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7/17/2019 Silvia Pedroso - TeseRevisada230211_2.pdf

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SLVIA PEDROSO MELEGARI

ESTUDO DO MECANISMO DE AO TXICA DA

SAXITOXINA E AVALIAO DE SUA ADSORO EMMATERIAIS ALTERNATIVOS PARA APLICAO EM

SISTEMAS DE TRATAMENTO DE GUA

Tese apresentada ao Programa dePs-Graduao em Engenharia

Ambiental da UniversidadeFederal de Santa Catarina, comorequisito para a obteno dottulo de Doutor em EngenhariaAmbiental, rea de concentraoToxicologia Ambiental.

Orientador: Prof. William Gerson Matias, Dr.Co-orientadora: Prof. Ctia Regina Silva de Carvalho Pinto, Dr.

FLORIANPOLIS

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AGRADECIMENTOS

Ao meu grande amor, Jos Ricardo, companheiro e melhoramigo. Agradeo por estar ao meu lado, pelo seu incentivo eadmirao e por acreditar e confiar em mim. Amo voc!

Aos meus pais, Zelindo e Izaura, pelo exemplo de vida.No posso v-los, mas sinto vocs comigo, me iluminando e meguardando! Amo vocs para sempre!

Ao Professor Dr. William Gerson Matias, pela orientao,amizade e confiana em meu trabalho!

Ao Professor Dr. Edmond Eku Creppy, por me acolherem seu laboratrio, pela confiana e pelas valiosas contribuiesneste estudo!

Professora e amiga Dra. Ctia Regina Silva de CarvalhoPinto, pela coorientao, pela amizade e pela enorme pacinciaem seus ensinamentos.

Ao Dr. Serge Moukha e ao Dr. Thophile Mobio, pelapacincia em repartirem seus conhecimentos e pelas valiosas

contribuies neste estudo.Ao CNPq e CAPES, pelo apoio financeiro para odesenvolvimento e suporte desta pesquisa.

Ao Programa de Ps-Graduao em EngenhariaAmbiental, pelos servios prestados, pelo comprometimento e

pelo esforo para a concluso desta tese!A todos os amigos do LABTOX e do LIMA que, direta ou

indiretamente contriburam de alguma forma para que essetrabalho pudesse ser concludo. Obrigada, meus amigos!

minha famlia: meus irmos Anglica, Luciane e LuisFernando; meus sobrinhos Karol, Manu, Ri, Luis, Gabi, P, Yurie Tat; minha sogra Luiza; minhas cunhadas Deinha, Bu e Dami,e meu cunhado Osmar! Obrigada pelo amor e carinho! Obrigada

por acreditarem em mim!E, acima de tudo, a Deus, pela vida, pela boa sade e pela

oportunidade que me foi oferecida.


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RESUMO

Entre os diversos problemas de sade pblica ligados aoabastecimento de gua, a contaminao de mananciais de guadoce por cianotoxinas tem sido muito enfatizada devido ao riscotoxicolgico que representa. Assim, este assunto tornou-se

preocupante e cada vez mais estudado pela comunidadecientfica, pois compromete a qualidade das guas destinada aoconsumo humano, atingindo conjuntos de organismos muito almda comunidade aqutica. A saxitoxina (STX) uma neurotoxina

produzida pela cianobactria Cylindrospermopsis raciborskii, que

compe a biota da Lagoa do Peri, um dos principais mananciaisde abastecimento de gua para o Municpio de Florianpolis-SC.Este estudo investigou o mecanismo de ao da STX por meio demtodos toxicolgicos in vitro, alm de verificar a capacidade deadsoro de conchas de ostra e quitina STX. Os testescitotxicos e genotxicos in vitro, realizados para avaliar a aoda STX sobre clulas Neuro 2A (N2A) e Vero, foram os testes doMTT, a fragmentao e a metilao do DNA, a lipoperoxidao ea frequncia de clulas micronucleadas. Os ensaios de adsoroderam-se com o emprego de conchas de ostras trituradas equitina, como matrizes adsorventes para a verificao dacapacidade de adsoro da STX em solues aquosas. Para aquantificao da STX, foi empregada a cromatografia lquida dealta eficincia (HPLC). Os resultados obtidos nas avaliaestoxicolgicas demonstraram que a STX possui um potencialefeito citotxico e genotxico, pois induziu as clulas N2A apoptose, fragmentao e hipermetilao do DNA, alm de

causar a oxidao lipdica da membrana celular. Nessasavaliaes toxicolgicas ainda foi possvel verificar o potencialda STX induo de formao de microncleos em clulas N2Ae Vero, com evidncias dos efeitos de origem aneugnica. Nosensaios de adsoro, foi possvel verificar que a concha de ostra ea quitina foram eficientes para remoo da STX (>60% em 48h)em amostras da gua, na escala de concentraes empregadasneste estudo.Palavras-Chave: saxitoxina, clulas Neuro-2A, clulas Vero,

efeito citotxico e genotxico, adsoro, concha de ostra, quitina.


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ABSTRACT

Amongst the diverse problems of public health on the watersupply, the contamination of fresh water sources fromcyanotoxins had been emphatized due toxicological risk. Thus,this subject that concern more and more studied by the scientificcommunity, therefore compromises the waters quality destined tothe human consumption, reaching organisms beyond the aquaticcommunity. The saxitoxin (STX) is a neurotoxin produced in

blooms of Cylindrospermopsis raciborski, cyanobacteria thatcomposes the biota of Peri Lagoon - Florianpolis/SC. This study

evaluated the mechanism of action of STX through toxicologymethods in vitro, besides verifying the absorption capacity ofoyster shell and chitin to STX. To evaluate the action of STX in

Neuro 2A (N2A) and Vero cells, the cytotoxic and genotoxic invitro essays employed were: MTT assay, DNA methylation andfragmentation, lipid peroxidation and frequency ofmicronucleated cells. From the adsorption essays were employedoyster shells powdered and chitin as adsorbents matrices andverifying the capacity of absorption of STX soluble to theseadsorbents. The quantification of STX was for high performanceliquid chromatography (HPLC). The results of toxicologicalevaluation showed that STX had a potential cytotoxic andgenotoxic effects. The STX exposure induced to N2A cells to

cellular apoptosis, DNA fragmentation and methylation and lipidoxidation of cellular membrane. The toxicological evaluationdemonstrated that STX induced to the N2A and Vero cellsexposed to micronuclei formation, with evidenced to aneugenic

effects. The adsorption assays verified that oyster shell and chitinwere efficient to remove the STX (>60% in 48h) from watersamples, in the concentrations scale employed in this study.

Keywords: Saxitoxin (STX), Neuro 2A cells, Vero cells,cytotoxic and genotoxic effects, adsorption, oyster shell, chitin.


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LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1: Vista panormica do Parque da Lagoa do Peri (Fonte:Oliveira, 2002)................................................................................. 38Figura 3.2: Estruturas qumicas das toxinas paralisantes de molusco(PSP)................................................................................................ 41Figura 3.3: Estrutura da saxitoxina (STX). ...................................... 41Figura 3.4: Peroxidao da saxitoxina. ............................................ 45Figura 3.5: Mecanismo de metilao do DNA. A 5metilcitosina

produzida pela ao das DNA-metiltransferases (DNMT 1, 3a ou 3b)

que catalisam a transferncia de um grupo meti da S-adenosilmetionina (SAM) para o carbono na posio 5 da citosina. 48Figura 3.6: Fragmentao do DNA aps tratamento de clulas Caco2ao cido domico. 1: marcador DNA (Ladder); 2: controle;

3:15ng/mL; 4: 30ng/mL; 5:60ng/mL; 6:100ng/mL (Carvalho Pinto-Silva, 2005). .................................................................................... 50Figura 3.7: Esquema simplificado da lipoperoxidao, com aformao do malondialdedo e o aduto com a guanina, M1G. ........ 51Figura 3.8: Fotomicrografia da concha de ostra calcinada (Fonte:

Silva, 2007). .................................................................................... 55Figura 3.9: Fotomicrografia de amostras de quitina proveniente dacarapaa do camaro (1300X) (Fonte: Antonino, 2007). ................ 56Figura 5.1: Perfil dose-resposta da STX em clulas N2A na presenae ausncia de O/V. Viabilidade celular (%)DP v. Concentrao deSTX em nM. Condio Sem O/V: R2=0,997; condio ComO/V::R2= 0,9904. .......................................................................... 70Figure 5.2: Fragmentao do DNA de clulas N2A extrado apsexposio STX. O DNA foi isolado de clulas N2A expostas e aeletroforese foi realizada em gel de agarose 1,5% nas seguintesconcentraes: 1: Ladder 1000 kpb, 2: OTA (ocratoxina)10M, 3:3,0nM, 4: 1,5nM; 5: 0,8nM 6: Controle negativo com antibitico e 7:Controle negativo sem antibitico. .................................................. 72Figura 5.3: % de DNA fragmentado para clulas expostas STX,obtido pela anlise da imagem do gel. ............................................. 73Figura 5.4: % m5dC com relao a quantidade total de citosina(dC+m5dC) das amostras do DNA extradas de clulas N2Aexpostas por 24 horas, para os controles negativo e positivo e asdiferentes concentraes de STX empregadas. ............................... 74


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Figura 5.5: Lipoperoxidao induzida pelo aumento da concentraode STX em clulas N2A avaliando o efeito da ausncia e presena dediferentes antioxidantes, com dosagem da quantidade de MDA

produzido, aps 24 horas de incubao (*diferena significativa comrelao clulas no tratadas com STX para p


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Figura A6: Cromatograma do padro do MDA(60nM - tR: 4,58 min)........................................................................................................ 132Figura A7: Curva de calibrao do mtodo empregado paraquantificao da protena BSA no ensaio de lipoperoxidao....... 134Figura A8: Esquema de diluio em cascata da STX na microplacade 96 poos para os ensaios citotxicos do MTT. ......................... 135Figura A9: Esquema de diluio em cascata da STX na microplacade 24 poos para os ensaios de lipoperoxidao e microncleo. ... 136Figura A10: Esquema de diluio em cascata da STX na microplaca

de 6 poos para os ensaios de fragmentao e metilao do DNA. 137


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LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1: Condies para determinao de STX em HPLC comdetector de fluorescncia ................................................................. 68Tabela 5.1: Lipoperoxidao medida pela % do aumento na

produo do MDA com relao ao controle. ................................... 81Tabela 5.2: Parmetros obtidos pelas isotermas de adsoro da STXnas diferentes condies analisadas. ................................................ 95Tabela 5.3: Valores de Gads para a STX para os adsorventestestados nos pH 5,0 e 7,0. ................................................................ 98

Tabela A1: Dados para a construo da curva de calibrao da STX........................................................................................................ 127Tabela A2: Dados para a construo da curva de calibrao dacitosina e 5-metilcitosina. .............................................................. 129Tabela A3: Dados para a construo da curva de calibrao MDA........................................................................................................ 131Tabela A4: Dados para a construo da curva de calibrao BSA. 133


