Aminoácidos, peptídeos e proteínas

Características químicas dos aminoácidos

Os aminoácidos

• Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L– A biologia é canhota

• Glicina nãotem isomeriaóptica

Carbono alfa

Grupo R apolar e alifáticos

• Aminoácidos apolares e hidrofóbicos• Ligações de Van der Waals• Ala, Val, Leu, Iso– Interações hidrofóbicas

• Gly; menor aminoácido• Met– Possui átomo de enxofre

• Pro– Iminoácido, menor flexibilidade estrutural

Grupo R aromáticos

• Aminoácidos hidrofóbicos• Tirosina pode formar pontes de hidrogênio

com a água• Modificações pós-

traducionais– Fosforilação do OH

da tirosina• Fenilalanina– Mais apolar

Grupos R polares, não carregados

• Solubilidade intermediária em água• Serina e treonina– Grupos hidroxil

• Asparagina e glutamina– Grupo amida

• Cisteína– Grupo sulfidril– Ligações dissulfeto

Grupos R carregados• Aminoácidos básicos– Carga positiva– Lisina, segundo grupo amino– Arginina, grupo guanidina– Histidina, grupo aromático

imidazol

• Aminoácidos ácidos– Carga negativa– Possuem segundo grupo

ácido carboxílico

Aminoácidos incomuns

• Modificações pós-traducionais– 4-hidroxiprolina– 5-hidroxilisina– 6-N-metil-lisina– Gama-carboxiglutamato– Fosforilação de resíduos

• Selenocisteína– Selênio ao invés de enxofre na Cys– É adicionado durante a tradução por

mecanismo específico e regulado

pH e pKa

• Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas

• Ionização

• < pH; > [H]+

estado não-ionizado

Aminoácidos são ionizáveis

• Substâncias anfóteras: possuem natureza dual

• Podem funcionar assim como ácidos ou bases– Doam ou recebem

prótons

Titulação de um aminoácido

• Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas

Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos

• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral

Peptídeos e proteínas

Ligações peptídicas e o ângulo omega

Trans: ω = 180º

• Ligações peptídicas tem geometria rígida e planar

Ângulos torsionais, phi e psi

• Responsáveis pela curvatura na estrutura da proteína

• Entre o C-αe o N (do NH2)e o C (do COOH)

Omega, phi e psi

Polipeptídeo

>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

Peptídeos são ionizáveis

• Ou seja, possuem curva de titulação característica

• Funcionam em faixas de pH ótimas

Número de resíduos por proteína

Uso de aminoácidos

• Varia bastante entre as proteínas

• Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula

Proteínas com outros grupos químicos

• Adicionados pós-traducionalmente

Trabalhando com proteínas

Proteínas podem ser separadas e purificadas

• Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?– Basta selecionar por propriedade

• Tamanho, carga e propriedades de ligação

• Obter o extrato bruto– “correr” em cromatografia de coluna

• Fase estável (matriz)• Fase móvel (solução com tampão)

– Coluna maior permite maior resolução na separação

Cromatografia por troca iônica

• Polímero carregado negativamente– Proteínas positivas ligam ao

polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna

• Afinidade da proteína é definido também pelo pH

Cromatografia por exclusão de tamanho

• Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores

• Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

Cromatografia de afinidade• Adiciona-se à matriz da

coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse

• Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz

• Elui-se com solução de ATP

Eletroforese -- Histórico• 1952, Markham and Smith

– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico

• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar

proteínas do soro humano

• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem

separar ainda moléculas grandes de DNA

• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos

enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de

biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...

Eletroforese• Movimento de partículas dispersas

num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme

• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo

positivo quando sujeito a um campo elétrico

• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com

detergente (SDS)

• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas

1.Preparação do gel

2.Aplicação das amostras

3.Eletroforese

4.Coloração

5. Análise dos resultados

Preparação do gel

Horizontal X Vertical

Agarose X Poliacrilamida

Aplicação das amostras

Definição do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico

• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão

• Terminais positivo e negativo

• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

Coloração das moléculas

• Prata– Gel SDS-PAGE

• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

– Melhor resolução

• Coomassie blue, etc• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA

• Cancerígeno!

– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose

Eletroforese de um resultado de cromatografia

O marcador de peso molecular• Comprado de uma empresa

– Possui proteínas de peso molecular bem conhecido

• Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra

Geis bidimensionais

• Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois corre-se em outra dimensão

• Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra– Maiores géis dão maiores

resolução

Proteínas não separadas podem ser quantificadas

• Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa

• Deve-se poder medir o produto da ação enzimática

• Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC

Estrutura primária das proteínas

Níveis estruturais das proteínas

Estruturas secundárias• Descreve o arranjo espacial dos

átomos na cadeia principal

• Ocorre quando os ângulos diedros (phi e psi) permanecem quase iguais durante todo um segmento da proteína

• Tipos– Hélices α– Conformações β– Voltas β– Indefinida (loops, coils, turns)

Alfa-hélices• O arranjo mais simples que as proteínas podem assumir é um

arranjo helicoidal

• Esqueleto polipeptídico fica enrolado em torno de um eixo imaginário– Cada volta contém 3,6 resíduos – Φ = -57º; ψ = -47º

• Grupos R se voltam para fora do eixo

• Em média, 25% dos aminoácidos de qualquer proteína estão em hélices α

All-alpha proteins

Estabilidade da alfa hélice• A hélice é comum porque

nesse modelo as posições das ligações de hidrogênio estão otimizadas– Entre um H ligado ao NH2 e um

