Post on 03-Mar-2018
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
1/126
LUS FERNANDO MERCIER FRANCO
ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMASCONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS
So Paulo
2012
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
2/126
LUS FERNANDO MERCIER FRANCO
ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMASCONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS
Dissertao apresentada Escola
Politcnica da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de
Mestre em Engenharia
So Paulo
2012
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
3/126
LUS FERNANDO MERCIER FRANCO
ESTUDO DO EQUILBRIO SLIDO-LQUIDO DE SISTEMASCONTENDO AMINOCIDOS E PROTENAS
Dissertao apresentada Escola
Politcnica da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de
Mestre em Engenharia
rea de Concentrao:
Engenharia Qumica
Orientador: Professor Livre-Docente
Pedro de Alcntara Pessa Filho
So Paulo2012
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
4/126
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
5/126
Aos meus avs Zenaide e Antnio Srgio,
Marylande e Paulo Fernando (in memoriam);
a minha me, Priscila; ao papai,
Gilberto (in memoriam); e ao mano
Henrique dedico este trabalho.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
6/126
AGRADECIMENTOS
, alm de mandatrio que eu o faa, mandatrio pela minha conscincia mais do
que pelo mero preenchimento de algumas linhas, um imenso prazer agradecer a
quem de algum modo contribuiu comigo durante a execuo deste trabalho.
O primeiro a quem devo e desejo agradecer o meu orientador Professor Livre-
Docente Pedro de Alcntara Pessa Filho. ele a quem devo tudo o que sei sobre
Termodinmica, desde os bancos acadmicos do terceiro ano de engenharia quando
aprendi os primeiros conceitos de equilbrio de fases; poca em que ainda eu no
sabia que isso seria objeto de investigao do meu mestrado. com imensa
gratido que agora me dirijo a ele dizendo-lhe que sem sua pacincia e
generosssima disponibilidade nada do que este texto contm lograria tal xito que
agora surde a necessidade, mais do que o dever, de apresentar.
Tambm agradeo aos amigos e colegas do Grupo de Engenharia de Bioprocessos
(GEnBio), antigo Laboratrio de Engenharia Bioqumica (LEB), do Departamento de
Engenharia Qumica da Escola Politcnica da Universidade de So Paulo cujas
discusses incessantes, sobre os mais diversos contedos, esto dispersas aindaque de modo imperceptvel nas entrelinhas deste trabalho. Em particular, agradeo a
Kelly Cristina Nascimento Alves Cruvinel quem, alm de me haver fornecido alguns
dados experimentais que enriquecem a discusso dos modelos propostos neste
trabalho, sempre me apoiou desde os tempos em que eu era aluno de iniciao
cientfica.
Por fim, agradeo ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico (CNPq) e ao Departamento de Engenharia Qumica da EscolaPolitcnica da Universidade de So Paulo, pois me concedendo uma bolsa para
cursar meu mestrado permitiram que eu o fizesse dignamente.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
7/126
Deve-se escrever da mesma maneira como as lavadeiras l
de Alagoas fazem o seu ofcio. Elas comeam com uma
primeira lavada, molham a roupa na beira da lagoa ou do
riacho, torcem o pano, molham-no novamente, voltam a torcer.
Colocam o anil, ensaboam e torcem uma, duas vezes. Depoisenxguam, do mais uma molhada, agora jogando a gua com
a mo. Batem o pano na laje ou na pedra limpa, e do mais
uma torcida e mais outra, torcem at no pingar do pano uma
s gota. Somente depois de feito tudo isso que elas
dependuram a roupa lavada na corda do varal, para secar. Pois
quem se mete a escrever devia fazer a mesma coisa. A palavra
no foi feita para enfeitar, brilhar como ouro falso; a palavra foi
feita para dizer.
(Graciliano Ramos)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
8/126
RESUMO
A modelagem termodinmica do equilbrio slido-lquido de sistemas que contm
aminocidos e protenas tem sido cada vez mais necessria para o desenvolvimento
de equaes que permitam um projeto mais racional e eficiente das operaes
unitrias encontradas nos processos de purificao destas molculas, tais como a
precipitao e a cristalizao. Neste trabalho, apresentada uma relao unvoca
entre a solubilidade de protenas e o pH; sendo necessrios como parmetros
apenas informaes sobre a estrutura primria e os valores das constantes de
ionizao de cada resduo na cadeia protica, considerando os diferentes estados
de ionizao que a protena assume em soluo. Esta relao foi aplicada a
sistemas de insulina suna a trs diferentes temperaturas, a sistemas de insulinas
mutantes e a sistemas de b-lactoglobulina a diferentes concentraes de cloreto de
sdio, resultando em uma bem sucedida correlao dos dados experimentais de
solubilidade destes sistemas. Estudou-se tambm a no-idealidade de sistemas
contendo aminocidos, partindo de consideraes sobre diferentes estados de
ionizao da molcula assim como feito para protenas, mas adicionando um termo
de no-idealidade, neste caso, um termo advindo do modelo de Pitzer para solues
eletrolticas. Os sistemas, cujas curvas de solubilidade em funo do pH foram
estudadas, so: DL-Alanina, DL-Metionina, L-Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina,
tambm glicina e seus oligopeptdeos e molculas com grupos b-lactmicos tais
como a ampicilina, que um antibitico, e o cido 6-aminopenicilnico, que um
precursor na rota de produo da ampicilina. Uma interpretao atravs de
termodinmica estatstica para o parmetro de interao de Pitzer permitiu umaanlise mais profunda dos resultados. Relaes entre o segundo coeficiente virial
osmtico, a solubilidade de protenas e a concentrao de agente precipitante foram
desenvolvidas e aplicadas a sistemas de lisozima, ovalbumina e imunoglobulina
humana. Os resultados desta aplicao mostraram quo profcua a abordagem
empregada.
Palavras-chave: Termodinmica Qumica. Equilbrio Slido-Lquido. Protenas.Aminocidos.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
9/126
ABSTRACT
The thermodynamic modeling of solid-liquid equilibrium of systems containing amino
acids and proteins has become increasingly necessary for a more rational and
efficient design of unit operations found in the downstream processing of these
molecules, such as precipitation and crystallization. In this work, an unequivocal
relationship between the protein solubility and the pH is presented. The resulting
equation accounts for the different ionization states that protein molecules may
assume in solution, and is written as a function of the primary structure and values of
the ionization constant of each residue in the protein chain. The model was applied to
the solid-liquid equilibrium of porcine insulin solutions at three different temperatures,
solutions of mutant insulin molecules and solutions of b-lactoglobulin at different
sodium chloride concentrations. A very successful correlation of the experimental
solubility data was obtained in all cases. The solubility of amino acids and b-lactam
compounds was also studied through a similar approach, but in this case the non-
ideality of the solutions was accounted for by introducing Pitzers model for
electrolyte solutions. The compounds whose solubility curves as a function of the pH
were modeled include the amino acids DL-Alanine, DL-Methionine, L-Isoleucine, L-
Leucine, DL-Phenylalanine, Glycine and its oligopeptides, and b-lactam compounds
such as ampicillin, which is an antibiotic, and 6-aminopenicillanic acid, which is a
precursor in the ampicillin production route. The interpretation of the binary
interaction parameter values through a statistical thermodynamic approach allowed a
deeper analysis of the results. Finally, equations relating the osmotic second virial
coefficient, the protein solubility and the concentration of precipitant agents such assalts were developed. The resulting equations were successfully applied to solutions
containing lysozyme, ovalbumin and immunoglobulin, which shows that the
considered approach is promising.
Keywords: Chemical Thermodynamics. Solid-Liquid Equilibrium. Proteins. Amino
acids.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
10/126
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 - Estrutura primria da insulina suna: seqncia de aminocidos e pontesde dissulfeto. Grupos ionizveis em negrito e distribuio de carga da configurao
neutra correspondente ao estado de ionizao preponderante.................................47
Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras de insulina em funo do
pH. Dados de pKA de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990). Linha contnua,
frao total. Linha pontilhada, frao preponderante.................................................47
Figura 3.3 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 278,2 K em 10,0 mM
NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto comvalores de pKAde Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com
valores de pKAde Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),
linha semi-contnua....................................................................................................48
Figura 3.4 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 288,2 K em 10,0 mM
NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com
valores de pKAde Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com
valores de pKAde Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),linha semi-contnua. ..................................................................................................49
Figura 3.5 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a 298,2 K em 10,0 mM
NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et al., (2009). Modelo proposto com
valores de pKAde Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990), linha contnua; com
valores de pKAde Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al. (2009),
linha semi-contnua....................................................................................................49
Figura 3.6 - Curva de solubilidade da insulina mutante B13-GluGln em funo do
pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e
Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................52
Figura 3.7 - Curva de solubilidade da insulina mutante B9-SerAsp em funo do
pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e
Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................53
Figura 3.8 - Curva de solubilidade da insulina mutante B25-PheHis em funo do
pH em 0,1 M KCl a 23 oC. Dados experimentais (), Kaarsholm; Havelung e
Hougaard (1990). Equao (3 - 32), linha contnua...................................................53
Figura 3.9 - Solubilidade da b-lactoglobulina bovina em soluo aquosa contendo
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
11/126
NaCl a 298,2 K. Dados experimentais (Grnwall, 1941): 0,001 mol L-1NaCl (); 0,005
mol L-1NaCl (); 0,01 mol L-1NaCl (); 0,02 mol L-1NaCl (). Modelagem: linha
contnua, 0,001 mol L-1; linha pontilhada, 0,005 mol L-1; linha semi-contnua, 0,01 mol
L-1; linha com travesses, 0,02 mol L-1.......................................................................56
Figura 4.1 - Valores de solubilidade da DL-Alanina a 298,15 K em soluo aquosa.
Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009); soluo com NaOH ou HCl (),
Pradhan e Vera (1998); soluo com KOH ou HNO3 (), Pradhan e Vera (1998).
Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .........................70
Figura 4.2 - Valores de solubilidade de DL-Metionina a 303,0 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (), Fuchs et al. (2006).
Modelagem: soluo ideal, linha pontilhada; modelo proposto, linha contnua...... ...70Figura 4.3 - Valores de solubilidade da L-Isoleucina a 298,15 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada). .....................................................71
Figura 4.4 - Valores de solubilidade da L-Leucina a 298,15 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto
(linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).......................................................71
Figura 4.5 - Valores de solubilidade da DL-Fenilalanina a 298,15 K em soluoaquosa (com HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo
Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)........................................72
Figura 4.6 - Valores de solubilidade da L-Serina 298,15 K em soluo aquosa (com
HCl ou NaOH). Dados experimentais (o), Tseng et al. (2009). Modelo Proposto (linha
contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada).................................................................72
Figura 4.7 - Valores de solubilidade da tirosina 298,15 K em soluo aquosa. Dados
experimentais (o), Hitchcock (1924). Modelo considerando o grupo Rionizvel (linhacontnua). Modelo considerando o grupo Rno-ionizvel (linha pontilhada)............75
Figura 4.8 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em
funo do pH. Dados experimentais de glicina (), de diglicina () e de triglicina (),
Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de lda Tabela 4.4:
glicina, linha contnua; diglicina, linha semi-contnua; triglicina, linha pontilhada..... .77
Figura 4.9 - Curva de solubilidade em soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em
funo do pH. Dados experimentais de tetraglicina (), de pentaglicina () e de
hexaglicina (), Lu et al. (2006). Modelagem - Equao (4 - 23) - com valores de l
da Tabela 4.4: tetraglicina, linha contnua; pentaglicina, linha semi-contnua;
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
12/126
hexaglicina, linha pontilhada......................................................................................77
Figura 4.10 - Estrutura da ampicilina.........................................................................79
Figura 4.11 - Estrutura do cido 6-aminopenicilnico................................................79
Figura 4.12 - Valores de solubilidade da ampicilina 283,06 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............80
Figura 4.13 - Valores de solubilidade da ampicilina 288,01 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............81
Figura 4.14 - Valores de solubilidade da ampicilina 292,95 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............81
Figura 4.15 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,03 K em soluo aquosa
(com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o), Santana et al.
(2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha pontilhada)...............82
Figura 4.16 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 283,06 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linhapontilhada).................................................................................................................82
Figura 4.17 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 288,01 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................83
Figura 4.18 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 292,95 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................83
Figura 4.19 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 298,03 K em
soluo aquosa (com HCl ou NaOH) em funo do pH. Dados experimentais (o),
Santana et al. (2010). Modelo Proposto (linha contnua). Modelo Ideal (linha
pontilhada).................................................................................................................84
Figura 4.20 - Valores de solubilidade da ampicilina 298,15 K em soluo aquosa em
funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes mssicas de metanol: (o)
0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana; Mattedi e Giordano (2010).
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
13/126
Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 % (linha com travesses), 30,0 %
(linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada)......................................................85
Figura 4.21 - Valores de solubilidade do cido 6-aminopenicilnico 298,15 K em
soluo aquosa em funo do pH. Dados experimentais a diferentes fraes
mssicas de metanol: (o) 0,0 %, () 15,0 %, () 30,0 % e () 50,0 %. Santana;
Mattedi e Giordano (2010). Modelo proposto: 0,0 % (linha contnua), 15,0 %(linha
com travesses), 30,0 % (linha semi-contnua) e 50,0 % (linha pontilhada).............86
Figura 5.1 - Solubilidade da lisozima da clara de ovo de galinha em funo da
molalidade de cloreto de sdio. Dados experimentais (), Watanabe (2007).
Equao de Cohn (linha contnua).............................................................................95
Figura 5.2 - Valores do segundo coeficiente virial osmtico em funo da molalidadede cloreto de sdio em pH = 4,5. Dados experimentais obtidos em Curtis et al.
(2002). Lisozima nativa, modelo (linha contnua), dados experimentais (). Lisozima
D101F, modelo (linha pontilhada), dados experimentais ()......................................96
Figura 5.3 - Valores da solubilidade da lisozima em funo do segundo coeficiente
virial osmtico. Dados experimentais obtidos em Guo et al. (1999). Lisozima a 25 C
e pH = 4,2 com variaes na concentrao de cloreto de sdio (). Lisozima a 18 C
e pH = 4,5 com variaes na concentrao de cloreto de amnio (). Lisozima a 23C e pH = 7,8 com variaes na concentrao de brometo de magnsio (). Modelo
de Haas; Drenth e Wilson (1999) com z= 3 eA= 0.001 (linha pontilhada). Modelo de
Guo et al. (1999) com Dm= 250 kJ mol-1(linha semi-contnua). Modelo de Ruppert;
Sandler e Lenhoff (2001), (linha com travesses). Equao (5 23) (linha contnua).
...................................................................................................................................97
Figura 5.4 - Solubilidade da ovalbumina em solues de sulfato de amnio. Dados
experimentais (), Judge; Johns e White (1996). Equao de Cohn (linha contnua)....................................................................................................................................98
Figura 5.5 - Segundo coeficiente virial osmtico da ovalbumina em solues de
sulfato de amnio a pH = 4,0. Dados experimentais (), Mehta; White e Litster
(2011). Equao (5 21) com Ks= 2,45 kg mol-1, (linha contnua)............................99
Figura 5.6 - Segundo coeficiente virial osmtico da imunoglobulina humana (IgG)
em solues de cloreto de sdio. Dados experimentais (), estes dados ainda no
foram publicados, mas foram cedidos por Kelly Cristina do Nascimento Alves
Cruvinel (comunicao pessoal). Equao (5 21), (linha contnua)......................100
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
14/126
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 - Anlise da funo qjk...............................................................................45
Tabela 3.2 - Valores de pKAdos grupos ionizveis da insulina humana....................46
Tabela 3.3 - Valores de CQ[Equao (3 40)] e CQG[Equao (3 41)] entre os
modelos aplicados e os dados experimentais de solubilidade de insulina suna a
diferentes temperaturas.............................................................................................51
Tabela 3.4 - Valores de pKAe de nmero de resduo que se ionizam como ctions
(n+) para insulinas mutantes. Dados de Kaarsholm; Havelung e Hougaard (1990)..52
Tabela 3.5 - Valores de pKAdos grupos ionizveis da b-lactoglobulina bovina..........55
Tabela 4.1 - Quadro-resumo de trabalhos sobre a no-idealidade de solues de
aminocidos...............................................................................................................60
Tabela 4.2 - Valores do parmetro de interao le do CQ[Equao (3 40)] para
diversos conjuntos de dados experimentais de solubilidade de aminocidos em
funo do pH..............................................................................................................69
Tabela 4.3 - Valores de CQ[Equao (3 40)] em porcentagem para os diferentes
modelos aplicados aos conjuntos de dados de solubilidade de DL-Alanina, L-
Isoleucina, L-Leucina, DL-Fenilalanina e L-Serina a 298,15 K. Dados experimentais
de Tseng et al. (2009). ..............................................................................................73
Tabela 4.4 - Valores do parmetro de interao le do CQ(Equao 3 - 40) para
diversos conjuntos de dados experimentais de solubilidade de glicina e seus
oligopeptdeos em funo do pH. Dados experimentais de Lu et al. (2006)..............76
Tabela 4.5 - Valores dos parmetros s, e e CQG para os sistemas contendo
ampicilina e cido 6-aminopenicilnico. Dados experimentais de Santana et al.