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LISTA DE ABREVIATURAS

AOAC:Association of Official Analytical ChemistsASP:AminesicShellfish PoisiongBNMN:binucleated micronucleated cellsCASAN: Companhia Catarinense de guas e SaneamentoCAT: catalaseCBMN: Cytokinesis-block micronucleus assayCOL: ColchicinaCytB: Citocalasina B

DMSO: Dimetil-sulfxido

DNA: cido desoxirribonuclicoDSP:Diarrheic Shellfish PoisiongEC50: Concentrao efetiva 50%ELISA:Enzime Linked Immunosorbent AssayFISH: Hibridizao in situpor FluorescnciaFD:Fluorescence detectorGPx: glutationa peroxidaseGSH: glutationa reduzidaHPLC:High Performance Liquid ChromatographyIBAMA: Instituto Brasileiro do Meio AmbienteISOC-HAB:International Symposium on Cyanobacterial

Harmful Algal BloomsLABTOX: Laboratrio de Toxicologia AmbientalLIMA:Laboratrio Integrado do Meio AmbienteLin: LinearLMP:Low Melting Point

LPO: LipoperoxidaoMBA:Mouse BioassayMDA: MalondialdedoMEV: Microscopia Eletrnica de VarreduraMN: micronucleus/ micronucleiMTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol il-2,5-difeniltetrazlio)

N-Lin: No-LinearNMP:Normal Melting PointNRC:National Research Council Canada

NSP:Neurotoxic Shellfish Poisoning


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O/V: ouabana/veratridinaOMS: Organizao Mundial de SadePBS:Phosphate Buffered SalineTampo salino de fosfato

pH: Potencial hidrogeninicoPSP:Paralitic Shellfish PoisiongROS:Reactive Oxigen SpeciesRNA: cido ribonucleicoRNase A: Ribonuclease ARNase T1: Ribonuclease T1

RNS:Reactive Nitrogen SpeciesRPMI: Roswell Park Memorial InstituteSDS: Dodecilsulfato de sdioSOD: Superxido dismutaseSTX: SaxitoxinaTBA: cido 2-tiobarbitricoUSEPA: United State Environmental Protection AgencyUV: ultravioletaVitE: Vitamina EVitC: Vitamina CVMP: Valor mximo permitidov.: versusWHO: World Health Organization


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SUMRIO

CAPTULO I .............................................................................. 231. INTRODUO ...................................................................... 23

1.1. Hipteses da Pesquisa ..................................................... 291.1.1. Primeira Hiptese .................................................... 291.1.2. Segunda Hiptese .................................................... 301.1.3. Terceira Hiptese ..................................................... 30

1.2. Justificativa da Pesquisa .................................................. 30

CAPTULO II ............................................................................. 332. OBJETIVOS ........................................................................... 332.1. Objetivo Geral ................................................................. 332.2. Objetivos Especficos ...................................................... 33

CAPTULO III ............................................................................ 353. REVISO BIBLIOGRFICA ............................................... 35

3.1. Eutrofizao Natural e Artificial ..................................... 353.2. Floraes de Algas .......................................................... 363.3. Cianotoxinas .................................................................... 39

3.3.1. Toxinas Paralytic Shellfish Poisons (PSP)........... 403.3.2. Legislao Brasileira v.Cianotoxinas ...................... 423.3.3. Quantificao da STX .............................................. 44

3.4. Bioensaios para Monitoramento da Citotoxicidade eGenotoxicidade Celular .......................................................... 45

3.4.1. Teste de citotoxicidade: Teste do MTT ................... 463.4.2. Teste de Microncleo ............................................... 463.4.3. Metilao Biolgica ................................................. 473.4.4. Fragmentao do DNA e Apoptose ......................... 493.4.5. Lipoperoxidao Biolgica ...................................... 50

3.5. Propriedades Qumicas dos Adsorventes Empregados naAdsoro da Saxitoxina .......................................................... 54

CAPTULO IV ........................................................................... 594. METODOLOGIA ................................................................... 59

4.1. Instalaes ....................................................................... 594.2. Ensaios de Citotoxicidade e Genotoxicidade .................. 59

4.2.1. Cultura Celular ......................................................... 59

4.2.2. Ensaio do MTT: Determinao da EC50 ................. 604.2.3. Fragmentao e Metilao do DNA ........................ 61


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4.2.4. Lipoperoxidao: Extrao e Quantificao do MDA........................................................................................... 634.2.5. Teste do Microncleo: Bloqueio Citocintico(CBMN) ............................................................................. 65

4.3. Ensaios de Adsoro ....................................................... 664.3.1. Materiais Adsorventes ............................................. 664.3.2. Cinticas e Isotermas de Adsoro .......................... 664.3.3. Dosagem da Saxitoxina ........................................... 67

CAPTULO V............................................................................. 69

5. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................ 695.1. Resultados do Artigo 1: Ensaio do MTT, Fragmentao eMetilao do DNA ................................................................. 69

5.1.1 Influncia de STX na Viabilidade Celular: Ensaio deMTT e Determinao de EC50 .......................................... 695.1.2. Efeitos de STX na fragmentao do DNA em clulas

N2A ................................................................................... 715.1.3. Efeitos de STX na metilao do DNA em clulas

N2A ................................................................................... 735.2. Discusso do Artigo 1 ..................................................... 755.3. Resultados do artigo 2: Lipoperoxidao e Efeito Protetorde Vitaminas e Enzimas ......................................................... 79

5.3.1. Lipoperoxidao: efeito do estresse oxidativo ......... 795.4. Discusso do Artigo 2: .................................................... 815.5. Resultados do Artigo 3: Teste do Microncleo ............... 85

5.5.1. Influencia da STX na viabilidade celular em ClulasN2A e Vero: teste do MTT e Determinao da EC50 ....... 85

5.5.2. Teste do Microncleo .............................................. 875.6. Discusso do Artigo 3: .................................................... 885.7. Resultados do Artigo 4: Ensaios de Adsoro ................ 915.8. Discusso artigo 4 ........................................................... 995.9. Consideraes Finais para Complementao do Estudo deCaso: Lagoa do Peri ............................................................. 100

CAPTULO VI ......................................................................... 1036. CONCLUSES E RECOMENDAES ............................ 103CAPTULO VII ........................................................................ 107

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................. 107


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CAPTULO VIII ....................................................................... 1278. APNDICES ........................................................................ 127A1. Curva de calibrao da STX .......................................... 127A2. Curva de calibrao para quantificao da citosina e 5-metilcitosina ......................................................................... 129A3. Curva de calibrao do malondialdedo ........................ 131A4. Curva de calibrao para a quantificao de protenas .. 133A5. Esquema de diluio em cascata da STX nas placas de 96

poos para os ensaios citotxicos do MTT ........................... 135

A6. Esquema de diluio em cascata da STX nas placas de 24poos para os ensaios do microncleo e lipoperoxidao .... 136A7. Esquema de diluio em cascata da STX nas placas de 6

poos para os ensaios de fragmentao e metilao do DNA.............................................................................................. 137A8. Artigo 1.......................................................................... 138A9. Artigo 2.......................................................................... 159A10. Artigo 3........................................................................ 177A11. Artigo 4........................................................................ 190


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CAPTULO I

1 INTRODUO

A gua o principal constituinte de todos os organismosvivos. O homem, alm de usar a gua para suas funes vitais,como o fazem todas as outras espcies de organismos vivos,utiliza os recursos hdricos para um grande conjunto deatividades, tais como, produo de energia, navegao, produode alimentos, desenvolvimento industrial, agrcola e econmico.De toda a gua disponvel no planeta, apenas 2,5% so de guadoce; e deste percentual, apenas 0,3% pode ser tratada para autilizao como gua potvel. Este precioso recurso, cada vezmais escasso, vem sendo muito ameaado por aesantropognicas (BARATA; CRISPINO, 2006).

A gua de m qualidade empobrece as populaes locais ede determinadas regies, interfere na economia regional e destrialternativas saudveis de desenvolvimento sustentvel.

(TUNDISI, 2003). O acelerado desenvolvimento urbano eindustrial est submetendo a graves presses os recursos hdricos.A crescente urbanizao no entorno de rios, lagoas e represasvem causando muitos problemas para os ecossistemas aquticos. cada vez mais evidente a desestabilizao das condies deequilbrio desses ecossistemas, causada pelo aumento dadensidade populacional nestas localidades, ultrapassando o nvelda tolerncia do ambiente aqutico (CARVALHO, 2004).

Certas caractersticas dos ambientes aquticos, como a alta

solubilizao de compostos orgnicos e inorgnicos, lhesconferem peculiaridades que possibilitam aos organismos,especialmente os auttrofos, a absoro de nutrientes por toda asuperfcie do corpo; assim sendo, o baixo teor de sais dissolvidos,tpico de gua doce, faz com que a maioria dos organismos quehabitam estes ambientes seja hipertnica com relao ao meio,sendo necessrias, portanto, adaptaes no sentido de manter oequilbrio osmtico entre os lquidos internos e o meio(ESTEVES, 1998).


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A diversidade da fauna e da flora das guas continentais

dependente dos mecanismos de funcionamento de rios, lagos,reas alagadas, represas, como o ciclo hidrolgico e a variedadede habitat e nichos. O ambiente em que vivemos caracteriza-se

por uma vida vegetal muito diversificada da qual depende nossaexistncia. As plantas verdes, aquticas e terrestres, so abase dacadeia de alimentos para o reino animal. Cerca de 90% dafotossntese na Terra realizada por plantas aquticas,

principalmente algas planctnicas. Certas algas azuis e algumasbactrias podem empregar o nitrognio gasoso da atmosfera na

construo do seu protoplasma e contribuir significativamentepara a sntese de compostos nitrogenados na gua e no solo ondevivem (fixao de nitrognio) (BARATA; CRISPINO, 2006).

Os seres humanos no esto isolados de seu ambientenatural; eles esto no topo de muitas cadeias alimentares e h

poucos ecossistemas nos quais a espcie humana no estenvolvida (AZEVEDO; CHASIN, 2003). Impactos ao meioambiente e sade humana esto cada vez mais presentes nocotidiano de populaes do mundo todo. Dentre as aesantropognicas que contribuem para tais impactos, a mais

preocupante a descarga de fontes difusas e pontuais denitrognio e fsforo nos rios, lagos e represas, a partir de esgotosno tratados e do emprego de fertilizantes que produzem ofenmeno de eutrofizao artificial, cujos efeitos ecolgicos nasade humana e nos custos do tratamento de gua so relevantes(TUNDISI, 2003).

A eutrofizao artificial manifesta-se com a quebra do

equilbrio ecolgico. Este processo, causado pelo lanamento deefluentes domsticos e industriais nos corpos d'gua,disponibiliza uma quantidade maior de matria orgnica que osistema capaz de decompor. Esses agentes eutrofizantes(constitudos principalmente de nitrognio, na forma de nitrato eamnia, e fsforo, na forma de fosfato) esto diretamenterelacionados com o processo fotossinttico das algas, uma vezque pertencem estrutura de muitos compostos importantes parao metabolismo da clula vegetal.


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O aumento da concentrao de nutrientes implica no s o

aumento da densidade de algas, mas, tambm, alteraesqualitativas, como o surgimento de novas espcies e odesaparecimento de outras. A poluio de um ambiente aquticoenvolve, portanto, processos de ordem fsica, qumica e biolgica.As floraes algais, resultado da interao desses fatores fsicos,qumicos e biticos, so caracterizadas por um crescimentoexplosivo, autolimitante e de curta durao dos microorganismosde uma ou poucas espcies, frequentemente produzindocoloraes visveis nos corpos de guas naturais (TORGAN,

1989 apud MATTHIENSEN et al., 1999).A florao de algas txicas causa gosto e odor

desagradveis na gua e altera o equilbrio ecolgico doecossistema aqutico. Entre as algas que podem causar floraoem corpos de guas continentais, destacam-se as cianobactriasque produzem as cianotoxinas. As floraes de algas txicas emmananciais utilizados para abastecimento pblico representamum risco potencial aos seus consumidores. As toxinas soaltamente solveis em guas e no podem ser removidas da gua

por sistema de tratamento convencional (BARTRAM et al.,1999).

A contaminao direta e indireta da gua por algas txicase/ou toxinas liberadas em floraes tem sido muito relatada emtodo mundo (RIEGMAN, 1998; CLOERN, 2001; SUNDA et al,2006). Estas floraes txicas se apresentaram prejudiciais nosomente para os ecossistemas aquticos, como tambm para asade humana. Muitos casos, que vo desde intoxicaes at a

morte, vm sendo citados na literatura, tanto que se pode observarum aumento significativo na frequncia, intensidade edistribuio geogrfica dessas floraes nas ltimas dcadas(RESSOM et al., 1994; HALLEGRAEFF et al., 1995; CHORUS;BARTRAM, 1999).

Esta problemtica relatada em todo o mundo foi registradano Brasil por Faria e Cunha (1917). Segundo tais autores, o

primeiro episdio de florao de algas no Brasil ocorreu em1913, na baa de Guanabara, no estado do Rio de Janeiro, quando

foi observada grande mortandade de peixes. Entretanto, somente


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em meados dos anos 80 o fenmeno da florao de algas recebeu

estudos mais aprofundados no Brasil. Estudos pioneiros no pastm sido realizados nos estados do Rio de Janeiro e do RioGrande do Sul, como monitoramento do fitoplncton txico, eestudos com cianobactrias de gua doce, que afetam osecossistemas costeiros, aplicando metodologias de bioensaios ecromatografia lquida de alta eficincia.

O estudo do fitoplncton txico no estado do Rio de Janeirotem sido realizado desde a dcada de 1970, na regio de CaboFrio (a partir de 1973), e a partir da dcada de 1980, na baa de

Guanabara (desde 1985, com monitoramento semanal) e na baada Ribeira (desde 1987, com monitoramento mensal) (SAR et al.,2002). No Rio Grande do Sul, desde 1987, floraes dacianobactria Microcystis aeruginosa tm sido registradas eestudadas na Lagoa dos Patos, considerada o segundo maiormanancial natural do Brasil (YUNES et al.,2002; YUNES, 2003;MATTHIENSEN et al.,1999).

No estado de Santa Catarina, desde 1994 so realizadasamostragens de fitoplncton na costa, sendo que j foramencontradas algumas floraes de algas potencialmente txicas. A

partir de 1997 foi estabelecido pelo governo do estado umprograma de monitoramento de fitoplncton txico para odesenvolvimento sustentvel do cultivo de moluscos numaextenso de 400km do litoral no estado (SAR et al.,2002). Umestudo recente, realizado em parceria pela Universidade Federalde Santa Catarina e o IBAMA, no qual foi monitorada aincidncia de fitoplncton txico na costa catarinense e seu

impacto na sade pblica e no meio ambiente, apresentou dadospreocupantes e confirmam a necessidade de um monitoramentoconstante. O estudo abrangeu mais de 500km do litoralcatarinense e, dos 21 pontos amostrados, 17 apresentaram vriasespcies de microalgas txicas (CARVALHO PINTO-SILVA,2005).

A presena dessas algas potencialmente txicas preocupa,em especial, pelas toxinas produzidas que, alm de seremhepatotxicas ou neurotxicas, podem apresentar genotoxicidade,

ou seja, podem causar dano celular em nvel de DNA, acelerando


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ou aumentando o aparecimento de mutaes que esto associadas

ao desenvolvimento de neoplasias. Ainda no estudo de CarvalhoPinto-Silva (2005) foi comprovado, em ensaios in vitro, que aexposio de clulas de adenocarcinoma de intestino grossohumano (Caco-2) a toxinas marinhas apresentou elevadacitotoxicidade e genotoxicidade. Isto indica que essas toxinasdiminuem a viabilidade celular, causam danos nas membranas,alteraes nos lisossomos, diminuio da atividade metablicadas mitocndrias e induzem apoptose (morte celular

programada). Parece evidente, portanto, que a monitorao desses

efeitos genotxicos das toxinas seja de interesse fundamental naToxicologia Ambiental para determinar quais os danos que estacontaminao pode causar em organismos vivos (KIMA; HYUN,2006; CARVALHO PINTO-SILVA, 2005).

Aponta-se como especialmente crtico o caso de floraesde cianobactrias txicas em corpos da gua utilizados paraconsumo humano ou para finalidades recreacionais, uma vez quetais eventos podem apresentar srios riscos de sade para a

populao humana. A gua segura, destinada ao consumohumano, um dos fatores mais crticos para garantir a sade emlongo prazo da populao. Dependendo das condies climticasem muitas regies e da carga de nutriente da agricultura, acomunidade fitoplanctnica presente em reservatrios, lagos erios dominada frequentemente por cianobactrias. Os sistemasde tratamento da gua no somente tm que reduzir o odor e a cordurante o processo do tratamento de gua; devem tambmeliminar estas clulas de cianobactrias e as toxinas produzidas

por elas (HOEGER et al.,2004).Um acontecimento que alertou a comunidade cientficabrasileira e a populao em geral foi um incidente de grandespropores, ocorrido em 1996, em uma clnica de hemodilise deCaruaru, Pernambuco, onde ocorreu intoxicao humana causada

por cianotoxinas que resultou na morte de 76 pacientesintoxicados com hepatotoxinas presentes na gua utilizada nahemodilise. As mortes ocorreram at cinco meses aps o inciodos sintomas. De acordo com informaes fornecidas pela

Secretaria de Sade de Estado de Pernambuco, a referida clnica


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recebia gua sem um tratamento completo e usualmente era feita

uma clorao no prprio caminho tanque utilizado paratransportar a gua, em perodos de falha no abastecimento pelarede pblica (JOCHIMSEN et al., 1998; CARMICHAEL et al.,2001).

Em ambientes aquticos, as cianotoxinas normalmentepermanecem contidas nas clulas das cianobactrias e soliberadas em quantidade considervel aps a lise celular, queocorre durante a morte natural, estresse celular, uso de algicidas,como sulfato de cobre ou clorao. Portanto, a ocorrncia de

espcies potencialmente produtoras dessas substncias em nossosambientes aquticos precisa ser muito bem investigada emonitorada, a fim de evitar danos sade animal, humana e do

prprio ecossistema. Nesse cenrio de risco potencial sade, asvariveis cianobactrias e cianotoxinas vm ganhando espao emnormas relacionadas sade e qualidade ambiental no mundotodo (DEBERT et al.,2006).

Com o intuito de minimizar o risco da contaminao deguas destinadas ao consumo humano, diversos pasesestabeleceram procedimentos para monitorar a presena decianotoxinas em guas tratadas, porm poucas referncias

propem valores limites para cianobactrias e cianotoxinas. AOrganizao Mundial da Sade (WHO), por meio do adendo dasegunda edio do Guidelines for drinking-water quality(WHO, 1998), concluiu que no havia dados suficientes que

possibilitassem a definio de valores de referncia para qualqueroutra cianotoxina, alm da microcistina-LR. A WHO (1998)

recomendou o valor limite mximo para microcistina-LR total(livre mais intracelular) de 1g/L, considerando a exposioatravs da gua de consumo humano. A terceira e mais recenteedio do Guidelines for drinking-water quality (WHO, 2003)

manteve o mesmo valor para microcistina-LR e no apresentouvalores para as demais cianotoxinas.

Atualmente, o Brasil o nico pas que estabelece limitespara densidade de cianobactrias e concentrao de cianotoxinasem norma nacional, com fora de lei (DEBERDT et al., 2006). O

Ministrio da Sade estabeleceu, por meio da Portaria n 518 de


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2004, como um dos padres de potabilidade para substncias que

apresentam riscos sade, a microcistina, sendo que o valormximo permitido (VMP) de 1g/L; recomenda, ainda, valoreslimites para cilindrospermopsina e saxitoxinas (15,0 g/L e 3,0g/L de equivalentes STX/L, respectivamente) em gua para

consumo humano. Sempre que o nmero de cianobactrias nagua do manancial, no ponto de captao, exceder a 20.000clulas/mL (2mm3/L de biovolume), ser exigida a anlise decianotoxinas ou a comprovao de toxicidade na gua bruta pormeio da realizao de bioensaios em camundongos. Assim, o

desenvolvimento dos mtodos para reduzir eficazmenteconcentraes dessas toxinas, mantendo-as abaixo dos nveisaceitveis, transformou-se num foco importante de esforosatuais da pesquisa.

Entretanto, o estabelecimento normativo de valores limitesda presena de cianotoxinas em gua potvel permite umquestionamento: at que ponto estes valores so confiveis? Oque esses valores podem causar a sade humana? A partir dosfatos relatados, e considerando a problemtica da florao dealgas txicas, to evidenciada nos ltimos tempos, cabe ao

presente estudo responder a trs hipteses que so as orientadorasdesta investigao cientfica, as quais sero apresentadas a seguir.

1.1HIPTESES DA PESQUISA

1.1.1 Primeira Hiptese

Baseando-se nas proposies tericas de que a saxitoxina(STX) potencialmente txica por pertencer a um grupo detoxinas neurotxicas paralisantes e por sua alta solubilidade emgua, havendo evidncias significativas da presena decianobactrias produtoras desta toxina em um manancial deabastecimento pblico, afirma-se que a STX pode causar efeitoscitotxicos e genotxicos aos indivduos expostos a esta toxina.