O do COOH– Cada ligação peptídica participa

de ligação de hidrogênio, conferindo estabilidade

• Para isso, todos os aminoácidos precisam ter o mesmo tipo de isomeria óptica (L ou D)

Tendência dos Aminoácidos em formar hélices

• O grupo lateral interfere na capacidade do aminoácido em formar hélices– Volume e forma de Asp, Ser, Thr e Cys

desestabilizam se estiverem muito próximos

– Pro e Gly dificultam a formação de hélices

• Relações com o vizinho também são importantes

• Componentes amino a carbonil formam dipolo elétrico

Restrições para a formação de hélice-α

1. Tendência do resíduo em formar hélice

2. Interações entre os grupos R espaçados 3-4 aa

3. Volumes dos grupos R adjacentes

4. Ocorrência de Pro e Gly5. Interações entre resíduos

das extremidades com o dipolo

1951

Conformação β (beta)• Esqueleto estendido em

forma de zigue-zague

• Folhas β paralelas e anti-paralelas– Paralela: Φ = -119º; ψ = 113º– Anti-par: Φ = -139º; ψ = 135º

• Quanto as folhas são próximas, os grupos R devem ser pequenos– Teias e queratinas... Gly e Ala

Estruturas em folhas Beta

• Beta-propeller Beta-barril

Dicroismo circular (CD)

• Uma assimetria estrutural em uma molécula leva a diferenças de absorção de luz polarizada

• A medida dessa diferença permite-nos ter uma idéia da estrutura secundária de uma proteína.

Dicroismo circular

O CD pode ser empregado na obtenção de detalhes estruturais de diferentes tipos de compostos:▪Proteínas;▪Carboidratos;▪Ácidos nucléicos;▪Fármacos;É considerado o método de escolha para determinação rápida do conteúdo de estrutura 2ª de peptídeos e proteínas;O CD é um método altamente sensível, capaz de distinguir conformações de α-hélice, folhas-β e alças.

Estruturas terciárias e quaternárias de proteínas

Estrutura terciária (3D)• Arranjo tridimensional total de

todos os átomos de uma proteína• Alcance mais longo e dimensão

total, quando comparado com 2D• Segmentos distantes na estrutura

1D podem ser atraídos por interações fracas

• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)

• Proteínas fibrosas e globulares

Proteínas fibrosas

• Queratina, colágeno, fibroína– Proteínas estruturais: força e

elasticidade

• Insolúveis em água: aa’s hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, Ile, Met e Phe)

• Alfa queratina: cabelo, pelo, unhas, garras, penas, chifres, cascos e parte externa da pele

• Pontes dissulfeto estabilizam e dão mais resistências às cadeias

Colágeno• Tecidos conectivos:

tendões, cartilagens– Garante resistência

• Hélice específica (phi = -51º; psi = 153º)

• Existem mais de 30 variantes do colágeno dependendo do tecido e da função

Fibroínas de seda

• Folhas beta• Rica em Ala e Gly

– Alto empacotamento

• Ligações de H entre as cadeias B

• Não é elástica, mas é flexível

• A fibroína, produzida por aranhas e insetos, é uma proteína fibrosa constituída por cadeias β estendidas, e rica em Alanina e Glicina (estudos da sequência indicam a presença da unida de (-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-)n)• As folhaβ ficam sobrepostas em camadas com um empacotamento de Alaninas numa face e Glicinas na outra• A as propriedades mecânicas da seda podem ser explicadas se considerarmos a sua estrutura:pequena extensibilidade: porque a cadeia β já é uma estruturaquase totalmente estendidaflexibilidade: porque as forças entre camadas sucessivas são de natureza não-covalente (relativamente fracas)

Proteínas globulares

• Diversidade estrutural reflete diversidade funcional– Dobramento gera estrutura compacta

• Teem partes em hélices-a e partes em folhas-B• Motivos estruturais

– Padrão identificável– Envolve elementos 2D

e conexões entre eles

Classificação estrutural das proteínas

Classificação estrutural das proteínas

SCOP – Famílias de proteínas

Estrutura quaternária

• Dímeros, homodímeros, heterodímeros

• Trímero, tetrâmero• Oligômero, multímero

Desnaturação de proteínas

• Condições diferentes das celulares levam as proteínas à desnaturação

• Perda da estrutura leva também à perda da função

• Calor, pHs extremos, temperatura (?), solventes orgânicos, detergentes

Renaturação de proteínas• A sequência terciária é

determinada pela sequência primária, certo?

• As proteínas desnaturadas, portanto, podem voltar aos estados nativos através de renaturação, quando o estímulo é retirado

Enovelamento protéico

• Lento e gradual• Diminuição da entropia

até alcançar um estadoestável

• Algumas proteínas se dobramde forma assistida pelasproteínas chaperonas

As estruturas primárias das proteínas são conhecidas

• Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo

• As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas– E principalmente dentro da

mesma

Sequenciamento de peptídeos• Degradação de Edman– Marca e remove apenas o

resíduo N-terminal

• Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas

• Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina

Produção de peptídeos

• Purificação a partir de tecidos

• Engenharia genética

• Síntese química direta

Alinhamento de sequências• Os organismos possuem,

em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas)– Derivam do ancestral

comum entre os organismos

• O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína

Evolução molecular

• Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente

Árvore molecular da vida

Conclusões• Diferentes características químicas das cadeias laterais dos

aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas• Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas

ou milhares para formar peptídeos e proteínas• As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente• As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e

afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese

• As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)

• As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra