Estudo do equilíbrio sólido-líquido de sistemas contendo aminoácidos e proteínas

7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas

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LUS FERNANDO MERCIER FRANCO

ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMASCONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS

So Paulo

2012


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Dissertao apresentada Escola

Politcnica da Universidade de So

Paulo para obteno do ttulo de

Mestre em Engenharia

So Paulo

2012


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Dissertao apresentada Escola

Politcnica da Universidade de So

Paulo para obteno do ttulo de

Mestre em Engenharia

rea de Concentrao:

Engenharia Qumica

Orientador: Professor Livre-Docente

Pedro de Alcntara Pessa Filho

So Paulo2012


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Aos meus avs Zenaide e Antnio Srgio,

Marylande e Paulo Fernando (in memoriam);

a minha me, Priscila; ao papai,

Gilberto (in memoriam); e ao mano

Henrique dedico este trabalho.


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AGRADECIMENTOS

, alm de mandatrio que eu o faa, mandatrio pela minha conscincia mais do

que pelo mero preenchimento de algumas linhas, um imenso prazer agradecer a

quem de algum modo contribuiu comigo durante a execuo deste trabalho.

O primeiro a quem devo e desejo agradecer o meu orientador Professor Livre-

Docente Pedro de Alcntara Pessa Filho. ele a quem devo tudo o que sei sobre

Termodinmica, desde os bancos acadmicos do terceiro ano de engenharia quando

aprendi os primeiros conceitos de equilbrio de fases; poca em que ainda eu no

sabia que isso seria objeto de investigao do meu mestrado. com imensa

gratido que agora me dirijo a ele dizendo-lhe que sem sua pacincia e

generosssima disponibilidade nada do que este texto contm lograria tal xito que

agora surde a necessidade, mais do que o dever, de apresentar.

Tambm agradeo aos amigos e colegas do Grupo de Engenharia de Bioprocessos

(GEnBio), antigo Laboratrio de Engenharia Bioqumica (LEB), do Departamento de

Engenharia Qumica da Escola Politcnica da Universidade de So Paulo cujas

discusses incessantes, sobre os mais diversos contedos, esto dispersas aindaque de modo imperceptvel nas entrelinhas deste trabalho. Em particular, agradeo a

Kelly Cristina Nascimento Alves Cruvinel quem, alm de me haver fornecido alguns

dados experimentais que enriquecem a discusso dos modelos propostos neste

trabalho, sempre me apoiou desde os tempos em que eu era aluno de iniciao

cientfica.

Por fim, agradeo ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e

Tecnolgico (CNPq) e ao Departamento de Engenharia Qumica da EscolaPolitcnica da Universidade de So Paulo, pois me concedendo uma bolsa para

cursar meu mestrado permitiram que eu o fizesse dignamente.


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Deve-se escrever da mesma maneira como as lavadeiras l

de Alagoas fazem o seu ofcio. Elas comeam com uma

primeira lavada, molham a roupa na beira da lagoa ou do

riacho, torcem o pano, molham-no novamente, voltam a torcer.

Colocam o anil, ensaboam e torcem uma, duas vezes. Depoisenxguam, do mais uma molhada, agora jogando a gua com

a mo. Batem o pano na laje ou na pedra limpa, e do mais

uma torcida e mais outra, torcem at no pingar do pano uma

s gota. Somente depois de feito tudo isso que elas

dependuram a roupa lavada na corda do varal, para secar. Pois

quem se mete a escrever devia fazer a mesma coisa. A palavra

no foi feita para enfeitar, brilhar como ouro falso; a palavra foi

feita para dizer.

(Graciliano Ramos)


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RESUMO

A modelagem termodinmica do equilbrio slido-lquido de sistemas que contm

aminocidos e protenas tem sido cada vez mais necessria para o desenvolvimento

de equaes que permitam um projeto mais racional e eficiente das operaes

unitrias encontradas nos processos de purificao destas molculas, tais como a

precipitao e a cristalizao. Neste trabalho, apresentada uma relao unvoca

entre a solubilidade de protenas e o pH; sendo necessrios como parmetros

apenas informaes sobre a estrutura primria e os valores das constantes de

ionizao de cada resduo na cadeia protica, considerando os diferentes estados

de ionizao que a protena assume em soluo. Esta relao foi aplicada a

sistemas de insulina suna a trs diferentes temperaturas, a sistemas de insulinas

mutantes e a sistemas de b-lactoglobulina a diferentes concentraes de cloreto de

sdio, resultando em uma bem sucedida correlao dos dados experimentais de

solubilidade destes sistemas. Estudou-se tambm a no-idealidade de sistemas

contendo aminocidos, partindo de consideraes sobre diferentes estados de

ionizao da molcula assim como feito para protenas, mas adicionando um termo

de no-idealidade, neste caso, um termo advindo do modelo de Pitzer para solues

eletrolticas. Os sistemas, cujas curvas de solubilidade em funo do pH foram

estudadas, so: DL-Alanina, DL-Metionina, L-Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina,

tambm glicina e seus oligopeptdeos e molculas com grupos b-lactmicos tais

como a ampicilina, que um antibitico, e o cido 6-aminopenicilnico, que um

precursor na rota de produo da ampicilina. Uma interpretao atravs de

termodinmica estatstica para o parmetro de interao de Pitzer permitiu umaanlise mais profunda dos resultados. Relaes entre o segundo coeficiente virial

osmtico, a solubilidade de protenas e a concentrao de agente precipitante foram

desenvolvidas e aplicadas a sistemas de lisozima, ovalbumina e imunoglobulina

humana. Os resultados desta aplicao mostraram quo profcua a abordagem

empregada.

Palavras-chave: Termodinmica Qumica. Equilbrio Slido-Lquido. Protenas.Aminocidos.


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ABSTRACT

The thermodynamic modeling of solid-liquid equilibrium of systems containing amino

acids and proteins has become increasingly necessary for a more rational and

efficient design of unit operations found in the downstream processing of these

molecules, such as precipitation and crystallization. In this work, an unequivocal

relationship between the protein solubility and the pH is presented. The resulting

equation accounts for the different ionization states that protein molecules may

assume in solution, and is written as a function of the primary structure and values of

the ionization constant of each residue in the protein chain. The model was applied to

the solid-liquid equilibrium of porcine insulin solutions at three different temperatures,

solutions of mutant insulin molecules and solutions of b-lactoglobulin at different

sodium chloride concentrations. A very successful correlation of the experimental

solubility data was obtained in all cases. The solubility of amino acids and b-lactam

compounds was also studied through a similar approach, but in this case the non-

ideality of the solutions was accounted for by introducing Pitzers model for

electrolyte solutions. The compounds whose solubility curves as a function of the pH

were modeled include the amino acids DL-Alanine, DL-Methionine, L-Isoleucine, L-

Leucine, DL-Phenylalanine, Glycine and its oligopeptides, and b-lactam compounds

such as ampicillin, which is an antibiotic, and 6-aminopenicillanic acid, which is a

precursor in the ampicillin production route. The interpretation of the binary

interaction parameter values through a statistical thermodynamic approach allowed a

deeper analysis of the results. Finally, equations relating the osmotic second virial

coefficient, the protein solubility and the concentration of precipitant agents such assalts were developed. The resulting equations were successfully applied to solutions

containing lysozyme, ovalbumin and immunoglobulin, which shows that the

considered approach is promising.

Keywords: Chemical Thermodynamics. Solid-Liquid Equilibrium. Proteins. Amino

acids.


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LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 - Estrutura primria da insulina suna: seqncia de aminocidos e pontesde dissulfeto. Grupos ionizveis em negrito e distribuio de carga da configurao

neutra correspondente ao estado de ionizao preponderante.................................47

Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras de insulina em funo do

pH. Dados de pKA de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990). Linha contnua,

frao total. Linha pontilhada, frao preponderante.................................................47

Figura 3.3 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 278,2 K em 10,0 mM

NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto comvalores de pKAde Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com

valores de pKAde Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),

linha semi-contnua....................................................................................................48


NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com

valores de pKAde Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com

valores de pKAde Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),linha semi-contnua. ..................................................................................................49


NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com

valores de pKAde Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com

valores de pKAde Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),

linha semi-contnua....................................................................................................49

Figura 3.6 - Curva de solubilidade da insulina mutante B13-GluGln em funo do

pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e

Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................52

Figura 3.7 - Curva de solubilidade da insulina mutante B9-SerAsp em funo do



Figura 3.8 - Curva de solubilidade da insulina mutante B25-PheHis em funo do



Figura 3.9 - Solubilidade da b-lactoglobulina bovina em soluo aquosa contendo


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NaCl a 298,2 K. Dados experimentais (Grnwall, 1941): 0,001 mol L-1NaCl (); 0,005

mol L-1NaCl (); 0,01 mol L-1NaCl (); 0,02 mol L-1NaCl (). Modelagem: linha

contnua, 0,001 mol L-1; linha pontilhada, 0,005 mol L-1; linha semi-contnua, 0,01 mol

L-1; linha com travesses, 0,02 mol L-1.......................................................................56

Figura 4.1 - Valores de solubilidade da DL-Alanina a 298,15 K em soluo aquosa.

Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009); soluo com NaOH ou HCl (),

Pradhan e Vera (1998); soluo com KOH ou HNO3 (), Pradhan e Vera (1998).

Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .........................70

Figura 4.2 - Valores de solubilidade de DL-Metionina a 303,0 K em soluo aquosa

(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (), Fuchs et al. (2006).

Modelagem: soluo ideal, linha pontilhada; modelo proposto, linha contnua...... ...70Figura 4.3 - Valores de solubilidade da L-Isoleucina a 298,15 K em soluo aquosa

(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto

(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .....................................................71

Figura 4.4 - Valores de solubilidade da L-Leucina a 298,15 K em soluo aquosa

(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto

(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).......................................................71

Figura 4.5 - Valores de solubilidade da DL-Fenilalanina a 298,15 K em soluoaquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo

Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)........................................72

Figura 4.6 - Valores de solubilidade da L-Serina 298,15 K em soluo aquosa (com

HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha

contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).................................................................72

Figura 4.7 - Valores de solubilidade da tirosina 298,15 K em soluo aquosa. Dados

experimentais (o), Hitchcock (1924). Modelo considerando o grupo Rionizvel (linhacontnua). Modelo considerando o grupo Rno-ionizvel (linha pontilhada)............75

Figura 4.8 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em

funo do pH. Dados experimentais de glicina (), de diglicina () e de triglicina (),

Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de lda Tabela 4.4:

glicina, linha contnua; diglicina, linha semi-contnua; triglicina, linha pontilhada..... .77

Figura 4.9 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em

funo do pH. Dados experimentais de tetraglicina (), de pentaglicina () e de

hexaglicina (), Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l

da Tabela 4.4: tetraglicina, linha contnua; pentaglicina, linha semi-contnua;


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hexaglicina, linha pontilhada......................................................................................77

Figura 4.10 - Estrutura da ampicilina.........................................................................79

Figura 4.11 - Estrutura do cido 6-aminopenicilnico................................................79

Figura 4.12 - Valores de solubilidade da ampicilina 283,06 K em soluo aquosa

(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.

(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............80





(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............81




Figura 4.16 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 283,06 K em

soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),

Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linhapontilhada).................................................................................................................82



Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha

pontilhada).................................................................................................................83


soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha

pontilhada).................................................................................................................83



Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha

pontilhada).................................................................................................................84

Figura 4.20 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,15 K em soluo aquosa em

funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes mssicas de metanol: (o)

0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana; Mattedi e Giordano (2010).


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Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 % (linha com travesses), 30,0 %

(linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada)......................................................85


soluo aquosa em funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes

mssicas de metanol: (o) 0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana;

Mattedi e Giordano (2010). Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 %(linha

com travesses), 30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada).............86

Figura 5.1 - Solubilidade da lisozima da clara de ovo de galinha em funo da

molalidade de cloreto de sdio. Dados experimentais (), Watanabe (2007).

Equao de Cohn (linha contnua).............................................................................95

Figura 5.2 - Valores do segundo coeficiente virial osmtico em funo da molalidadede cloreto de sdio em pH = 4,5. Dados experimentais obtidos em Curtis et al.

(2002). Lisozima nativa, modelo (linha contnua), dados experimentais (). Lisozima

D101F, modelo (linha pontilhada), dados experimentais ()......................................96

Figura 5.3 - Valores da solubilidade da lisozima em funo do segundo coeficiente

virial osmtico. Dados experimentais obtidos em Guo et al. (1999). Lisozima a 25 C

e pH = 4,2 com variaes na concentrao de cloreto de sdio (). Lisozima a 18 C

e pH = 4,5 com variaes na concentrao de cloreto de amnio (). Lisozima a 23C e pH = 7,8 com variaes na concentrao de brometo de magnsio (). Modelo

de Haas; Drenth e Wilson (1999) com z= 3 eA= 0.001 (linha pontilhada). Modelo de

Guo et al. (1999) com Dm= 250 kJ mol-1(linha semi-contnua). Modelo de Ruppert;

Sandler e Lenhoff (2001), (linha com travesses). Equao (5 23) (linha contnua).

...................................................................................................................................97

Figura 5.4 - Solubilidade da ovalbumina em solues de sulfato de amnio. Dados

experimentais (), Judge; Johns e White (1996). Equao de Cohn (linha contnua)....................................................................................................................................98

Figura 5.5 - Segundo coeficiente virial osmtico da ovalbumina em solues de

sulfato de amnio a pH = 4,0. Dados experimentais (), Mehta; White e Litster

(2011). Equao (5 21) com Ks= 2,45 kg mol-1, (linha contnua)............................99

Figura 5.6 - Segundo coeficiente virial osmtico da imunoglobulina humana (IgG)

em solues de cloreto de sdio. Dados experimentais (), estes dados ainda no

foram publicados, mas foram cedidos por Kelly Cristina do Nascimento Alves

Cruvinel (comunicao pessoal). Equao (5 21), (linha contnua)......................100


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LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 - Anlise da funo qjk...............................................................................45

Tabela 3.2 - Valores de pKAdos grupos ionizveis da insulina humana....................46

Tabela 3.3 - Valores de CQ[Equao (3 40)] e CQG[Equao (3 41)] entre os

modelos aplicados e os dados experimentais de solubilidade de insulina suna a

diferentes temperaturas.............................................................................................51

Tabela 3.4 - Valores de pKAe de nmero de resduo que se ionizam como ctions

(n+) para insulinas mutantes. Dados de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990)..52

Tabela 3.5 - Valores de pKAdos grupos ionizveis da b-lactoglobulina bovina..........55

Tabela 4.1 - Quadro-resumo de trabalhos sobre a no-idealidade de solues de

aminocidos...............................................................................................................60

Tabela 4.2 - Valores do parmetro de interao le do CQ[Equao (3 40)] para

diversos conjuntos de dados experimentais de solubilidade de aminocidos em

funo do pH..............................................................................................................69

Tabela 4.3 - Valores de CQ[Equao (3 40)] em porcentagem para os diferentes

modelos aplicados aos conjuntos de dados de solubilidade de DL-Alanina, L-

Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina e L-Serina a 298,15 K. Dados experimentais

de Tseng et al. (2009). ..............................................................................................73

Tabela 4.4 - Valores do parmetro de interao le do CQ(Equao 3 - 40) para

diversos conjuntos de dados experimentais de solubilidade de glicina e seus

oligopeptdeos em funo do pH. Dados experimentais de Lu et al. (2006)..............76

Tabela 4.5 - Valores dos parmetros s, e e CQG para os sistemas contendo

ampicilina e cido 6-aminopenicilnico. Dados experimentais de Santana et al.

(2010).........................................................................................................................80

Tabela 5.1 - Comparao dos valores de CQdefinido pela Equao (3 40) para o

sistema contendo lisozima.........................................................................................97

Tabela A.1 - Valores de pKApara aminocidos, peptdeos e molculas com grupos b-

lactmicos estudados no captulo quatro.................................................................126


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LISTA DE SMBOLOS E SIGLAS

Letras latinas

a parmetro universal do Modelo de Pitzer

aH+ atividade do on H+

ai atividade do componente i

aP0 atividade da molcula de protena eletricamente neutra

A rea superficial do soluto

parmetro do modelo de Debye-Hckel

b parmetro universal do modelo de Pitzer

Bij segundo coeficiente virial osmtico para interao entre os componentes iej

B parmetro do modelo de Debye-Hckel

ck carga total de uma molcula de protena em um estado de ionizao k

c carga mdia das molculas de protena

C parmetro do modelo de Debye-Hckel

C1 parmetro ajustvel para clculo do segundo coeficiente virial do modelo de

Pitzer

C2 parmetro ajustvel para clculo do segundo coeficiente virial do modelo de

Pitzer

ds densidade do solvente

D parmetro do modelo de Kirkwood

e carga eltrica

fi fugacidade do componente i

fi0 fugacidade do componente ino estado de referncia

gk restrio de igualdade devido s leis de conservaogEX energia livre de Gibbs excedente

