concentrado (H

2SO

4). O aparecimento de um disco avermelhado na

interfase ácido/éter ou nos óleos é indicativo da presença de colesterol ou outros esteroides.


Aluno (a): Curso:



Plano de Aula 257195 (semana 10) da

disciplina

Período:

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Materiais usados:

Levedura (fermento)

Sacarose

2 Banho-Maria (a 40C e fervente)

Reagente de Seliwanoff


Tubo Falcon ou tubo de ensaio com tampa

Pipetas volumétricas ou pipetadores automáticos

Balança, bécker e erlenmeyer

Procedimentos:

Prepare uma solução de leveduras com 3g do fermento e 60ml de água.

Prepare 100ml de solução de sacarose 10%.

Prepare o Tubo de Fermentação: em um tubo grande e com tampa coloque 10ml da

solução de leveduras e 5 ml da solução de sacarose 10%. Complete com água até

encher o tubo. Tampe e homogeneíze.

Coloque o Tubo de Fermentação em Banho – Maria a 40C.

Comece a marcar o tempo. No tempo 0 e a cada 15 minutos retire uma alíquota de

cerca de 0,5ml do tubo de fermentação, coloque em um tubo de ensaio e ferva por

10min em Banho-Maria.

Dilua esta alíquota 10x.

Retire uma alíquota de 0,5ml, e dose o teor de carboidratos adicionando 2ml de

Reagente de Seliwanoff e fervendo por 10min em Banho-Maria.

APOSTILA PRATICA 2015

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