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1.1.2 Segunda HipteseBaseando-se no fato de a genotoxicidade ser um processo

que produz efeitos precoces de alterao do genoma; nos indciosde que cianotoxinas em concentraes muito baixas induzem a

processos genotxicos; e nos valores recomendados paraconcentraes de saxitoxinas pela Portaria n 518 do Ministrioda Sade (referente aos nveis aceitveis de presena decianotoxinas em guas potveis destinadas a consumo humano),

afirma-se que o valor recomendado na Portaria n 518 doMinistrio da Sade no seguro, pois valores abaixo do VMPcausam efeitos txicos em nvel celular.

1.1.3 Terceira Hiptese

Baseando-se no fato de a STX ser uma toxina altamentesolvel em gua, dificultando, assim, aos sistemas convencionaisde tratamento de gua sua remoo; e considerando a

possibilidade de utilizao de materiais naturais que tmdemonstrado eficincia de adsoro de diversos materiais deorigem natural, afirma-se que a concha de ostra e a quitina podemser empregadas como adsorventes para a remoo de STX desolues aquosas.

1.2JUSTIFICATIVA DA PESQUISA

A atividade antrpica tem levado a uma crescente

contaminao das lagoas costeiras brasileiras. Essa contaminaocausa mudanas na qualidade das guas, incluindo reduo dooxignio dissolvido, morte extensiva de peixes e aumento dasincidncias de floraes de algas txicas. A Lagoa do Peri,situada na rea do Parque da Lagoa do Peri, o manancialutilizado para abastecer o sul e a costa leste da Ilha deFlorianpolis - Santa Catarina. A grande problemtica da Lagoado Peri a quantidade de algas que dificulta o tratamento dagua. Essas algas causam desde obstruo de filtros at a

liberao de toxina presentes em algumas espcies. De acordo


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com estudos locais, a espcie Cylindrospermopsis raciborskii a

dominante absoluta da Lagoa, e vem preocupando a comunidadecientfica por estar entre as espcies de cianobactriaspotencialmente txicas. So capazes de produzir cianotoxinas quepodem ser acumuladas na rede trfica atingindo conjuntos deorganismos muito alm da comunidade aqutica: atingemtambm a populao local que consome esta gua. At omomento, poucos estudos tm investigado a contaminao destalagoa com toxinas e nenhum estudo ainda foi realizadoinvestigando a genotoxicidade das toxinas presentes na Lagoa do

Peri. Diante do exposto, e consciente da gravidade do problemaapresentado, este estudo pretende contribuir com a comunidadecientfica e local, realizando uma avaliao dos efeitos txicos daSTX, uma neurotoxina presente na Lagoa do Peri Florianpolis/SC, atravs de testes de citotoxicidade egenotoxicidade desta toxina. Pretende-se ainda verificar qual aconformidade de valores de concentrao de STX com alegislao vigente do Ministrio da Sade.

A crescente preocupao com a disponibilidade de guapotvel destinada para o abastecimento pblico vem despertandoum interesse geral para este assunto. A Declarao de DireitosHumanos de 1948 (ONU) prev, no artigo XXV, que: toda

pessoa tem direito a um nvel de vida suficiente para lheassegurar e sua famlia a sade e o bem-estar. Para assegurareste direito, imprescindvel que a gua destinada ao consumohumano atenda a condies mnimas, seja para ingesto, seja parafins higinicos. Para que a gua do manancial no oferea risco

sade pblica, deve-se impedir sua contaminao, evitando quereceba despejo de efluentes domsticos e rejeitos industriais.O Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental da

UFSC comeou a desenvolver a rea de toxicologia ambiental,com da criao da Disciplina de Toxicologia Ambiental (Portariano168/PREG/96), a partir de setembro de 1996, juntamente com amontagem e o desenvolvimento do Laboratrio de ToxicologiaAmbiental LABTOX. As atividades do LABTOX tiveramincio em fevereiro de 1997, com o objetivo de dar suporte ao

ensino, pesquisa e extenso. Esta estrutura vem sendo utilizada


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em estudos cientficos no mbito das floraes de algas txicas e

controle de poluio ambiental. As tcnicas desenvolvidaspossibilitam introduzir nos diagnsticos de qualidade ambiental,variveis sobre os efeitos txicos e genotxicos de elementosqumicos dispostos no meio ambiente.


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CAPTULO II

2 OBJETIVOS

2.1OBJETIVO GERAL

Estudar o mecanismo de ao txica da STX e avaliar sua

remoo da gua por adsoro em diferentes materiais deorigem natural.

2.2OBJETIVOS ESPECFICOS

Implementar uma metodologia analtica utilizando um sistemade Cromatografia Lquida de Alta Eficiencia (HPLC, doinglsHigh Performance Liquid Chromatography) e detector

de fluorescncia para quantificao de STX e outroscompostos de interesse. Avaliar a citotoxicidade (viabilidade celular) da STX

utilizando o ensaio do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2,5-difeniltetrazlio)).

Avaliar os efeitos txicos da STX em sistemas genticos,utilizando os mtodos da fragmentao do DNA e o ensaio dafrequncia de microncleo.

Avaliar os efeitos txicos da STX em sistemas epigenticos,

utilizando os mtodos da metilaco do DNA (dosagem dam5dC) e da lipoperoxidaco (dosagem do malondialdedo).

Comparar os resultados obtidos com as medidas estabelecidas proteo da sade humana pela Portaria n 518, de 2004,doMinistrio da Sade.

Verificar a capacidade de adsoro da STX a conchas deostras trituradas e quitina.


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CAPTULO III

3 REVISO BIBLIOGRFICA

Neste captulo foram feitas breves revises sobreeutrofizao natural e artificial, florao de algas e a sua

problemtica no local de estudo, a Lagoa do Peri, que ummanancial destinado ao abastecimento pblico, na Ilha de SantaCatarina. A seguir, foram abordadas, nesta reviso, ascianotoxinas, em especial as da STX,por ser o alvo deste estudo,

destacando uma breve reviso sobre a legislao brasileira queregulamenta sua presena em guas destinadas a consumohumano e metodologias para qualificar e quantificar tais toxinasem gua. Apresenta-se, ao final, uma reviso sobre alguns

bioensaios para monitoramento dos efeitos genotxicos que estastoxinas causam. Finalizando este captulo, inserem-se, ainda,algumas informaes sobre as propriedades qumicas dosadsorventes empregados neste estudo.

3.1EUTROFIZAO NATURAL E ARTIFICIAL

Os ecossistemas lacustres so paisagens temporrias quesurgem a partir de depresses do terreno, preenchidas de gua aolongo do tempo geolgico. Podem decorrer milhares de anos atque um lago apresente as condies ideais para a proliferao de

peixes e ostente plantas aquticas superiores, como as queflutuam na superfcie d'gua. O processo que resulta num

aumento de nutrientes essenciais para o fitoplncton e promove oaumento da produtividade deste ambiente chamado deeutrofizao natural. Essa ao acontece de forma natural, e suascondies passam de oligotrficas a eutrficas, num processo deenvelhecimento natural. Arbitrariamente, o homem aprendeu areproduzir o processo natural e, assim, surgiu a eutrofizaoartificial, tambm chamada de eutrofizao acelerada ouantrpica, da qual resultam impactos ao meio ambiente e sadehumana, cada vez mais presentes no cotidiano de populaes do

mundo todo.


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Dentre as aes antropognicas que contribuem para esses

impactos, a mais preocupante a descarga de fontes difusas epontuais de nitrognio e fsforo nos rios, lagos e represas. Issoocorre pelo escoamento, em guas fluviais e lacustres, de esgotosno tratados e de resduos de fertilizantes que produzem ofenmeno de eutrofizao artificial, cujos efeitos ecolgicos, nasade humana e nos custos do tratamento de gua, so relevantes.

A eutrofizao artificial se manifesta com a quebra doequilbrio ecolgico. Este processo, num breve relato de Carvalho(2004), causado pelo lanamento de efluentes domsticos e

industriais nos corpos d'gua, disponibilizando uma quantidademaior de matria orgnica que o sistema capaz de decompor.Estes agentes eutrofizantes (constitudos principalmente denitrognio, na forma de nitrato e amnia, e fsforo, na forma defosfato) esto diretamente relacionados com o processofotossinttico das algas, uma vez que pertencem estrutura demuitos compostos importantes para o metabolismo da clulavegetal.

3.2FLORAES DE ALGAS

A florao de algas consiste num crescimento algalexcessivo, o qual pode ser resultado de fenmenos naturaisregionais de ocorrncia sazonal, mas que, na maioria das vezes,est relacionado a processos de eutrofizao artificial causados

por excesso de nutrientes vindos de efluentes domsticos, rejeitosindustriais e fertilizantes da agricultura. Alm de alterar o

equilbrio ecolgico do ecossistema aqutico, a florao de algaspode causar gosto e odor desagradvel e modificao da cor dasguas. Matias (2002) afirma que esta induo ao stress desistemas ecolgicos por meio de importantes poluentes modificao habitat,introduzindo espcies exticas e removendo as espciesnativas. No entanto, o mais grave que certas espcies socapazes de produzir cianotoxinas que podem ser acumuladas narede trfica atingindo conjuntos de organismos muito alm dacomunidade aqutica.


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A intoxicao humana por cianotoxinas ocorre pelo

contato direto com a pele e mucosas, pela ingesto e pela inalaode gua contendo cianobactrias. As cianotoxinas so liberadaspara o ambiente quando as clulas destas cianobactrias serompem. Essas toxinas no podem ser removidas da gua pelostratamentos convencionais das redes pblicas de abastecimento eso resistentes fervura. Elas so compostas por diversas classesde biomolculas com funo e mecanismos de sntese ainda nototalmente conhecidos. Algumas delas tm efeitos antibiticoscontra bactrias ou outras algas. Embora existam mais de 5.000

espcies cianobactrias conhecidas, apenas um pequeno nmerodestas produz toxinas (HALLEGRAEFF et al., 1995).

A presena de floraes de cianobactrias em corpos deguas artificiais ou naturais tem sido relatada em todo o mundo(BAND-SCHMIDT et al.,2005; ROBERTSON et al.,2004). NoBrasil, muitos dados atualizados tm sido documentados,relatando casos de florao de algas. Como exemplos tm-secorpos de gua como a Lagoa de Jacarepagu, no Rio de Janeiro ea Lagoa dos Patos, no Rio Grande do Sul, onde pesquisadorestm confirmado a presena de toxinas em valores considerveis(TUCCI; SANTANNA, 2003, FERRO-FILHO et al., 2002;MAGALHES et al., 2001; ROSA et al., 2005;MATTHIENSEN et al.,1999).

Estudo de Caso: A Lagoa do Peri

Em Santa Catarina, a Lagoa do Peri, situada na rea doParque da Lagoa do Peri (regulamentada atravs da LeiMunicipal 1.828/81, pelo Decreto Municipal n 091/82 IPUF,1978), o manancial utilizado pela CASAN (CompanhiaCatarinense de guas e Saneamento) para abastecer o sul e acosta leste da Ilha de Santa Catarina, Florianpolis, no estado deSanta Catarina Brasil. A Figura 3.1 traz uma vista geral doParque da Lagoa do Peri, onde podem ser observados a Lagoa eos seus arredores. A forma de agrupamento humano se diferenciano interior do Parque, com comunidades voltadas para atividades

agrcolas, associadas fabricao da farinha de mandioca e dacachaa de cana, e com populao da restinga exercendo


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diversificada atividade ocupacional (GARCIA, 2002). Alem da

populao local, todas estas atividades em torno da lagoacontribuem para um aumento na quantidade de resduos gerados(Teive et al, 2008). Acredita-se que uma parte considervel desteresduo lanada de forma clandestina diretamente na lagoa,contribuindo para alteraes nas suas caractersticas trficas.

Figura 3.1: Vista panormica do Parque da Lagoa do Peri (Fonte:OLIVEIRA, 2002).

A grande problemtica da Lagoa do Peri a elevada

quantidade de algas, o que dificulta o tratamento da gua, poiscausa desde a obstruo de filtros at a liberao de toxinaspresentes em algumas espcies. Para Silveira (2003), osambientes de gua doce so os mais importantes para ocrescimento de cianobactrias, visto que a maioria das espciesapresenta um melhor crescimento em guas neutroalcalinas (pH6-9), temperatura entre 15 a 30C e alta concentrao denutrientes, principalmente nitrognio e fsforo.

Em estudos apresentados por NEMAR (Nucleo de Estudos

do Mar-UFSC) apud Garcia (2002), as espcies algais maispresente em amostras de rede na Lagoa do Peri, foram: Cyanophyceae: Aphanothece comasii, Cylindrospermopsis

raciborskii, Mycrocystis wesenbergii, Planktolyngbya

limnetica, Pseudanabaena galeata. Bacillariophyceae:Aulacoseira ambigua. Dinophyceae:Peridinium volzii, Peridiniales sp. Chlorophyceae: Coelastrum polychordum, Dictyosphaerium

ehrenbergianum, Monoraphidium irregulare.


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Zygnemaphyceae: Cosmarium bioculatum var. depressum,

Staurastrum muticum, Staurastrum sp, Staurastrumtetracerum, Staurodesmus cuspidatus.

No presente estudo taxonmico, destacou-se a espcieCylindrospermopsis raciborskii como a dominante absoluta,atingindo densidades mdias que corresponderam a 82% dadensidade total. Devido sua capacidade altamente invasora, aCylindrospermopsis raciborskii, dentre as espcies decianobactrias potencialmente txicas, tem sido objeto de estudo

de diversos pesquisadores e autoridades sanitrias.Cepas de cianobactrias da espcie Cylindrospermopsis

raciborski j foram isoladas, obtidas primeiramente emdinoflagelados marinhos. Sua alta competitividade em ambienteseutrofizados e sua capacidade de formar floraes e produzirtoxinas fazem desta espcie uma das cianobactrias maisestudadas tanto do ponto de vista ecolgico como de sade

pblica. (TUCCI; SANTANNA, 2003).

3.3CIANOTOXINAS

As toxinas produzidas pelas cianobactrias tm comofuno aumentar as defesas contra espcies zooplanctnicas, seus

predadores primrios. No caso de guas destinadas ao consumohumano, Amorim (1997) destaca que os tratamentosconvencionais por filtrao apenas evitam que as clulas cheguem rede de abastecimento, mas no evitam a libertao das toxinas

para a gua que ir ser consumida.A estabilidade das cianotoxinas uma caracterstica muitoimportante na tomada de decises sobre qualidade de guaquando ocorrem as floraes de cianobactrias. Ressom et al.(1994) descrevem que algumas neurotoxinas apresentammolculas relativamente lbeis que tendem a se decomporrapidamente sob condies naturais em subprodutos no-txicos,enquanto que as hepatotoxinas ciclicopeptdicas soextremamente estveis devido estrutura qumica que elas

possuem.47


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De acordo com Matias (1999), o consumo desta gua

contaminada e seus derivados podem acarretar muitos tipos depatologias: a sndrome da paralisia ou PSP (Paralytic ShellfishPoisoning), a sndrome neurotxica ou NSP (NeurotoxicShellfish Poisoning), a sndrome ciguatrica, a sndrome daamnsia ou ASP (Amnesic Shellfish Poisoning) e a sndrome dadiarreia ou DSP (Diarrheic Shellfish Poisoning). Contudo,registros de intoxicaes por toxinas so muito limitados, sendo

possvel que, em muitos casos, problemas provocados por estesorganismos sejam confundidos com outros tipos de doenas, tais

como gastrenterites, hepatites, herpes-zoster, acidentes vascularesenceflicos, etc.

3.3.1 Toxinas Paralytic Shellfish Poisons (PSP)

As toxinas PSP, sigla esta que pode se traduzida comoenvenenamento paralisante de molusco, uma sndrome

neurotxica resultante da ingesto de moluscos contaminados quese alimentam de cianobactrias toxicas. Essas toxinas agem no

sistema neuromuscular; seus efeitos predominantes soneurolgicos e consistem de formigamento/dormncia de face,

braos e pernas, queimao, torpor, sonolncia, fala incoerente,ausncia de coordenao muscular, sensao de flutuao e

paralisia respiratria. A morte pode ocorrer no perodo de 2 a 25horas aps a ingesto. As toxinas associadas a esta sndromeforam referenciadas como saxitoxinas (STXs), sendo este o nicoagente responsvel por esta contaminao. Os incidentes comtoxinas PSP tiveram aumento significativo a partir da dcada de1970, e at a atualidade tais contaminaes so registradas emregies do mundo, onde at ento eram desconhecidas, emborasejam espordicas e imprevisveis. Na atualidade, as toxinas PSPso consideradas um problema global que requer uma grandeconscincia pblica e profissional (DMELO, 2003).

As toxinas PSPs pertencem a um grupo de compostosaltamente polares e solveis em gua. Suas estruturas qumicasesto apresentadas na Figura 3.2 a seguir. A Cylindrospermopsis

raciborskii, espcie dominante absoluta na rea de estudo, quandopredominante em floraes, produz algumas toxinas


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potencialmente venenosas: a cilindrospermopsina, um alcaloide

com ao txica no fgado e rins e duas neurotoxinas paralisantes,a STX e a neo-saxitoxina, pertencentes classe PSP (SIVONEN;JONES, 1999).

Figura 3.2: Estruturas qumicas das toxinas paralisantes de molusco(PSP).

A STX pertence ao grupo dos alcalides neurotxicoscarbamatados, no-sulfatados. Apresenta peso molecular de

299,3g/mol, e seu pKa em gua de 8,24. solvel em gua emetanol e pouco solvel em etanol, e no solvel em acetona, terou clorofrmio. estvel em soluo cida quente a pH 2,4, e setorna cada vez mais lbil com o aumento do pH. resistente cristalizao, bastante higroscpica e se decompe sem fuso(RESSOM et al.,1994). A sua estrutura apresentada na Figura3.3 abaixo.

Figura 3.3:Estrutura da saxitoxina (STX).


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A STX foi identificada pela primeira vez em meio de gua

doce proveniente da Aphanizomenon flos-aquae. Alm daCylindrospermopsis, a STX tambm sintetizada por outrasespcies de cianobactrias, como Anabaena e Aphanizomenons,

por exemplo. A sua toxicidade extremamente elevada,apresentando DL50 de 5g/Kg de peso corpreo (ratos)(BOUACHA, 2001).

A STX tem uma ao rpida que inibe a conduo nervosa,bloqueando canais de sdio sem afetar permeabilidade a potssio.Das vrias toxinas causadoras de paralisia, apenas a STX tem

sido uma das neurotoxinas mais estudadas em detalhes quanto aosseus efeitos farmacolgicos, haja vista a dificuldade de se isolaras outras toxinas para maiores estudos (SILVEIRA, 2003). Aindaassim, pouco tem sido investigado sobre a presena das STXs nasguas da Lagoa do Peri (MELO FILHO, 2006; MONDARDO,2004).

So tambm muito escassas as informaes sobre osefeitos genotxicos (sobre o genoma) in vitro desta toxina.

Embora tenham sido realizadas intensas pesquisas sobre o tema,poucas referncias foram encontradas em bases de dadoscientficos, cruzando as palavras-chaves genotoxicidade in vitroe saxitoxina. Dados recentes de Falconer (2008), publicados noInternational Symposium on Cyanobacterial Harmful AlgalBlooms (ISOC-HAB), simpsio organizado pela Agncia deProteo Ambiental dos Estados Unidos (USEPA), relatam queainda no existem dados disponveis na literatura referentes sSTXs sobre seus efeitos de exposio subcrnica, efeitos na

reproduo, efeitos teratognicos ou carcinognicos.

3.3.2 Legislao Brasileira v.Cianotoxinas

A importncia da gua para a vida, sade, bem-estar edesenvolvimento humano inquestionvel, e, assim sendo, toda

pessoa deveria contar com o fornecimento suficiente, fisicamentee a custo acessvel, de uma gua salubre e de qualidade aceitvel

para as utilizaes pessoais e domsticas de cada um. Nesse

sentido, pode-se afirmar que o acesso gua potvel est


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intimamente relacionado com o direito vida, direito este

assegurado pela Declarao Universal de Direitos Humanos de1948 (ONU), artigo XXV, assim como no caput do art. 5 daConstituio da Repblica Federativa do Brasil, de 1988, quetrata dos direitos e garantias fundamentais, no captulo dosdireitos e deveres individuais e coletivos.

Conscientes das ameaas que pressionam nossos recursoshdricos, cada vez mais as cianobactrias e cianotoxinas vmrecebendo uma ateno especial dos rgos regulamentadores emtodo o mundo. Pases como Austrlia e Estados Unidos criaram

estratgias de controles para cianobactrias e cianotoxinas, mas,como citado anteriormente, o Brasil o nico pas na atualidadeque estabelece limites para densidade de cianobactrias econcentrao de cianotoxinas em norma nacional, com fora delei (DEBERDT et al., 2006).

A legislao brasileira recomenda como padro depotabilidade da gua para consumo humano, valor mximopermitido (VMP) para a microcistina de 1g/L, e recomenda queas anlises para cianotoxinas incluam a determinao decilindrospermopsina e STXs, observando, respectivamente, osvalores limites de 15,0g/L e 3,0g/L de equivalentes STX/L.