gij parmetro de energia caracterstico da interao entre os componentes iej

gij(.) funo de distribuio radial

Gij parmetro do modelo NRTL

I fora inica

kB constante de Boltzmann

Ks constante de salting-out

Kk constante do equilbrio de ionizao entre uma molcula de protena neutra e

uma molcula da mesma protena em um estado de ionizao k


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L(.) operador lagrangeano

m nmero de componentes no sistema

mi molalidade do componente i

mi0 molalidade do componente ino estado de referncia

m0 molalidade de molculas eletricamente neutras de protenas

msal molalidade do sal

M ction

nmero de conjuntos de dados experimentais

Ms massa molecular do solvente

n nmero total de resduos ionizveis de uma dada protena

nA nmero de resduos carregados negativamente

nB nmero de resduos negativos no carregados

nC nmero de resduos carregados positivamente

nD nmero de resduos positivos no carregados

n+ nmero de resduos positivos em uma dada protena

N quantidade de matria do sistema

nmero de dados experimentais

NA nmero de Avogadro

Ni quantidade de matria total do componente ino sistemaNi

(a) quantidade de matria do componente ina fase a

p presso

P0 protena eletricamente neutra

Pk+c protena em um estado de ionizao k com carga total +c

r coordenada radial

R constante real dos gases

S entropia

solubilidadeSA solubilidade de um dado aminocido

T temperatura

uij potencial intermolecular entre os componentes iej

U energia interna do sistema

U energia interna total do sistema

U(a) energia interna da fase a

V volume do sistema

V volume total do sistema

V(a) volume da fase a


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ws massa do solvente

Wij potencial da fora mdia entre os componentes iej

xi frao molar do componente i em fase condensada

X nion

yi frao molar do componente iem fase gasosa

zi carga eltrica do componente i

z+ carga eltrica do ction M

z- carga eltrica do nion X

Letras gregas

aj frao ionizada do resduoj

aij parmetro de no-aleatoriedade na mistura

a+1 frao de grupos amina ionizados em sistemas contendo aminocidos

a-1 frao de grupos cido carboxlico ionizados em sistemas contendo

aminocidos

b parmetro da equao de Cohn

g tenso superficial do solventeg0 tenso superficial da gua pura

gi coeficiente de atividade do componente i

gA0 coeficiente de atividade de um aminocido eletricamente neutro

g coeficiente de atividade inica mdio

e parmetro de interao atrativa de van der Waals

e0 permissividade do vcuo

er constante dieltrica

ejk carga do resduojem uma molcula de protena em um estado de ionizao

k

hj(.) funo auxiliar que depende apenas do resduoj

qjk(.) funo auxiliar que depende tanto do resduo j quanto do estado de

ionizao k

k inverso do comprimento de Debye

ke termo de correo no clculo da variao do potencial qumico devida

energia envolvida na formao de uma cavidade para alocar a molcula nasoluo


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lk multiplicador de Lagrange relativo restrio de igualdade gk

lij segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer para as interaes entre os

componentes iej

l-1 segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre as formas aninica e

zwitterinica de um dado aminocido

l+1 segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre as formas catinica e

zwitterinica de um dado aminocido

l0 segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre a forma zwitterinica e a

forma neutra no-zwitterinica de um dado aminocido

lzwitt segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre duas molculas

zwitterinicas de um dado aminocidoL coeficiente de salting-in

Lijk terceiro coeficiente virial do modelo de Pitzer para as interaes entre os

componentes i,je k

md momento de dipolo eltrico

mi potencial qumico do componente i

miL potencial qumico do componente ina fase lquida

miS potencial qumico do componente ina fase slida

mi0 potencial qumico do componente ino estado de referncia

Dm* potencial qumico de transferncia de uma molcula de protena do estado

de um gs hipottico para o interior de uma soluo

Dmcav variao do potencial qumico devida energia envolvida na formao de

uma cavidade para alocar a molcula na soluo

Dmelet contribuio eletrosttica variao do potencial qumico

DmvdW variao sofrida pelo potencial qumico devido as interaes atrativas de van

der Waals entre o solvente e o soluto.nj estado carregado do resduoj

n+ coeficiente estequiomtrico do ction M

n- coeficiente estequiomtrico do nion X

p nmero de fases no sistema

P presso osmtica

ri concentrao do componente i

s raio de van der Waals mdioincremento molal da tenso superficial


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tij parmetro do modelo NRTL

fA0 frao de molculas de aminocido eletricamente neutras

fk frao de molculas de protena em um estado de ionizao k

coeficiente de fugacidade osmtico

fzwitt frao de molculas de aminocido na forma zwitterinica

f0 frao de molculas de protenas eletricamente neutras

frao de molculas de aminocido eletricamente neutras na forma no-

zwitterinica

f-1 frao de molculas de aminocido na forma aninica

f+1 frao de molculas de aminocido na forma catinica

y nmero de estados de ionizao possveisyj potencial eltrico do componentej

W razo entre o coeficiente de salting-out e o incremento molal da tenso

superficial

Siglas

CQ critrio quantitativo

CQG critrio quantitativo global

NRTL do ingls: Non-Random Two Liquids

pH co-logaritmo decimal da atividade do on H+

pI ponto isoeltrico

pKA co-logaritmo decimal da constante de equilbrio de ionizao


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SUMRIO

1 Introduo...............................................................................................................222 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases........................25

2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica................................25

2.2 A equao de Gibbs-Duhem.............................................................................26

2.3 Os critrios de equilbrio de fases....................................................................27

2.4 Fugacidade, atividade e convenes...............................................................29

2.5 Modelos termodinmicos de energia livre de Gibbs excedente.......................31

2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas.......................................32

3 Efeito do pH na solubilidade de protenas..............................................................353.1 Introduo.........................................................................................................35

3.2 Desenvolvimento terico..................................................................................36

3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra...................................39

3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall...................................41

3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens....................................................44

3.3 Resultados e Discusses.................................................................................45

3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura.....................45

3.3.2 Solubilidade da b-lactoglobulina em funo do pH e da fora inica.........54

4 No-idealidade de solues de aminocidos e compostos b-lactmicos...............57

4.1 Introduo.........................................................................................................57


4.2.1 Clculo das fraes eletricamente neutras e carregadas ..........................61

4.2.2 Modelo de Pitzer ........................................................................................63

4.2.3 Uma abordagem por termodinmica estatstica da no-idealidade...........66


4.3.1 Solubilidade de aminocidos em funo do pH.........................................69

4.3.2 Solubilidade da glicina e de seus oligopeptdeos em funo do pH...........76

4.3.3 Solubilidade de compostos b-lactmicos em funo do pH, da temperaturae do solvente.......................................................................................................78

5 Segundo coeficiente virial osmtico de protenas e suas relaes.........................87

5.1 Introduo.........................................................................................................87


5.2.1 Potencial qumico de referncia.................................................................90

5.2.2 Equao de Cohn.......................................................................................92

5.2.3 Modelo proposto.........................................................................................93


21/126


5.3.1 Resultados para a lisozima........................................................................94

5.3.2 Resultados para a ovalbumina...................................................................98

5.3.3 Resultados para a imunoglobulina humana.............................................1006 Concluses...........................................................................................................101

7 Referncias bibliogrficas.....................................................................................104

Apndice A Integrao do perfil de carga em funo do pH.................................110

Apndice B Cdigo-fonte do programa de clculo de solubilidade de protenas. .112

Apndice C Expresso para o coeficiente de atividade de um soluto no ensemblede McMillan-Mayer...................................................................................................117

Apndice D Cdigo-fonte do programa de ajuste de parmetros para o clculo dasolubilidade de aminocidos e compostos b-lactmicos..........................................121

Anexo A Valores de pKAusados nos clculos do quarto captulo.........................126


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22

1 Introduo

et si in tanta scriptorum turba mea fama in obscuro sit,

nobilitate ac magnitudine eorum me qui nomini officient

meo consoler

(Titus Livius, inHistria de Roma)

Apesar de muitos acreditarem ser a Termodinmica uma rea concluda do universo

cientfico, prova-se constantemente que, justamente por estar a Termodinmicaconsolidada do ponto de vista formal da lgica matemtica e da interpretao fsica,

ela pode contribuir de modo nico para a descrio de fenmenos descritos apenas

recentemente. A revoluo biotecnolgica, que marca desde a segunda metade do

sculo XX at os dias correntes tanto os processos industriais quanto a pesquisa

acadmica, traz consigo desafios importantes para uma maior compreenso dos

sistemas ditos biolgicos, ou seja, sistemas que tm como alguns de seus

componentes molculas de algum modo originadas de seres vivos.A importncia mais bvia da Termodinmica reside no fato de ela poder fornecer

uma imensa gama de informaes sobre o sistema com a necessidade de poucos

parmetros. Este fato tanto mais relevante quanto mais complexo for o sistema

estudado. Na verdade, a Termodinmica em sua forma mais primitiva prescinde

inclusive da hiptese atmica, o que a garante tal generalidade que ainda em uma

natureza na qual no houvesse tomos suas leis seriam vlidas e poderiam ser

aplicadas irrestritamente. Quanto a isso, notam-se na introduo de seu livro sobre

Termodinmica Estatstica as observaes de Terrell L. Hill:

[...] Although thermodynamics itself does not provide a molecular picture of

nature, this is not always a disadvantage. Thus there are many complicated

systems for which a molecular theory is not possible; but regardless of

complications on the molecular level, thermodynamics can still be applied to

such systems with confidence and exactness.[]

(HILL, 1986, p. 1)

A reside a explicao para a comunho entre a Termodinmica e todas as outras

cincias da natureza, sem considerar os aspectos filosficos muitas vezes


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apropriados das leis da Termodinmica.

No h mais espao (se que antes houve algum) para a pesquisa cientfica que se

limite a uma nica rea do conhecimento. Dessarte, os profissionais de

Termodinmica tm na medida do possvel servido a comunidade cientfica como um

todo, com interpretaes, modelos e mesmo dados experimentais de propriedades

que auxiliam as pesquisas dedicadas s mais diversas reas.

