Cap.24 - Aminoácidos e Proteínas

capíturo24

Aminoácidos e Proteinas

Anticorpos Catalíticos: Catalisadores DesenhistasOs químicos estão se aproveitando da adaptabilidade natural do sistema imunológico para criar aquilo quepodemos adequadamente chamar de catalisadores desenhistas. Tais catalisadores são anticorpos-espécies deproteínas geralmente produzidas pelo sistema imunológico para capturaÍ e remover agentes estranhos, masque, neste caso, são eliciados de modo a tomá-los capazes de catalisar reações químicas.

A criação dos primeiros anticorpos catalíticos por Richard A. Lerner (Scripps Research Institute) e Peter G.Schultz (Universidade da Califórnia, Berkeley) representou uma união engenhosa de princípios relacionadosà química das enzimas e às capacidades naturais do sistema imunológico. Em alguns aspectos os anticorposcatalíticos são como as enzimas, as proteínas catalisadoras que já mencionamos por muitas vezes e que estu-daremos mais adiante neste capítulo. Diferente das enzimas, os anticorpos catalíticos podem virtualmente ser"feitos para possibilitar" as reações específicas por um casamento de química e imunologia. Exemplos inclu-em anticorpos catalíticos para rearranjos de Claisen, reações de Diels-Alder, hidrólise de ésteres e reaçõesaldólicas. Mais adiante, em "A Química de... Alguns Anticorpos Catalíticos", estudaremos como os anticor-pos catalíticos são produzidos. Catalisadores desenhistas estão, de fato, à mão.

24.1 Introdução24.2 Aminoácidos24.3 Síntese de ct-Aminoácidos em Laboratório24.4 Análise de Polipeptídios e Proteínas24.5 A Seqüência de Aminoácidos nos Polipeptídios e nas

Proteínas24.6 Estruturas Primárias de Polipeptídios e Proteínas

24.7 Síntese de Polipeptídios e de Proteínas24.8 Estruturas Secundária, Terciária e Quaternária das

Proteínas24.9 Introdução às Enzimas

24.10 Lisozima: Modo de Ação de uma Enzima24.11 Proteases Serina24.12 Hemoglobina: Uma Proteína Conjugada

398 Aminoácidos e ProteÍnas

24.1 lNrnoDuçÃoSão nês os grupos de polímeros biológicos: polissacarídeos, proteínas e ácidos nucléicos. Estudamos os

polissacarídeos no Cap. 22 e vrnos que eles funcionam, principalmente, como reseryas de energia, comomarcadores bioquímicos das superfícies das células e, nos vegetais, como materiais estruturais. Quando es-tudarmos os ácidos nucléicos no Cap. 25 veremos que servem para dois objetivgs principais: aÍmazenÍìmen-to e ffansmissão de informação. Dos ffês grupos de biopolímeros, são as proteínas que possuem as funçõesmais diversas. Como enzimas e hormônios, as proteínas catalisam e regulam as reações que ocoÍrem no or-ganismo; como músculos e tendões, proporcionam ao cor?o os elementos do movimento; como pele e cabe-lo, oferecem ao corpo revestimento extemo; como moléculas de hemoglobina, ffansferem o importante on-gênio para os locais mais remotos do organismo; como anúcorpos, nos fomecem os meios de proteção con-tra doenças; e em combinação com oufras substâncias, nos ossos, proporcionam suporte esfutural.

Com tal diversidade de funções, não seria su4neendente descobrir que as proteínas existam em diversostamaúos e formas. Pelos padrões da maioria das molécúas que já estudamos, mesmo as proteínÍÌs pequenaspossuem pesos molecúares múto altos. A lisozima uma enzima, é uma proteína relativamente pequena eainda assim seu peso molecular é 14.ffi. Os pesos moleculares da maioria das proteínas são muito maiores.Suas formas abrangem uma faixa que vai das proteínas globulares, tais como lisozima e hemoglobina, até ashélices da a-queratina (cabelos, uúas e lã) e as lâminas (folhas) pregueadas da fibroína da seda.

Apesar desta diversidade de tamanho, formato e função, todas as proteínas têm característicascomuns que nos permitem deduzir suas estruturas e compreender suas propriedades. Mais adianteneste capítulo veremos como se faz isto.

Proteínas são poliamidas e suas unidades monoméricas compreendem cerca de 20 a-aminoáci-dos diferentes:

Ligaçõesamida

R'

HICHI\ ü. . . / \ t . . . /

C-N C-Ni l t i l l

..o.. H ..o.. HParte de uma moldtula de proteína

As células usam c-aminoácidos diferentes para sintetizar proteínas. A seqüência exata dos a-ami-noácidos ao longo da cadeia protéica é denominada estrutura primária da proteína. Como o nomesugere, esta estrutura primária é de importância fundamental. Para a proteína exercer certa função espe-cífica, a estrutura primária deve estar bem determinada. Veremos mais adiante que quando a estruturaprimária está correta, a cadeia de poliamidas se dobra, de modo apropriado, para lhe oferecer a formanecessária para executar uma tarefa específica. Este dobramento da cadeia das poliamidas leva a níveisde complexidade maiores, chamados de estruturas secundárias e terciárias da proteína. A estruturaquaternária surge quando a proteína contém uma agregação de mais de uma cadeia de poliamida.

A hidrólise de proteínas em meio ácido ou alcalino produz uma mistura de diferentes aminoácr-dos. Embora a hidrólise de proteínas naturais possa levar a até cerca de 22 amrnoâcidos diferentes.todos eles possuem uma importante característica estrutural em comum: com exceção da glicina (cu-jas moléculas são aquirais), quase todos os aminoácidos naturais possuem configuração L no carbo-no a.* Isto é, possuem a mesma configuração relativa que o L-gliceraldeído:

H-

Um

RICH

,/\N: C-OHt l l

H ..O..

a-aminoácido

-NII

H

RI

,'C(.

R''

CH

c-il

..o..

C.tl

,.o..

NI

H

9o,tH2N>C<H

R

UmL-a-aminoácido

[usualmente um(S)-o-aminoácidol

CO,HI

H"N--t-H- lR

IroHO>C<H cH2co2H

=l

cH2oH NH'L-Gliceraldeído Glicina[(S)-gliceraldeídol

CHOI

HO----+-HI

cH2oH

Projeções de Fischer para um L-a-aminoácidoe para o L-gliceraldeído

minoácidos são obtidos do material das puedes celuìres de bactérias e da hidrólise de certos mtibióúcos.

Aminoácidos e Proteínas 399

24.zAurNoÁctDos

24.2A Estrutura e Nomes

Os 22 a-atnnoácidos que podem ser obtidos das proteínas podem ser subdivididos em três gru-pos diferentes, com base nas estruturas de suas cadeias laterais, R. Estes aminoácidos estão na Tabe-la24. l .

De fato, apenas 20 dos 22 a-aminoácidos da Tabela 24.1 são usados pelas células na síntese deproteínas. Dois aminoácidos são sintetizados após a cadeia da poliamida estar completa. Hidroxipro-lina (presente principalmente no colágeno) é sintetizada a partir da prolina, e cistina (presente namaioria das proteínas) é sintetizada a partir da cisteína.

A conversão da cisteína em cistina requer um comentário adicional. O grupo -SH da cisteína atomaam tiol. Uma propriedade dos tióis é que eles podem ser convertidos em dìssulfetos por agentesoxidantes brandos. Esta conversão, por sua vez, pode ser revertida pela ação de agentes redutoresbrandos.

fol2 R-S-H i---) R*S-S-R

DissulfetotHl

,-Ligação dissulfeto

2 HO2CCHCHTSH +

HO2CCHCH2S9SCHTCUCOTH

Veremos mais adiante como as ligações dissulfeto entre unidades de cisteína na cadeia das proteínascontribuem para a estrutura e paÍa o formato globais da proteína.

24.28 Aminoácidos Essenciais

Os aminoácidos podem ser sintetizados por todos os organismos vivos, vegetais ou animais. Muitosanimais superiores, porém, são deficientes no que se refere à capacidade de sintetizar todos os ami-noácidos que necessitam para suas proteínas. Assim, estes animais precisam de certos aminoácidoscomo parte de suas dietas. Para um humano adulto, são oito os aminoácidos essenciais; estão repre-sentados pelo índice superior e, na T abela 24.1.

24.2CAminoácidos como íons Dipolares

Os aminoácidos contêm um grupo básico (-NHr) e um grupo ácido (-COOH). No estado sóli-do, seco, os aminoácidos existem çomo íons dipolares, uma forma em que o grupo carboxila estápfesente como íon carboxilato, -1Or-, e o grupo amino como'íon amínio, -NH3+. (ons dipolaressão também chamados zwitterions.) Em solução aquosa, existe um equilíbrio entre o íon dipolar e asformas aniônica e catiônica do aminoácido.

NH,

Cisteína

H,frcHcornI

R

NH, NH,

Cistina

;!f; u,ilcuco" ;rf; H,NCHC.,-+H3O*l-+HìOFl

' Forma catiônica(predominante em

soluções fortementeácidas, com pll 0,

por exemplo)

,RIon dipolar

RForma aniônica

(predominante emsoluções fortementebásicas, com pII 14,

por exemplo)

Em solução, a forma predominante do aminoácido depende do pH da solução e da nâtureza doaminoácido. Em soluções fortemente ácidas, todos os aminoácidos estarão presentes, principalmen-

te como cátions; em soluções fortemcnte básicas, eles estarão presentes como ânions. Num certo pH

intermediário, chamado de ponto isoelétrico (pD, a concentração do íon dipolar será miíxima e asconcentrações dos ânions e cátions serão iguais. Cada aminoácido tem seu próprio ponto isoelétrico,que está mostrado naTabela24.l.

400 Aminoácidos e Proteínas

Tabela 24. I L-Aminoácidos encontrados nas Proteínas

ïo'"H,N-Ï-H

R

Hro..

R>C-CO2IJ

NHt

Estrutura de R Nome{ AbreúaçõesPK"t

a-CO2IlPK"z

a-NH3+PK,. dogrupo R

x

F

pI

Aminoácidos Neutros-H-CH.-cH(cH3)'-cH2cH(cH3)2-cHcH2cH3

IctI3

^-cH'-1( ))

\Y-cH2coNH2-cH2cH2coNH'

HOC-CH-CH2tl

HN CH,\ . /

CH,(estrutura completa)

-cH2oH_CHOH

CH,

GlicinaAlanina

Valina"Leucina"Isoleucina"

Fenilalanina"

AsparaginaGlutamina

Triptofano"

Prolina

SerinaTreonina"

Tirosina

Hidroxiprolina

Cisteína

Cistina

Metionina"

G ou GliA ou Ala

V ou ValL ou LeuI ou Ile ou Ileu

F ou Fen ou Phe

N ou AsnQ ou Gln

W ou Tri ou Trp

P ou Pro

S ou SerT ou Ter ou Thr

Y ou Tir ou Tyr

Hyp ou Hipro

C ou Cis ou Cys

Cis-Cis ou Cys-Cys

M ouMet

)a

2,4)4

9,6

9,69,6g7

6,06,06,06,06,1

9,4

1,8

2,0') ')

2,4

ol

8,89,r

-CH,

)-/^\( i l I'ú--\r'H

otl

6,32,0 10,6

o,

t0,4 Á<

) )2,6

6,3

9,r

9,7

) ' )

t ,9

5,0

5,1

5,8

8,3

10,1

1,7

r,6Z,J

10,8

7,99,99,2

otl

HOC-CH-CH2tl

HN CH\, / \

cH, oH(estrutura completa)

-cH2sH_cH,_i

I-cH2-s-cH2cH2scH3


Tabela 24. I L-Aminoácidos encontrados nas Proteínas (continuação)

ïo,tH,N-Ï_H

R

H'o

R>C-COzIJ.

NH,

Estrutura de R Nome' AbreviaçõesPKor

a-COzHPKoz

a-NH3t

pK,r dogrupo R pI

R Contém um grupo Acido (CarÌroxila)

-cH2co2H-cH2cH2co2H

R Contém um Grupo Básico-cHrcH2cH2cH2NH2

Ácido aspártico

Ácido Glutâmico

Lisina"

D ou AspE ou Glu

K ou Lis ou Lys

R ou Arg

H ou His

NH

-CH2CH2CH2NH-C-NH2 Arginina

n-Ni l rl

-CHr-\i{.2 Histidina

IH

)1

' ) )

' ) )

) )

1.8

9,89,7

9,0

9,0

9,2

3,947

10,5'

1a <b

6,00

3,0J,a

9,8

r0,8

7.6

'e : aminoácido essenciaÌ.òpK" da amina protonada do grupo R.

Consideremos inicialmente um aminoácido com a cadeia lateral que não contém grupos ácidosnem básicos - um aminoácido tal como a alanina.

Se a alanina estiver presente em uma solução foÍemente ácida (p. ex., em pH 0), estará principal-mente na forma catiônica mostrada abaixo. O pK.para o grupo carboxila da forma catiõnica é 2,3.Este valor é consideravelmente menor do que o do pK, do ácido carboxflico coÍrespondente (p. ex.,o do ácido propiônico) e indica que a forma catiônica da alanina é o ácido mais forte. Mas esperarí-amos que fosse assim. Afinal, é uma espécie canegada positivamente e, por isto, deve perder umpróton mais facilmente.

CH.CHCO,H CH.CH,CO,H- lTH,

Forma catiônica da alanina Acido propanóico

pKo,' 2,3 pKo = 4,89

A forma do íon dipolar de um aminoácido é também um ácido em potencial, pois o grupo -NH,*

pode doar um próton. O pK, do íon dipolar da alanina é 9,7 .

cHlcHc02-

*".

Px")=i:t

O ponto isoelétrico (pI) de um aminoácido como a alanina é amédia entre pK,r ePK"z-

2.3 + 9.7pI : t=t- : 6.0 (ponto isoelétrico da alanina)

O que isto significa sobre o comportamento da alanina, quando o pH da solução fortemente ácidaem que se encontra vai sendo gradualmente aumentado pela adição de base (isto é, de OH-)? No

início (pH 0) (Fig. 24.1), a forma catiônica predomina. Quando a acidez chega a pH2,3 (o pK, daforma catiôni ca, pK.r),metade da forma catiônica estará convertida em íon dipolar.* Com o próximo

xA equação de Henderson-Hasselbalch mostra que pila um ácido (HA) e sua base conjugada (A-)

p&=pH*"r f f iQumdo o ácido estiver metade neutrâlizado, [HA] = [A ] e log tHAytA-l : 0; assim' pH = pÇ.


Fig.24.l Curva de titulação

de CH.CHCOTH.I

YH,

I4

t2

10

pH

0r0 0,5 1,0 1,5

Equivalentes de OH-

aumento de pH - de pH2,3 para pH 9,7 - aforma predominante será a do íon dipolar. Em pH 6,0.o pH é igual ao pI e a concentração do íon dipolar é máxima.

oH- OH

2,0

CH3CHCO2H 5;f

CH3CHCO2- 5;J

CH3CHCO2

NH.+-

Forma catiônica Íon

NH,

oH-=-----------}H,o*

-oHH.NíCH.).CHCO. T--- H2N(CH2)4çHCO2

'"1 ' H,c INH, NH,

lH,dipolar Forma aniônica

(pK.,= 2r3) QtK",= 9r7)

Quando o pH atinge pH9,7 (o pK, do íon dipolar), metade do íon dipolar está convertido na formaaniônica. Então, à medida que o pH se aproxima de pH 14, a forma iônica torna-se a forma predomi-nante na solução.

Se a cadeia lateral do aminoácido possuir um grupo ácido, ou básico, extra, então o equilíbrio émais complexo. Considere, por exemplo, a lisina, üm aminoácido que possui um grupo -NH, extrano caÍbono e. Em soluções fortemente ácidas, a lisina está presente como um dicátion, pois ambos osgrupos amino estão protonados. O primeiro próton a ser perdido, à medida que o pH aumenta, é umpróton do grupo carboxila (pK,: 2,2); o próximo vem do grupo a-amínio (pK, : 9,0) e o último dogrupo e-amínio.

+H3N(CH2)4CHCO2H

INH.+-

Forma dicatiônicada lisina

(pK",= 2,2)

O ponto isoelétriço da lisina é a média entre o pK"r(do monocátion) e opKo. (do íon dipolar).

ot : 4S : 9.8 (ponto isoelétrico da lisina)

OH+

-

HrN(CH2)4CHCO2-Hro* -

|NH.+-

Formamonocatiônica

(pK",= 9ro)Íon dipolar(p.Ko. = 10,5)

Forma aniônica

Probfema 24.1 > Que forma do ácido glutâmico você espera que predomine em: (a) soluções fortemente ácidas? (b)Soluções fortemente básicas? (c) No seu ponto isoelétrico (pl3,2)? (d) O ponto isoelétrico daglutamina (pI 5,7) é consideravelmente maior do que o do ácido glutâmico. Explique.

t

"'"*i:"/

/

oK^ = 9.7

I/

PI= 6,03H?CHCOt- l

1'/r:'i:f':

Probfema 24.2>


NH

O grupo guanidino-Ng-ë-NHrda arginina é um dos grupos orgânicos mais fortemente

básicos. Explique.

24.3 SíNTESE DE o-AMlNoÁclDos EM LnaoRAroRlo

Muitos métodos foram desenvolvidos para a síntese de a-aminoácidos em laboratório. Descreve-

remos aqui três métodos gerais, todos baseados em reações que já vimos antes.

24.3AAmonólise Direta de Ácido ot'Halogenado

R-CH.CO.H l l i I '=* r RCHCO,H \Hr(excesso)

' R-CHCO"-

(2)H2u I ' I

x lH'Este método é, possivelmente, o menos usado, pois os rendimentos costumam ser baixos. Vimos

um exemplo deste método na Seção 18.9.

24.38 A partir da Ftalimida Potássica

Este método é uma modificação da síntese de Gabriel piìÍa as aminas (Seção 20.54). Os rendi-

mentos costumam ser altos e os produtos são facilmente purificados'

o

, -)\l ( ) l N- K+ + c lcH2co2c2H5 -+

t\lA--1\\o

Ftalimidapotássica

o

Cloroacetato de etila

,^-4 ,,, kôr{ru ô - 1/\nco'ut'Ol- !-cn,co,.,t, *#4 cH,cõ, + l( ) | + c2H5oH:\ NH, v^co,H

o+

Em uma variação deste procedimento usa-se ftalimida potássica e a-bromomalonato de dietila

para preparaÍ um -éster

imidomalõnico. Ilustramos o método com a síntese da metionina.

(e7%)

P.4.-{l( )l ,N- K+ + BrcH(corcrHr), $r'orfiv\

oo-Bromomalonato de dietila

o

Glicina Ácido(85%) ftálico

NaOCHTCH, ,NCH(Co2C2Hs)z ìffiH,scu,

(e6-e8%)

oÉster

ftalimidomalônico


Problema 24.3 >

f co2c2H5rÂr-'\ | "ì( ) l .N-ccH2cHrscH, iq>

v\ 1o,.,",o

. '-.CO2-l t ' \ l Co"-

V\.-Nul*r,cu,scH3 J9=-i l lo cor-

oll

--\ -COH

CH,SCH,CH,CHCO, + COI -íOT- | \7 con

ÌH' ADL-Metionina

partindo do a-bromomalonato de dietila e da ftalimida potássica, e usando quaisquer outros

reasentes necessários, mostre como você sintetizaria: (a) Dl-leucina, (b) Dl-alanina e

(c) Dl-fenilalanina.

24.tC A Síntese de Strecker

O tratamento de um aldeído com amônia e cianeto de hidrogênio produz uma a-aminonitrila. Hi-

úólise do grupo nitrila (Seção 18.3) da a-aminonitrila converte-a em um a-aminoácido. Esta síntese

é chamada de síntese de Strecker.

otl

RCH+NH3+HCN ___+ RCHC* llff___* RCHCO2-

NH,

c-Aminonitrila

NH,+

a-Aminoácido

A primeira etapa desta síntese provavelmente envolve a formação inicial de uma imina, a partir do

aldeído e da amônia, seguindo-se da adição de cianeto de hidrogênio'

ffm Mecanismo Para a Reação

Formação de uma a-Aminonitrila Durante a Síntese de Strecker

o- OHI -H"Ol l - l+ l

RCÌ{ +iNH3 ----}

RCHNH3 + RCHNH2È--./

tr-r*-nín=Nn r+ RCH-NH

\a lCN

Imina

H,O*T-L---', RCH-NH2

ICN

c-Aminonitrila


l Exemplo

Esboce a síntese de Strecker para a Dl-tirosina.

Resposto

,'^ro-\!/-cH2cHCo2

NÉ{.+

DL-Tirosina

probf ema 24.4> (a) Esboce a síntese de Strecker para a Dl-fenilalanina. (b) Dl-metionina também pode ser preparada

oela síntese de Strecker. O aldeíão inicial pode ser preparado a paftiÍ da acroleína (CHr: CHCHO) e

ào metanotiol (CH3SH). Esquematize todas as etapas desta síntese da Dl-metionina.

24.3D Resolução de DL'Aminoácidos

Com exceção da glicina, que não possui um estereocentro, todos os aminoácidos obtidos pelos

métodos que descrevemos sãó produádos nas formas racêmicas. Para obter o L-aminoácido natural

devemos,ìbviamente, resolvei a forma racêmica. Isto pode ser feito de vários modos, incluindo os

mótodos descritos na Seção 20.3.Um método particulaimente interessante para resolver aminoácidos baseia-se no emprego de en-

zimas chama dai deacílase.ç. Estas enzimas cãhlisam a hidrólise de N-acilaminoácidos em organis-

mos vivos. Como o sítio ativo da enzima é quiral, ela hidrolisa apenas os N-acilaminoácidos de con-

figuração L. Quando a enzimaé exposta à mistura racêmica de N-acilaminoácidos, apenas o deriva-

aõ Oo -L-aminoácido

é afetado, e os produtos, conseqüentemente, são facilmente separados'

DL-RCHCO, (cH1co)2o

>

IfH'

(forma racêmica)co, Çor-

* l lH3N-J-H + HÌ-NHCOCH3

l lRR

L-Aminoácido D-N-Acilaminoácido

DL-RCHCOTH -r,*..*

cHlco2H

cHlcoNH

24.3E Sínteses Estereosseletivas de Ami noácidos

A síntese ideal de um aminoácido, é claro, seria a que produzisse apenas o L-aminoácido de ocor-

rência natural. Hoje em dia este ideal pode ser atingido com o uso_de catalisadores quirais de hidroge-

nação, derivados ãe metais de transição. Uma grande variedade de catalisadores tem sido usada' Um

deies, desenvolvido por B. Bosnich (du Uniu"tiidade de Toronto), baseia-se num complexo de ródio

"oÁ (n)-t,Z-Uis(difenilfosfino)propano, um composto conhecido como "(R)-profos". Quando um.com-

pi;;;j" ródio ào norbornadiáno ixnn) é trataão com (R)-profos, este substitui uma das moléculas

do norbornadieno que estão ao redor do átomo de ródio e produz um complexo quiral de r6dio'

H,Czt{a-an,

(c6H5)2É r1cuH,;,(R)-Profos

tRh(NBD)rlClOo + (R)-protbs----) [Rh((Ã)-profo$(NBD)]ClO4 + NBDComplexo quiral de ródio

Separados facilmente

406 Arninoácidos e PÍoteínas

O tratamento deste complexo de ródio com hidrogênio, em um solvente como o etanol, produz umasolução contendo o catalisador quiral de hidrogenação, ativo, que provavelmente tem a composição

[Rh((R)-profosXHr(BtOH)r] +.

Quando o ácido 2-acetllaminopropenóico é adicionado a esta solução, realizando a hidroge-nação, o produto da reação é o derivado N-acetilado da L-alanina, com 9OVo de excessoenantiomérico. Posterior hidrólise do grupo N-acetil gera a L-alanina. Como o catalisador dehidrogenação é quiral, ele transfere seus átomos de hidrogênio de modo estereosseletivo. Estetipo de reação é normalmente chamado de síntese assimétrica ou síntese enantiosseletiva (Se-

ção 5.88).

H

cH,:c-co,H %"'t í- .o,"NHCOCn, NHCOCH3

Ácido N-Acetil-L-atanina2-acetiìaminopropenóico

__:"r t ) OH . H:O. calor(2) H,O+

, t ,ata_C+ _

/NH.+-

L-Alanina

O mesmo procedimento foi usado para sintetizarem-se vários outros L-aminoácidos a partir de

ácidos 2-acetilaminopropenóicos com substituintes na posição 3. O uso do catalisador (R)-profos na

hidrogenaçãodoisômero (Z)produzoL-aminoácidocomumexcessoenantioméricode87-93Vo.

H CO.H\/C:C

R NHCOCH3

H(1)lRh((R)-profosXHzXsolvente)z]+, Hr, *atr&"

-aar^-(2)OH.H2O.calor:depoisHsO'

/NH.+'

L-AminoácidoÃcido Q\-2-acetilaminopropenóico.

3-substitúdo

z4.4ANeuse DE PoLrpEpríDtos E PRorEíNAsAs enzimas podem causar a polimerização dos a-aminoácidos, através da eliminação de água:

oo*l l . l l

n *-f" c-o- + H3N-cH-c-o-

RR'

It-",otü

oo*l l l l

H3N-CH-C-NH-CH-C-O-

RR'

Um dipeptídio

A ligação -CO-NH- (amida) que se forma entre os aminoácidos é conhecida como ligaçãopeptídica ou laço peptídico. Os aminoácidos unidos desta maneira (diferentes de quando estão li-vres) são chamados de resíduos de aminoácidos. Os polímeros que contêm 2, 3, alguns poucos (en-tre 3 e 10) ou muitos resíduos de aminoácidos são chamados dipeptídios, tripeptídios, oligopeptí-dios e polipeptídios, respectivamente. Proteínas são moléculas que contêm uma ou mais cadeias depolipeptídios., Polipeptídios são polímeros lineares. Uma das extremidades da cadeia do polipeptídio termina

com um resíduo de aminoácido que tem um grupo -NH,* livre; a outra termina com um resíduo deaminoácido que tem um grupo -{Or- livre. Estes dois grupos são chamados de resíduo N-termi-nal e resíduo C-terminal, respectivamente.

t


i / t \ ?H,ú-cu-ëtNu-1-ëtNH-1u-c-o-R\R'I ,R'

Resíduo N-terminal Resíduo C-terminal

Por convenção, representamos as estruturas dos peptídios e das proteínas çom o resíduo do aminoá-cido N-terminal à esquerda e o resíduo C-terminal à direita.

HrC CHr H.C CHr

Glicilvalina Valilglicina(Gti.yal) ffal.Gli)

O tripeptídio glicilvalilfenilalanina pode ser representado do seguinte modo:

ot l

+ l lIT3NCH2C-NH

CHol /^cH-< ( )FSO,-tv

CHo

J"[email protected],

CIc

oo*l l l l

H3NCH2C-NHCHCO-I

CH,/\

oo. l l l l

H3NCHC-NHCH2CO-I

CH

ool l l l

TIC_NHCHCO-

HrC

Glicilvalilfenilalanina(Gli.Val.Fen)

Quando se refluxa uma proteína ou um polipeptídio com ácido clorídrico 6M, por 24h, normal-mente ocorre hidrólise de todas as ligações amida, produzindo uma mistura de aminoácidos. Umadas primeiras tarefas a cumprir na determinação da estrutura de um polipeptídio ou de uma proteínaé a separação e a identificação dos aminoácidos individuais presentes na mistura. Como até 22 ami-noácidos diferentes podem estar presentes, esta tarefa torna-se formidável se nos restringirmos aosmétodos convencionais.

Felizmente, foram desenvolvidas técnicas baseadas no princípio da eluição cromatográfica,que simplificam imensamente este problema, permitindo, inclusive, que sua solução seja auto-maÍizada. Analisadores automáticos de aminoácidos foram desenvolvidos no Instituto Roçkefel-ler, em 1950, e desde então tornaram-se disponíveis comercialmente. Baseiam-se no uso depolímeros insolúveis contendo grupos sulfonato, chamados de resinas trocadoras de cótíons (Fig.

24.2\ .

I /^.cH<( )FSo,-l \y

q f"'cH,

ô\7/

+H"N_CHCO"H

dl

IR

+H.N-CHCO.H

ol

IR'

+H.N-CHCO.H

ol

IR"

+H"N-CHCO.H

Òl

Iw'

Fig.24.2 Paúe de uma resina trocadora de cátions, com aminoácidos adsorvidos.


Fig. 24.3 Resultado típicoobtido de um analisadorautomático de aminoácidos.[Adaptado com permissãode Spackman, D. H.; Stein,W. H. e Moore, S.Anal.C he m. 19 58, 3 0, 1190-1206,direitos autorais @ porAmerican ChemicalSociety.'l

Se uma solução ácida, contendo mistura de aminoácidos, passaÍ através de uma coluna empaco-tada com resina trocadora de cátions, os aminoácidos serão adsorvidos na resina, devido às forçasatrativas entre os grupos sulfonato, cÉìÍïegados negativamente, e os aminoácidos, carregados positi-vamente. A força da adsorção vaÍia com a basiçidade de cada aminoácido; os que forem mais básicossão presos mais fortemente. Se a coluna for então eluída com solução tamponada, em dado pH, osaminoácidos individuais descerão pela coluna em diferentes velocidades, sendo assim separados. Nofim da coluna, o eluato é misturado com ninidrina, substância que reage com a maioria dos amino-ácidos e dá derivado çom intensa coloração púrpura (\*. 570 nm). O analisador de aminoácidos éconstruído de modo que possa medir, continuamente, a absorvância do eluato (a 570 nm) e registrá-la em função do volume do efluente.

Um gráfico típico obtido de analisador automático de aminoácidos é mostrado na Fig.24.3. Quandoo procedimento é padronizado, as posições dos picos são caracteísticas de cada aminoácido, e asáreas definidas pelos picos correspondem às suas quantidades relativas.

Ninidrina é o hidrato de indano-1,2,3-triona. Com exceção da prolina e da hidroxiprolina, todosos a-aminoácidos encontrados nas proteínas reagem com ninidrina, dando o mesmo ânion de intensacoloração púrpura (ì,.* 570 nm). Não detalharemos o mecanismo aqui, mas observe que a única partedo ânion que provém do a-aminoácido é o nitrogênio.

Indano-1r2r3-triona

o

oNinidrina

o

1,0

(5 n5P õ:ã

<(ú

> n?o

2 u, ,

0,1

0,4

0,1

otl

+ H,o 7^ì-C\ /'oHOr- l t ) l C-H,o v-c/ \ou

\

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2l( ) l FO+RCHCO,- -- : : - : - - - ) l ( ) l FN-</ l ( ) l+RCH+CO.

- \ ( i " , ' ( -Hro v\( ry

O +- O O

Ânion de cor púrpura

Acido -Sulfona da metionina Treonina

Glicina 4ilffiAcido -

glutamrco

Acidoaspártico

Serina

Cistina

Al/ t \ , \

Efluente, mL 60 80 100 I2O 140 160 r80 200

_|-Metionina lqalpr nrnâ

- Llslna -:Hist i , lna=

NH.-F-F

FenilalaninaAr

Arsl{iïaI

-Tirosina-1rf

11.. I I330 350 370 390 410 430 470 490 90 110 130


Prolina e hidroxiprolina não reagem com ninidrina do mesmo modo porque os respectivos grupos cr-amino são aminas secundárias e fazem parte de anel de cinco membros.

24.5 A SeOüÊNcrA DEAt"ílxoactDos Nos PoLIPEPTíDlos E NAsPnorrínns

lJmavez determinada a composição de aminoácidos da proteína ou do polipeptídio, devemos emseguida determinar seu peso molecular. Vários mótodos são disponíveis para isto, incluindo técnicasquímicas, espectrometria de massa, ultracentrifugação, difusão de luz, pressão osmótica e difraçãode raios X. Tendo o peso molecular e a composição de aminoácidos, podemos agora calcular afór-mulamolecular daproÍeína; isto é, podemos saber quantos aminoácidos de cada tipo estão presentesçomo resíduos de aminoácido em cada molécula de proteína. Infelizmente, porém, este é só o come-

ço da tarefa de determinar a estrutura da proteína. A etapa seguinte é realmente formidável. Temosque determinar a ordem em que os aminoácidos estão conectados; ou seja, temos que determinar aestrutura covulente (ou estratura primária) d.o polipeptídío.

Um tripeptídio simples composto por 3 aminoácidos diferentes pode ter 6 seqüências diferentesde aminoácidos; um tetrapeptídio composto por 4 aminoácidos diferentes pode ter 24 seqüências.Para uma proteína constituída por 20 aminoácidos diferentes, numa só cadeia de 100 resíduos, exis-tem 20100 : I,27 X 10130 polipeptídios possíveis, um número muito maior do que o número de áto-mos que se estima haver no Universo (9 x 10i).

Apesar disto, foram desenvolvidos muitos métodos que permitem a determinação da seqüênciade aminoácidos e, como veremos, estes métodos foram empregados com sucesso fantástico. Limita-remos nossa discussão a dois métodos, que ilustram como as determinações de seqüência podem serfeitas: a análise dos resíduos terminais e a hidrólise parcial. Na Seção 25.6 estudaremos um mé-todo mais simples.

24.5 A Análise dos Resíduos Terminais

Um método muito útil para determinar o resíduo de aminoácido N-terminal, chamado método deSanger, baseia-se no uso de 2,4-dinitrofluorbenzeno (DNFB). Quando um polipeptídio é tratado comDNFB, em solução levemente básica, ocone uma substituição nucleofílica aromática (S"Ar, veja Seção21.11) envolvendo o grupo amino livre do resíduo N-terminal. Hidrólise subseqüente do polipeptí-dio dá uma mistura de aminoácidos, onde o aminoácido N-terminal está marcado pelo grupo 2,4-dinítrofenil. Então, depois de separar este aminoácido da mistura, podemos identificá-lo.

Este método foi introduzidopor Frederick Sanger. daUniversidade deCambridge, em 1945.Sanger usou esteprocedimentoextensivamente nadeterminação da seqüênciade aminoácidos da insulinae ganhou o Prêmio Nobel de

Química, pelo seu trabalho,em 1958.

,^\o,N-< ( )F-F' \--7

+ H.NCHCO-NHAl

IR

Polipeptídio

CHCO*etc

R'

HCO.-- -J) I

(_HF)

NO,2,4-Dinitrofl uorbenzeno

(DNFB)

o.N -1íì\- NHCHCo - NIrcHCo *.t.. j9*'v t l

\RR'Not

Polipeptídio marcado

/r--rìo,N-1(

' /-NHCHco,H\></ |

\RNOt

Aminoácido, N-terminal marcado-

Separar e identificar

Probfema 24,5 > A propriedade de retirar elétrons do grupo 2,4-dinitrofenila torna a separação do aminoácidomarcado muito fácil. Susira como isto é feito.

+

+ H,NCHCO,-I

R'

Mistura deaminoácidos

,T


É certo que o 2,4-dinitrofluorbenzeno reagirá com qualquer grupo amino livre presente no poli-peptídio, inclusive o grupo e-amino da lisina. Porém, apenas o aminoácido de resíduo N-terminalserá marcado no grupo a-amino.

O segundo método de análise do resíduo N-terminal é a degradação de Edman (desenvolvido porPehr Edman, da Universidade de Lund, Suécia). Este método oferece uma vantagem sobre o métodode Sanger, já que remove o resíduo N-terminal e deixa a cadeia peptídica restante intacta. A degrada-

ção de Edman é baseada na reação de marcação entre o grupo amino N-terminal e o isotiocianato de

fenila, CuHrN:C- S.

R'

CIR

Í{ÀHCO*etc. ë

HlIÌ

L)-r-:c:s + n"Ncnco-NHCHco*",.. !!.%vt l

R

S/2-\, ll( | FNH-C-NHCHCO-NHVI

R

Polipeptídio marcado

/oS-C/\

ry-cx l{INR

Intermediário instável

++

Feniltioidantoína

IT3NCHCO*

R'Polipeptídio com um resíduo

de aminoácido a menos

Quando o polipeptídio marcado é tratado com ácido, o resíduo de aminoácido N-terminal separa-secomo intermediário instável, que se rearranja e forma uma feniltioidantoína. Este produto pode seridentificado por comparação com feniltioidantoínas preparadas a partir de aminoácidos-padrão.

O polipeptídio que pennanece após a primeira degradação de Edman pode ser submetido a outradegradação, para identificar o próximo aminoácido na seqüência. O processo foi, inclusive, automa-tizado.Infelizmente, degradações de Edman não podem ser repetidas indefinidamente. A medida queos resíduos vão sendo sucessivamente removidos, os aminoácidos formados pela hidrólise, durante otratamento ácido, se acumulam na mistura reacional e interferem no procedimento. A degradação deEdman, no entanto, foi automatizada, no que se denomina seqüenciador. Cada aminoácido é detec-tado automaticamente, à medida que é removido. Esta técnica foi aplicada de modo bem-sucedidopara polipetídios com até 60 resíduos de aminoácidos.

Resíduos C-terminais podem ser identificados pelo uso de enzimas digestivas, çhamadas carbo-xipeptidases. Estas enzimas catalisam, especificamente, a hidrólise da ligação amida do resíduo deaminoácido contendo um grupo -CO2H livre, liberando-o como aminoácido livre. Uma carboxt-peptidase, no entanto, continuará atacando a cadeia do polipeptídio remanescente, arrancando osresíduos C-terminais. Conseqüentemente, será necessário seguir os aminoácidos liberados em fun-

ção do tempo. O procedimento pode ser aplicado a apenas uma seqiiência limitada de aminoácidorpois, depois de um ceÍo tempo, a situação fiça muito complicada pÍÌra ser compreendida.

Probfema 24.6 > (a) Escreva uma reação mostrando como 2,4-dinitrofluorbenzeno pode ser usado para identificar oaminoácido N-terminal de Val.Ala.Gli. (b) Que produtos você esperaria (após hidrólise) quando

Val.Lis.Gli é tratado com 2,4-dinitrofluorbenzeno?

Problema 24.7 > Escreva as reações envolvidas na degradação de Edman seqüencial de Met.Ile.Arg.

\minoácidos e Proteínas 4ll

24.58 Hidrólise Parcial

Análise seqüencial utilizando degradação de Edman ou carboxipeptidase torna-se impraticável comproteínas ou polipeptídios de tamanho apreciável. Felizmente, porém, pode-se recorrer a outra técnica,a da hidrólise parcial. Usando ácidos diluídos ou enzimas, tenta-se quebrar a cadeia de polipeptídioem fragmentos menores, que possam ser identificados mediante a técnica do DNFB ou pela degrada-ção de Edman. Então, examinam-se as estruturas destes fragmentos menores, procurando por pontosde sobreposição; e tenta-se estabelecer a seqüência de aminoácidos do polipeptídio original.

Considere um exemplo simples: Temos um pentapeptídio que sabemos que contém valina (doisresíduos), leucina (um resíduo), histidina (um resíduo) e fenilalanina (um resíduo). Com esta infor-mação podemos escrever a "fórmula molecular" da proteína do seguinte modo, usando vírgulas paraindicar que a seqüência é desconhecida.

Valr, Leu, His, Fen

Vamos admitir que, mediante DNFB e carboxipeptidase, descobrimos que a valina e a leucina sãoos resíduos N-terminal e C-terminal, respectivamente. Até então sabemos que:

Val (Val, His, Fen) Leu

Mas a seqüência dos três aminoácidos não-terminais ainda é desconhecida.Submetemos, então, o pentapeptídio a hiúólise ácida parcial e obtemos os dipeptídios a seguir.

(Também obtemos aminoácidos individuais e fragmentos maiores, i.e., tripeptídios e tetrapeptídios.)

Val.His * His.Val * Val.Fen * Fen'Leu

Os pontos de sobreposição dos dipeptídios (His, Val e Fen) nos dizem que o pentapeptídio originaldeve ser o seguinte:

Val.His.Val.Fen.Leu

Duas enzimas também são empregadas freqüentemente para clivar ceúas ligações peptídicas numaproteína maior. Atripsina catalisa preferencialmente a hidrólise de ligações peptídicas onde o grupocarboxila fazparte do resíduo da lisina ou da arginina. A quimotripsina catalisapreferencialmente ahidrólise de ligações peptídicas nos grupos carboxila da fenilalanina, da tirosina e do triptofano.Também ataca as ligações peptídicas nos grupos carboxila da leucina, da metionina, da asparagina eda glutamina. O tratamento de uma proteína grande com tripsina ou com quimotripsina a dividirá empedaços menores. Depois, cada pedaço menor pode ser submetido a uma degradação de Edman ou aum processo de marcação seguido por hidrólise parcial.

Problema 24.8 > A glutationa é um tripeptídio encontrado na maioria das células vivas. Hidrólise parcial catalisadapor ácido da glutationa gera dois dipeptídios, o Cis.Gli e um outro constituído por Glu e Cis.Quando este segundo dipeptídio é tratado com DNFB, a hidrólise âçida dâ Glu com N marcado.(a) Com base apenas nesta informação, que estruturas seriam possíveis para a glutationa? (b)Experiências de síntese mostraram que o segundo dipeptídio possui a seguinte estrutura:

H"úcHCH,cH,coNHCHCo, -

éo,- òr,rtQual é a estrutura da glutationa?

Probfema 24.9 > Dê a seqüência de aminoácidos dos seguintes polipeptídios, usando apenas os dados fornecidospela hidrólise ácida parcial.

(a) Ser, Hip, Pro, Tre F

Ser.Tre * Tre.Hip -| Pro.Ser

(b) Ala, Arg, Cis, Val, Leu #

Ala'Cis + Cis.Arg Ì Arg.Val*Leu.Ala

24.6 EsrRuruRAs PRrMÁnlas DE Pol.tpEpríDtos e PnoreíNasA estrutura covalente de uma proteína ou de um polipeptídio é chamada de estrutura primária

Gig.2a.q. Empregando as técnicas que descrevemos nas seções anteriores, os químicos obtiveramnotável sucesso na determinação de estruturas primiírias de polipeptídios e proteínas. Os compostosdescritos nas páginas seguintes são exemplos importantes.


Fig, 24.4 Representação daestrutura primária de umtetrapeptídio.

Vincent du Vigneaud, daEscola de Medicina deCornell, sintetizou aoxitocina e a vasopressinaem 1953; recebeu o PrêmioNobel de Química em 1955.

ffi Hidrogênio

@ Gruoo n@ ruitrogonio

* Ligação peptídica

@@

24.6A Oxitocina e Vasopressina

Oxitocina e vasopressina (Fig. 24.5) são dois polipeptídios bastante pequenos, com estru-turas notavelmente semelhantes (onde a oxitocina tem leucina, a vasopressina tem arginina eonde a oxitocina tem isoleucina, a vasopressina tem fenilalanina). Apesar da semelhança dasseqüências de aminoácidos, estes dois polipeptídios possuem efeitos fisiológicos muito diferen-tes. A oxitocina ocorre apenas nas fêmeas das espécies animais e estimula a contração do úterodurante o parto. A vasopressina ocorre em machos e fêmeas e causa a contração dos vasos san-guíneos periféricos e o aumento da pressão sanguínea. Sua principal função, entretanto, é comoantidiurético; os fisiologistas referem-se freqüentemente à vasopressina como hormônio anti-diurético.

As estruturas da oxitocina e da vasopressina também ilustram a importância da ligação dissulfetoentre resíduos de cisteína (Seçáo24.2A) na estrutura primária global de um polipeptídio. Nestas duasmolóculas as ligações dissulfeto levam a uma estrutura cíclica.

Oxigênio

Carbono

Probfema 24.10 > O tratamento da oxitocina com certos agentes redutores (p. ex., sódio em amônia líquida) causauma única modificação química, que pode ser revertida por oxidação ao ar. Que mudançasquímicas estão envolvidas?

24.68Insulina

Insulina, um hormônio secretado pelo pâncreas, regula o metabolismo da glicose. A defìciênciade insulina nos humanos é o principal problema do diabetes melito.

A seqüência de aminoácidos da insulina bovina (Fig.24.6) foi determinada por Sanger em 1953.após 10 anos de trabalho. A insulina bovina tem um total de 51 resíduos de aminoácidos, em duascadeias polipeptídicas, chamadas de cadeia A e cadeia B. Estas cadeias estão unidas por duas liga-ções dissulfeto. A cadeia A contém uma ligação dissulfeto adicional entre os resíduos de cisteína nasposições 6 e 11.

A insulina humana difere da insulina bovina em apenas três resíduos de aminoácido: A treoninasubstitui a alanina uma veznacadeia A (resíduo 8) e uma vez na cadeia B (resíduo 30), e a isoleucinasubstitui a valina umavez na cadeia A (resíduo 10). As insulinas da maioria dos outros mamíferospossuem estruturas semelhantes.

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H2NCCH2NH-C-

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Oxitocina

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Vasopressina

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IOH

Fig. Z4.S As estruturas da oxitocina e da vasopressina. Os resíduos de aminoácidos que diferem entre

eles são mostrados em vermelho.


Fig, 24.6 A seqüência deaminoácidos da insulinabovina.

-.--ser. .- í \ \

cadeia A S \

| ï " ' \GIi-Ile-Val-Glu-Gln- Cis Ser -\\ ,/ Leu'Cis -Alâ |

I ti.sl1 ci',

cadeia B Ì "l;Fen-Val-Asn-Gln-His-Leu- Cis -i-

Cu *]''I Asn

Glu-Val-Leu-His-Ser I,/AIa Tir

\ lLeu- Tir -Leu-Val- Cis -S-S- Cis

l lGli Asn

Ala - Lis -Pro- Tre - Tir - Fen - Fen - Gli -Arg-Gltr

A doença genética denominada anemia falciforme resulta do erro de um único aminoá-cido na cadeia B da hemoglobina. Na hemoglobina normal, a posição 6 tem um resíduo deácido glutâmico, enquanto na hemoglobina com célula falciforme a posição 6 é ocupadapela val ina.

As células vermelhas do sangue (eritrócitos) que contêm hemoglobina com este erro deresíduo de aminoácido tendem a adquirir forma crescente (de foice) quando a pressão par-cial do oxigênio é baixa, como no sangue venoso. Torna-se mais difícil para o coração bom-bear estas células distorcidas através de vasos capilares pequenos. Quando se aglomeram,

as células podem causar o entupimento dos vasos; em outros casos podem até se dividir. Criançasque herdam esta característica genética de ambos os pais sào afetadas pela forma mais severa dadoença e normalmente não atingem os dois anos de idade. As que herdam esta doença de apenasum dos pais geralmente são afetadas por uma forma muito mais branda. A anemia falciforme sur-giu entre as populações da África central e ocidental onde, ironicamente, poderia ter um efeitobenéfico. Pessoas acometidas pela forma branda da doença são muito menos suscetíveis à maláriado que aquelas com hemoglobina normal. Maliária, doença causada por um organismo infeccioso,prevalece principalmente nas regiòes central e ocidental da Africa. Mutações como as que levamà anemia falciforme são muito comuns. Aproximadamente 150 tipos diferentes de hemoglobinamodificada foram detectados no homem; felizmente, a maioria é inofensiva.

24.6C Outros Polipeptídios e ProteÍnas

Análises seqüenciais bem-sucedidas foram alcançadas para centenas de outros polipeptídios e pro-teínas, incluindo os que se seguem:

L. Ribonuclease bovina. Esta enzima que catalisa a hidrólise do ácido ribonucléico (Cap. 25), pos-sui uma única cadeia, constituída por 124 resíduos de aminoácidos e quatro ligações dissulfeto nointerior da cadeia.

2. Hemoglobina humana. Há quatro cadeias peptídicas nesta importante proteína careadora de oxr-gênio. Duas cadeias a idênticas, cada uma com 141 resíduos, e duas cadeias B idênticas, cadauma com 146 resíduos.

Células vermelhas dosangue, normal(esquerda) e em formade foice (direita),visualizadas com ummicroscópio devarredura de elétronsocom ampliação de 18.000vezes.

Química


3. Tripsinogênio e quimotripsinogênio bovinos. Estes dois precursores enzimáticos possuem ca-deias simples constituídas, respectivamente, por 229 e 245 resíduos de aminoácidos.

4. Gamaglobulina. Esta imunoproteína tem um total de L32O resíduos de aminoácidos em quatrocadeias, duas com 214 resíduos e duas com 446 resíduos.

5. p53, uma proteína anticâncer. A proteína chamada p53 (p de proteína), constituída por 393 resíduosde aminoácidos, possui viárias funções celulares, mas as mais impoÍantes envolvem o controle das eta-pas que levam ao crescimento das células. Atua como supressor de turnor, obstando o crescimentoanormal de células normais e, desta maneira, previne o câncer. Descoberta em 1979, imaginou-se ini-cialmente que a proteína p53 fosse sintetizada por um oncógeno (gene que causa câncer). Pesquisasmais recentes, porém, mostraram que a forma da p53 que se pensava ter esta ação cancerígena era umaforma mutante da proteína normal. A forma sem mutação (ott tipo selvagem) da p53 apaÍentementecoordena um conjunto complexo de respostas a variações do DNA que, de outra maneira, poderiamlevar ao câncer. Quando p53 sofre mutação, a proteína não mais atribú à célula sua função de preven-

ção contra o câncer; apaÍentemente faz o oposto, agindo para estimular o crescimento anormal.Mais da metade das pessoas diagnosticadas com câncer, a cada ano, possuem uma forma mu-

tante da p53 no tumor. Formas diferentes de câncer foram mostradas como resultantes de muta-

ções diferentes da proteína e a lista de tipos de câncer associados à p53 mutante inclui a maioriadas partes do corpo: cérebro, seios, vesícula, colo do útero, cólon, fígado, pulmão, ovário, pâncre-as, próstata, pele, estômago etc.

6. Proteínas Ras. São proteínas modifiçadas associadas ao crescimento celular e à resposta das células àinsulina. Pertencem à classe de proteínas denominadas proteínas preniladas, nas quais os grupos lipídi-cos derivados dabiossíntese de isoprenóide (Tópico Especial D) são apendiculados como úoéteres aosresíduos C-terminais da cisteína. Certas formas mutantes das proteínas rdr causam modificaçõesoncogênicas em vários tipos de células eucarióticas. Um efeito da prenilação e de outras modifi-cações lipídicas das proteínas é prender estas proteínas nas membranas celulares. A prenilaçãopode também auxiliar o reconhecimento molecular de proteínas preniladas por outras proteínas.x

24.7 Sírurese DE Pol.rpEpríDtos E DE PRorEíNAs

Vimos no Cap. 18 que a síntese da ligação amida é relativamente simples. Inicialmente devemos"ativar" o grupo carboxila do ácido, convertendo-o em anidrido ou em cloreto de ácido, e depoisprovocar a reação com uma amina:

oool l i l l l

R-C-O-C-R + R'-NH, --+ R-C-NHR' + R-CO,H

Anidrido Amina Amida

O problemaficaumtanto mais complicado, porém, quando o grupo ácido e o grupo amino estãopresentesna mesma molécula, como é o caso dos aminoácidos. E especialmente complicado quando nosso objetivoé a síntese de uma poliamida de ocorrência natural, em que a seqüência de aminoácidos diferentes temimportância capital. Consideremos como exemplo a síntese do dipeptídio simples aÌanilglicina, Ala'Gli.Podemos inicialmente ativar o grupo carboxila da alanina converlendo-o em cloreto de ácido e depoisdeixálo reagir com a glicina. Infelizmente, no entanto, não podemos evitar que o cloreto de alanila reajaconsigomesmo. Nossareação, então, formarianão apenas Ala'Gli, mas tambémAla'Ala. Podeíamosterainda Ala.Ala'Ala, Ala.A1a.Gli, e assim por diante. O rendimento do produto desejado seria baixo e terí-amos também o difícil problema da separação dos dipepídios, tripepídios e pepídios maiores.

oooll ,,, ,o.t" tl I

CHìCHCO ;, ' .+ CH.CHCNHCH2CO2- + CHTCHCNHCHCO,|

. - . - - , {CH2CO2- ' l | |

TH, YH. TH, CH.

Ala Gli Ala'Gli Ala.Ala

ooool l l l l l l l

+ CH.CHCNHCHCNHCHCO,- + CH?CHCNHCHCNHCH2COT- * outros' r t l l lIH, CH. CH, TH, CH,

AÌa.Ala 'Ala Ala'Ala 'Gl i

*Veja Gelb, M. H. Modification of Proteins by Phenyl GroupsGreenwich, CT, 1995; Vol.4, Cap. 14,p.373-333.

No Prínciples of Meclìcal Bíology, Bittu, E. E., Bittil, N., Eds.; JAI Press:


24.7 A Grupos Protetores

A solução deste problema ó "proteger" o grupo amino do primeiro aminoácido antes de ativá-lo eentão deixá-lo reagir com o segundo. Por proteção do grupo amino entendemos que devemos conveÍê-lo em outro grupo de baixa nucleofilicidade - um grupo que não ird interagir com um derivado acilareativo. O grupo protetor deve ser escolhido com cuidado, pois após termos sintetizado a ligaçãp amidaentre o primeiro e o segundo aminoáçidos, teremos que removê-lo sem perturbar a nova ligação amida.

Muitos reagentes que reúnem estas características foram desenvolvidos. Dois deles, usados fre-qüentemente, são o cloroformato de benzila e o caÍbonato de di-terc-bú11a.

ooi l t l

c6HscH2o-c-cl (cH3)3co-c-oc(cH3)3Cloroformato de benzila Carbonato de di-Íerc-butila

Ambos reagem com grupos amino e formam derivados inativos frente a acilação posterior. Os doisderivados, poÍanto, são do tipo que permite a remoção do grupo protetor sob condições que não afetam asligações pepídicas. O grupo benziloxicarbonila (abreviado como Z) pode ser removido por hidrogenaçãocatalítica ou pelo tratamento do derivado com lIBr a frio em ácido acético. O grupo /erc-butiloxicarbonila(abreüado como Boc) pode ser removido pelo tratamento com HCI ou com CFTCOTH em ácido acético.

Grup o b e nziloxic arb o nila

otl

cH2oc-NH-R + Cl-

Grupobenziloxicarbonila ou Z

lH,/Pdv

@."rBr * co, + H2N-R

@."3 + co2 + H2N-R

oH.. Pd ll

R C.HsCHr + HOCR

o/-. llQF.",oë-cr

+ H2N-R FCloroformato de benzila

ácido acético(frio)

Grup o terc -butiloxic arb onila

ooll n,"" ll

(CHJ3COCOC(CHJ3 + H2N-R ËÌ,(CHJ3COC-NHR

+ (CH3)3COH

Carbonatodedi-Íerc-butila

-Grupo /erc-butiloxicarbonila

ou Boc

I HCI ou CFrCo2H

I a.ioo u.ãf.o. zs'c

(cHr)rc:cH, +vco, + HrN -R

A facilidade de remoção de ambos os grupos (Z e Boc) em meio ácido resulta da estabilidadeacentuada dos carbocátions que são formados inicialmente. O grupo benziloxicarbonila geraum cdtionbenzila: o grupo terc-butrloxicarbonila gera, inicialmente, um cáttion terc-butila.

A remoção do grupo benziloxicarbonila com hidrogênio e catalisador é conseqüência de as liga-

ções benzila-oxigênio serem fracas e estarem sujeitas a hidrogenólise a temperaturas baixas.

otl

c6H5cH2-ocR

Um éster benzílico

24.78 Ativação do Grupo Carboxila

Talvezo modo mais óbvio de ativar um grupo carboxila seja a sua conversão em cloreto de acila.Este método foi usado nas primeiras sínteses de peptídios, mas os cloretos de acila são, na verdade.mais reativos do que o necessário. Conseqüentemente, seu uso leva a reações laterais complicadas.Um método muito melhor consiste na conversão do grupo carboxila do aminoácido "protegido" em

otl

um anidrido misto, usando cloroformato de etila, CI-C-OC"H".

A,minoácidos e Proteínas 417

?ooi l ír) (c"H.)"N ll l lZ-NHCHC-OH ----- Z-NHCH-C-O-C-OC2H.

| (r) C|CO2C,Hr

IRR

"Anidrido misto"

O anidrido misto pode então ser usado para acilar outro aminoácido e formar uma ligação peptídica.

o O u.fr-cncor- Ol Í l r I , i l

Z-NHCHC-O-COC2H. Z-NHCHC-NHCHCO2H + CO2 + C2H5OHt ' " r l

RPode-se empregaÍ também dicicloexilcarbodiimida (Seção 18.8E) para ativar o grupo carboxila deum aminoácido. Na Seçáo 24.7D veremos como este reagente é usado numa síntese automática depeptídio.

24.7C Síntese de Peptídios

Examinemos agora como poderemos usaÍ estes reagentes na preparação do dipeptídio simplesAla'Leu. Os princípios envolvidos aqui podem ser estendidos, como é evidente, para a síntese decadeias peptídicas muito mais longas.

oII

cH3cHCO2- + C6H5CH2OC-C|I

NH,

Aìa Cloroformato de benzila

CH,CH-CO.HI

NHI

C:OI

c6HscH2o

Z-Na

+

NH'I

(cH)2CHCH2CHC02-Leu

CHrI

OH+25"C

(1) (C,H.) ,N

(2) CtCOrC2Hr

ool l t l

cHlcH-c-ococ2H5I

NTIIc:oI

cóH5cH2o

Anidridomisto de Z.Ala

NHI

otl

CH3CH-ë-NHCHCO2H H2lPd

>

------ì*

co2 + c2HsoH

C:O CH| . / \

c6H.cH2ò HrC CH,

Z-Ala . Leu

o

cH3cHCNHCHCo2- . Õ!cH3 + co2r t \Y

ÌH, ÇH'I

CH, / \

H.C CH.Ala . Leu

418 Aminoácidos e Proteinas

Problema 24.1 | > Mostre todas as etapas da síntese de Gli'Val'Ala, usando o grupo terc-bttiToxicarbonila (Boc)

como grupo protetor.

Problema 24j2> A síntese de um polipeptídio contendo lisina requer a proteção de dois grupos amino. (a) Mostrecomo você o faria na síntese de Lis.Ile, usando o grupo benziloxicarbonila como grupo protetor.(b) O grupo benziloxicarbonila também pode ser usado para proteger o grupo guanidino,

NHI I

-NHC-NHr, da arginina. Mostre a síntese da Arg'Ala.

Problema 24.13 > Os grupos carboxila terminais do ácido glutâmico e do ácido aspiírtico são protegidos, freqüente-mente, pela sua conversão em ésteres benzflicos. Que método brando pode ser usado para aremoção deste grupo protetor?

24.7D Síntese Automatizada de Peptídios

Embora os métodos que descrevemos até agora sejam usados para sintetizarmútos polipeptídios, inclu-indo alguns tão grandes quanto a insúina, eles consomem muito tempo. E necessário isolar e purificar oproduto em quase todas as etapas. Um avanço real noúvel na síntese de pepídios surgiu com o desenvolvi-mento de um procedimento para a sÍntese automatizada de pepídios, de autoria de R. B. Merrifield (da Uni-versidade de Rocldeller). Merrifield recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1984 por este trabalho.

O método dd Menifield baseia-se no uso de uma resina de poliestireno, semelhante à que vimosna Fig. 24.2, mas que contém grupos -CH2C| no lugar de grupos ácido sulfônico. Esta resina é usa-da na forma de pequenos grãos e é insolúvel na maioria dos solventes.

A primeira etapa na síntese automatizada de peptídios (FiS. 2a.7) consiste na reação que liga oprimeiro resíduo de aminoácido protegido aos grãos da resina. Terminada esta etapa, o grupo prote-

ool l l l

Grãosde FCHTCI + HOCCHNHCOC(CHB)3resina \,-/

t

I our"Y

ool l ì l

) CHpCCHNHCOC(CH3)3' r - l

RI CFÌCO2H em CH,C',+o

cH20ccHNH2I

R

19()l l

lHoccHNHcoc(cH3)3I R' ,"I dicicloexilcarbodiimida

Yoool l l l

F cHrocc HNHCCHNHCOC(CH3)3---/ | |

RR'

I CFìCO2H em CH2C|2ü

Repetições das etapas 4-7

I ner em cF.CorHv

Etapa 7

Etapa 2

Etapa 3

Etapa 4

Etapa 5

Etapa 6

Etapa 7

Etapa Final

Liqa o resíduo deam-i n oác ido C-terminal(protegido) à resina

Purifica, por lavagem,a fesrna com oresíduo ligado

Remove ogrupo protetor

Purificação por lavagem

Adiciona o oróximo resídur'de aminoácido (protegido )

Purificação por lavagem

Remove ogrupo protetor

Desconecta o polipeptídiocompleto

Fig.24.7 Método deMerrifield para sínteseautomatizada de proteínas.

t*'

ooor r l l l l

}-CttrBr + HOCCHNHCCHNHCCHNH- etc.- -J- t l l

RR'R'


tor é removido e o próximo aminoácido (também protegido) é condensado com o primeiro, usando-se dicicloexilcarbodiimida (Seção 18.8E) para ativar seu grupo carboxila. Depois, a remoção do gru-po protetor do segundo resíduo prepara a resina-dipeptídio para a próxima etapa.

A grande vantagem deste procedimento é que a purificação da resina, com seus polipeptídios co-nectados, pode ser realizadaapós cadaetapa, pela simples lavagem com o solvente adequado. Comoas impurezas não estão conectadas à resina insolúvel, elas são simplesmente arrastadas pelo solven-te. No procedimento automatizado, çada ciclo da "máquina de fabricar proteína' requer apenas 4 hpara ligar um novo resíduo de aminoácido. A síntese de proteínas no organismo, catalisada por enzi-mas e dirigida pelo DNA e pelo RNA, leva apenas 1 min para juntar 150 aminoácidos numa seqüên-cia específica (veja Seção 25.5).

A técnica de Menifield foi aplicada com sucesso na síntese da ribonuclease, uma proteína com124 resíduos de aminoácidos. A síntese envolveu 369 reações químicas e 11.931etapas automatiza-das - todas realizadas sem o isolamento dos intermediários. A ribonuclease sintética não apenastinha as mesmas características físicas da enzima natural, mas possuía também atividade biológicaidêntica. O rendimento total foi de 177o, o que significa que o rendimento médio de cada etapa indi-vidual foi maior qte99Vo.

Problema 24.,4> A resina usada no processo de Merrifield é preparada tratando-se poliestireno, -f-CftrCUf,t l f\ CoHr/,

com CHTOCHTCI e um ácido de Lewis como catalisador. (a) Qual a reação envolvida? (b) Após apurificação, o polipeptídio ou a proteína completos podem ser desconectados da resina pelotratamento com HBr em ácido trifluoracético, em condições suficientemente brandas que nãoafetam as ligações amida. Que característica estrutural da resina torna isso possível?

Probf ema 24.15 > Esboce as etapas da síntese de Lis'Fen'Ala usando o processo de Menifield.

24.8 EsrnuruRAs SEcUNDÁRn,TERcIÁRIA E QUATERNARIA DAsPnoreíNns

Vimos como as ligações amida e dissulfeto constituem a estrutura covalente ot estrutura primd-ria das proteínas. Igualmente importante para a compreensão do modo de funcionamento das prote-ínas é o conhecimento do arranjo tridimensional das cadeias peptídicas. Este arranjo envolve as es-truturas secundária e terciiíria das proteínas.

24.8A Estrutura Secundária

Define-se como estrutura secundária de uma proteína a conformação local de seu esqueletopolipeptídico. Tais conformações locais se descrevem em termos de padrões regulares de dobra-mento, conhecidos como hélices, lâminas pregueadas e espiras. As principais técnicas experimen-tais usadas na elucidação das estruturas secundárias das proteínas são raios X e RMN (incluindo

RMN 2D).Quando os raios X atravessam uma substância cristalina, produzem padrões de difração diferen-

tes. Análise destes paúões indica uma repetição regular de certas unidades estruturais específicas,com distâncias fixas entre elas, chamadas módulos de repetição. Análise de raios X revelou que acadeia polipeptídica de uma proteína natural pode interagir consigo mesma de dois modos princi-pais: pela formação de lâmina B-pregueada e de a-hélice.

Para compreender como ocorrem estas interações, observemos inicialmente o que a análise de raiosX revelou sobre a geometria da própria ligação peptídica. As ligações peptídicas tendem a assumiruma geometria onde seis átomos da ligação amida estão coplanares (Fig.24.8). A ligação çarbono-nitrogênio da amida é excepcionalmente curta, indicando que são importantes as contribuições deressonância mostradas a sequir.

\.. /oN-C <---> N:C

,/ \\+

Conseqüentemente, a ligação carbono-nitrogênio possui carâÍer acentuado de ligação dupla(-4OVo)e as rotações dos grupos ao redor desta ligação são drasticamente dificultadas.

Rotações dos grupos ligados ao nitrogênio amídico e ao carbono carbonflico são relativamentelivres, porém estas rotações permitem que as cadeias peptídicas adquiram conformações diferentes.

,/o


Fig. 24.8 A geometria e oscomprimentos das ligações(em angstrõms, Ã) daligação peptídica. Os seisátomos envolvidos tendema estar coplanares eassumem um arranjo'transóide". [De Voet, D.;Yoet, J. G. Biochemistry, 2,"ed.; \ililey: New York,1995; p. 142. Impresso comautorização.l

Cadeia principal

Grupo trans-peptídico

O arranjo transóide dos grupos ao redor da ligação amida, relativamente ígida, faz com que osgrupos R se alternem de um lado a outro da cadeia peptídica completamente esticada:

Os cálculos mostram que a cadeia peptídica teria um módulo (i.e., distância entre unidades alterna-das) de 7,2 Ã.

Cadeias polipeptídicas completamente esticadas poderiam formar uma estrutura laminar, com ami-noácidos alternados, de cada cadeia, formando duas ligações hidrogênio com um aminoácido na ca-deia adjacente:

HR"zì

-N\_. , - . - r - t - . . - . , -N\.-c\ , , -(- ^ -c- -c- N

s\ | l l s \ |;-R H H I ;_R H tI

*" ï ï ïH ó

' Ì* ' ï Ï ïH òz.. l l l | "z l l l

Cí- 'NCC

:../-\"/ \c / ' ' \r/ -\N,/,,- \

ll I ,,*.'\_ ll Ia H HR g tr

Estrutura laminar hipotética(não se forma devido ao impedimento estérico)

Esta estrutura não ocorre nas proteínas naturais, devido à aglomeração que existiria entre os grupos

R. Se existiss e, tena o mesmo módulo da cadeia peptídica esticada, ou seja, 7,2 Ã.Uma pequena rotação das ligações, entretanto, pode transformar uma estrutura laminar na estru-

tura chamada lâmina B.pregueada ou configuração B Gig. 24.9). A estrutura de lâmina pregueadafornece espaço suficiente aos grupos R, pequenos e médios, para evitar repulsões de van der \Vaals.É a estrutura predominante da fibroína da seda (487o de resíduo de glicina e 38Vo de resíduos de se-rina e de resíduo de alanina). A estrutura de lâmina pregueada possui módulo de repetição um pouco

menor, 7,0 Ã, do que a de folha laminar.De importância muito maior para as proteínas de ocorrência natural é a estrutura secundi4ria cha-

mada a-hélice (Fig. 24.10). Esta estrutura é uma hélice dextrogira, com 3,6 resíduos de aminoácidopor volta. Cada grupo amida na cadeiafazuma ligação hidrogênio com outro grupo amida, à distân-

:otl

:ôtl

Aminoácrdos e ProteÍna:

Fig.24.i A lâmina B-pregueadâ ou configuraçãop de uma proteína. [Figuracom direitos autorais @ porIrving Geis. De D. Voet, J.G. Biochemistry, 2," ed.;Wiley: New York, 1995; p.L50, Impresso comautorização.l

cia de três resíduos de aminoácido, em qualquer das duas direções, e os grupos R estão todos dirigi-dos para longe do eixo da hélice. O módulo da a-hélice é 5,4 A.

A estrutura a-helicoidal é encontrada em muitas proteínas; é a estrutura predominante das cadeiaspolipeptídicas de proteínas fibrosas, tais como miosina, a proteína dos músculos, e da a-queratina, aproteína dos cabelos, da lã não-tensionada e das unhas.

As hélices e as lâminas pregueadas respondem por apenas metade da estrutura das proteínas glo-bulares médias. Os segmentos de polipeptídios restantes possuem o que se denomina serpentina, ouconformação espiralada. Estas estruturas não-repetitivas não são aleatórias, mas são mais difíceisde se descrever. Proteínas globulares têm também estiramentos, chamados voltas reversas ou cur-vas-B, onde a cadeia polipeptídica muda de direção bruscamente. Estas mudanças acoplam diferen-tes segmentos das lâminas B e quase sempre ocorrem na superfície das proteínas.


Fig. 24.1 0 Representaçãoda estrutura a-helicoidal deum polipeptídio. As ligaçõeshidrogênio estãorepresentadas por linhastracejadas. [Figura comdireitos autorais @ porIrving Geis. De D. Voet, J.G. Biochemistry, 2," ed..;Wiley: New York, 1995; p.146. Impresso comautorização.l

AFig.24.Il mostra a estrutura da enzima humana anidrase carbônica, obtida com base em dadoscristalogriáficos de raios X. Segmentos de a-hélice e lâminas B interagem entre voltas reversas e es-truturas não-repetitivas.

A localização das cadeias laterais de aminoácidos das proteínas globulares é, normalmente, o quese pode esperar de suas respectivas polaridades.

1. Resíduos com cadeias laterais apolares, hidrofóbicas, como valina, leucina, isoleucina, metio-nina e fenilalanina são quase sempre encontrados no interior da proteína, sem contato com o sol-vente aquoso. (Estas interações hidrofóbicas são as principais responsáveis pela estrutura terciá-ria das proteínas, que discutiremos na Seção 24.88.)

2. Cadeias laterais de resíduos polares com cargas * ou -, como arginina, lisina, ócido aspártí-co e ócido glutâmico estão, geralmente, na superfície da proteína, em contato com o solventeaquoso.


t g.24.1 | Estrutura da.nzima anidrâse carbônica:rumana, baseada em dados

-i,rtalográficos de raios X.r. cadeias laterais dos três-:iiduos de histidina

: 'r,rdenam-se com um;romo de zinco. Nesta.r'tnagem não está claro o: ito interessante de o C-:t rminal estar dentro derrìa espira da cadeia:,,lipeptídica, o que torna a:nidrase carbônica um.tenpJo raÍo de ama:roteína nativa na qual a. rdeia polipeptídica forma*n nó. [Imagem preparadair esúruÍura de crktal de:aios X por Eriksson, A. E.;J ,nes, T. A.; Li l jas,4.,.rquivo do Banco de Dados:e Proteína lCA2.pdb.l

3. Cadeias laterais polares sem carga, como as da serina, treonina, asparagina, glutamina, tirosi-

na e tripíofano sãã encontradas mais freqüentemente na superfície, mas algumas delas também

no inteiioida proteína. Quando no interior, estão todas unidas, por ligações hidrogênio, aoutros

resíduos semelhantes. Aparentemente a ligação hidrogênio ajuda a neutralizar a polaridade des-

ses grupos.

CeÍas cadeias peptídicas assumem forma de enovelamento aleatório, uma estrutura flexível, mu-

tável e estatisticamente randômica. Polilisina sintética, por exemplo, existe na forma de enovelamento

randômico, e nofinalmente não forma a-hélice. Em pH 7 os grupos e-amino dos resíduos de lisina es-

tão com carga positiva e, por isso, as forças de repulsão entre eles são tão grandes que ultrapassam qual-

quer estabiúiçao que seãa adquirida pela formação de ligações hidrogênio da a-hélice. Em pH 12, no

eìhnto, os grupos s-amino estão sem carga e a polilisina forma a a-hélice espontaneamente.

A presença-de resíduos de prolina ou de hidroxiprolina nas cadeias polipeptídicas produz outro

efeito notável: como os átomos de nitrogênio desses aminoácidos fazem parte de anéis de cinco

membros, os grupos que estão ligados pela ligação nitrogênio-carbono d não podem girar o suficien-

te para permitìr á formação da estrutura a-helicoidal. Sempre que a prolina ou a hidroxiprolina fize-

t"- purì" da cadeia peptídica, há um enroscamento ou dobra interrompendo a a-hélice.

24.88 Estrutura Terciária

A estrutura terciária da proteína ó a forma tridimensional que surge do enovelamento de suas

cadeias polipeptídicas, o enovelamento superposto às espiras das a-hélices. Este enovelamento não

ocorre aleatoriamente: nas condições ambientais apropriadas, ocoÍïe de modo particular - um modo

característico de uma proteína específica e é de grande importância pararcalizar sua função.

Várias forças estão envolvidas na estabilização de estruturas terciárias, inclusive as ligações dis-

sulfeto da estrutura primária. Uma característica da maioria das proteínas é que o enovelamento acon-

tece de modo a expor o número máximo de grupos polares (hidrofílicos) ao ambiente aquoso, e aco-

modar o número máximo de grupos apolares (hidrofóbicos) em seu interior.

As proteínas globulares solúveis tendem a se enovelar muito mais do que as proteínas fibrosas. As

proteínas fibrosãs, porém, também possuem estrutura Íerciâria; os filamentos a-helicoidais da c-

queratina, por exemplo, enrolam-se numa "super-hé1ice". A super-hélice dá uma volta completa a

cada 35 volìas da a-hèüce. A estrutura terciíria,no entanto, não terrnina assim. As super-hélices podem

se enrolar mutuamente, gerando uma estrutura semelhante a uma corda de sete fios.

A mioglobin a (Fig. 24.12) e a hemoglobina (Seção 24.12) foram as primeiras proteínas a_serem

submetidãs a análise,de raios X completamente bem-sucedida (em 195'7 e 1959). Este trabalho foi

realjzadopor J. C. Kendrew e Max Perutz, da Universidade de Cambridge, Inglaterra. (Eles recebe-

ram o Prêmio Nobel de Química em 1962.) Desde então, muitas outras ptoteínas, como lisozima,

ribonuclease e cr-quimotripsina revelaram-se na análise estrutural completa. De fato, hoje é possível

acessar dados de èstruturaì de raios X de milhares de proteínas, armazenados em bancos de dados

públicos por pesquisadores.