(2010).........................................................................................................................80
Tabela 5.1 - Comparao dos valores de CQdefinido pela Equao (3 40) para o
sistema contendo lisozima.........................................................................................97
Tabela A.1 - Valores de pKApara aminocidos, peptdeos e molculas com grupos b-
lactmicos estudados no captulo quatro.................................................................126
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
15/126
LISTA DE SMBOLOS E SIGLAS
Letras latinas
a parmetro universal do Modelo de Pitzer
aH+ atividade do on H+
ai atividade do componente i
aP0 atividade da molcula de protena eletricamente neutra
A rea superficial do soluto
parmetro do modelo de Debye-Hckel
b parmetro universal do modelo de Pitzer
Bij segundo coeficiente virial osmtico para interao entre os componentes iej
B parmetro do modelo de Debye-Hckel
ck carga total de uma molcula de protena em um estado de ionizao k
c carga mdia das molculas de protena
C parmetro do modelo de Debye-Hckel
C1 parmetro ajustvel para clculo do segundo coeficiente virial do modelo de
Pitzer
C2 parmetro ajustvel para clculo do segundo coeficiente virial do modelo de
Pitzer
ds densidade do solvente
D parmetro do modelo de Kirkwood
e carga eltrica
fi fugacidade do componente i
fi0 fugacidade do componente ino estado de referncia
gk restrio de igualdade devido s leis de conservaogEX energia livre de Gibbs excedente
gij parmetro de energia caracterstico da interao entre os componentes iej
gij(.) funo de distribuio radial
Gij parmetro do modelo NRTL
I fora inica
kB constante de Boltzmann
Ks constante de salting-out
Kk constante do equilbrio de ionizao entre uma molcula de protena neutra e
uma molcula da mesma protena em um estado de ionizao k
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
16/126
L(.) operador lagrangeano
m nmero de componentes no sistema
mi molalidade do componente i
mi0 molalidade do componente ino estado de referncia
m0 molalidade de molculas eletricamente neutras de protenas
msal molalidade do sal
M ction
nmero de conjuntos de dados experimentais
Ms massa molecular do solvente
n nmero total de resduos ionizveis de uma dada protena
nA nmero de resduos carregados negativamente
nB nmero de resduos negativos no carregados
nC nmero de resduos carregados positivamente
nD nmero de resduos positivos no carregados
n+ nmero de resduos positivos em uma dada protena
N quantidade de matria do sistema
nmero de dados experimentais
NA nmero de Avogadro
Ni quantidade de matria total do componente ino sistemaNi
(a) quantidade de matria do componente ina fase a
p presso
P0 protena eletricamente neutra
Pk+c protena em um estado de ionizao k com carga total +c
r coordenada radial
R constante real dos gases
S entropia
solubilidadeSA solubilidade de um dado aminocido
T temperatura
uij potencial intermolecular entre os componentes iej
U energia interna do sistema
U energia interna total do sistema
U(a) energia interna da fase a
V volume do sistema
V volume total do sistema
V(a) volume da fase a
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
17/126
ws massa do solvente
Wij potencial da fora mdia entre os componentes iej
xi frao molar do componente i em fase condensada
X nion
yi frao molar do componente iem fase gasosa
zi carga eltrica do componente i
z+ carga eltrica do ction M
z- carga eltrica do nion X
Letras gregas
aj frao ionizada do resduoj
aij parmetro de no-aleatoriedade na mistura
a+1 frao de grupos amina ionizados em sistemas contendo aminocidos
a-1 frao de grupos cido carboxlico ionizados em sistemas contendo
aminocidos
b parmetro da equao de Cohn
g tenso superficial do solventeg0 tenso superficial da gua pura
gi coeficiente de atividade do componente i
gA0 coeficiente de atividade de um aminocido eletricamente neutro
g coeficiente de atividade inica mdio
e parmetro de interao atrativa de van der Waals
e0 permissividade do vcuo
er constante dieltrica
ejk carga do resduojem uma molcula de protena em um estado de ionizao
k
hj(.) funo auxiliar que depende apenas do resduoj
qjk(.) funo auxiliar que depende tanto do resduo j quanto do estado de
ionizao k
k inverso do comprimento de Debye
ke termo de correo no clculo da variao do potencial qumico devida
energia envolvida na formao de uma cavidade para alocar a molcula nasoluo
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
18/126
lk multiplicador de Lagrange relativo restrio de igualdade gk
lij segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer para as interaes entre os
componentes iej
l-1 segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre as formas aninica e
zwitterinica de um dado aminocido
l+1 segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre as formas catinica e
zwitterinica de um dado aminocido
l0 segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre a forma zwitterinica e a
forma neutra no-zwitterinica de um dado aminocido
lzwitt segundo coeficiente virial do modelo de Pitzer entre duas molculas
zwitterinicas de um dado aminocidoL coeficiente de salting-in
Lijk terceiro coeficiente virial do modelo de Pitzer para as interaes entre os
componentes i,je k
md momento de dipolo eltrico
mi potencial qumico do componente i
miL potencial qumico do componente ina fase lquida
miS potencial qumico do componente ina fase slida
mi0 potencial qumico do componente ino estado de referncia
Dm* potencial qumico de transferncia de uma molcula de protena do estado
de um gs hipottico para o interior de uma soluo
Dmcav variao do potencial qumico devida energia envolvida na formao de
uma cavidade para alocar a molcula na soluo
Dmelet contribuio eletrosttica variao do potencial qumico
DmvdW variao sofrida pelo potencial qumico devido as interaes atrativas de van
der Waals entre o solvente e o soluto.nj estado carregado do resduoj
n+ coeficiente estequiomtrico do ction M
n- coeficiente estequiomtrico do nion X
p nmero de fases no sistema
P presso osmtica
ri concentrao do componente i
s raio de van der Waals mdioincremento molal da tenso superficial
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
19/126
tij parmetro do modelo NRTL
fA0 frao de molculas de aminocido eletricamente neutras
fk frao de molculas de protena em um estado de ionizao k
coeficiente de fugacidade osmtico
fzwitt frao de molculas de aminocido na forma zwitterinica
f0 frao de molculas de protenas eletricamente neutras
frao de molculas de aminocido eletricamente neutras na forma no-
zwitterinica
f-1 frao de molculas de aminocido na forma aninica
f+1 frao de molculas de aminocido na forma catinica
y nmero de estados de ionizao possveisyj potencial eltrico do componentej
W razo entre o coeficiente de salting-out e o incremento molal da tenso
superficial
Siglas
CQ critrio quantitativo
CQG critrio quantitativo global
NRTL do ingls: Non-Random Two Liquids
pH co-logaritmo decimal da atividade do on H+
pI ponto isoeltrico
pKA co-logaritmo decimal da constante de equilbrio de ionizao
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
20/126
SUMRIO
1 Introduo...............................................................................................................222 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases........................25
2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica................................25
2.2 A equao de Gibbs-Duhem.............................................................................26
2.3 Os critrios de equilbrio de fases....................................................................27
2.4 Fugacidade, atividade e convenes...............................................................29
2.5 Modelos termodinmicos de energia livre de Gibbs excedente.......................31
2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas.......................................32
3 Efeito do pH na solubilidade de protenas..............................................................353.1 Introduo.........................................................................................................35
3.2 Desenvolvimento terico..................................................................................36
3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra...................................39
3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall...................................41
3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens....................................................44
3.3 Resultados e Discusses.................................................................................45
3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura.....................45
3.3.2 Solubilidade da b-lactoglobulina em funo do pH e da fora inica.........54
4 No-idealidade de solues de aminocidos e compostos b-lactmicos...............57
4.1 Introduo.........................................................................................................57
4.2 Desenvolvimento terico..................................................................................61
4.2.1 Clculo das fraes eletricamente neutras e carregadas ..........................61
4.2.2 Modelo de Pitzer ........................................................................................63
4.2.3 Uma abordagem por termodinmica estatstica da no-idealidade...........66
4.3 Resultados e Discusses.................................................................................69
4.3.1 Solubilidade de aminocidos em funo do pH.........................................69
4.3.2 Solubilidade da glicina e de seus oligopeptdeos em funo do pH...........76
4.3.3 Solubilidade de compostos b-lactmicos em funo do pH, da temperaturae do solvente.......................................................................................................78
5 Segundo coeficiente virial osmtico de protenas e suas relaes.........................87
5.1 Introduo.........................................................................................................87
5.2 Desenvolvimento terico..................................................................................89
5.2.1 Potencial qumico de referncia.................................................................90
5.2.2 Equao de Cohn.......................................................................................92
5.2.3 Modelo proposto.........................................................................................93
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
21/126
5.3 Resultados e Discusses.................................................................................94
5.3.1 Resultados para a lisozima........................................................................94
5.3.2 Resultados para a ovalbumina...................................................................98
5.3.3 Resultados para a imunoglobulina humana.............................................1006 Concluses...........................................................................................................101
7 Referncias bibliogrficas.....................................................................................104
Apndice A Integrao do perfil de carga em funo do pH.................................110
Apndice B Cdigo-fonte do programa de clculo de solubilidade de protenas. .112
Apndice C Expresso para o coeficiente de atividade de um soluto no ensemblede McMillan-Mayer...................................................................................................117
Apndice D Cdigo-fonte do programa de ajuste de parmetros para o clculo dasolubilidade de aminocidos e compostos b-lactmicos..........................................121
Anexo A Valores de pKAusados nos clculos do quarto captulo.........................126
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
22/126
22
1 Introduo
et si in tanta scriptorum turba mea fama in obscuro sit,
nobilitate ac magnitudine eorum me qui nomini officient
meo consoler
(Titus Livius, inHistria de Roma)
Apesar de muitos acreditarem ser a Termodinmica uma rea concluda do universo
cientfico, prova-se constantemente que, justamente por estar a Termodinmicaconsolidada do ponto de vista formal da lgica matemtica e da interpretao fsica,
ela pode contribuir de modo nico para a descrio de fenmenos descritos apenas
recentemente. A revoluo biotecnolgica, que marca desde a segunda metade do
sculo XX at os dias correntes tanto os processos industriais quanto a pesquisa
acadmica, traz consigo desafios importantes para uma maior compreenso dos
sistemas ditos biolgicos, ou seja, sistemas que tm como alguns de seus
componentes molculas de algum modo originadas de seres vivos.A importncia mais bvia da Termodinmica reside no fato de ela poder fornecer
uma imensa gama de informaes sobre o sistema com a necessidade de poucos
parmetros. Este fato tanto mais relevante quanto mais complexo for o sistema
estudado. Na verdade, a Termodinmica em sua forma mais primitiva prescinde
inclusive da hiptese atmica, o que a garante tal generalidade que ainda em uma
natureza na qual no houvesse tomos suas leis seriam vlidas e poderiam ser
aplicadas irrestritamente. Quanto a isso, notam-se na introduo de seu livro sobre
Termodinmica Estatstica as observaes de Terrell L. Hill:
[...] Although thermodynamics itself does not provide a molecular picture of
nature, this is not always a disadvantage. Thus there are many complicated
systems for which a molecular theory is not possible; but regardless of
complications on the molecular level, thermodynamics can still be applied to
such systems with confidence and exactness.[]
(HILL, 1986, p. 1)
A reside a explicao para a comunho entre a Termodinmica e todas as outras
cincias da natureza, sem considerar os aspectos filosficos muitas vezes
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
23/126
23
apropriados das leis da Termodinmica.