No caso de sistemas que contm protenas, h uma grande e crescente demanda

por conhecimento devido s inmeras aplicaes, seja no setor farmacutico, seja

na indstria alimentcia. Aqui, estudar-se-o alguns destes sistemas. A abordagem

pretendida corresponde explorao dos limites da termodinmica clssica na

descrio destes sistemas.Molculas de protena apresentam, entre outras, uma caracterstica que torna a sua

modelagem termodinmica um pouco mais complicada: a presena de ons na

cadeia. Pode-se dizer que a teoria de solues eletrolticas nasce, ou pelo menos,

ganha notoriedade com o trabalho de Petrus Debye e Erich Hckel, que no incio da

dcada de 1920, propuseram um mtodo de clculo da no-idealidade devida

presena de eletrlitos em soluo atravs da soluo linearizada e unidirecional da

equao de Poisson-Boltzmann. Mesmo assim, as solues contendo eletrlitosainda hoje so alvo de intensa pesquisa. At porque a prpria teoria de lquidos

ainda um captulo no qual h hoje muito esforo empregado. Quando se pensa em

protenas, que na verdade so polieletrlitos muito menos simples que polieletrlitos

de polmeros sintticos, a modelagem se apresenta repleta de simplificaes, sejam

de ordem geomtrica (tal como considerar a protena uma esfera), sejam de ordem

de distribuio de cargas, dotando a protena de uma carga lquida sem considerar

os diferentes estados de ionizao.As principais intenes aqui pretendidas esto centradas em uma busca por uma

descrio termodinmica mais fiel na sua representao dos fenmenos estudados.

O segundo captulo ser dedicado a uma brevssima reviso dos conceitos

fundamentais de termodinmica de equilbrio de fases de modo a facilitar ao leitor,

desacostumado nomenclatura termodinmica, a compresso dos captulos

seguintes. Diferentemente do segundo captulo, os que o seguiro, com

pouqussimas excees que sero postas em relevo a medida que aparecerem,

integram os desenvolvimentos tericos inditos aqui propostos.

No terceiro captulo ser apresentado o desenvolvimento de uma relao terica


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24

para a predio da curva de solubilidade de protenas em funo do pH

considerando que a fase slida nica e s contm molculas eletricamente neutras

de protenas pelo princpio de eletroneutralidade da fase em equilbrio

termodinmico. Resultados para a insulina suna a diferentes temperaturas, algumas

insulinas mutantes e para a b-lactoglobulina a diferentes valores de fora inica

sero apresentados e discutidos tambm neste captulo. Tanto a modelagem quanto

os principais resultados deste captulo foram publicados em um artigo recente

(FRANCO; PESSA FILHO, 2011).

No quarto captulo, a equao deduzida no captulo terceiro ser modificada de

modo a ser aplicada a sistemas contendo aminocidos e molculas com grupos b-

lactmicos incluindo para tanto um termo de no-idealidade calculado pelo modelo

de Pitzer para solues eletrolticas. Ao parmetro de interao introduzido pelo

modelo de Pitzer ser dada uma interpretao a partir da termodinmica estatstica

que permitir uma discusso mais robusta do ponto de vista cientfico.

No quinto captulo sero deduzidas relaes entre o segundo coeficiente virial, a

concentrao de agente precipitante (tipicamente sais) e a solubilidade de protenas.

Sero estudados sistemas com lisozima, ovalbumina e imunoglobulina G humana.

Outros modelos publicados na literatura sero comparados ao modelo proposto.O sexto e derradeiro captulo ser dedicado exclusivamente a exposio das

concluses deste trabalho e a sugesto de trabalho futuros.

Todas estas contribuies visam a aprofundar e a discutir a fsico-qumica envolvida

em sistemas que contm aminocidos ou protenas do ponto de vista clssico da

termodinmica de equilbrio de fases. As relaes aqui desenvolvidas so de

utilidade no apenas da discusso cientfica, mas claramente da aplicao

tecnolgica.Acaba-se, por fim, este introito com uma esperana sutil lanada pelo famoso

historiador romano, Tito Lvio, e aqui registrada sob a forma de epgrafe: a que os

trabalhos que a esse sucedam o superem, e este ser o consolo deste que o

escreve.


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2 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases

,

(Pilatos, inEvangelho de So Joo)

O objetivo de despender algumas pginas com aspectos introdutrios aos

problemas de equilbrio de fases facilitar ao leitor desta dissertao alguns

conceitos sem os quais a compreenso do trabalho que se segue se tornariaextremamente rdua e laboriosa. No h, todavia, algum intento aqui seno o de

expor exclusivamente o formalismo termodinmico necessrio s dedues que se

seguiro. Reitera-se que nada do que neste captulo est apresentado novo, nem

to pouco fruto da pesquisa a qual esta dissertao justifica sua existncia, todavia,

estas linhas que custaram mais de cem anos de pesquisa em termodinmica so

indispensveis ao entendimento das discusses que se seguiro.

A epgrafe, ainda que de alguma forma jocosa (em uma traduo livre: o queescrevi, escrevi), pretende ilustrar a robustez da termodinmica quanto um ramo da

cincia consistente e inviolvel.

2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica

Dado um sistema simples com mcomponentes, a equao fundamental descreve

completamente todos os estados de equilbrio. Em sua representao entrpica, a

equao fundamental dada explicitando a entropia, S, do sistema como funo da

energia interna, U, do volume, V, e da quantidade de matria, N, de cada

componente (MODELL; REID, 1983):

S=S(U , V , N 1 ,...,Nm) (2 - 1)

A equao fundamental representa, assim, uma hipersuperfcie em um espao dem+3dimenses cujos pontos representam estados de equilbrio do dado sistema.


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Sendo uma diferencial exata, a equao fundamental pode ser associada s duas

primeiras leis da termodinmica de modo que a variao infinitesimal de entropia do

sistema seja dada por:

dS(U , V , N 1 ,...,Nm)=1T

dU+p

TdV

i =1

m i

TdNi (2 - 2)

Em que T a temperatura termodinmica:

1T

=( SU)V ,N (2 3)p a presso do sistema:

p=T( SV)U ,N (2 4)

E, mi o potencial qumico da espcie i:

i=T ( SN i )U , V , Nj ,ij (2 5)

2.2 A equao de Gibbs-Duhem

A equao fundamental expressa em sua forma entrpica pela Equao (2 1) pode

tambm ser, e assim comumente , escrita em sua representao energtica:

U=U (S , V , N1 , ..., Nm) (2 6)

Com sua diferencial exata dada por:

dU (S , V , N1 , ...,Nm)=T dSp dV +i=1

m

i dN i (2 7)

Sendo a transformada de Legendre total de uma dada funo

f( x ):n / x =[ x1 , ... , x n] , tem-se que:

T (f( x ))=f(x)k=1

n

( f( x )x k)x k (2 8)E, aplicando-se essa transformada de Legendre total na funo definida na Equao

(2 6), tem-se que:


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27

T (U (S , V , N1 , ..., Nm))=U (S , V , N1 , ..., Nm)TS+ pVi =1

m

i N i (2 9)

Tomando a diferencial da Equao (2 9):

d T(U (S , V , N1 , ... ,Nm))=...

...dU (S , V , N1 ,...,Nm)TdSSdT + pdV + Vdpi=1

m

i dN ii =1

m

N idi (2 10)

A equao de Gibbs-Duhem simplesmente dada pela condio de que a variao

infinitesimal da transformada de Legendre total da equao fundamental nula,

logo, observando-se a substituio da Equao (2 7) na Equao (2 10), tem-se:

SdTVdp+i=1

m

N i di =0 (2 11)

Essa Equao (2 11) serve como uma restrio a ser respeitada por qualquer

modelagem termodinmica que se pretenda em equilbrio de fases. Na verdade, ela

usada como garantia de consistncia termodinmica a um dado modelo.

2.3 Os critrios de equilbr io de fases

Em geral, a apresentao que se faz dos critrios para os equilbrio de fases

perpassa caminhos matemticos e propostas de exemplos que acabam por dificultar

a compreenso.

Aqui, tentar-se- um mtodo pouco utilizado nas classes de termodinmica, mas que

segundo a percepo deste que escreve parece apresentar uma consistncia

matemtica que deve por fim isentar dvidas quanto a sua aplicao mais geral.

Tomemos para anlise um sistema isolado com m componentes e p fases; de

acordo com a segunda lei da termodinmica a entropia deste sistema isolado

sempre aumenta em uma dada transformao, logo no equilbrio sua entropia deve

ser mxima de modo que no haja nenhuma transformao que leve o sistema para

outro estado que no seja o de equilbrio.

Deve-se reescrever, ento, a equao fundamental expressa pela equao (2 1)

de modo a contemplar um sistema multifsico:


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S=S(U ,V ,N1 , ... ,N m) (2 12)

Sendo os vetores definidos por coordenadas de cada fase do sistema:

U =[U(1)

,U(2)

, ...,U()

] (2 13)

V =[V(1) ,V(2) , ...,V ()] (2 14)

N i =[N i(1)

,N i(2)

, ... ,N i( )] , com i =1,2,..., m (2 15)

Posto isto, tem-se que este um problema de maximizao de entropia sujeito s

restries de conservao energtica, espacial e material:

max S=S (U ,V ,N1 , ...,Nm)

s.t. :

g1(U )==1

U()U=0

g2 (V )==1

V()V =0

gj(N i)==1

N i()

N i=0, i=1,... ,m e j=3,... ,m+ 2 (2 16)

Assim, pode-se definir o lagrangeano da entropia como:

L(U ,V ,N1, ...,N m , )=S (U ,V ,N1,... ,Nm)k=1

m+ 2

k gk (2 17)

A condio de otimalidade dada pela condio de gradiente do lagrangeano da

entropia nulo:

L(U , V ,N1, ... ,Nm , )=0 (2 18)

Com isso, ter-se-o (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas:

{

L(U ,V ,N1, ... ,Nm , )

U () =

1T

()1=0, =1,... ,

L (U ,V ,N1,... ,Nm , )

V() =

p()

T()2=0, =1,... ,

L(U ,V , N1,... , Nm , )

N i()

=i

( )

T()i+ 2=0, =1,... , e i =1,..., m

(2 19)


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29

Obviamente para completar as (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas, devem-se

incluir as restries de igualdade que reaparecem nas derivada parciais do

lagrangeano pelo multiplicadores de Lagrange.

Logo, tem-se que para maximizar a entropia de um sistema isolado com m

componentes e pfases, devem-se obedecer as seguintes relaes:

11

=T (1)=T (2)==T ()

21

=p (1)=p(2)==p()

i+ 2

1 =i(1)

=i(2)

==i()

, i=1,... , m (2 20)

As equaes apresentadas em (2 20) representam os critrios do equilbrio de

fases: igualdade das temperaturas, das presses e dos potenciais qumicos de cada

componente.

Do ponto de vista de fenmenos de transporte possvel, e at talvez mais fcil,

imaginar que o equilbrio um caso particular do estado estacionrio para o qual a

fora motriz da grandeza responsvel pelo transporte constante e nula, id est, o

transporte s ocorre se h diferena de potencial, se o potencial trmico

(temperatura) for o mesmo em todas as fases do sistema no h transporte de calor,

se o potencial mecnico (presso) for igual em todas as fases do sistema no h

deslocamento de fronteira e, analogamente, se o potencial qumico de cada

componente for o mesmo em todas as fases no h transporte de massa. As

equaes fenomenolgicas mostram claramente como o fluxo dependente da

fora motriz de tal modo que se esta ltima for nula no h fluxo e o sistema est em

equilbrio. Ainda que se considerem acoplamentos, a situao de equilbrio aquela

em que todas as foras motrizes so nulas; portanto, mesmo os efeitos de

acoplamento no ocorrero.

2.4 Fugacidade, atividade e convenes

O potencial qumico tal como proposto por Gibbs na segunda metade do sculo XIX


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30

(PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999) no de fcil assimilao,

porque no possvel sua percepo no mundo fsico real de modo to intuitivo

quanto o potencial trmico (temperatura) e o mecnico (presso). No entanto, a

definio de fugacidade d uma idia mais sensvel do fenmeno fsico. A

fugacidade, assim como definida por Lewis, substitui a presso no clculo do

potencial qumico de um processo isotrmico de um gs ideal de modo a contemplar

os efeitos no considerados no modelo de gs ideal:

fi

fi0=exp(ii

0

RT) (2 21)

em que fi a fugacidade do componente i, fi0

a fugacidade do componente i noestado padro,mi o potencial qumico do componente i, mi0 o potencial qumico do

componente ino estado padro, R a constante real dos gases (R= 8,314 J mol-1K-

1), T a temperatura do sistema em K.

Pela sua definio possvel equivaler a igualdade de fugacidades de cada

componente em todas as fases do sistema como um critrio de equilbrio alternativo

ao da igualdade de potenciais qumicos expressa na Equao (2 20) sem perda de

generalidade.

Para um gs ideal puro, a fugacidade igual a presso e, para uma mistura de

gases ideais, igual a presso multiplicada pela frao molar: yip. A definio de

fugacidade assim completada pelo limite observvel a todos os sistemas puros ou

misturados no qual o comportamento destes sistemas se aproxima do de gs ideal

para presses muito baixas:

limp0

fi

y i p=1 (2 22)

em que yi a frao molar do componente ie p a presso do sistema.

Embora a definio de fugacidade ajude nos clculos de equilbrio de fases de

gases, sua aplicao a sistemas condensados um tanto quanto mais complicada.

Isto se deve ao fato de ter-se relacionado tudo a diferena entre o comportamento

do sistema real e o do gs ideal; e, portanto, isso exige dados experimentais a

temperatura e composio constante sobre todo o intervalo de densidades no se

excetuando a regio bifsica. Como na maioria das vezes no se dispe de tamanha

quantidade de informaes, usa-se alternativamente uma outra abordagem para

clculos da fase lquida. Definindo uma soluo ideal e calculando os desvios entre


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31

a soluo real e essa soluo ideal pelas propriedades de excesso, que no caso da

energia livre de Gibbs de excesso ou ainda, energia livre de Gibbs excedente

est relacionada ao coeficiente de atividade. Assim, cabe definir a atividade de um

componente e o coeficiente de atividade deste componente. Da prpria definio de

fugacidade expressa pela Equao (2 21), define-se a atividade como:

a i=fi

fi0 (2 23)

De modo similar ao que est escrito em (2 22), surge a necessidade de se definir o

coeficiente de atividade, g, de um dado componente icomo:

i=a

i

x i (2 24)

Aqui cabe explicitar algo que ser necessrio: a conveno simtrica e a

assimtrica. Esta necessidade emerge a medida em que se arbitra qual o estado

padro (ou estado de referncia) com o qual se executar o clculo do potencial

qumico. Na conveno simtrica, o estado padro o mesmo para todos os

componentes; j na conveno assimtrica, no.

2.5 Modelos termod inmicos de energia livre de Gibbs excedente

O coeficiente de atividade est relacionado a energia livre de Gibbs excedente ou

seja, a diferena entre a energia livre de Gibbs de um sistema real e a energia livre

de Gibbs de uma mistura ideal pela seguinte equao:

lni =[ (g

EX

RTi =1

m

N i)N i

]T , p ,N

j

(2 25)

A Equao (2 25) traz a possibilidade de ao se propor um modelo de energia livre

de Gibbs excedente, possa-se avaliar a no-idealidade de um dado componente em

soluo. Um dos modelos mais aplicados nos ltimos quarenta anos o famoso

NRTL (da sigla em ingls: Non-Random Two Liquids) que foi proposto em um artigo

de Renon e Prausnitz (1968). Na sua forma para sistemas multicomponentes, a


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energia livre de Gibbs excedente dada por:

gEX

RT

=i=1

m

x i

j=1

m

jiGji xj

l=1

m

G li x l

(2 26)

em que, o parmetro tij dado pela diferena entre os parmetros de energia

caractersticos da interao de iej, gij:

ji =gjig ii

RT(2 27)

E, o parmetro Gij dado pela exponencial da multiplicao entre o parmetro tije o

parmetro de no-aleatoriedade na mistura aij:

Gji =exp(ji ji ) , c om ji=ij (2 28)

Em termos do logaritmo natural do coeficiente de atividade de um dado componente

i, tem-se que:

lni =j=1

m

ji Gji xj

l=1

m

Gli x l

+j=1

m xj G ij

l=1

m

G lj x l

(ijr=1

m

x rrj Grj

l=1

m

G li x l

)(2 29)

Coube aqui apresentar mais pormenorizadamente este modelo em especial, para

ajudar a discusso de uma particular aplicao a sistemas contendo aminocidos

apresentada no captulo quarto. Evidentemente h outros tantos e to importantes

modelos que inclusive sero citados ao decorrer do texto, todavia como a aplicao

do modelo NRTL ser comparada a aplicao de um outro modelo neste trabalho,

considerou-se por bem apresentar sua formulao.

2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas

Enquanto a prpria teoria de lquidos ainda objeto de intensa pesquisa, no foi

abandonada durante o sculo passado, e nem nos prximos o ser, a modelagemde solues que contenham eletrlitos. A natureza de tais solues traz


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33

complicaes adicionais a este tipo de modelagem e restries antes no

consideradas tais como o princpio de eletroneutralidade da fase termodinmica em

equilbrio estvel.

A teoria de Debye-Hckel publicada no incio dos anos de 1920 foi pioneira no

tratamento de solues eletrolticas e at hoje constitui um trabalho de referncia na

maioria das publicaes relacionadas a este tema. Este teoria est baseada na

soluo linearizada e unidirecional da equao de Poisson-Boltzmann (HILL, 1986):

2j=4e

i

z i i(1z i eikB T) (2 30)

em quey

o potencial da espciej,

e a carga eltrica,

e a permissividade do

vcuo, zi a carga eltrica da espcie i, ri a concentrao da espcie i, kB a

constante de Boltzmann e T a temperatura.

Pela soluo da Equao (2 30), e por algumas consideraes, chega-se ao

coeficiente de atividade de uma espcie inica no limite de altas diluies:

lnj=zj

2e

2

2kB T (2 31)

em que k o inverso do comprimento de Debye1:

2=

4e2

k BT

i

i z i2

(2 32)

Muitas vezes esta Equao (2 32) escrita em termos da fora inica, I, que

definida como:

I=12

i

m i z i2

(2 33)

em que mi a molalidade do componente iem mol por kilograma.

De fato este modelo um modelo limite a concentraes de eletrlitos muito baixas,

tipicamente limitado a fora inica da ordem de 0,01 mol kg-1 (PRAUSNITZ;

LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999). No decorrer do sculo passado outros

modelos foram propostos com o intento de ampliar a faixa de aplicao a sistemas

eletrolticos; um dos mais exitosos nesta empresa o modelo de Pitzer (PITZER,

1973). No fundo, este modelo pode ser dividido em dois termos principais: um de

1 O comprimento de Debye uma distncia de interao caracterstica associada ao potencialeletrosttico blindado (PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999).


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longo alcance que devido as interaes eletrostticas anlogas ao modelo de

Debye-Hckel, e um de curto alcance que uma expanso virial de modo a assumir

a hiptese que as interaes entre muitos corpos pode ser dividida em contribuies

de interaes de dois-a-dois, trs-a-trs e assim por diante. Este modelo tambm se

baseia em uma proposio para a energia livre de Gibbs excedente:

gEX

RTw s=f(I )+

i

j

m i mj ij (I)+i

j

k

m i mj mk ijk+ ... (2 34)

em que ws a massa de solvente, f(I) uma funo dependente da fora inica, lij

o parmetro das interaes binrias (dois-a-dois) e Lijk o parmetro das interaes

ternrias (trs-a-trs).

Como as propriedades termodinmicas so usualmente medidas para eletrlitos

neutros e no espcies inicas individuais, convencionou-se escrever os modelos

para solues eletrolticas aplicando a restrio de eletroneutralidade em termos de

um coeficiente de atividade inica mdio que dado pela mdia geomtrica dos

coeficientes de atividade do ction e o do nion. Esta abordagem que para sistemas

salinos, por exemplo, muito interessante, no o para polieletrlitos, para os quais

algumas complicaes aparecem. Em termos do coeficiente de atividade inica

mdio, o modelo de Pitzer dado por:

ln=13z+ z-( e

2

0rk B T)3/ 2

(2ds NA)1/2

8 [ 2b ln(1+ bI )+ I1+ bI ]+ ...

...+ m( 2+ -+ + -){2 (0)+ 2(1)

2I[1(1+ I1/ 2

2I

2)exp(I 1/ 2)]}+ ...

...+ 9m 2

[ (+ -)

2

++ -](+ MMX+ -MXX) (2 35)

em que n+e n-so respectivamente os coeficientes estequiomtricos do ction Me

do nion X. Os outros parmetros sero definidos no quarto captulo quando da

aplicao do modelo de Pitzer.


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3 Efeito do pH na solubilidade de protenas

Si lon veut noncer le prncipe dans toute sa gnralit et en lappliquant lUnivers, on le voit pour

ainsi dire svanouir et il ne reste plus que ceci: il y a quelque chose qui demeure constant.

(Henri Poincar, in Thermodynamique)

3.1 Introduo

Os primeiros trabalhos relacionados modelagem da curva de solubilidade de

protenas em funo do pH datam do incio do sculo XX. Green (1931) props um

modelo para a curva de solubilidade da carboxihemoglobina eqina considerando

que esta protena se comportaria tanto como um cido bivalente quanto uma base

bivalente. J Grnwall (1941) atribuiu a Linderstrm-Lang o desenvolvimento de um

modelo capaz de predizer a curva de solubilidade a partir da integrao do perfil de

carga da protena. Este trabalho de Grnwall, apesar de esquecido, de extrema

importncia e relevncia tanto para o trabalho aqui apresentado quanto, e aqui um

motivo muito mais nobre, para o desenvolvimento de modelos a partir das

ferramentas da termodinmica clssica.

digno de nota o trabalho de Fredericq e Neurath (1950) no qual uma proposta de

equacionamento para uma correlao semi-emprica da curva de solubilidade de

insulina apresentada. No h, de fato, algo novo em relao modelagem do

efeito do pH na curva de solubilidade neste trabalho; no entanto, apesar de no

haver qualquer meno ou referncia quanto origem da equao proposta, nota-se

que uma aplicao direta da equao descrita por Grnwall (1941). H uma

hiptese implcita no trabalho de que o perfil de carga lquida da insulina em funo

do pH seja linear na regio do ponto isoeltrico, o que bastante plausvel para

muitas protenas. Assim, pela integrao da equao diferencial proposta por

Grnwall (1941), uma correlao semi-emprica quadrtica obtida. Refora-se o

uso da expresso semi-emprica devido natureza dual da equao: em parte

advinda de um desenvolvimento terico descrito por Grnwall (1941) e atribudo a

Linderstrm-Lang; e em parte pela necessidade de se obterem parmetros a partir


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36

de um ajuste de um conjunto de dados experimentais.

Contudo, os trabalhos mais recentes se concentram na modelagem da curva de

solubilidade de aminocidos em funo do pH dando maior enfoque aos modelos

termodinmicos para solues no-ideais, tanto atravs de equaes de estado

como de modelos de energia livre de Gibbs excedente.

Entretanto, o primeiro trabalho dedicado exclusivamente modelagem e predio da

curva de solubilidade de protenas propriamente dita em funo do pH foi publicado

por Tjong e Zhou (2008). Neste trabalho, a solubilidade foi calculada a partir da

energia livre de transferncia da fase slida para a fase lquida. Para a execuo

deste clculo, a energia livre de transferncia foi dividida em duas contribuies:

uma de natureza eletrosttica, calculada pela mdia de 100 conformaes proticasadvindas da aplicao de dinmica molecular a pH constante; e outra, de natureza

no-eletrosttica, baseada na rea superficial acessvel ao solvente. Porm, o

esforo computacional requerido pelo modelo por eles proposto para calcular

apenas alguns pontos da curva no apresenta uma aplicabilidade razovel. Alm

deste trabalho, Tashima et al. (2009) propuseram uma modelagem termodinmica

para prever a curva de solubilidade especificamente da insulina suna aplicando o

modelo de Pitzer truncado aps o segundo coeficiente virial.Aqui uma relao analtica entre a solubilidade de protenas em funo do pH ser

desenvolvida sob a hiptese de que a atividade da molcula de protena

eletricamente neutra permanece constante com o pH. Assim se entende a epgrafe

deste captulo e que encontrada no apenas neste mas em muitos

desenvolvimentos tericos: h alguma coisa que permanece constante.

3.2 Desenvolvimento terico

No caso do equilbrio slido-lquido, no qual a fase slida nica e contm apenas

molculas de um soluto i, a condio do equilbrio de fases expressa na Equao (2

20) supondo a igualdade de presses e temperaturas das fases a priori dada

simplesmente por:

iL(T , p , x)=i

S(T , p) (3 1)


37/126

37

em que miL o potencial qumico do soluto na fase lquida e miS o potencial qumico

do soluto na fase slida. Desprezando-se os efeitos da presso sobre o clculo do

potencial qumico, hiptese comum a sistemas que no envolvam fase gasosa, tem-

se que para um processo isotrmico no h variao do potencial qumico da fase

slida j que sua composio fixa; portanto, o potencial qumico do soluto na fase

lquida tambm no se altera em tal processo. Posto isto, conclui-se que mudanas

nas condies da fase lquida tais como variao de pH no alteram o potencial

qumico do soluto nesta fase.

A solubilidade de um soluto em fase lquida a concentrao de equilbrio deste

componente nesta fase. Assim, se a solubilidade do soluto for suficientemente

diminuta, para um processo isotrmico desprezando-se os efeitos da presso, pode-

se adotar a considerao de uma soluo ideal segundo a lei de Henry e expressar

o potencial qumico deste soluto na fase lquida em termos de molalidade como:

iL(m )=i

0(m 0)+ RT lnm i

mi0 (3 2)

em que:

m0=[0,0,...,0, m i

0=1,0,..., 0] (3 3)

Sendo mia molalidade do soluto na fase lquida, ou ainda a solubilidade do soluto

em termos de molalidade; e, mi0(m0) o potencial qumico de referncia do soluto. Este

estado de referncia escolhido o estado de referncia de uma soluo ideal de

concentrao unitria, ou seja, uma soluo hipottica na qual o soluto tem uma

molalidade mi0 = 1,0 mol kg-1, mas experimenta as mesmas interaes que se

estivesse em uma soluo a infinita diluio.

Quando o soluto uma protena, outros pormenores devem ser levados em conta. Amolcula de protena um polieletrlito biolgico e, sendo assim, esta se ioniza em

soluo aquosa. Isto se deve ao fato de que alguns aminocidos que compem a

protena tm grupos polares que participam de equilbrios qumicos com o on H+.

Para grupos alcalinos, o equilbrio de ionizao :

NH 3+NH2+ H

+ (3 4)

Todavia, para grupos cidos, o equilbrio de ionizao :

COOHCOO-+ H+ (3 5)


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38

A partir destes equilbrios qumicos possvel notar que as molculas de protena

em uma soluo tm diferentes estados de protonao, e, portanto, distintos valores

de carga eltrica. Porm, a solubilidade determinada experimentalmente a soma

da concentrao de todas as molculas de protenas.

