I - Introduo O termo cromatografia atribudo ao botnico russo Mikhail Tswett, que, em 1906,

empregou este termo em dois de seus trabalhos, descrevendo suas experincias na separao dos componentes de algumas misturas. Num desses trabalhos, ele separou vrios pigmentos de planta, como a clorofila e a xantofila, passando solues destes compostos atravs de uma coluna de vidro recheada com carbonato de clcio finamente dividido. As espcies separadas apareceram como bandas coloridas na coluna, o que levou a escolha do nome para o mtodo (do grego, chroma = cor e graphein = escrever).

A cromatografia um mtodo que utiliza diversas tcnicas e tem como objetivo principal a

SEPARAO de substncias de uma mistura, com fins analticos ou preparativos. Os componentes da mistura so distribudos por duas fases imiscveis, uma estacionria (slida ou lquida) e outra mvel (gasosa ou lquida), que esto em contato. A separao resulta das diferentes velocidades com que os componentes so arrastados pela fase mvel de acordo com as diferentes interaes com a fase estacionria e, em alguns casos, com a fase mvel tambm.

A tabela abaixo mostra algumas combinaes de fases estacionrias e fases mveis:

Fase Mvel Fase Estacionria

Abreviatura Mecanismo de separao

Tipo de cromatografia

lquido slido C L S adsoro cromatografia lquida gs slido C G S adsoro cromatografia gasosa

lquido lquido C L L partio cromatografia lquida gs lquido C G L partio cromatografia gasosa

Cada uma dessas combinaes envolve diferentes mecanismos de separao. Por exemplo, na CLS acontece, em geral: adsoro na superfcie do slido e interao resultante da troca inica ou da formao de complexos. Na CGS tambm ocorre, de maneira geral, o fenmeno da adsoro. Na CLL ocorre a partio definida pela solubilidade relativa do soluto nos dois lquidos. Na CGL d-se a partio do soluto definida pela presso parcial de vapor do soluto na soluo. A fase estacionria, de forma geral, acondicionada nas chamadas colunas cromatogrficas, que na sua maioria so tubos de vidro ou metal de dimenses diversas. Quando essa fase um slido, basta que a coluna seja preenchida com o mesmo, de acordo com tcnicas especiais. Por outro lado, quando a fase estacionria um lquido, esse pode tanto revestir as paredes da coluna, no caso de colunas capilares, quanto estar aderido a um suporte slido com o qual se enche a coluna. A amostra introduzida na coluna e a fase mvel carreia os diversos componentes dessa amostra atravs da coluna e, dependendo do tipo de cromatografia, pode participar ou no da separao. Assim, a separao dos diversos componentes ser dada em funo de uma maior ou menor afinidade de cada um deles, por cada uma das fases. Logo, o componente com maior afinidade pela fase estacionria fica mais tempo retido na coluna, enquanto aquele que tiver mais afinidade pela fase mvel percorrer a coluna com mais rapidez (fig. 1). Outras caractersticas importantes na separao sero o tamanho da molcula, sua massa e, no caso da cromatografia em fase gasosa, sua presso de vapor (ou ponto de ebulio).

FIGURA 1 - Desenvolvimento da cromatografia: (a,b,c) - ilustrao esquemtica de uma separao utilizando cromatografia lquida; (d) - grfico representativo de fraes coletadas durante a eluio.

II As Classificaes da Cromatografia

Segundo o sistema fsico empregado

cromatografia em coluna - fase estacionria colocada dentro de um tubo cilndrico;

cromatografia planar - fase estacionria disposta sobre uma superfcie planar.

Segundo o estado fsico da fase mvel

cromatografia (em fase) gasosa a fase mvel um gs.

Cromatografia (em fase) lquida a fase mvel um lquido.

Segundo o mecanismo de separao (processos fsicos, qumicos ou mecnicos)

cromatografia por adsoro (lquido-slido, CLS) - a adsoro do soluto ocorre na interface entre a fase estacionria slida e a fase mvel, devido presena de grupos ativos na sua superfcie (figura 2-a);

cromatografia por partio (lquido-lquido, CLL) - quando a fase estacionria um lquido, espalhado na superfcie de um suporte slido inerte, ou nas paredes do tubo cromatogrfico. O processo baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria e na fase mvel (figura 2-b);

cromatografia por troca inica (CTI) - a fase estacionria constituda de uma matriz onde so adicionados grupos funcionais ionizveis. Assim so obtidos os trocadores aninicos que tm stios ativos carregados positivamente, retendo nions, e os trocadores catinicos que tm stios ativos carregados negativamente, retendo ctions. A fase mvel , geralmente, uma soluo inica com propriedades tamponantes e compatvel com o tipo de trocador utilizado. Dessa forma, se a fase estacionria retm ctions, a fase mvel deve conter ctions capazes de substitu-los preferencialmente (figura 2-c);

cromatografia por bioafinidade - a fase estacionria apresenta grupos com especificidade biolgica (antgeno, enzimas, etc.) quimicamente ligados a uma matriz. A eluio dos componentes retidos pode ocorrer com uma mudana nas propriedades da fase mvel,