No h mais espao (se que antes houve algum) para a pesquisa cientfica que se
limite a uma nica rea do conhecimento. Dessarte, os profissionais de
Termodinmica tm na medida do possvel servido a comunidade cientfica como um
todo, com interpretaes, modelos e mesmo dados experimentais de propriedades
que auxiliam as pesquisas dedicadas s mais diversas reas.
No caso de sistemas que contm protenas, h uma grande e crescente demanda
por conhecimento devido s inmeras aplicaes, seja no setor farmacutico, seja
na indstria alimentcia. Aqui, estudar-se-o alguns destes sistemas. A abordagem
pretendida corresponde explorao dos limites da termodinmica clssica na
descrio destes sistemas.Molculas de protena apresentam, entre outras, uma caracterstica que torna a sua
modelagem termodinmica um pouco mais complicada: a presena de ons na
cadeia. Pode-se dizer que a teoria de solues eletrolticas nasce, ou pelo menos,
ganha notoriedade com o trabalho de Petrus Debye e Erich Hckel, que no incio da
dcada de 1920, propuseram um mtodo de clculo da no-idealidade devida
presena de eletrlitos em soluo atravs da soluo linearizada e unidirecional da
equao de Poisson-Boltzmann. Mesmo assim, as solues contendo eletrlitosainda hoje so alvo de intensa pesquisa. At porque a prpria teoria de lquidos
ainda um captulo no qual h hoje muito esforo empregado. Quando se pensa em
protenas, que na verdade so polieletrlitos muito menos simples que polieletrlitos
de polmeros sintticos, a modelagem se apresenta repleta de simplificaes, sejam
de ordem geomtrica (tal como considerar a protena uma esfera), sejam de ordem
de distribuio de cargas, dotando a protena de uma carga lquida sem considerar
os diferentes estados de ionizao.As principais intenes aqui pretendidas esto centradas em uma busca por uma
descrio termodinmica mais fiel na sua representao dos fenmenos estudados.
O segundo captulo ser dedicado a uma brevssima reviso dos conceitos
fundamentais de termodinmica de equilbrio de fases de modo a facilitar ao leitor,
desacostumado nomenclatura termodinmica, a compresso dos captulos
seguintes. Diferentemente do segundo captulo, os que o seguiro, com
pouqussimas excees que sero postas em relevo a medida que aparecerem,
integram os desenvolvimentos tericos inditos aqui propostos.
No terceiro captulo ser apresentado o desenvolvimento de uma relao terica
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
24/126
24
para a predio da curva de solubilidade de protenas em funo do pH
considerando que a fase slida nica e s contm molculas eletricamente neutras
de protenas pelo princpio de eletroneutralidade da fase em equilbrio
termodinmico. Resultados para a insulina suna a diferentes temperaturas, algumas
insulinas mutantes e para a b-lactoglobulina a diferentes valores de fora inica
sero apresentados e discutidos tambm neste captulo. Tanto a modelagem quanto
os principais resultados deste captulo foram publicados em um artigo recente
(FRANCO; PESSA FILHO, 2011).
No quarto captulo, a equao deduzida no captulo terceiro ser modificada de
modo a ser aplicada a sistemas contendo aminocidos e molculas com grupos b-
lactmicos incluindo para tanto um termo de no-idealidade calculado pelo modelo
de Pitzer para solues eletrolticas. Ao parmetro de interao introduzido pelo
modelo de Pitzer ser dada uma interpretao a partir da termodinmica estatstica
que permitir uma discusso mais robusta do ponto de vista cientfico.
No quinto captulo sero deduzidas relaes entre o segundo coeficiente virial, a
concentrao de agente precipitante (tipicamente sais) e a solubilidade de protenas.
Sero estudados sistemas com lisozima, ovalbumina e imunoglobulina G humana.
Outros modelos publicados na literatura sero comparados ao modelo proposto.O sexto e derradeiro captulo ser dedicado exclusivamente a exposio das
concluses deste trabalho e a sugesto de trabalho futuros.
Todas estas contribuies visam a aprofundar e a discutir a fsico-qumica envolvida
em sistemas que contm aminocidos ou protenas do ponto de vista clssico da
termodinmica de equilbrio de fases. As relaes aqui desenvolvidas so de
utilidade no apenas da discusso cientfica, mas claramente da aplicao
tecnolgica.Acaba-se, por fim, este introito com uma esperana sutil lanada pelo famoso
historiador romano, Tito Lvio, e aqui registrada sob a forma de epgrafe: a que os
trabalhos que a esse sucedam o superem, e este ser o consolo deste que o
escreve.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
25/126
25
2 Elementos fundamentais da termodinmica de equilbrio de fases
,
(Pilatos, inEvangelho de So Joo)
O objetivo de despender algumas pginas com aspectos introdutrios aos
problemas de equilbrio de fases facilitar ao leitor desta dissertao alguns
conceitos sem os quais a compreenso do trabalho que se segue se tornariaextremamente rdua e laboriosa. No h, todavia, algum intento aqui seno o de
expor exclusivamente o formalismo termodinmico necessrio s dedues que se
seguiro. Reitera-se que nada do que neste captulo est apresentado novo, nem
to pouco fruto da pesquisa a qual esta dissertao justifica sua existncia, todavia,
estas linhas que custaram mais de cem anos de pesquisa em termodinmica so
indispensveis ao entendimento das discusses que se seguiro.
A epgrafe, ainda que de alguma forma jocosa (em uma traduo livre: o queescrevi, escrevi), pretende ilustrar a robustez da termodinmica quanto um ramo da
cincia consistente e inviolvel.
2.1 A equao fundamental em sua representao entrpica
Dado um sistema simples com mcomponentes, a equao fundamental descreve
completamente todos os estados de equilbrio. Em sua representao entrpica, a
equao fundamental dada explicitando a entropia, S, do sistema como funo da
energia interna, U, do volume, V, e da quantidade de matria, N, de cada
componente (MODELL; REID, 1983):
S=S(U , V , N 1 ,...,Nm) (2 - 1)
A equao fundamental representa, assim, uma hipersuperfcie em um espao dem+3dimenses cujos pontos representam estados de equilbrio do dado sistema.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
26/126
26
Sendo uma diferencial exata, a equao fundamental pode ser associada s duas
primeiras leis da termodinmica de modo que a variao infinitesimal de entropia do
sistema seja dada por:
dS(U , V , N 1 ,...,Nm)=1T
dU+p
TdV
i =1
m i
TdNi (2 - 2)
Em que T a temperatura termodinmica:
1T
=( SU)V ,N (2 3)p a presso do sistema:
p=T( SV)U ,N (2 4)
E, mi o potencial qumico da espcie i:
i=T ( SN i )U , V , Nj ,ij (2 5)
2.2 A equao de Gibbs-Duhem
A equao fundamental expressa em sua forma entrpica pela Equao (2 1) pode
tambm ser, e assim comumente , escrita em sua representao energtica:
U=U (S , V , N1 , ..., Nm) (2 6)
Com sua diferencial exata dada por:
dU (S , V , N1 , ...,Nm)=T dSp dV +i=1
m
i dN i (2 7)
Sendo a transformada de Legendre total de uma dada funo
f( x ):n / x =[ x1 , ... , x n] , tem-se que:
T (f( x ))=f(x)k=1
n
( f( x )x k)x k (2 8)E, aplicando-se essa transformada de Legendre total na funo definida na Equao
(2 6), tem-se que:
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
27/126
27
T (U (S , V , N1 , ..., Nm))=U (S , V , N1 , ..., Nm)TS+ pVi =1
m
i N i (2 9)
Tomando a diferencial da Equao (2 9):
d T(U (S , V , N1 , ... ,Nm))=...
...dU (S , V , N1 ,...,Nm)TdSSdT + pdV + Vdpi=1
m
i dN ii =1
m
N idi (2 10)
A equao de Gibbs-Duhem simplesmente dada pela condio de que a variao
infinitesimal da transformada de Legendre total da equao fundamental nula,
logo, observando-se a substituio da Equao (2 7) na Equao (2 10), tem-se:
SdTVdp+i=1
m
N i di =0 (2 11)
Essa Equao (2 11) serve como uma restrio a ser respeitada por qualquer
modelagem termodinmica que se pretenda em equilbrio de fases. Na verdade, ela
usada como garantia de consistncia termodinmica a um dado modelo.
2.3 Os critrios de equilbr io de fases
Em geral, a apresentao que se faz dos critrios para os equilbrio de fases
perpassa caminhos matemticos e propostas de exemplos que acabam por dificultar
a compreenso.
Aqui, tentar-se- um mtodo pouco utilizado nas classes de termodinmica, mas que
segundo a percepo deste que escreve parece apresentar uma consistncia
matemtica que deve por fim isentar dvidas quanto a sua aplicao mais geral.
Tomemos para anlise um sistema isolado com m componentes e p fases; de
acordo com a segunda lei da termodinmica a entropia deste sistema isolado
sempre aumenta em uma dada transformao, logo no equilbrio sua entropia deve
ser mxima de modo que no haja nenhuma transformao que leve o sistema para
outro estado que no seja o de equilbrio.