Sendo a fase slida composta apenas por protena e sendo uma fase em equilbrio

estvel, pelo princpio de eletroneutralidade nela deve haver somente molculas

eletricamente neutras. Isto significa que o equilbrio de fases se estabelece apenas

entre molculas de protena eletricamente neutras. Logo, a Equao (3 2) no

vlida para qualquer molcula de protena, mas apenas e to-somente para as

molculas de protena eletricamente neutras. E, por conseqncia do critrio de

equilbrio de fases expresso na Equao (3 1), a molalidade das molculas deprotena eletricamente neutras na fase lquida deve permanecer inalterada com a

variao do pH da soluo. A molalidade destas molculas uma frao da

solubilidade da protena nesta soluo. Assim pode-se escrever:

m0=0(pH )S (pH ) (3 6)

em que m0 a molalidade das molculas de protena eletricamente neutras da fase

lquida, f0 a frao de molculas de protena eletricamente neutras da fase lquida

e S a solubilidade da protena na fase lquida. Contudo, conforme afirmado

anteriormente, m0deve ser constante com a variao do pH, assim ao se aplicar a

Equao (3 6) no ponto isoeltrico, pode-se escrever que:

m0=0(pI )S( pI) (3 7)

Logo, pela simples comparao entre as Equaes (3 6) e (3 7), chega-se

seguinte relao:

S( pH)=0(pI )S (pI )0(pH )

(3 8)

A Equao (3 8) descreve a curva de solubilidade de uma dada protena em

soluo em funo do pH. Apesar de ser uma equao simples, resta ainda a

dificuldade de se calcular a frao de molculas de protena eletricamente neutras

na fase lquida.


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39

3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra

Para o clculo da frao de molculas de protena eletricamente neutras

indispensvel considerar que todos os resduos efetivamente ionizveis da protena,

inclusive os grupos amina e cido carboxlico terminais, podem estar eletricamente

carregados ou no devido aos equilbrios qumicos expressos nas Equaes (3 4)

e (3 5). Sendo no nmero total de resduos ionizveis de uma dada protena, o

nmero de estados de ionizao possveis, y, :

=

=0

nn!

(n)!!=

=0

n

(n

)=2n (3 9)

Dentre estes estados, alguns representam molculas de protena cuja carga total

seja nula. A carga de uma molcula de protena dada pela soma da carga

individual de cada resduojem um dado estado de ionizao k:

ck=j=1

n

jk (3 10)

em que ejk a carga individual de cada resduo jem um dado estado de ionizao ke pode ser expressa como:

jk={1, paragrupos cidoscarregados0, paraquaisquer grupos neutros

+ 1,paragrupos bsicoscarregados(3 11)

Considerando que a equao de Henderson-Hasselbach vlida para cada grupoj

e que o equilbrio qumico estabelecido entre o grupoje o on H+ independente de

qualquer outro equilbrio qumico desta natureza que ocorra nesta mesma molculade protena, tem-se que a frao ionizada deste grupoj dada por:

j (pH)=( 11+ 10pHpKAj )[(1+ j)

2

(j1)

210pHpK Aj] (3 12)

em que pKAj o co-logaritmo decimal da constante de equilbrio qumico do grupoje

nj o estado carregado do grupo j (-1, para grupos cidos e, +1, para grupos

alcalinos).

Assim, a frao de molculas de uma dada protena em um dado estado deionizao k dada pelo produtrio da frao do grupo jcom a carga especfica


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40

associada ao estado de ionizao k:

k(pH )=i=1

n

j' (pH) (3 13)

Sendo que:

j' (pH)={ j (pH) , sejk01j (pH ), sejk=0 (3 14)

Logo, substituindo a Equao (3 12) na Equao (3 14) e a resultante na

Equao (3 13), ter-se- que a frao de molculas de protena eletricamente

neutras em um dado estado de ionizao k dada simplesmente por:

k(pH )=j=1

n

{(1

1+ 10pHpKAj )[(1+ j

2 jk)10pHpKAj(

j12 jk)]} (3 15)

Sujeita seguinte restrio de eletroneutralidade:

j=1

n

jk=0 (3 16)

Apesar de a frao de molculas de protena eletricamente neutras de um dado

estado de ionizao kdepender do pH, a razo entre esta frao e a frao demolculas de protena eletricamente neutras em outro estado de ionizao qualquer

lno depende do pH. Pode-se demonstrar por argumentos de equilbrio qumicos

entre molculas eletricamente neutras em diferentes estados de ionizao que esta

razo dada por (FRANCO; PESSA FILHO, 2011) :

logk(pH )

l (pH )=

j =1

n

pKAj(jkjl) (3 17)

Assim, indiferente qual estado de ionizao que resulte em uma molcula

eletricamente neutra de protena utilizado para efetuar o clculo da Equao (3

8). Combinando as Equaes (3 8) e (3 15), tem-se que a curva de solubilidade

de uma dada protena em funo do pH dada por:

S( pH)=S (pI)j =1

n

{(1+ 10

pHpKAj

1+ 10pIpK

Aj)[(1+ j2 jk)10pIpKAj(j12 jk)]

[(1+ j

2

jk

)10pHpKAj

(j1

2

jk

)]}(3 18)


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41

para qualquer estado de ionizao kque respeite a restrio imposta na Equao (3

16). Basicamente a Equao (3 18) uma expresso para a predio da curva

de solubilidade de uma dada protena em funo do pH da soluo e requer como

parmetros apenas a solubilidade no ponto isoeltrico e informaes a respeito da

estrutura primria da protena, ou seja, a seqncia de aminocidos que a compe e

as respectivas constantes de equilbrio de ionizao. Isto torna esta abordagem

extremamente relevante e de fcil aplicao.

3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall

fato que as primeiras tentativas de se prever a curva de solubilidade de uma

protena, em funo seja do pH seja da concentrao de agente precipitante, datam

da primeira metade do sculo passado, quando ainda muito poucas informaes

estruturais sobre protenas eram conhecidas. Ainda assim, clebres trabalhos como

o de Cohn (1925) e o de Green (1931) so ainda hoje referncias abundantemente

citadas e prepararam de certo modo o caminho trilhado neste quase um sculo dededicao pesquisa sobre a fsico-qumica de sistemas proticos. Infelizmente

alguns trabalhos de no menor importncia ficaram esquecidos. Este o caso do

trabalho de Grnwall (1941). Neste trabalho Grnwall atribui a Linderstrm-Lang o

desenvolvimento de uma teoria para o clculo da solubilidade de protenas em

funo do pH atravs da integrao do perfil de carga lquida da protena em funo

do pH.

As hipteses desta teoria apresentada por Grnwall (1941) so: i) o equilbrio slido-lquido se estabelece com as molculas eletricamente neutras de protena em

soluo; ii) a variao do pH da soluo no altera a atividade das molculas

eletricamente neutras de protena em soluo.

Assim, poder-se-ia reconstituir a formulao de Linderstrm-Lang e Grnwall

partindo do seguinte equilbrio entre uma molcula de protena eletricamente neutra

e uma molcula ionizada em um dado estado de ionizao kcom uma carga total c:

P0+ cH+ P

k

+ c (3 19)

cuja relao de equilbrio dada por:


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42

K k=a

P k+ c

a P0a

H+

c(3 20)

em que Kk a constante de equilbrio referente a Equao qumica (3 19), aPk a

atividade da molcula de protena de carga total cem um estado de ionizao k, aP0

a atividade da molcula de protena eletricamente neutra e aH+ a atividade do on

H+. Todavia, a atividade de um componente o produto entre sua concentrao e o

coeficiente de atividade deste componente (g) Equao (2 24). Assim, a

molalidade da molcula de protena com carga total ce em um estado de ionizao

k dada por:

mk=K ka P 0

aH

+

c

k(3 21)

J a solubilidade da protena a soma das concentraes de todos os estados de

ionizao possveis, mesmo de cargas totais distintas:

S=k=1

mk=k=1

K ka P0

aH

+

c

k(3 22)

Derivando a Equao (3 22) com respeito atividade do on H+

e assumindo que aatividade da molcula de protena eletricamente neutra permanece constante:

dS

d aH

+

=a P0k=1

c aH+c1 K k

ka P0

k =1

aH+c K k

k2

d k

d aH

+

(3 23)

O segundo termo do lado direito da Equao (3 23) pode ser simplificado do

seguinte modo:

a P0

k=1

a

H

+

c K k

k2

d k

d a H+=a P

0

k=1

a

H

+

c K k

k

d lnk

d a H +=

k=1

mkd lnk

d a H +(3 24)

Considerando que os coeficientes de atividade da gua e do on H+so constantes a

Equao (3 24) deve ser nula para que a equao de Gibbs-Duhem seja satisfeita

(uma deduo para a equao de Gibbs-Duhem est apresentada no seo 2.2do

segundo captulo). Assim, a Equao (3 23) pode ser reescrita como:

d lnS

d lna H+=

(a H +

S

)d S

d a H+=k =1

c aH+c K k

k

k=1

aH

+

c K kk

=k =1

c mk

k=1

mk

=c (3 25)


