Bioquímica I

Ano letivo 2013/2014

Ana Isabel Gonçalves; Cristiana Dias; Inês Santos Turma de sexta-feira das 8:00 às 11:00

AMOSTRAS PURAS COM PROPRIEDADES

TÉCNICAS DE SEPARAÇÃO E ANÁLISE

COM BASE NESSAS PROPRIEDADES

• CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA

•CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

CROMATOGRAFIA

Fase estacionária = Matriz

Fase Móvel (Solvente/Eluente)

+

Solução que contém as proteínas

Objetivo:

Recolher a fração apenas com o

analito desejado.

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA

Baseada nas propriedades hidrofóbicas dos componentes que se

pretendem separar.

Interação reversível entre as zonas hidrofóbicas da superfície da

proteína e o ligante hidrofóbico da matriz.

VANTAGENS:

-Separações rápidas;

-Baixa degradações do produto;

-Baixa exigência de solventes;

-Níveis de purificação muito bons.

CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA

CIH

Sal

Proteínas adsorvidas na presença de altas

concentrações de sal e eluídas com a redução dessas concentrações de sal.

pH

Ajustar o pH da proteína ao do seu ponto isoelétrico.

Temperatura

+ Energia Cinética + interações hidrofóbicas da proteína com superfície do

adsorvente.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Propriedades físicas

Interações biológicas específicas

Purificação absoluta

Ligação reversível entre:

-Proteína

-Enzima

-Imunoglobulina

-Recetor membranar

-Nucleótido

-Ácido nucleico

-Fragmento celular

-Célula

-Ligando

-Substrato

-Inibidor

competitivo

reversível

-Modificador

alostérico

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Matriz

Características essenciais:

Grupos químicos adequados e suficientes de modo a que o ligando esteja acoplado e fixo;

Estável durante a ligação da macromolécula de interesse e sua subsequente eluição;

Fraca interação com outras macromoléculas;

Boas propriedades de fluxo.

Exemplos: partículas uniformes, esféricas e rijas ( de celulose, vidro poroso, sílica…)

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Natureza química do ligando determinada pela especificidade biológica do composto a ser

purificado;

Braços espaçadores (seis a dez átomos de carbono ) entre a matriz e o ligando, se este for

demasiado pequeno, para evitar a perda de eficácia por parte deste.

Ligandos

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Eluição específica:

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Eluição específica e não-específica:

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

t

sal/pH