Deve-se reescrever, ento, a equao fundamental expressa pela equao (2 1)
de modo a contemplar um sistema multifsico:
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
28/126
28
S=S(U ,V ,N1 , ... ,N m) (2 12)
Sendo os vetores definidos por coordenadas de cada fase do sistema:
U =[U(1)
,U(2)
, ...,U()
] (2 13)
V =[V(1) ,V(2) , ...,V ()] (2 14)
N i =[N i(1)
,N i(2)
, ... ,N i( )] , com i =1,2,..., m (2 15)
Posto isto, tem-se que este um problema de maximizao de entropia sujeito s
restries de conservao energtica, espacial e material:
max S=S (U ,V ,N1 , ...,Nm)
s.t. :
g1(U )==1
U()U=0
g2 (V )==1
V()V =0
gj(N i)==1
N i()
N i=0, i=1,... ,m e j=3,... ,m+ 2 (2 16)
Assim, pode-se definir o lagrangeano da entropia como:
L(U ,V ,N1, ...,N m , )=S (U ,V ,N1,... ,Nm)k=1
m+ 2
k gk (2 17)
A condio de otimalidade dada pela condio de gradiente do lagrangeano da
entropia nulo:
L(U , V ,N1, ... ,Nm , )=0 (2 18)
Com isso, ter-se-o (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas:
{
L(U ,V ,N1, ... ,Nm , )
U () =
1T
()1=0, =1,... ,
L (U ,V ,N1,... ,Nm , )
V() =
p()
T()2=0, =1,... ,
L(U ,V , N1,... , Nm , )
N i()
=i
( )
T()i+ 2=0, =1,... , e i =1,..., m
(2 19)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
29/126
29
Obviamente para completar as (m+2)(p +1) equaes a serem satisfeitas, devem-se
incluir as restries de igualdade que reaparecem nas derivada parciais do
lagrangeano pelo multiplicadores de Lagrange.
Logo, tem-se que para maximizar a entropia de um sistema isolado com m
componentes e pfases, devem-se obedecer as seguintes relaes:
11
=T (1)=T (2)==T ()
21
=p (1)=p(2)==p()
i+ 2
1 =i(1)
=i(2)
==i()
, i=1,... , m (2 20)
As equaes apresentadas em (2 20) representam os critrios do equilbrio de
fases: igualdade das temperaturas, das presses e dos potenciais qumicos de cada
componente.
Do ponto de vista de fenmenos de transporte possvel, e at talvez mais fcil,
imaginar que o equilbrio um caso particular do estado estacionrio para o qual a
fora motriz da grandeza responsvel pelo transporte constante e nula, id est, o
transporte s ocorre se h diferena de potencial, se o potencial trmico
(temperatura) for o mesmo em todas as fases do sistema no h transporte de calor,
se o potencial mecnico (presso) for igual em todas as fases do sistema no h
deslocamento de fronteira e, analogamente, se o potencial qumico de cada
componente for o mesmo em todas as fases no h transporte de massa. As
equaes fenomenolgicas mostram claramente como o fluxo dependente da
fora motriz de tal modo que se esta ltima for nula no h fluxo e o sistema est em
equilbrio. Ainda que se considerem acoplamentos, a situao de equilbrio aquela
em que todas as foras motrizes so nulas; portanto, mesmo os efeitos de
acoplamento no ocorrero.
2.4 Fugacidade, atividade e convenes
O potencial qumico tal como proposto por Gibbs na segunda metade do sculo XIX
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
30/126
30
(PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999) no de fcil assimilao,
porque no possvel sua percepo no mundo fsico real de modo to intuitivo
quanto o potencial trmico (temperatura) e o mecnico (presso). No entanto, a
definio de fugacidade d uma idia mais sensvel do fenmeno fsico. A
fugacidade, assim como definida por Lewis, substitui a presso no clculo do
potencial qumico de um processo isotrmico de um gs ideal de modo a contemplar
os efeitos no considerados no modelo de gs ideal:
fi
fi0=exp(ii
0
RT) (2 21)
em que fi a fugacidade do componente i, fi0
a fugacidade do componente i noestado padro,mi o potencial qumico do componente i, mi0 o potencial qumico do
componente ino estado padro, R a constante real dos gases (R= 8,314 J mol-1K-
1), T a temperatura do sistema em K.
Pela sua definio possvel equivaler a igualdade de fugacidades de cada
componente em todas as fases do sistema como um critrio de equilbrio alternativo
ao da igualdade de potenciais qumicos expressa na Equao (2 20) sem perda de
generalidade.
Para um gs ideal puro, a fugacidade igual a presso e, para uma mistura de
gases ideais, igual a presso multiplicada pela frao molar: yip. A definio de
fugacidade assim completada pelo limite observvel a todos os sistemas puros ou
misturados no qual o comportamento destes sistemas se aproxima do de gs ideal
para presses muito baixas:
limp0
fi
y i p=1 (2 22)
em que yi a frao molar do componente ie p a presso do sistema.
Embora a definio de fugacidade ajude nos clculos de equilbrio de fases de
gases, sua aplicao a sistemas condensados um tanto quanto mais complicada.
Isto se deve ao fato de ter-se relacionado tudo a diferena entre o comportamento
do sistema real e o do gs ideal; e, portanto, isso exige dados experimentais a
temperatura e composio constante sobre todo o intervalo de densidades no se
excetuando a regio bifsica. Como na maioria das vezes no se dispe de tamanha
quantidade de informaes, usa-se alternativamente uma outra abordagem para
clculos da fase lquida. Definindo uma soluo ideal e calculando os desvios entre
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
31/126
31
a soluo real e essa soluo ideal pelas propriedades de excesso, que no caso da
energia livre de Gibbs de excesso ou ainda, energia livre de Gibbs excedente
est relacionada ao coeficiente de atividade. Assim, cabe definir a atividade de um
componente e o coeficiente de atividade deste componente. Da prpria definio de
fugacidade expressa pela Equao (2 21), define-se a atividade como:
a i=fi
fi0 (2 23)
De modo similar ao que est escrito em (2 22), surge a necessidade de se definir o
coeficiente de atividade, g, de um dado componente icomo:
i=a
i
x i (2 24)
Aqui cabe explicitar algo que ser necessrio: a conveno simtrica e a
assimtrica. Esta necessidade emerge a medida em que se arbitra qual o estado
padro (ou estado de referncia) com o qual se executar o clculo do potencial
qumico. Na conveno simtrica, o estado padro o mesmo para todos os
componentes; j na conveno assimtrica, no.
2.5 Modelos termod inmicos de energia livre de Gibbs excedente
O coeficiente de atividade est relacionado a energia livre de Gibbs excedente ou
seja, a diferena entre a energia livre de Gibbs de um sistema real e a energia livre
de Gibbs de uma mistura ideal pela seguinte equao:
lni =[ (g
EX
RTi =1
m
N i)N i
]T , p ,N
j
(2 25)
A Equao (2 25) traz a possibilidade de ao se propor um modelo de energia livre
de Gibbs excedente, possa-se avaliar a no-idealidade de um dado componente em
soluo. Um dos modelos mais aplicados nos ltimos quarenta anos o famoso
NRTL (da sigla em ingls: Non-Random Two Liquids) que foi proposto em um artigo
de Renon e Prausnitz (1968). Na sua forma para sistemas multicomponentes, a
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
32/126
32
energia livre de Gibbs excedente dada por:
gEX
RT
=i=1
m
x i
j=1
m
jiGji xj
l=1
m
G li x l
(2 26)
em que, o parmetro tij dado pela diferena entre os parmetros de energia
caractersticos da interao de iej, gij:
ji =gjig ii
RT(2 27)
E, o parmetro Gij dado pela exponencial da multiplicao entre o parmetro tije o
parmetro de no-aleatoriedade na mistura aij:
Gji =exp(ji ji ) , c om ji=ij (2 28)
Em termos do logaritmo natural do coeficiente de atividade de um dado componente
i, tem-se que:
lni =j=1
m
ji Gji xj
l=1
m
Gli x l
+j=1
m xj G ij
l=1
m
G lj x l
(ijr=1
m
x rrj Grj
l=1
m
G li x l
)(2 29)
Coube aqui apresentar mais pormenorizadamente este modelo em especial, para
ajudar a discusso de uma particular aplicao a sistemas contendo aminocidos
apresentada no captulo quarto. Evidentemente h outros tantos e to importantes
modelos que inclusive sero citados ao decorrer do texto, todavia como a aplicao
do modelo NRTL ser comparada a aplicao de um outro modelo neste trabalho,
considerou-se por bem apresentar sua formulao.
2.6 Modelos termodinmicos para solues eletrolticas
Enquanto a prpria teoria de lquidos ainda objeto de intensa pesquisa, no foi
abandonada durante o sculo passado, e nem nos prximos o ser, a modelagemde solues que contenham eletrlitos. A natureza de tais solues traz
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
33/126
33
complicaes adicionais a este tipo de modelagem e restries antes no
consideradas tais como o princpio de eletroneutralidade da fase termodinmica em
equilbrio estvel.
A teoria de Debye-Hckel publicada no incio dos anos de 1920 foi pioneira no
tratamento de solues eletrolticas e at hoje constitui um trabalho de referncia na
maioria das publicaes relacionadas a este tema. Este teoria est baseada na
soluo linearizada e unidirecional da equao de Poisson-Boltzmann (HILL, 1986):
2j=4e
i
z i i(1z i eikB T) (2 30)
em quey
o potencial da espciej,
e a carga eltrica,
e a permissividade do
vcuo, zi a carga eltrica da espcie i, ri a concentrao da espcie i, kB a
constante de Boltzmann e T a temperatura.