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como fora inica e pH, ou por deslocamento, usando outro grupo fortemente atrado (figura 2-d);

cromatografia por excluso (permeao em gel ou peneira molecular) - baseia-se em processo puramente mecnico. A fase estacionria uma matriz de composio inerte, com partculas com forma, tamanho e porosidade uniformes. As diferentes molculas da amostra so separadas de acordo com sua capacidade de penetrar nos poros da matriz, conforme seu tamanho e sua forma; as menores ficam mais tempo retidas porque entram nos poros (figura 2-e).

FIGURA 2 - Esquema dos mecanismos cromatogrficos de a: adsoro; b: partio; c: troca inica; d: bioafinidade e e: excluso.

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III Cromatografia Planar Na cromatografia planar, a fase mvel, proveniente de um reservatrio, passa atravs do

ponto de partida da amostra ("spot") e arrasta seus componentes durante o processo de desenvolvimento. Define-se por dr a distncia percorrida pelos componentes e por dm a distncia percorrida pela fase mvel.

FIGURA 3 - Cromatograma tpico desenvolvido por cromatografia planar.

A anlise qualitativa de uma substncia realiza-se atravs de seu fator de reteno (Rf) que se determina utilizando-se a expresso:

Rf = dr / dm

O Rf uma constante fsica de uma determinada substncia desde que permaneam constantes as condies da anlise cromatogrfica.

Existem dois tipos de cromatografia planar:

Cromatografia em Papel - uma tcnica simples, que utiliza pequena quantidade de amostra, de fcil reproduo de Rf e aplica-se, principalmente, na separao e identificao de compostos polares. Classifica-se como cromatografia planar por partio lquido-lquido.

A gua, um lquido bastante polar, tem grande afinidade pelas hidroxilas da estrutura da celulose, formando pontes de hidrognio. Por isso fica retida, funcionando como fase estacionria. Os lquidos menos polares (solventes orgnicos) so repelidos por essa estrutura e funcionam como fase mvel (partio entre a gua e o solvente orgnico).

Normalmente, as substncias separadas so incolores, necessitando artifcios externos para serem observadas. So utilizados mtodos qumicos e fsicos para detectar as substncias separadas.

QUMICOS: soluo reveladora ou agente cromognico.

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FSICO: muitas substncias orgnicas absorvem radiaes de luz ultravioleta tornando-se fluorescentes.

Cromatografia em Camada Delgada - consiste na separao dos componentes de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana. uma tcnica de fcil execuo, que fornece separaes em breve espao de tempo, verstil, de boa reprodutibilidade e de baixo custo.

O processo de separao est fundamentado, principalmente, no fenmeno de adsoro. Entretanto, usando fases estacionrias tratadas, pode ocorrer tambm por partio ou troca inica, o que permite maior versatilidade.

Os adorventes mais usados so slica, alumina, celulose e poliamida.

Aps o desenvolvimento do cromatograma as placas so secas e reveladas. Assim como na cromatografia em papel, tambm podem ser utilizados agentes cromognicos ou luz UV, de acordo com a amostra analisada. Para compostos orgnicos muito utilizada a exposio da cromatoplaca a vapores de iodo em recipiente fechado, resultando em manchas marrons (iodo adsorvido por compostos orgnicos). A grande vantagem desse mtodo que o iodo, na maioria dos casos, pode ser eliminado posteriormente atravs de aquecimento brando.

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IV Cromatografia em Coluna

Para facilitar o entendimento dos parmetros aplicados cromatografia em coluna, usaremos como exemplo a cromatografia clssica em fase lquida. No entanto, os mesmos podem ser aplicados a qualquer tcnica cromatogrfica realizada em coluna.

Os mtodos lquido-slido (adsoro), lquido-lquido (partio), troca inica e excluso podem ser realizados numa coluna recheada. A cromatografia em coluna por adsoro , em geral, a primeira a ser realizada porque tecnicamente mais simples, no exigindo instrumentao esmerada. Dependendo do tamanho da coluna usada facilmente aplicada para fins preparativos, devendo ser monitorada, principalmente, por cromatografia em camada delgada.

FASE MVEL

AMOSTRA

FASE ESTACIONRIA

DIREO DO FLUXO DA FASE MVEL

COLUNA (METAL OU VIDRO) BANDAS

SEPARADAS

MATERIAL DE RETENO ELUIO DAS

BANDAS SEPARADAS

A

r e s p detector

tempo ou volume

FIGUcrom

Ordem de reteno: C>B>

RA 4 - Eluio de trs compostos em mistura por cromatografia em coluna e cromatograma tpico de atografia em coluna.

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A cromatografia clssica em coluna tem a desvantagem de produzir cauda (efeito de difuso, resultando num pico no simtrico) e, alm disso, no apresenta boa reprodutibilidade.

Na cromatografia lquida a escolha do eluente (fase mvel) um dos passos mais importantes, pois este no deve interagir com a fase estacionria e deve promover a separao dos componentes da amostra. Muitas vezes necessria a utilizao de misturas de solventes ou de diferentes solventes em seqncia.

No caso da cromatografia por adsoro, deve-se seguir uma srie gradual de eluentes, do menos polar para o mais polar, e as substncias eluiro da coluna segundo a sua polaridade. Se o eluente mais polar for utilizado primeiro, este ser capaz de eluir todas as substncias do interior da coluna.

Parmetros Cromatogrficos

Coeficiente de Partio

O equilbrio de distribuio que ocorre durante o processo cromatogrfico descrito por uma simples equao que envolve a transferncia do analito entre uma fase mvel e uma estacionria. Para o analito A, tem-se:

AFM AFE

A constante K para esse equilbrio chamada de coeficiente de partio e definida como:

K = [A]FM / [A]FE

Tempo de Reteno - tR

O tempo de reteno o tempo que cada soluto leva para percorrer a coluna e no qual o pico correspondente ao soluto vai aparecer. a soma do tempo gasto entre a fase estacionria e a fase mvel. Quanto mais forte a interao entre o soluto e a fase estacionria, maior ser seu tempo de reteno.

Tempo Morto (tempo de reteno para um composto no retido) tM

O tempo morto o tempo que um composto que no interage com a fase estacionria leva para percorrer a coluna, fazendo isto mesma velocidade que a fase mvel. Esse valor o mesmo para todos os compostos numa mesma corrida cromatogrfica.

Fator de Capacidade ou Fator de Reteno - k

um importante parmetro empregado para descrever as velocidades de migrao dos analitos nas colunas. a razo entre o tempo gasto pelo soluto na fase estacionria e na fase mvel, calculado pela equao:

k = (tR - tM) / tM = t'R / tM

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Quando k muito menor que 1, a eluio ocorre to rapidamente que pode no ser possvel a determinao do tempo de reteno. Quando k muito grande, o tempo de eluio ode ser muito longo. Um composto no retido apresenta k = 0.

Fator de Seletividade -

O fator de seletividade de uma coluna para duas espcies A e B definido como:

= kB / kA

Onde kB o fator de capacidade da espcie mais fortemente retida, B, e kA o fator de capacidade da espcie mais rapidamente eluda, A. Por definio sempre maior que 1. Quanto maior que 1, mais seletivo o sistema.

= k2 / k1

= tr2 t0 / tr1 t0

FIGURA 5 - Esquema para o clculo da seletividade de um sistema cromatogrfico para dois compostos.

Eficincia da Coluna

A eficincia de uma coluna cromatogrfica medida em termos de pratos tericos. Um prato terico pode ser considerado equivalente a uma etapa de equilbrio entre as duas fases, anlogo aos pratos tericos da teoria de destilao, e definido como:

N = L/H

onde N o numero de pratos, H a altura do prato e L a altura da coluna (geralmente em cm). Quanto maior o nmero de pratos e/ou quanto menor a altura do prato, mais etapas de equilbrio existiro, maior ser a eficincia e, portanto, melhor a separao. A eficincia de uma coluna est relacionada obteno de picos estreitos no menor tempo possvel.

A coluna cromatogrfica tratada como se fosse composta de numerosas estreitas camadas, dispostas de maneira contnua, chamadas pratos tericos. Em cada prato, o equilbrio das espcies entre as fases mvel e estacionria acontece. O movimento do analito atravs da coluna tratado como se ele fosse transferido da fase mvel de um prato terico para outro.

Avaliao experimental de N e H:

N = 16(tR/W)2

H = L / N

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onde W a largura da base do pico cromatogrfico correspondente. Para que esses nmeros tenham significado comparando-se duas colunas, essencial que eles sejam determinados para um mesmo composto.

Resoluo (Rs)

A resoluo de um sistema cromatogrfico uma medida da habilidade de separar dois analitos. Quanto maior a resoluo, menor ser a sobreposio entre dois picos. A resoluo leva em conta a posio (tR) e a largura dos picos (w).

FIGURA 6 - Esquema para o clculo da resoluo entre dois picos.

Rs = 2[(tR)2 - (tR)1] W1 + w2

A finalidade mais importante de qualquer separao cromatogrfica a de resolver os componentes da amostra. Portanto, deve-se considerar os parmetros experimentais que influenciam a resoluo. A figura 8 mostra trs cromatogramas, destacando as contribuies da eficincia e da seletividade na resoluo. Assim, m eficincia e m seletividade resultam em m resoluo (figura 7-a). Quando a seletividade boa, pode-se compensar a m eficincia (figura 7-b). O ideal boa resoluo conquistada com boa eficincia e boa seletividade, (figura 7-c).

FIGURA 7 - Cromatogramas ilustrando a relao entre resoluo, seletividade e eficincia.

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A resoluo de um sistema cromatogrfico pode ser considerada adequada para Rs 1,5. Para a otimizao da resoluo, algumas atitudes podem ser tomadas:

aumentar N aumento no tamanho da coluna aumenta tempo.

diminuir H diminuindo o tamanho das partculas que constituem a fase estacionria.

otimizao do fator de capacidade valores para relao tima entre resoluo e tempo gasto: k = 1 a 5.

otimizao do fator de seletividade pode ser otimizado por mudanas na composio da

fase mvel, incluindo pH e fora inica, temperatura da coluna, etc.

V - Exerccios 1) (Sec. de Estado de Sade - RJ 1995) Duas substncias X e Y foram submetidas cromatografia de partio em papel, usando-se tiras de 20cm de comprimento. O deslocamento do eluente foi de 16cm e os valores encontrados de Rf foram 0,5 e 0,3, respectivamente. Logo, as presenas de X e Y foram observadas a uma distncia do "spot" igual a:

(a) 2,5 e 1,5. (b) 5 e 3. (c) 8 e 4,8. (d) 10 e 6. (e) 16 e 9,6.

2) (Sec. de Estado de Sade - RJ 1995) As substncias A e B foram submetidas anlise cromatogrfica em camada fina e apresentaram valores de Rf iguais a 0,38 e 0,62, respectivamente. Com esse resultado, chega-se concluso de que:

(a) B menos retida que A. (b) A menos retida que B. (c) A e B tm igual polaridade. (d) A e B pertencem mesma funo

qumica. (e) A ficou no "spot" e B localizou-se no

"front". 3) (Prefeitura Municipal de Campos dos Goytacazes 1996) A anlise cromatogrfica em camada fina de uma soluo contendo as substncias A e B foi feita utilizando-se placa de 20cm. O eluente deslocou-se a uma

distncia de 18cm e as substncias A e B foram observadas distantes do "spot" a 4,5 e 5,4cm, respectivamente. O Rf medido para as referidas substncias apresentou como respectivos valores:

(a) 0,225 e 0,27. (b) 0,25 e 0,30. (c) 0,775 e 0,73. (d) 1,12 e 1,17. (e) 4,0 e 3,33.

4) (PETROBRAS) Utilizando-se uma anlise qualitativa por cromatografia em fase gasosa, de uma amostra de hidrocarbonetos, obteve-se o seguinte cromatograma:

0 2 4 6 8 10 12min

Em relao a essa anlise, podemos afirmar corretamente que: (a) o cromatograma revela a presena de

quatro componentes na amostra e o tempo de reteno dado pela altura de cada pico correspondente.

(b) os componentes presentes na amostra podem ser identificados com absoluta

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certeza, comparando-se seu tempo de reteno com os registros na literatura.

(c) os tempos de reteno dependem da temperatura e da reprodutibilidade das condies de anlise. Em conseqncia, no podem ser identificados com absoluta certeza os componentes da amostra somente com um cromatograma.

(d) o mtodo absoluto na comprovao da presena de determinada substncia, devido ao tempo de reteno e forma do pico.

(e) o mtodo no absoluto para a comprovao da ausncia de determinada substncia, porque os tempos de reteno e formas dos picos podem coincidir.

5) (Casa da Moeda do Brasil 1997) A caracterstica fundamental da cromatografia por permeao em gel a:

(a) distribuio das molculas do soluto entre duas fases lquidas imiscveis, de acordo com as solubilidades relativas.

(b) separao das substncias em virtude dos respectivos tamanhos e formas moleculares.

(c) partio de uma amostra entre uma fase gasosa mvel e uma delgada camada de lquido no voltil.

(d) partio de uma amostra entre uma fase gasosa mvel e um slido com grande rea superficial como fase estacionria.

(e) fase estacionria ser apolar e a fase mvel polar.

6) (Skoog - p.594) As substncias A e B apresentaram tempos de reteno de 16,40 e 17,56min, respectivamente, em uma coluna de 30,0cm de altura. Espcies no retidas saram da coluna em 1,30min. As larguras dos picos (na base) so 1,11 e 1,21min, respectivamente. Calcule:

(a) a resoluo da coluna; (b) a altura do prato, supondo o nmero

mdio de pratos da coluna igual a 3,0 x 103.

7)

A figura acima mostra dois mtodos

para melhorar a separao de uma mistura hipottica de dois componentes, onde em (a) temos o cromatograma original, com os picos sobrepostos. Com relao cromatografia e figura acima, julgue os itens abaixo (certo ou errado). (__) Em (b) as condies foram alteradas de modo que o primeiro componente migrasse mais lentamente e o segundo mais rapidamente atravs da coluna. (__) Em (b) houve melhora na separao em conseqncia de uma melhor seletividade. (__) Em (c) houve diminuio no espalhamento das bandas. (__) Somente em (b) os picos esto resolvidos. (__) Em (c) uma boa resoluo foi obtida com boa eficincia e boa seletividade. 8)

A figura acima mostra o efeito da

variao dos solventes sobre cromatogramas

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(__) No cromatograma (b) as condies foram otimizadas para separar os componentes 5 e 6.

obtidos para uma mesma amostra. Com relao cromatografia lquida e a figura acima, julgue os itens abaixo (certo ou errado). (__) Uma soluo para o problema de

separar os seis componentes em menos tempo seria utilizar as condies de (a) e, imediatamente aps a eluio dos componentes 1 e 2, utilizar as condies de (c).

(__) Para a maioria das situaes, as condies utilizadas na obteno do cromatograma (c) seriam as mais indicadas porque este apresenta resoluo adequada num breve tempo de anlise. (__) A resoluo em (c) foi melhor que em

(a). (__) Em (c) no podemos afirmar que os cincos componentes estejam resolvidos. (__) O componente 1 o mais retido na fase

estacionria. (__) Modificaes na composio da fase mvel podem promover melhor seletividade e, conseqentemente, melhorar a resoluo.

10) O tipo de cromatografia no qual o mecanismo de separao sempre o de partio :

(__) Para separaes envolvendo cidos ou bases ionizveis, alteraes no pH da fase mvel podem resultar numa separao mais eficiente.

(a) cromatografia em coluna. (b) cromatografia em papel. (c) cromatografia em camada fina. (__) Em cromatografia, quando se verifica

melhores resultados com a manipulao da polaridade da fase mvel, podemos afirmar que o mecanismo de separao em desenvolvimento o de troca inica.

(d) cromatografia lquida. (e) cromatografia gasosa.

11) Sobre a cromatografia por troca inica correto afirmar que:

9)

(a) a fase estacionria inerte. (b) ela muito utilizada na separao

dos componentes do petrleo. (c) os solutos retidos na fase estacionria

podem ser eludos por deslocamento, utilizando-se outros ons de carga oposta.

(d) a eluio dos componentes da mistura se faz com solventes de diferentes polaridades.

(e) a fase estacionria altamente carregada.

12) O conhecimento da distribuio de massas moleculares de um polmero a melhor maneira de predizer suas propriedades fsicas como fora, flexibilidade e rigidez. O tipo de cromatografia mais empregado para separao e determinao da massa molecular de polmeros :

A figura acima mostra cromatogramas hipotticos para uma mistura de seis componentes, ilustrando um problema geral de eluio em cromatografia. Com relao figura acima, julgue os itens abaixo (certo ou errado).

(a) cromatografia por excluso. (b) cromatografia por bioafinidade. (__) Nenhuma das condies utilizadas foi

capaz de separar os seis componentes. (c) cromatografia por adsoro. (d) cromatografia por partio. (e) cromatografia gasosa.

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VI - Bibliografia 1. Skoog, Douglas A., Principles of instrumental Analysis, 3a. ed., Philadelphia: Saunders

College Publishing, 1985. 2. Collins, Carol H., Braga, Gilberto L. e Bonato, Pierina S., Introduo a Mtodos

Cromatogrficos, 6a ed., Campinas: Editora da UNICAMP, 1995.

VII - Gabarito 1 C 2 A 3 B 4 C 5 B 6 (a)1,0

(b)0,01cm 7 E C C E C 8 C E C C E 9 E C C E E 10 B 11 E 12 A

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