Recomenda, ainda, que sempre que o nmero de cianobactriasna gua do manancial, no ponto de captao, exceder a 20.000clulas/mL (2mm3/L de biovolume), deva ser exigida a anlise decianotoxinas ou comprovao da toxicidade na gua bruta pormeio de realizao de bioensaios em camundongos. Para anlisede cianobactrias e cianotoxinas e comprovao de toxicidade por

bioensaios em camundongos at o estabelecimento deespecificaes em normas nacionais ou internacionais quedisciplinem procedimentosdevem ser adotadas as metodologias

propostas pela Organizao Mundial da Sade (OMS) em suapublicao Toxic cyanobacteria in water: a guide to their publichealth consequences, monitoring and management (BRASIL,Ministrio da Sade, Portaria n 518 de 2004).


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3.3.3 Quantificao da Saxitoxina (STX)A deteco e a quantificao de toxinas de cianobactrias

podem ser realizadas por meio de mtodos biolgicos (emcamundongos MBA Mouse Bioassay), qumicos(Cromatografia Lquida de Alta Eficincia HPLC) e

bioqumicos (ensaios de inibio das fosfatases e imunoensaiosteste ELISA Enzime Linked Immunosorbent Assay). Dentreesses, o MBA o mtodo de referncia e o mais antigo,

empregado desde 1937 (BEN-GIGIREY et al.,2007). Contudo,por uma questo tica, muitas entidades esto empenhadas emreduzir ao mximo possvel o recurso a animais, incentivando

pesquisadores a desenvolverem outros mtodos alternativos experimentao animal.

O HPLC permite detectar e quantificar a presena detoxinas em amostras pr-purificadas com grande sensibilidade,com a vantagem de ser um mtodo qumico. Alm disso, muitosestudos tm feito comparaes, demonstrando a grande eficincia

do mtodo qumico com relao ao biolgico (LAWRENCE etal.,1995). No mtodo qumico, a deteco feitaespectofotometricamente, utilizando um comprimento de ondaque varia conforme a toxina de interesse presente na amostra.(LANAS, 2004; AMORIM, 1997).

As STXs em especial no so molculas naturalmentefluorescentes, mas, para que sejam analisadas por esta tcnica,

passam por um processo denominado derivatizao, pelo qual introduzida na STX outra molcula com propriedade fluorescente,

possibilitando assim sua deteco. Diversos estudos tmempregados esta tcnica na identificao de STXs. (OSHIMA etal.,2003; LAWRENCE et al.,1995). Ressalte-se, contudo, que astcnicas de HPLC subdividem-se em duas tcnicas que diferemna derivatizao da amostra para a deteco no detector defluorescncia: a derivatizao pr e ps-coluna (LANAS, 2004).

Atualmente, a metodologia que referenciada pelaAssociation of Official Analytical Chemists (AOAC) para anlise

de PSP a metodologia que emprega a derivatizao pr-coluna.Esta metodologia de anlise tem-se demonstrado de fcil


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reproduo alm de ser prtica e eficaz por se tratar de

procedimentos de uma reao muito simples, no necessitando deequipamentos muito sofisticados acoplados ao sistema decromatografia lquida. A reao de derivatizao com os

provveis produtos apresentada na Figura 3.4 a seguir.

Figura 3.4:Peroxidao da saxitoxina (STX).

3.4BIOENSAIOS PARA MONITORAMENTO DA CITOTOXICIDADEE GENOTOXICIDADE CELULAR

O termo citotoxicidade abrange processos de morte celularinduzida e o termo genotoxicidade abrange processos que alteram

a base gentica da vida, quer seja na estrutura fsico-qumica doDNA (cido desoxirribonucleico), processo este chamado demutagnese, quer seja na alterao do determinismo gentico emnvel celular ou orgnico, identificado respectivamente comocarcinognese e teratognese. A genotoxicidade estuda, sob oaspecto gentico, o que perturba a vida ou induz morte tanto nonvel da clula, como no de organismo (SILVA et al.,2003).

A monitorao de efeitos citotxicos e genotxicos detoxinas so de interesse fundamental na Toxicologia Ambiental

para determinar quais os danos que esta contaminao podecausar em organismos vivos. Os ensaios citotxicos egenotxicos so importantes ferramentas para avaliao dosdiferentes mecanismos de ao txica das toxinas, e estes testestm sido incorporados entre ensaios de rotina em laboratrios deexperimentao.

Diversos produtos qumicos produzem efeitos adversos naestabilidade do ecossistema, podendo causar leses do DNA,incluindo rupturas de hlice, bases modificadas e DNAcrosslinks, que a ligao de um agente exgeno ou endgeno


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que reage em duas posies diferentes do DNA, causando um

bloqueio no processo de replicao e consequente morte celular;o crosslink no pode ser reparado (KIMA; HYUN, 2006).Agncias de controle ambiental de diferentes pases vm

recomendando a utilizao de conjunto de testes para a avaliaode substncias quanto s suas caractersticas genotxicas comvistas a sua regulamentao para consumo ou liberao para oambiente. A principal preocupao dessas entidades tem sido adeteco de genotoxicidade em testes de curta durao, bemcomo o estudo preditivo desses testes. O mais recomendado a

combinao de testes dependendo das caractersticas do agentetxico, utilizando o estudo de diferentes tipos de danos. Osurgimento de bases de dados mais completas, que usam tcnicasde cultura de clulas, enriquece tanto a identificao dos agentestxicos como aqueles com potencial carcinognico (SILVA et al.,2003).

Dentre vrios ensaios utilizados para a deteco do danoem nvel citotxico e do DNA, podem ser destacados: o teste doMTT, o teste do microncleo, a metilao biolgica e alipoperoxidao.

3.4.1 Teste de citotoxicidade: Teste do MTT

O princpio deste ensaio consiste na absoro do salMTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2,5-difeniltetrazlio))

pelas clulas sendo reduzido no interior da mitocndria a umproduto chamado formazan. A succinato desidrogenase, umaenzima do ciclo de Krebs ativa em mitocndrias de clulasviveis, capaz de transformar o MTT, que de cor amarela, emcristais de formazan, que so de cor violeta. Somente as clulasviveis possuem esta capacidade, indicando atividademitocondrial e consequente viabilidade celular (WAN et al.,1994).

3.4.2 Teste de Microncleo

Microncleos so pequenos corpsculos compostos de

material cromossmico. Aps a diviso das cromtides no


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processo mittico, dois ncleos so reconstitudos, um em cada

polo. A membrana nuclear refletida ao redor desses doisconjuntos de cromossomos (SILVA et al., 2003). Entretanto, seum cromossomo inteiro ou um fragmento cromossmicoacntrico no se integrar ao novo ncleo (por no estar unido aofuso), ele constituir um microncleo.

Portanto, os microncleos so estruturalmente pequenosncleos que representam o material gentico que foi perdido peloncleo principal, como consequncia de um dano gentico que

pode ser causado por agentes fsicos, qumicos ou biolgicos,

capazes de interferir no processo de ligao do cromossomo sfibras do fuso, ou que possam induzir perda de materialgentico. O teste do microncleo detecta tais microncleosresultantes das rupturas cromossmicas durante a diviso celularou eventos de perda de cromossomos na anfase. Este testedetecta, portanto a mutagnese cromossmica em eucariotos dostipos clastognese (induzido a perda dos fragmentoscromossmicos), aneugnese (induzido a perda de um ou maiscromossomos do conjunto) e danos no fuso mittico. Para que omicroncleo seja visualizado, necessria uma diviso celularaps o evento mutagnico; por isso, necessrio utilizar clulasque estejam se multiplicando constantemente (in vivo, p.ex. amedula ssea), ou, ento, clulas de cultivo celular (in vitro).Assim, os microncleos podem ser identificados em qualquer tipode clula e, nos testes in vitro, os produtos a serem testadosdevem ser diludos preferencialmente em gua ou outro solventeno txico (SILVA et al.,2003; RIBEIRO et al.,2003).

3.4.3 Metilao Biolgica

A metilao biolgica consiste na transferncia de gruposmetil de S-adenosilmetionina (SAM, um cofator enzimtico

presente em todas as clulas eucariticas) para a posio 5 dacitosina, e catalisada por enzimas conhecidas como DNA-metilase (Figura 3.5). A metilao da citosina pode influenciar naexpresso gnica, sendo, portanto, um fator epigentico

(HAVLIS; TRBUSEK, 2002; GONZALGO, JONES, 1997).


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Este fenmeno epigentico pode ser definido como

mudana no material gentico (especialmente no DNA e nacromatina), que altera a regulao da expresso gnica de maneiraque esta passada para as clulas filhas dentro das clulassomticas, porm no caracterizada como mutao, pois noenvolve mudana na sequncia de DNA. Tem como principaismecanismos de represso transcricional a metilao do DNA e aacetilao das histonas. A modificao no padro de metilao doDNA a alterao epigenmica melhor estudada (HAVLIS;TRBUSEK, 2002; REIN et al., 1998; GONZALGO; JONES,

1997; EHRLICH et al.,1982).

Figura 3.5: Mecanismo de metilao do DNA. A 5metilcitosina produzida pela ao das DNA-metiltransferases (DNMT 1, 3a ou 3b)que catalisam a transferncia de um grupo meti da S-adenosilmetionina(SAM) para o carbono na posio 5 da citosina.

Ocorre quase que exclusivamente nas citosinas que so

seguidas imediatamente por uma guanina (dinucleotdeos CpG).A maior parte do genoma mostra uma clara depleo dessesdinucleotdeos, e os que esto presentes esto quase sempremetilados (GONZALGO; JONES, 1997).

A metilao de DNA o mecanismo que permite quedeterminados genes (e no outros) se manifestem dentro declulas normais especializadas, visto que todas as clulas docorpo trazem a mesma carga gentica. O que as diferencia amanifestao de um ou de outro gene durante o desenvolvimento


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e em toda a sua vida para desativar genes desnecessrios (SILVA

et al.,2003).

3.4.4 Fragmentao do DNA e Apoptose

Um padro morfolgico de leso celular, muitoconhecido como apoptose, atualmente aceito como um mododistinto e importante de morte celular. Destina-se a eliminarclulas do intoxicante ou hospedeiro por meio de uma sriecoordenada e programada internamente de eventos executados

por um conjunto exclusivo de produtos gnicos (COTRAN et al.,2000).A apoptose responsvel por numerosos eventos

fisiolgicos, adaptativos e patolgicos, incluindo a morte celularinduzida por estmulos nocivos que so capazes de caus-laquando fornecidos em baixas doses de calor, radiao, hipxia e

produtos qumicos (COTRAN et al.,2000).As clulas apoptticas exibem quebras tpicas do DNA

em fragmentos grandes de 50 a 300 quilobases (kb). Na

subsequencia, h a clivagem internucleossmica do DNA emoligonucleossomas em mltiplos de 180 a 200 pares de bases (pb)

por endonucleases dependentes de Ca2+e Mg2+. Estes fragmentospodem ser visualizados por eletroforese em gel de agarose comescalas de DNA. A Figura 3.6, a seguir, traz um exemplo defragmentao do DNA em gel de agarose (COTRAN et al.,2000).