Pela soluo da Equao (2 30), e por algumas consideraes, chega-se ao
coeficiente de atividade de uma espcie inica no limite de altas diluies:
lnj=zj
2e
2
2kB T (2 31)
em que k o inverso do comprimento de Debye1:
2=
4e2
k BT
i
i z i2
(2 32)
Muitas vezes esta Equao (2 32) escrita em termos da fora inica, I, que
definida como:
I=12
i
m i z i2
(2 33)
em que mi a molalidade do componente iem mol por kilograma.
De fato este modelo um modelo limite a concentraes de eletrlitos muito baixas,
tipicamente limitado a fora inica da ordem de 0,01 mol kg-1 (PRAUSNITZ;
LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999). No decorrer do sculo passado outros
modelos foram propostos com o intento de ampliar a faixa de aplicao a sistemas
eletrolticos; um dos mais exitosos nesta empresa o modelo de Pitzer (PITZER,
1973). No fundo, este modelo pode ser dividido em dois termos principais: um de
1 O comprimento de Debye uma distncia de interao caracterstica associada ao potencialeletrosttico blindado (PRAUSNITZ; LICHTENTHALER; AZEVEDO, 1999).
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
34/126
34
longo alcance que devido as interaes eletrostticas anlogas ao modelo de
Debye-Hckel, e um de curto alcance que uma expanso virial de modo a assumir
a hiptese que as interaes entre muitos corpos pode ser dividida em contribuies
de interaes de dois-a-dois, trs-a-trs e assim por diante. Este modelo tambm se
baseia em uma proposio para a energia livre de Gibbs excedente:
gEX
RTw s=f(I )+
i
j
m i mj ij (I)+i
j
k
m i mj mk ijk+ ... (2 34)
em que ws a massa de solvente, f(I) uma funo dependente da fora inica, lij
o parmetro das interaes binrias (dois-a-dois) e Lijk o parmetro das interaes
ternrias (trs-a-trs).
Como as propriedades termodinmicas so usualmente medidas para eletrlitos
neutros e no espcies inicas individuais, convencionou-se escrever os modelos
para solues eletrolticas aplicando a restrio de eletroneutralidade em termos de
um coeficiente de atividade inica mdio que dado pela mdia geomtrica dos
coeficientes de atividade do ction e o do nion. Esta abordagem que para sistemas
salinos, por exemplo, muito interessante, no o para polieletrlitos, para os quais
algumas complicaes aparecem. Em termos do coeficiente de atividade inica
mdio, o modelo de Pitzer dado por:
ln=13z+ z-( e
2
0rk B T)3/ 2
(2ds NA)1/2
8 [ 2b ln(1+ bI )+ I1+ bI ]+ ...
...+ m( 2+ -+ + -){2 (0)+ 2(1)
2I[1(1+ I1/ 2
2I
2)exp(I 1/ 2)]}+ ...
...+ 9m 2
[ (+ -)
2
++ -](+ MMX+ -MXX) (2 35)
em que n+e n-so respectivamente os coeficientes estequiomtricos do ction Me
do nion X. Os outros parmetros sero definidos no quarto captulo quando da
aplicao do modelo de Pitzer.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
35/126
35
3 Efeito do pH na solubilidade de protenas
Si lon veut noncer le prncipe dans toute sa gnralit et en lappliquant lUnivers, on le voit pour
ainsi dire svanouir et il ne reste plus que ceci: il y a quelque chose qui demeure constant.
(Henri Poincar, in Thermodynamique)
3.1 Introduo
Os primeiros trabalhos relacionados modelagem da curva de solubilidade de
protenas em funo do pH datam do incio do sculo XX. Green (1931) props um
modelo para a curva de solubilidade da carboxihemoglobina eqina considerando
que esta protena se comportaria tanto como um cido bivalente quanto uma base
bivalente. J Grnwall (1941) atribuiu a Linderstrm-Lang o desenvolvimento de um
modelo capaz de predizer a curva de solubilidade a partir da integrao do perfil de
carga da protena. Este trabalho de Grnwall, apesar de esquecido, de extrema
importncia e relevncia tanto para o trabalho aqui apresentado quanto, e aqui um
motivo muito mais nobre, para o desenvolvimento de modelos a partir das
ferramentas da termodinmica clssica.
digno de nota o trabalho de Fredericq e Neurath (1950) no qual uma proposta de
equacionamento para uma correlao semi-emprica da curva de solubilidade de
insulina apresentada. No h, de fato, algo novo em relao modelagem do
efeito do pH na curva de solubilidade neste trabalho; no entanto, apesar de no
haver qualquer meno ou referncia quanto origem da equao proposta, nota-se
que uma aplicao direta da equao descrita por Grnwall (1941). H uma
hiptese implcita no trabalho de que o perfil de carga lquida da insulina em funo
do pH seja linear na regio do ponto isoeltrico, o que bastante plausvel para
muitas protenas. Assim, pela integrao da equao diferencial proposta por
Grnwall (1941), uma correlao semi-emprica quadrtica obtida. Refora-se o
uso da expresso semi-emprica devido natureza dual da equao: em parte
advinda de um desenvolvimento terico descrito por Grnwall (1941) e atribudo a
Linderstrm-Lang; e em parte pela necessidade de se obterem parmetros a partir
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
36/126
36
de um ajuste de um conjunto de dados experimentais.
Contudo, os trabalhos mais recentes se concentram na modelagem da curva de
solubilidade de aminocidos em funo do pH dando maior enfoque aos modelos
termodinmicos para solues no-ideais, tanto atravs de equaes de estado
como de modelos de energia livre de Gibbs excedente.
Entretanto, o primeiro trabalho dedicado exclusivamente modelagem e predio da
curva de solubilidade de protenas propriamente dita em funo do pH foi publicado
por Tjong e Zhou (2008). Neste trabalho, a solubilidade foi calculada a partir da
energia livre de transferncia da fase slida para a fase lquida. Para a execuo
deste clculo, a energia livre de transferncia foi dividida em duas contribuies:
uma de natureza eletrosttica, calculada pela mdia de 100 conformaes proticasadvindas da aplicao de dinmica molecular a pH constante; e outra, de natureza
no-eletrosttica, baseada na rea superficial acessvel ao solvente. Porm, o
esforo computacional requerido pelo modelo por eles proposto para calcular
apenas alguns pontos da curva no apresenta uma aplicabilidade razovel. Alm
deste trabalho, Tashima et al. (2009) propuseram uma modelagem termodinmica
para prever a curva de solubilidade especificamente da insulina suna aplicando o
modelo de Pitzer truncado aps o segundo coeficiente virial.Aqui uma relao analtica entre a solubilidade de protenas em funo do pH ser
desenvolvida sob a hiptese de que a atividade da molcula de protena
eletricamente neutra permanece constante com o pH. Assim se entende a epgrafe
deste captulo e que encontrada no apenas neste mas em muitos
desenvolvimentos tericos: h alguma coisa que permanece constante.
3.2 Desenvolvimento terico
No caso do equilbrio slido-lquido, no qual a fase slida nica e contm apenas
molculas de um soluto i, a condio do equilbrio de fases expressa na Equao (2
20) supondo a igualdade de presses e temperaturas das fases a priori dada
simplesmente por:
iL(T , p , x)=i
S(T , p) (3 1)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
37/126
37
em que miL o potencial qumico do soluto na fase lquida e miS o potencial qumico
do soluto na fase slida. Desprezando-se os efeitos da presso sobre o clculo do
potencial qumico, hiptese comum a sistemas que no envolvam fase gasosa, tem-
se que para um processo isotrmico no h variao do potencial qumico da fase
slida j que sua composio fixa; portanto, o potencial qumico do soluto na fase
lquida tambm no se altera em tal processo. Posto isto, conclui-se que mudanas
nas condies da fase lquida tais como variao de pH no alteram o potencial
qumico do soluto nesta fase.
A solubilidade de um soluto em fase lquida a concentrao de equilbrio deste
componente nesta fase. Assim, se a solubilidade do soluto for suficientemente
diminuta, para um processo isotrmico desprezando-se os efeitos da presso, pode-
se adotar a considerao de uma soluo ideal segundo a lei de Henry e expressar
o potencial qumico deste soluto na fase lquida em termos de molalidade como:
iL(m )=i
0(m 0)+ RT lnm i
mi0 (3 2)
em que:
m0=[0,0,...,0, m i
0=1,0,..., 0] (3 3)
Sendo mia molalidade do soluto na fase lquida, ou ainda a solubilidade do soluto
em termos de molalidade; e, mi0(m0) o potencial qumico de referncia do soluto. Este
estado de referncia escolhido o estado de referncia de uma soluo ideal de
concentrao unitria, ou seja, uma soluo hipottica na qual o soluto tem uma
molalidade mi0 = 1,0 mol kg-1, mas experimenta as mesmas interaes que se
estivesse em uma soluo a infinita diluio.
Quando o soluto uma protena, outros pormenores devem ser levados em conta. Amolcula de protena um polieletrlito biolgico e, sendo assim, esta se ioniza em
soluo aquosa. Isto se deve ao fato de que alguns aminocidos que compem a
protena tm grupos polares que participam de equilbrios qumicos com o on H+.
Para grupos alcalinos, o equilbrio de ionizao :
NH 3+NH2+ H
+ (3 4)
Todavia, para grupos cidos, o equilbrio de ionizao :
COOHCOO-+ H+ (3 5)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
38/126
38
A partir destes equilbrios qumicos possvel notar que as molculas de protena
em uma soluo tm diferentes estados de protonao, e, portanto, distintos valores
de carga eltrica. Porm, a solubilidade determinada experimentalmente a soma
da concentrao de todas as molculas de protenas.