43/126

43

em que c a carga mdia das molculas de protena conforme proposta de

Linderstrm-Lang (1924). Reescrevendo a Equao (3 25) em termos de pH:

d logSd pH =c (3 26)

A Equao (3 26) descreve a curva de solubilidade da protena em funo do pH

pela integrao da carga mdia da protena. Esta equao foi primeiramente

derivada por Grnwall (1941). Entretanto, o nico mtodo de aplicao desta

equao encontrado na literatura era realizado pela aproximao linear do perfil de

carga na regio do ponto isoeltrico e a integrao da reta resultante. Contudo,

pode-se relacionar a carga mdia da protena com as informaes da estruturaprimria da mesma atravs da seguinte equao:

c (pH)=j=1

n

j j (pH ) (3 27)

Inserindo a Equao (3 12) na Equao (3 27), tem-se que:

c (pH)=12j=1

n

( 11+ 10pHpK Aj)[1+ j(1j)10pHpKAj ] (3 28)Logo, substituindo a Equao (3 28) na Equao (3 26):

d logSd pH

=12j=1

n

( 11+ 10pHpK Aj)[1+ j(1j)10pHpKAj ] (3 29)A Equao (3 29) pode ser integrada de um pH de referncia at o pH no qual se

deseja calcular a solubilidade da protena. Tomando como pH de referncia o ponto

isoeltrico, pI:

logS(pI)

logS(pH )

d logS=12

pI

pH

{j =1n

( 11+ 10pHpKAj)[1+ j(1j )10pHpKAj ]}

d pH (3 30)

Fazendo a integrao como apresentado no Apndice A, chega-se a:

logS (pH)S (pI )

=j=1

n

[log(1+ 10pHpK Aj1+ 10pIpKAj )(1+ j )2 (pHpI)] (3 31)Ou ainda:

log S (pH)S (pI )

=n+(pIpH )+j=1

n

[log(1+ 10pHpK

Aj

1+ 10pIpKAj )] (3 32)


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44

em que n+ o nmero total de grupos alcalinos na molcula de protena.

A Equao (3 32) relaciona a solubilidade da protena com a variao do pH da

soluo. A prxima subseo dedicada a provar que tanto a Equao (3 18)

quanto a Equao (3 32) so equivalentes.

3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens

Apesar das formulaes aparentemente distintas, tanto a integrao do perfil de

carga mdia da protena quanto o desenvolvimento exposto em 3.2.1so anlogos.Ao se tomar o logaritmo decimal da Equao (3 18), tem-se que:

logS (pH)S (pI)

=j=1

n

log(1+ 10pHpKAj

1+ 10pIpKAj)+ ...

...+j=1

n

log

{[(1+ j2 jk)10pIpKAj(j12 jk)]

[(1+

j

2 jk)10pHpKAj

(

j

1

2 jk)]}(3 33)

Pelo bem da simplicidade, definir-se-o duas funes:

j( pH)=log(1+ 10pHpKAj

1+ 10pIpKAj) (3 34)

jk (pH )=log

{[(1+ j

2

jk

)10pIpK Aj

(

j1

2

jk

)][(1+ j2 jk)10pHpKAj(j12 jk)]}(3 35)

Fica evidente pela observao das Equaes (3 34) e (3 35) que a funo hjno

depende do estado de ionizao k, enquanto a funo qjkdepende. Assim, pode-se

analisar cada possibilidade. Esta anlise da funo e qjk est na Tabela 3.1.


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45

Tabela 3.1 - Anlise da funo qjk.nj jk qjk Nmero de resduos

-1 -1 pI - pH nA-1 0 0 nB

+1 +1 0 nC+1 0 pI - pH nD

Pela Tabela 3.1, possvel inferir que a Equao (3 33) pode ser escrita como:

logS (pH)S (pI )

=(nA+ nD)( pIpH )+j =1

n

j(pH) (3 36)

Entretanto, a Equao (3 36) deve tambm satisfazer a restrio expressa na

Equao (3 16), assim:

j=1

n

jk=0nA=nC (3 37)

Portanto, de acordo com a restrio de eletroneutralidade advinda da Equao (3

37), tem-se que:

(nA+ nD)=(nC+ nD)=n+ (3 38)

Logo, a Equao (3 36) respeitando a restrio de eletroneutralidade pode ser

escrita como:

logS (pH)S (pI )

=n+(pIpH )+j=1

n

j (pH) (3 39)

Assim fica provada a identidade entre as Equaes (3 18) e (3 32).

3.3 Result ados e Discusses

3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura

A Tabela 3.2 apresenta os valores de pKAdos grupos ionizveis da insulina humana

para o clculo da curva de solubilidade desta protena em funo do pH de acordo

com a Equao (3 32). H na Tabela 3.2 dois conjuntos de valores de pKA: um

chamado isolado que o valor do pKA do aminocido livre obtido pela titulao


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46

potenciomtrica do aminocido, e outro que o valor do pKAna cadeia protica e

obtido pela titulao potenciomtrica da protena.

Tabela 3.2 - Valores de pKAdos grupos ion izveis da insulina humana.Aminocido Grupo Nmero pKA(isolado)a pKA(cadeia)b

Gly -NH2(terminal) 1 9,80 7,38

Glu -COOH 4 4,30 4,37

Tyr Fenol-OH 4 10,90 10,20

Asn -COOH (terminal) 1 2,00 3,45

Phe -NH2(terminal) 1 910 7,38

His Imidazol-NH2 2 6,00 5,98

Arg Guanidina-NH2 1 12,50 11,10

Lys -NH2 1 10,80 8,52

Ala -COOH (terminal) 1 2,30 3,45

aStryer (1995).bKaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).

De fato, os dados que sero correlacionados aqui so de insulina suna; entretanto,a diferena entre a insulina suna e a insulina humana de apenas um aminocido

em termos de estrutura primria, logo bastante razovel considerar que os valores

de pKAna cadeia da insulina humana so praticamente iguais aos valores do pKAna

cadeia da insulina suna.

O cdigo-fonte do programa de clculo dos diversos estados de ionizao bem

como do clculo da curva de solubilidade est apresentado no Apndice B.

Como a insulina possui ao todo 16 grupos ionizveis, o nmero de estados deionizao possveis : y= 65536. Destes, 8008 estados tem carga nula. A frao

total , pois, a soma das fraes destes 8008 estados cuja carga total seja nula. Na

Figura 3.1, ilustra-se a estrutura primria da insulina suna destacando-se os grupos

ionizveis e a distribuio de carga da molcula eletricamente neutra cuja frao

preponderante. Deve-se notar que o estado de ionizao correspondente a molcula

eletricamente neutra que prepondera aquele no qual h maior possibilidade de

resduos eletricamente carregados que ainda resultam em uma molcula neutra,

exceo da tirosina (Tyr), estarem carregados positiva ou negativamente nesta

configurao.


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47

Na Figura 3.2, so apresentadas as curvas de frao de molculas de insulina

eletricamente neutras em funo do pH na regio do ponto isoeltrico. H neste

grfico duas curvas: uma que a soma de todas as fraes neutras, chamada

frao total; e, outra que representa o estado de ionizao neutro preponderante da

insulina.

Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras deinsul ina em funo do pH. Dados de pKAde Kaarsholm; Havelunge Hougaard (1990). Linha contnua, frao total. Linha pont ilhada,

frao preponderante.

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

pH

Figura 3.1 - Estrutura primria da insul ina suna: seqncia de aminocidos e pontes dedissul feto. Grupos ionizveis em negrito e distr ibuio de carga da configurao neutra

correspondente ao estado de ioni zao preponderante.


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48

Observa-se pela Figura 3.2 que as fraes de molculas de protena eletricamente

neutras alcanam um ponto mximo exatamente no ponto isoeltrico, ponto este que

pode ser definido como pH no qual a carga lquida mdia das molculas de protena

nula. Ou seja, o ponto mximo da frao de molculas neutras corresponde ao

ponto de mnima solubilidade.

J as Figuras 3.3, 3.4 e 3.5 apresentam o resultado da modelagem para trs

diferentes temperaturas para a curva de solubilidade da insulina suna em funo do

pH. Comparam-se o modelo proposto calculado com diferentes valores de pKA

valores de pKAisolados; e, valores de pKAna cadeia com o modelo proposto por

Tashima et al. (2009).

Figura 3.3 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a278,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et

al., (2009). Modelo proposto com valores de pKAde Kaarsholm;Havelung e Hougaard (1990), linha cont nua; com valores de pKA

de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.(2009), linha semi-contnua.

4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0

4,0

8,0

12,0

16,0

20,0

24,0

28,0

32,0

Solubilidadex105/mol.kg

-1

pH


49/126

49




4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0

4,0

8,0

12,0

16,0

20,0

24,0

28,0

Solubilidadex105/mol.kg

-1

pH




4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

Solubilida

dex105/mol.kg

-1

pH


50/126

50

Deve-se notar que a validade do modelo restrita a regio prxima ao ponto

isoeltrico; j que para valores de pH distantes deste ponto a curva de frao de

molculas neutras tende a zero, resultando pela Equao

Estudo do equilíbrio sólido-líquido de sistemas contendo aminoácidos e proteínas

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