Eletroforese em gel de agarose uma tcnica empregadapara a separao e visualizao de fragmentos de DNA e RNA,na qual os fragmentos migram em um gel de agarose durante aaplicao de uma diferena de potencial. Os fragmentos soseparados de acordo com o seu tamanho. Na visualizao dematerial gentico (DNA e RNA), emprega-se o gel de agarose porapresentar porosidade irregular, funcionando assim como umarede que separa o DNA, por diferena de tamanho, dosfragmentos menores que chegam mais rapidamente ao final dacorrida eletrofortica. O DNA apresenta-se com carga negativa e,

devido a esta caracterstica, pode-se conduzi-lo de um polo comcarga negativa para um polo com carga positiva. Porm, este


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material gentico tem de estar em contato com uma soluo salina

que permita a conduo eltrica atravs de ons (MARTINEZ;PAIVA, 2008). Para se obter as imagens das corridaseletroforticas, podem ser utilizadas substncias intercalantescomo o brometo de etdio ou o SYBR Green, que revelam oscidos nucleicos sob luz ultravioleta (ZIPER et al.,2004), comomostrado na Figura 3.6.

Figura 3.6: Fragmentao do DNA aps tratamento de clulas Caco2 aocido domico. 1: marcador DNA (Ladder); 2: controle; 3:15ng/mL;4: 30ng/mL; 5:60ng/mL; 6:100ng/mL (CARVALHO PINTO-SILVA,2005).

3.4.5 Lipoperoxidao Biolgica

A lipoperoxidao (LPO) caracteriza-se pelo processo emque os radicais atacam os cidos graxos poliinsaturados damembrana celular, provocando uma reao em cadeia comlipoperxidos como produtos intermedirios e modificaes das

propriedades da membrana, como permeabilidade e fluidez, almde causar dano a enzimas e receptores. Estes radicais podem serda espcie oxirreativa (contendo um ou mais oxignios reativosna sua estruturado ingls ROS:Reactive Oxigen Species) ou da

espcie nitrorreativa (contendo um ou mais nitrognios reativos


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na sua estrutura do ingls RNS: Reactive Nitrogen Species)

(NAIR, 2007). Este processo pode resultar desestabilizao edesintegrao da membrana celular levando o ser humano a sriosproblemas de sade, desde o envelhecimento precoce at asusceptibilidade ao cncer. As protenas podem sofrer alteraesna sua conformao e perda na sua funo. O DNA tambm podeser alvo de ataque de radicais livres.

O processo total da LPO consiste em trs estgios: ainiciao, a propagao e a terminao. Uma vez iniciado, a LPOforma radicais peroxil (ROO) que podem ser rearranjados atravs

de uma reao de ciclizao dos endoperxidos (precursores domalondialdedo), produzindo, como produto final do processo de

peroxidao, o malondialdedo (MDA) (Figura 3.7). O MDA um biomarcador natural produzido nesta reao e que pode serquantificado e usado para avaliao desse processo. O MDA mutagnico em bactrias e clulas de mamferos e carcinognicoem camundongos (VALKO et al., 2006; HALLIWELL;GUTTERIDGE, 1999).

Figura 3.7: Esquema simplificado da lipoperoxidao, com a formaodo malondialdedo e o aduto com a guanina, M1G.

Os antioxidantes so substncias que retardam ouprevinem a oxidao desse substrato em baixas concentraes emrelao ao substrato oxidvel. Desse modo, os antioxidantesatuam como protetores da oxidao de biomolculas por radicaislivres e impedem a propagao da reao em cadeia por eles


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provocada (HALLIWELL, 2007; DAMIANI, 2006). Tais defesas

antioxidantes so extremamente importantes na remoo direta deradicais livres, fornecendo assim proteo biolgica mxima. Umbom antioxidante deve extinguir especificamente radicais livres,inativando-os; deve oxirreduzir metais, interagir (regenerar) comoutros antioxidantes dentro da "rede antioxidante", ter um efeito

positivo na expresso do gene, ser absorvido prontamente, teruma concentrao nos tecidos e nos biofluidos em um nvelfisiologicamente relevante e trabalhar nos domnios aquosos e/oumembranares (VALKO et al., 2006; HALLIWELL;

GUTTERIDGE, 1999).No sistema biolgico, principais defesas enzimticas

antioxidantes so a superxido dismutase (SOD), catalase (CAT)e glutationa peroxidase (GPx). Essas enzimas servem como linha

primria de defesa na destruio dos radicais livres. Alm disso,antioxidantes no-enzimticos, como a glutationa reduzida(GSH), o tocoferol (vitamina E) e o cido ascrbico (vitamina C),dentre outros, auxiliam no combate s ROS e RNS. Osantioxidantes esto amplamente distribudos nos organismosvivos e constituem um sistema de defesa muito importante emcondies aerbicas (DAMIANI, 2006). Alguns antioxidantesagem em ambientes hidroflicos; outros em ambienteshidrofbicos, e alguns em ambos os ambientes da clula. Porexemplo, a vitamina C reage com o radical livre superxido nafase aquosa, enquando a vitamina E reage na fase lipoflica(HALLIWELL, 2007; VALKO et al.,2006).

A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimtica

contra a produo intracelular de radicais livre, catalisando adismutao do nion superxido. Est presente na matrizmitocondrial (Mn-SOD), no citosol (CuZn-SOD) e no meioextracelular. Embora o nion superxido no seja altamentedanoso, pode extrair eltrons de diversos componentes celulares,causando reaes em cadeia de radicais livres. O produtoresultante da reao catalisada pela SOD o perxido dehidrognio, que deve se retirado do meio o mais rapidamente

possvel (VALKO et al., 2006).


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A CAT uma enzima presente em clulas de plantas,

mamferos e bactrias aerbicas. Desempenha a funo deeficiente catalisador do perxido de hidrognio em gua eoxignio molecular. Est localizada, principalmente, no

peroxissoma; entretanto, outras organelas como as mitocndriaspodem conter alguma atividade da CAT. A catlise do perxidode hidrognio importante, pois, na presena de Fe+2, leva formao de radical hidroxil (reao de Fenton), altamentereativo e danoso s biomolculas (VALKO et al.,2006).

A vitamina C (cido ascrbico) um importante e

poderoso antioxidante que atua em ambientes hidroflicos docorpo. Seus parceiros antioxidantes preliminares so a vitamina Ee os carotenides, que trabalham juntos to bem quanto asenzimas antioxidantes. A vitamina C coopera com a vitamina E

para regenerar o -tocoferol dos radicais -tocoferis nasmembranas e nas lipoprotenas O cido ascrbico participa aindada regenerao da forma reduzida e antioxidante da vitamina E(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). O cido ascrbico puro

slido, branco, cristalino e muito solvel em gua. O cidoascrbico necessrio in vivo como cofator de vrias enzimas,sendo as mais conhecidas a prolina-hidroxilase e a lisina-hidroxilase, envolvidas na biossntese do colgeno. A deficinciado ascorbato na dieta humana causa o escorbuto. A maisimpressionante propriedade qumica do ascorbato a suahabilidade para agir como agente redutor (doador de eltrons)(VALKO et al.,2006).

A vitamina E (-tocoferol) o maior antioxidante

lipossolvel presente em todas as membranas celulares e,portanto, atua na proteo contra a lipoperoxidao. Oitotocoferis so conhecidos, porm o -tocoferol o maisimportante biologicamente, o que faz com que os termos -tocoferol e vitamina E sejam quase intercambiveis na literatura.Como mencionado anteriormente, o cido ascrbico conhecidocomo o maior antioxidante hidroflico, e evidncias recentessugerrem que o -tocoferol e o cido ascrbico funcionam juntosem um processo cclico (VALKO et al.,2006).


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3.5 PROPRIEDADES QUMICAS DOS ADSORVENTESEMPREGADOS NA ADSORO DA SAXITOXINA (STX)

O crescimento excessivo de cianobactrias emreservatrios de gua potvel um problema cada vez maiscomum associado com a eutrofizao. Por isso existem diferentesalternativas de tratamento numa estao de tratamento de gua(ETA) no que concerne remoo dessas cianobactrias ecianotoxinas (CHOW et al., 1999). Quando ocorre a lise das

clulas de cianobactrias, por causas naturais ou por uso dealgicidas, as cianotoxinas so liberadas, passando a haveressencialmente toxinas solveis (JONES; NEGRI, 1997; CHOWet al., 1999). Neste caso, preciso que existam processos detratamento que consigam assegurar a sua eficiente e consistenteremoo. So necessrios processos que removam compostosorgnicos solveis, tais como o uso de oznio, carvo ativado,nanofiltrao ou osmose inversa, biodegradao, dentre tantasoutras possibilidades de mtodos que vm sendo testados eotimizados (CHOW et al., 1999; SENS et al.,2005; AMORIM,2007). H evidncias de que a utilizao de elevadas dosagens decarvo ativado em p apresenta bom desempenho nesse sentido.Contudo, trata-se de um processo lento e de custo elevado devidos grandes quantidades de carvo que precisam ser empregadas(KEIJOLA et al., 1988; HIMBERG et al., 1989). Diferentesalternativas de remoo de cianotoxinas j vm sendo testadas(MILLER et al., 2001; MILLER et al., 2005; BURNS et al.,

2009); porm, dada a escassez de informao ainda existente, autilizao de filtros com materiais alternativos para a remoo deSTX ainda um assunto novo e no muito explorado (SILVA,2005).

Conchas de moluscos bilvalves, em especial as ostras, soconstitudas preferencialmente de aragonita, que umamodificao mineral do carbonato de clcio (KITANO et al.,1976). O carbonato de clcio (CaCO3), por sua vez, apresenta-seem trs modificaes minerais, sendo a calcita o mais comum e o

constituinte principal de vastas formaes de rochas sedimentares


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de calcrio. A ocorrncia de aragonita est vinculada a

determinadas circunstncias fsico-qumicas durante suaformao. O terceiro polimorfo, a vaterita, um mineral bemmais escasso (BESSLER; RODRIGUES, 2008). A aragonita temum arranjo atmico mais compacto do que a calcita e o mineralformador das conchas, prolas e corais. Estes carbonatos declcio biognicos so importantes contribuintes na remoo defosfatos de guas, sendo que a aragonita oferece maior superfcieativa, e maiores stios adsorventes ativos que a calcita. Acapacidade de adsoro da aragonita em torno de 20 vezes

maior que a da calcita; ndice baseado no n de moles de fosfatoadsorvido por grama de partcula (MILLERO et al., 2001). AFigura 3.8, a seguir. apresenta uma fotomicrografia pormicroscopia eletrnica de varredura (MEV) da aragonita

proveniente de concha de ostras.

Figura 3.8: Fotomicrografia da concha de ostra calcinada (Fonte:SILVA, 2007).

A quitina um polissacardeo de cadeia linear formado porunidades de N-acetil-2-dioxi-D-glicopiranose, que sointerligadas por ligaes glicosdicas (14) (KUMAR, 2000;

AZEVEDO et al., 2007). A quitina um material de fontes


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naturais renovveis, biodegradvel, no-txico, insolvel em gua

e em muitos solventes orgnicos (AZEVEDO et al., 2007;ANTONINO, 2007). As principais fontes para a obteno dequitina em laboratrio so os exoesqueletos de vrios crustceos,como caranguejos e camares (KUMAR, 2000; ANTONINO,2007). A quitina est fortemente associada com protenas,material inorgnico, pigmentos e lipdios (KUMAR, 2000).Vrias condies so usadas para remover essas impurezas eainda no existe um processo padro. Para isolar a quitina pode-se seguir as etapas de desproteinizao, desmineralizao e

despigmentao (AZEVEDO et al., 2007). O maior problemaencontrado na extrao da quitina seu modo de preparao, poisdificilmente se obtm uma quitina com as mesmas caractersticasda sintetizada anteriormente, como, por exemplo, a massa molar eo grau de acetilao. A Figura 3.9, a seguir, traz umafotomicrografia por MEV de uma amostra de quitina provenientede carapaa de camaro.

Figura 3.9: Fotomicrografia de amostras de quitina proveniente dacarapaa do camaro (1300X) (Fonte: ANTONINO, 2007).

As carapaas de crustceos e as conchas de moluscos so

resduos abundantes rejeitados pela indstria pesqueira que, em


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muitos casos, consideram-nas poluentes. Sua reutilizao reduz o

impacto ambiental causado por seu acmulo em locais onde sogeradas ou estocadas (GOOSEN, 1996; AZEVEDO et al.,2007).A reutilizao dessas substncias muito relevante do ponto devista ambiental e econmico, pois alm de eliminar os resduos daindstria pesqueira, o custo final da produo de derivados dessesmateriais reduzido em cerca de 60% (MATHUR; NARANG,1990). Na literatura cientfica esses materiais so comumenteavaliados em estudos de adsoro dos mais diversos metais

pesados de solues aquosas: Cu(), Zn(), Cr(VI), Cd(II),

Pb(II) (KITANO et al., 1976; SOLODOVNIK, 2006;ODOEMELAM et al.,2009).


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CAPTULO IV

4 METODOLOGIA

A metodologia empregada para o desenvolvimento doestudo foi baseada na descrio a seguir. Para todos os ensaios foiempregado um padro puro da STX, certificado peloInstitute for

Marine Biosciences(HALIFAX, NS, Canada).

4.1INSTALAES

Para iniciar os trabalhos da pesquisa, foi desenvolvida,no Laboratrio de Toxicologia Ambiental LABTOX , umametodologia de extrao, purificao e dosagem da SXT atravsda cromatografia lquida (HPLC).

Como parte de um acordo de cooperao internacional,atividades laboratoriais foram desenvolvidas no Laboratoire deToxicologie et Hygine Applique, Facult de Pharmacie,

Universit Bordeaux 2 Frana, sob a orientao do ProfessorEdmond Creppy. Esse laboratrio possui sala para cultura declulas com fluxo laminar, estufa de CO2, cromatgrafos lquidoe gasoso e aparelho de absoro atmica. As pesquisasdesenvolvidas no referido laboratrio foram na rea degenotoxicidade e citotoxicidade, como o ensaio do microncleo,ensaio do MTT, dosagem da MDA e dosagem de adutos de DNA.

4.2ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE E GENOTOXICIDADE

Os testes de genotoxicidade foram avaliados in vitro,avaliando o crescimento celular e utilizando o MDA como

biomarcador. Foram tambm avaliados a metilao biolgica e oensaio do microncleo em clulas cultivadas em laboratrio.

4.2.1. Cultura Celular

Por estar avaliando uma toxina neurotxica, foram

escolhidas duas linhagens celulares para os ensaios in vitro: o


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neuroblastoma de camundongo Neuro-2A (N2A) e as clulas

renais de macaco Vero. As clulas N2A foram obtidas daColeo de Cultura Celular Europeia catlogo no 89121404(Porton Down, UK) e foram cultivadas num meio de culturadenominado completo, que consiste em: meio RPMI 1640

complementado com 10% de soro de feto bovino, 2% de L-glutamina (200mM), 1% de penicilina (50U/mL) e estreptomicina(50g/mL) e 1% de piruvato de sdio (100M) a 37C eatmosfera com 5%CO2(adaptado de MANGER et al., 2003). AsClulas Vero foram cultivadas em meio RPMI 1640

complementado com 10% de soro de feto bovino, 1% de L-glutamina (1mM), 1% de penicilina (50U/mL) e 1% deestreptomicina (50ug/mL). A cultura foi mantida a 37C eatmosfera umidificada com 5% de CO2 (TERASIMA;YSUKAWA apudMATIAS; CREPPY, 1998).

4.2.2 Ensaio do MTT: Determinao da EC50

As clulas cultivadas foram incubadas em microplacas de

96 poos por 24 horas com o meio de cultura completo a 37C e5% de CO2 e aps esse perodo elas foram expostas por um

perodo de 24 horas a 37C e 5% de CO2 s seguintesconcentraes de STX: 0,19, 0,38, 0,75, 1,50, 3,00, 6,00, 12,0 e24,0 g/L (0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0, 32,0 e 64,0 nM). Foramrealizadas diluies em cascatas (Apndice A5) com solues-estoque preparadas em gua e solues mes preparadas com omeio de cultura para posterior diluio nos poos da microplaca

para garantir que o volume de soluo de STX utilizado noultrapassasse 0,5% do volume do meio de cultura. Asconcentraes foram avaliadas em triplicatas. Um grupo decontrole negativo empregando apenas o meio de cultura e umgrupo de controle positivo empregando as toxinas veratridina(0,05M) e ouabana (0,5M) ou metotrexato (200mM). Aps o

perodo de exposio, o meio foi retirado e foram adicionados200L de uma soluo de MTT 0,5mg/mL solubilizada no meioRPMI. A microplaca foi incubada por 2 horas a 37C e 5% de

CO2. Apos incubao, o meio foi removido cuidadosamente porinverso da microplaca e foram adicionados 200L de DMSO. A


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microplaca foi envolvida em papel alumnio e colocada numa

mesa de agitao por 20 minutos. Em seguida, foi feita a leiturada absorbncia em uma leitora automtica de microplacas nocomprimento de onda de 560nm. Os valores de absorbncia dasamostras foram normalizados e os valores foram expressos em

porcentagem de viabilidade celular atravs da Equao 1 abaixo.Pela curva Viabilidade Celular x Log da concentrao, foi

determinada a EC50 (concentrao efetiva que mata 50% dasclulas). A partir da EC50, foram definidas as concentraes paraos demais testes.

(Equao 1)

onde: %VC: viabilidade celular;DO max: absorbncia do controle negativo;DO min: absorbncia do controle positivo;DO amostra: absorbncia da amostra.

4.2.3 Fragmentao e Metilao do DNA

A metilao da citosina ocorre quando um grupamentometila adicionado no sulco da dupla hlice do DNA celular.Este estudo foi realizado em quatros etapas e foi baseado nasdescries a seguir (KOUADIO et al., 2007).1) Extrao, purificao e quantificao do DNA: O DNA foiextrado e purificado com o uso do kit Promega WizardGenomic DNA Purification Kit cdigo A112. Aps a incubaodas clulas N2A por 24 horas em microplacas de 6 poos, foirealizada a exposio na seguintes concentraes de STX: 0,15,0,30, 0,60 e 1,20g/L (0,38, 0,75, 1,50 e 3,00 nM). Foram feitasdiluies em cascatas (ver Apndice A7) com solues-estoque

preparadas em gua e solues mes preparadas com o meio decultura para posterior diluio nos poos da microplaca paragarantir que o volume de soluo de STX utilizado noultrapassasse 0,5% do volume do meio de cultura. Foramempregados grupos de controle; um negativo, utilizando apenas o

%VC100DO

amostra DO

min DO

max DO

min


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meio de cultura, e um positivo, utilizando as toxinas ocratoxina

(OTA 10M) ou fumonisina B1 (FB1 15 M). Foramavaliadas sempre triplicatas de cada caso (STX e controlespositivos e negativos). As microplacas foram incubadas por 24horas a 37C e 5% de CO2. Aps exposio, o meio de culturacontendo a STX foi retirado cuidadosamente e as clulas foramcolocadas em suspenso em 1mL de PSB com auxlio de umamicropipeta. A suspenso celular foi transferida para microtubose centrifugada por 30 segundos a 16.000g. O sobrenadante foidescartado e o DNA do precipitado foi extrado conforme

descrio do protocolo do kit, com uma modificao na etapa deprecipitao da protena que consistiu em adicionar 800L declorofrmio para facilitar a separao das fases. O DNA foidiludo em gua ultrapura 1/200, e quantificado porespectrometria de ultravioleta. As absores dos cidos nucleicosforam medidas nos comprimentos de onda de 260 e 280nm. Arazo A260/A280 precisa estar entre 1,8 e 2,0 como garantia deque o DNA esteja com alto grau de pureza. Aps a dosagem doDNA de cada amostra, um volume contendo 10g de DNA foidestinado para a quantificao da 5-metilcitosina.2) Separao dos Fragmentos de DNA por Eletroforese: Paraeletroforese foram utilizados 10g de DNA extrados das clulastratadas com as diferentes concentraes de STX, como citadoanteriormente. A avaliao qualitativa da fragmentao do DNAfoi realizada por eletroforese em 1,5% de gel de agarose evisualizada pela colorao com brometo de etdio. A eletroforesefoi realizada em uma cuba de eletroforese horizontal (H4 - Life

Technologies Gibco BRL). A placa de acrlico contendo o gelfoi colocada na cuba e coberta com 1L de tampo TBE (1M Tris-HCL pH 8,0, 0,1mM EDTA e 0,1M cido brico). Depois daaplicao das amostras, a cuba foi conectada a uma fonte (250EX Life Technologies - Gibco BRL) e ajustada para 60 volts

por 180 minutos. O material foi revelado em um transiluminadorde luz UV (TFX 35M - Vilber Lourmat) e fotografado com filme

polaroide (Sigma, Frana).3) Liofilizao e hidrlise enzimtica do DNA:Esta fase teve por

objetivo hidrolisar as protenas e separar o DNA do RNA. Para


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tanto, foram liofilizados 10g do DNA num microtubo de

centrfuga durante uma noite com o auxlio de um liofilizador-centrifugador RC 10-10 (Jouan, France), sob temperaturavarivel, adaptado em srie a uma bomba a vcuo (Edwards) e aum evaporador por resfriamento (RCT 60). O DNA foi reidratadoem 10L

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