Sendo a fase slida composta apenas por protena e sendo uma fase em equilbrio
estvel, pelo princpio de eletroneutralidade nela deve haver somente molculas
eletricamente neutras. Isto significa que o equilbrio de fases se estabelece apenas
entre molculas de protena eletricamente neutras. Logo, a Equao (3 2) no
vlida para qualquer molcula de protena, mas apenas e to-somente para as
molculas de protena eletricamente neutras. E, por conseqncia do critrio de
equilbrio de fases expresso na Equao (3 1), a molalidade das molculas deprotena eletricamente neutras na fase lquida deve permanecer inalterada com a
variao do pH da soluo. A molalidade destas molculas uma frao da
solubilidade da protena nesta soluo. Assim pode-se escrever:
m0=0(pH )S (pH ) (3 6)
em que m0 a molalidade das molculas de protena eletricamente neutras da fase
lquida, f0 a frao de molculas de protena eletricamente neutras da fase lquida
e S a solubilidade da protena na fase lquida. Contudo, conforme afirmado
anteriormente, m0deve ser constante com a variao do pH, assim ao se aplicar a
Equao (3 6) no ponto isoeltrico, pode-se escrever que:
m0=0(pI )S( pI) (3 7)
Logo, pela simples comparao entre as Equaes (3 6) e (3 7), chega-se
seguinte relao:
S( pH)=0(pI )S (pI )0(pH )
(3 8)
A Equao (3 8) descreve a curva de solubilidade de uma dada protena em
soluo em funo do pH. Apesar de ser uma equao simples, resta ainda a
dificuldade de se calcular a frao de molculas de protena eletricamente neutras
na fase lquida.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
39/126
39
3.2.1 Clculo da frao de protena eletricamente neutra
Para o clculo da frao de molculas de protena eletricamente neutras
indispensvel considerar que todos os resduos efetivamente ionizveis da protena,
inclusive os grupos amina e cido carboxlico terminais, podem estar eletricamente
carregados ou no devido aos equilbrios qumicos expressos nas Equaes (3 4)
e (3 5). Sendo no nmero total de resduos ionizveis de uma dada protena, o
nmero de estados de ionizao possveis, y, :
=
=0
nn!
(n)!!=
=0
n
(n
)=2n (3 9)
Dentre estes estados, alguns representam molculas de protena cuja carga total
seja nula. A carga de uma molcula de protena dada pela soma da carga
individual de cada resduojem um dado estado de ionizao k:
ck=j=1
n
jk (3 10)
em que ejk a carga individual de cada resduo jem um dado estado de ionizao ke pode ser expressa como:
jk={1, paragrupos cidoscarregados0, paraquaisquer grupos neutros
+ 1,paragrupos bsicoscarregados(3 11)
Considerando que a equao de Henderson-Hasselbach vlida para cada grupoj
e que o equilbrio qumico estabelecido entre o grupoje o on H+ independente de
qualquer outro equilbrio qumico desta natureza que ocorra nesta mesma molculade protena, tem-se que a frao ionizada deste grupoj dada por:
j (pH)=( 11+ 10pHpKAj )[(1+ j)
2
(j1)
210pHpK Aj] (3 12)
em que pKAj o co-logaritmo decimal da constante de equilbrio qumico do grupoje
nj o estado carregado do grupo j (-1, para grupos cidos e, +1, para grupos
alcalinos).
Assim, a frao de molculas de uma dada protena em um dado estado deionizao k dada pelo produtrio da frao do grupo jcom a carga especfica
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
40/126
40
associada ao estado de ionizao k:
k(pH )=i=1
n
j' (pH) (3 13)
Sendo que:
j' (pH)={ j (pH) , sejk01j (pH ), sejk=0 (3 14)
Logo, substituindo a Equao (3 12) na Equao (3 14) e a resultante na
Equao (3 13), ter-se- que a frao de molculas de protena eletricamente
neutras em um dado estado de ionizao k dada simplesmente por:
k(pH )=j=1
n
{(1
1+ 10pHpKAj )[(1+ j
2 jk)10pHpKAj(
j12 jk)]} (3 15)
Sujeita seguinte restrio de eletroneutralidade:
j=1
n
jk=0 (3 16)
Apesar de a frao de molculas de protena eletricamente neutras de um dado
estado de ionizao kdepender do pH, a razo entre esta frao e a frao demolculas de protena eletricamente neutras em outro estado de ionizao qualquer
lno depende do pH. Pode-se demonstrar por argumentos de equilbrio qumicos
entre molculas eletricamente neutras em diferentes estados de ionizao que esta
razo dada por (FRANCO; PESSA FILHO, 2011) :
logk(pH )
l (pH )=
j =1
n
pKAj(jkjl) (3 17)
Assim, indiferente qual estado de ionizao que resulte em uma molcula
eletricamente neutra de protena utilizado para efetuar o clculo da Equao (3
8). Combinando as Equaes (3 8) e (3 15), tem-se que a curva de solubilidade
de uma dada protena em funo do pH dada por:
S( pH)=S (pI)j =1
n
{(1+ 10
pHpKAj
1+ 10pIpK
Aj)[(1+ j2 jk)10pIpKAj(j12 jk)]
[(1+ j
2
jk
)10pHpKAj
(j1
2
jk
)]}(3 18)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
41/126
41
para qualquer estado de ionizao kque respeite a restrio imposta na Equao (3
16). Basicamente a Equao (3 18) uma expresso para a predio da curva
de solubilidade de uma dada protena em funo do pH da soluo e requer como
parmetros apenas a solubilidade no ponto isoeltrico e informaes a respeito da
estrutura primria da protena, ou seja, a seqncia de aminocidos que a compe e
as respectivas constantes de equilbrio de ionizao. Isto torna esta abordagem
extremamente relevante e de fcil aplicao.
3.2.2 Extenso teoria de Linderstrm-Lang e Grnwall
fato que as primeiras tentativas de se prever a curva de solubilidade de uma
protena, em funo seja do pH seja da concentrao de agente precipitante, datam
da primeira metade do sculo passado, quando ainda muito poucas informaes
estruturais sobre protenas eram conhecidas. Ainda assim, clebres trabalhos como
o de Cohn (1925) e o de Green (1931) so ainda hoje referncias abundantemente
citadas e prepararam de certo modo o caminho trilhado neste quase um sculo dededicao pesquisa sobre a fsico-qumica de sistemas proticos. Infelizmente
alguns trabalhos de no menor importncia ficaram esquecidos. Este o caso do
trabalho de Grnwall (1941). Neste trabalho Grnwall atribui a Linderstrm-Lang o
desenvolvimento de uma teoria para o clculo da solubilidade de protenas em
funo do pH atravs da integrao do perfil de carga lquida da protena em funo
do pH.
As hipteses desta teoria apresentada por Grnwall (1941) so: i) o equilbrio slido-lquido se estabelece com as molculas eletricamente neutras de protena em
soluo; ii) a variao do pH da soluo no altera a atividade das molculas
eletricamente neutras de protena em soluo.
Assim, poder-se-ia reconstituir a formulao de Linderstrm-Lang e Grnwall
partindo do seguinte equilbrio entre uma molcula de protena eletricamente neutra
e uma molcula ionizada em um dado estado de ionizao kcom uma carga total c:
P0+ cH+ P
k
+ c (3 19)
cuja relao de equilbrio dada por:
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
42/126
42
K k=a
P k+ c
a P0a
H+
c(3 20)
em que Kk a constante de equilbrio referente a Equao qumica (3 19), aPk a
atividade da molcula de protena de carga total cem um estado de ionizao k, aP0
a atividade da molcula de protena eletricamente neutra e aH+ a atividade do on
H+. Todavia, a atividade de um componente o produto entre sua concentrao e o
coeficiente de atividade deste componente (g) Equao (2 24). Assim, a
molalidade da molcula de protena com carga total ce em um estado de ionizao
k dada por:
mk=K ka P 0
aH
+
c
k(3 21)
J a solubilidade da protena a soma das concentraes de todos os estados de
ionizao possveis, mesmo de cargas totais distintas:
S=k=1
mk=k=1
K ka P0
aH
+
c
k(3 22)
Derivando a Equao (3 22) com respeito atividade do on H+
e assumindo que aatividade da molcula de protena eletricamente neutra permanece constante:
dS
d aH
+
=a P0k=1
c aH+c1 K k
ka P0
k =1
aH+c K k
k2
d k
d aH
+
(3 23)
O segundo termo do lado direito da Equao (3 23) pode ser simplificado do
seguinte modo:
a P0
k=1
a
H
+
c K k
k2
d k
d a H+=a P
0
k=1
a
H
+
c K k
k
d lnk
d a H +=
k=1
mkd lnk
d a H +(3 24)
Considerando que os coeficientes de atividade da gua e do on H+so constantes a
Equao (3 24) deve ser nula para que a equao de Gibbs-Duhem seja satisfeita
(uma deduo para a equao de Gibbs-Duhem est apresentada no seo 2.2do
segundo captulo). Assim, a Equao (3 23) pode ser reescrita como:
d lnS
d lna H+=
(a H +
S
)d S
d a H+=k =1
c aH+c K k
k
k=1
aH
+
c K kk
=k =1
c mk
k=1
mk
=c (3 25)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
43/126
43
em que c a carga mdia das molculas de protena conforme proposta de
Linderstrm-Lang (1924). Reescrevendo a Equao (3 25) em termos de pH:
d logSd pH =c (3 26)
A Equao (3 26) descreve a curva de solubilidade da protena em funo do pH
pela integrao da carga mdia da protena. Esta equao foi primeiramente
derivada por Grnwall (1941). Entretanto, o nico mtodo de aplicao desta
equao encontrado na literatura era realizado pela aproximao linear do perfil de
carga na regio do ponto isoeltrico e a integrao da reta resultante. Contudo,
pode-se relacionar a carga mdia da protena com as informaes da estruturaprimria da mesma atravs da seguinte equao:
c (pH)=j=1
n
j j (pH ) (3 27)
Inserindo a Equao (3 12) na Equao (3 27), tem-se que:
c (pH)=12j=1
n
( 11+ 10pHpK Aj)[1+ j(1j)10pHpKAj ] (3 28)Logo, substituindo a Equao (3 28) na Equao (3 26):
d logSd pH
=12j=1
n
( 11+ 10pHpK Aj)[1+ j(1j)10pHpKAj ] (3 29)A Equao (3 29) pode ser integrada de um pH de referncia at o pH no qual se
deseja calcular a solubilidade da protena. Tomando como pH de referncia o ponto
isoeltrico, pI:
logS(pI)
logS(pH )
d logS=12
pI
pH
{j =1n
( 11+ 10pHpKAj)[1+ j(1j )10pHpKAj ]}
d pH (3 30)
Fazendo a integrao como apresentado no Apndice A, chega-se a:
logS (pH)S (pI )
=j=1
n
[log(1+ 10pHpK Aj1+ 10pIpKAj )(1+ j )2 (pHpI)] (3 31)Ou ainda:
log S (pH)S (pI )
=n+(pIpH )+j=1
n
[log(1+ 10pHpK
Aj
1+ 10pIpKAj )] (3 32)
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
44/126
44
em que n+ o nmero total de grupos alcalinos na molcula de protena.
A Equao (3 32) relaciona a solubilidade da protena com a variao do pH da
soluo. A prxima subseo dedicada a provar que tanto a Equao (3 18)
quanto a Equao (3 32) so equivalentes.
3.2.3 Equivalncia entre as duas abordagens
Apesar das formulaes aparentemente distintas, tanto a integrao do perfil de
carga mdia da protena quanto o desenvolvimento exposto em 3.2.1so anlogos.Ao se tomar o logaritmo decimal da Equao (3 18), tem-se que:
logS (pH)S (pI)
=j=1
n
log(1+ 10pHpKAj
1+ 10pIpKAj)+ ...
...+j=1
n
log
{[(1+ j2 jk)10pIpKAj(j12 jk)]
[(1+
j
2 jk)10pHpKAj
(
j
1
2 jk)]}(3 33)
Pelo bem da simplicidade, definir-se-o duas funes:
j( pH)=log(1+ 10pHpKAj
1+ 10pIpKAj) (3 34)
jk (pH )=log
{[(1+ j
2
jk
)10pIpK Aj
(
j1
2
jk
)][(1+ j2 jk)10pHpKAj(j12 jk)]}(3 35)
Fica evidente pela observao das Equaes (3 34) e (3 35) que a funo hjno
depende do estado de ionizao k, enquanto a funo qjkdepende. Assim, pode-se
analisar cada possibilidade. Esta anlise da funo e qjk est na Tabela 3.1.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
45/126
45
Tabela 3.1 - Anlise da funo qjk.nj jk qjk Nmero de resduos
-1 -1 pI - pH nA-1 0 0 nB
+1 +1 0 nC+1 0 pI - pH nD
Pela Tabela 3.1, possvel inferir que a Equao (3 33) pode ser escrita como:
logS (pH)S (pI )
=(nA+ nD)( pIpH )+j =1
n
j(pH) (3 36)
Entretanto, a Equao (3 36) deve tambm satisfazer a restrio expressa na
Equao (3 16), assim:
j=1
n
jk=0nA=nC (3 37)
Portanto, de acordo com a restrio de eletroneutralidade advinda da Equao (3
37), tem-se que:
(nA+ nD)=(nC+ nD)=n+ (3 38)
Logo, a Equao (3 36) respeitando a restrio de eletroneutralidade pode ser
escrita como:
logS (pH)S (pI )
=n+(pIpH )+j=1
n
j (pH) (3 39)
Assim fica provada a identidade entre as Equaes (3 18) e (3 32).
3.3 Result ados e Discusses
3.3.1 Solubilidade da insulina em funo do pH e da temperatura
A Tabela 3.2 apresenta os valores de pKAdos grupos ionizveis da insulina humana
para o clculo da curva de solubilidade desta protena em funo do pH de acordo
com a Equao (3 32). H na Tabela 3.2 dois conjuntos de valores de pKA: um
chamado isolado que o valor do pKA do aminocido livre obtido pela titulao
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
46/126
46
potenciomtrica do aminocido, e outro que o valor do pKAna cadeia protica e
obtido pela titulao potenciomtrica da protena.
Tabela 3.2 - Valores de pKAdos grupos ion izveis da insulina humana.Aminocido Grupo Nmero pKA(isolado)a pKA(cadeia)b
Gly -NH2(terminal) 1 9,80 7,38
Glu -COOH 4 4,30 4,37
Tyr Fenol-OH 4 10,90 10,20
Asn -COOH (terminal) 1 2,00 3,45
Phe -NH2(terminal) 1 910 7,38
His Imidazol-NH2 2 6,00 5,98
Arg Guanidina-NH2 1 12,50 11,10
Lys -NH2 1 10,80 8,52
Ala -COOH (terminal) 1 2,30 3,45
aStryer (1995).bKaarsholm; Havelung e Hougaard (1990).
De fato, os dados que sero correlacionados aqui so de insulina suna; entretanto,a diferena entre a insulina suna e a insulina humana de apenas um aminocido
em termos de estrutura primria, logo bastante razovel considerar que os valores
de pKAna cadeia da insulina humana so praticamente iguais aos valores do pKAna
cadeia da insulina suna.
O cdigo-fonte do programa de clculo dos diversos estados de ionizao bem
como do clculo da curva de solubilidade est apresentado no Apndice B.
Como a insulina possui ao todo 16 grupos ionizveis, o nmero de estados deionizao possveis : y= 65536. Destes, 8008 estados tem carga nula. A frao
total , pois, a soma das fraes destes 8008 estados cuja carga total seja nula. Na
Figura 3.1, ilustra-se a estrutura primria da insulina suna destacando-se os grupos
ionizveis e a distribuio de carga da molcula eletricamente neutra cuja frao
preponderante. Deve-se notar que o estado de ionizao correspondente a molcula
eletricamente neutra que prepondera aquele no qual h maior possibilidade de
resduos eletricamente carregados que ainda resultam em uma molcula neutra,
exceo da tirosina (Tyr), estarem carregados positiva ou negativamente nesta
configurao.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
47/126
47
Na Figura 3.2, so apresentadas as curvas de frao de molculas de insulina
eletricamente neutras em funo do pH na regio do ponto isoeltrico. H neste
grfico duas curvas: uma que a soma de todas as fraes neutras, chamada
frao total; e, outra que representa o estado de ionizao neutro preponderante da
insulina.
Figura 3.2 - Frao de molculas eletricamente neutras deinsul ina em funo do pH. Dados de pKAde Kaarsholm; Havelunge Hougaard (1990). Linha contnua, frao total. Linha pont ilhada,
frao preponderante.
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
pH
Figura 3.1 - Estrutura primria da insul ina suna: seqncia de aminocidos e pontes dedissul feto. Grupos ionizveis em negrito e distr ibuio de carga da configurao neutra
correspondente ao estado de ioni zao preponderante.
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
48/126
48
Observa-se pela Figura 3.2 que as fraes de molculas de protena eletricamente
neutras alcanam um ponto mximo exatamente no ponto isoeltrico, ponto este que
pode ser definido como pH no qual a carga lquida mdia das molculas de protena
nula. Ou seja, o ponto mximo da frao de molculas neutras corresponde ao
ponto de mnima solubilidade.
J as Figuras 3.3, 3.4 e 3.5 apresentam o resultado da modelagem para trs
diferentes temperaturas para a curva de solubilidade da insulina suna em funo do
pH. Comparam-se o modelo proposto calculado com diferentes valores de pKA
valores de pKAisolados; e, valores de pKAna cadeia com o modelo proposto por
Tashima et al. (2009).
Figura 3.3 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a278,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et
al., (2009). Modelo proposto com valores de pKAde Kaarsholm;Havelung e Hougaard (1990), linha cont nua; com valores de pKA
de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.(2009), linha semi-contnua.
4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
28,0
32,0
Solubilidadex105/mol.kg
-1
pH
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
49/126
49
Figura 3.4 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a288,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et
al., (2009). Modelo proposto com valores de pKAde Kaarsholm;Havelung e Hougaard (1990), linha cont nua; com valores de pKA
de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.(2009), linha semi-contnua.
4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
28,0
Solubilidadex105/mol.kg
-1
pH
Figura 3.5 - Solubilidade da insulina suna em funo do pH a298,2 K em 10,0 mM NaHCO3. Dados experimentais (), Tashima et
al., (2009). Modelo proposto com valores de pKAde Kaarsholm;Havelung e Hougaard (1990), linha cont nua; com valores de pKA
de Stryer (1995), linha pontilhada. Modelo de Tashima et al.(2009), linha semi-contnua.
4,0 4,5 5,0 5,5 6,00,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
Solubilida
dex105/mol.kg
-1
pH
7/26/2019 Estudo do equilbrio slido-lquido de sistemas contendo aminocidos e protenas
50/126
50
Deve-se notar que a validade do modelo restrita a regio prxima ao ponto
isoeltrico; j que para valores de pH distantes deste ponto a curva de frao de
molculas neutras tende a zero, resultando pela Equao