Flg.24.12 Estruturatridimensional damioglobina. (Imagempreparada da estrutura decristal de raios X porPhillips, S. E. V., arquivodo Banco de Dados deProteína lMBD.pdb.)

Anidrase carbônica

Anidrase carbônica é umaenzima que catâlisa aseguinte reação: HrO +COrf H2CO3.Discutimos sua funçãoÍisiológica reguladora dopH sanguíneo na vinheta deabertura do Cap.3.

24.8C Estrutura QuaternáriaMuitas proteínas existem na forma de agregados não-covalentes estáveis e ordenados de mais de

uma cadeia polipeptídica. A estrutura global de uma proteína contendo subunidades múltiplas é de-nominada estrutura quaternária. A estrutura quaternária da hemoglobina, por exemplo, envolvequatro subunidades (veja Seção 24.12).

24.9 lNrnoouçÃo Às EttzlmnsTodas as reações que ocoÍïem nas células vivas são mediadas por catalisadores biológicos notá-

veis, chamados enzimas. As enzimas possuem a capacidade de provocar aumento considerável navelocidade das reações; na maioria dos casos, as velocidades das reações catalisadas por enzimas sãomais rápidas do que as reações não-catalisadas, por fatores de 106-1012. Para os organismos vivos,aumentos de velocidade desta magnitude são importantes porque permitem que as reações ocoÍïamem velocidades razoáveis, mesmo nas condições brandas que existem nas células vivas (i.e., pH apro-ximadamente neutro e temperatura da ordem de 35'C).

As enzimas tarnbém eúbem noúvel especificidade diante de seus reagentes (chamados de substra-tos) e produtos. Esta especiÍicidade é muito maior do que se verifica na maioria dos catalisadores quími-

cos. Na síntese enzimáúicadeproteínas, por exemplo (mediante reações que ocorrem nos ribossomas, Seção25.5D), polipepídios constituídos de mais de 1 .000 resíduos de aminoácidos são sintetizados, praticÍrmentesem erro. Foi a descoberta de Emil Fischer, em 1894, sobre a capacidade de as enzimas distinguirem entreasligaçõesglicosídicasaeB(Seção22.12)queolevouaformularahipótesedachaveefechadurapara a especificidade das enzimas. De açordo com esta hipótese, a especificidade de uma enzima (a

fechadura) e de seu substrato (a chave) provêm de suas formas geometricamente complementares.A enzima e o substrato combinam-se e formam um complexo enzima-substrato. A formação deste

complexo freqüentemente induz uma mudança conformacional na enzima, que a leva a se ligar aosubstrato de modo mais efetivo. A isto denomina-se ajustamento induzido. A união com o substra-to também pode causar tensão de algumas ligações, tornando-as mais frágeis. O produto da reação

normalmente tem uma forma diferente do substrato. Esta forma modificada ou, em alguns casos, aintervenção de outra molécula, causa a dissociação do complexo. A enzima, então, pode aceitar ou-tra molécula do substrato e todo o processo se repete.

Enzima * substrato =----*_ :.o-p!l:"{!. < + enzima * produroe n zl ma-su DSIralo

Quase todas as enzimas são proteínas. O substrato se liga à proteína e a reação ocorre no chamadosítio ativo. As forças não-covalentes que unem o substrato ao sítio ativo são as mesmas que expli-cam as próprias conformações das proteínas: forças de van der Waals, forças eletrostáticas, ligações

Certas moléculas de RNA.chamadas de ribozimas,também podem agir comoenzimas. O Prêmio Nobelde Química de 1989 foidado para Sidney Altman(Universidade de Yale) epara Thomas R. Cech(Universidade do Colorado,Boulder) por estadescoberta.

Nos familiarizamos commuitas coenzimas noscapítulos anteriores porqueelas são as'1náquinas daquímica orgânicatt paraalgumas enzimas. Veja, porexemplo, "Dois Aspectos daCoenzima NADH" (vinhetade aberturá do Cap. l2),u^Química de... Fosfato dePiridoxal" (Seção 16.8) e "AQuímica de... Tiamina"(Seção 18.11).

Diagrama de Íita dalisozima.

otla

R/-\o-R'Éster

\minoácidos e Proteínas 425

hidrogênio e interações hidrofóbicas. Os aminoácidos localizados nos sítios ativos estão organizadosde modo a interagir especificamente com o substrato.

As reações catalisadas por enzimas são completamente estereoespecíficas, e esta especificidadeprovém do modo como as enzimas se ligam aos seus substratos. Uma o-glicosidade apenas se ligaráà forma a de um glicosídio, não à B. As enzimas que metabolizÍìm os açúcares se ligam apenas aosaçúcares D; as enzimas que sintetizam a maioria das proteínas se unem apenas aos L-aminoácidos, eassim por diante.

Embora sejam absolutamente estereoespecíficas, as enzimas variam freqüentemente, de modo con-siderável, sua especificidade geométrica. Entende-se por especificidade geométrica a especificida-de relacionada à identidade dos grupos químicos dos substratos. Algumas enzimas só aceitam umcomposto como seu respectivo substrato. Outras, porém, aceitam vários compostos com grupos se-melhantes. A carboxipeptidase A, por exemplo, hidrolisa o peptídio C-terminal de todos os polipep-tídios, desde que o penúltimo resíduo não seja arginina, lisina ou prolina e que o antepenúltimo resí-duo não seja prolina. A quimotripsina, enzima digestiva que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas, também catalisa a hidrólise de ésteres. Consideraremos este mecanismo na Seção 24.1 1.

ool l l l *

- i .- + H.o

qumotnpsrna >

-ò-- + H1N-R'

R- -1111- P' - R- -O

Peptídio

ooúmotriDsina ll

+ H2OR' -OH

t

ìI

1

I

D

D

I

:t

Um composto que pode alterar negativamente a atividade de uma enzima é chamado inibidor.Um composto que compete diretamente com o substrato pelo sítio ativo é conhecido como inibidorcompetitivo. Aprendemos na Seção 20.11, por exemplo, que a sulfanilamida é um inibidor compe-titivo da enzima bacteriana que incorpora o ácido p-aminobenzóico ao ácido fólico.

Algumas enzimas requerem a presença de um co-fator. O co-fator pode ser um íon metálico como,por exemplo, o átomo de zinco da anidrase carbônica humana (veja a vinheta de abertura do Cap. 3e a Fig. 24.II). Outras requerem a presença de uma molécula orgânica, como o NAD+ (Seção 14.10),que é denominada coenzima. Coenzimas se modificam quimicamente no curso das reações enzim6-ticas. O NAD+ converte-se em NADH. Em algumas enzimas o co-fator está ligado permanentemen-te à enzima, chamado, neste caso, de grupo prostético.

Muitas vitaminas solúveis em água são precursoras de coenzimas. A niacina (ácido nicotínico),por exemplo, é um precursor do NAD*. O ácido pantotênico é um precursor da coenzima A.

o cH,

Niacina Acido pantotênico

24.,0 Lrsozrue: MoDo DE AçÃo DE UMA ENzrmaA lisozima é formadapor 129 resíduos de aminoácido @i9.24.13). Três segmentos curtos dacadeia,

entreosresíduos5e15,24e34,e88e96têmestruturaa-hel icoidal ; osresíduosentre4le45e50e 54 formam lâminas pregueadas e uma volta em U ocorre entre os resíduos 46 e 49. Os segmentosrestantes de polipeptídios da lisozima têm conformação enovelada.

A descoberta da lisozima é uma história interessante:

Um dia, em l922,Alexander Fleming estava acometido de um resfriado. Isto não é incomum em Londres,mas Fleming era um homem incomum e aproveitou o resfriado de modo característico. Deixou cair algumasgotas de seu muco nasal sobre uma culfura de bactérias com que estava trabalhando e depois apartou a placapara observar o que acontecia. Imagine-se a sua excitação quando descobriu, algum tempo depois, que asbactórias próximas ao muco haviam se dissolvido. Durante algum tempo ele pensou ter alcançado sua cobi-

çada ilescoberta de um antibiótico universal. Num súbito de atividade, estabeleceu rapidamente que a açãoantibacteriana do muco devia-se à presença de uma enzima, a qual chamou de lisozima por causa da capaci-dade de dissolver (lise) as células bacterianas. Logo a lisozima foi encontrada em muitos tecidos e secreções

)


Fig. 24. l3 Estruturaprimária da lisozima daclara do ovo. De Voet, D.Voet, J. G. Biachemistry,2."ed.; Wiley: New York,1995; p.382.1

do corpo humano, nos vegetais e, principalmente, na clara do ovo. Infelizmente, Fleming descobriu que alisozima não era eficiente contra a maioria das bactérias patogênicas. Ele teve que esperar 7 anos até que.numa experiência semelhante, igualmente pitoresca, revelou a existência de um antibiótico verdadeiramenteefetivo: a penicilina.

Esta história foi relatada pelo Professor David C. Phillips, da Universidade de Oxford, que utilizou,muitos anos mais tarde, a aniálise por raios X para descobrir a estrutura tridimensional da lisozima.*

As investigações de Phillips, sobre difração de raios X da lisozima, são especialmente interessan-tes porque também revelaram informações importantes sobre o modo de ação desta eïzima sobre orespectivo substrato. O substrato da lisozima é um polissacaídeo de aminoaçúcares que faz parte daparede celular da bactéria. Um oligossacarídeo com a mesma estrutura geral do polissacarídeo daparede celular é mostrado naFig.24.14.

ooi l t l

& =-cHroH &=-NHCCH, R, = -cHCoH

é",

Fig.24.l4 Hexassacaúdeo que tem a mesma estrutura geral que o polissacaúdeo da pârede celularonde a lisozima atua. Estão presentes dois aminoaçúcares diferentes: Os anéis A, C e E são derivadosde um monossacarídeo chamado N-acetilglicosamina; os anéis B, D e F são derivados domonossacarídeo chamado ácido N-acetilmurâmico. Quando a lisozima age sobre estes oligossacarídeos,ocorre hidrólise, que resulta na quebra da tigação glicosídica entre os anéis D e E.

*Citação de David C. Phillips, The Three-Dimensional Structure of an Enzyme Molecul€. Dieitos autorais O 1966 por Scientiïic Ameriçan,Inc. Todos os direitos são resenados.

R1

\minoácidos e Proteínas 427

Usando oligossacarídeos (constituídos apenas por unidades de N-acetilglicosamina) sobre osquais a lisozima atua muito lentamente, Phillips e colaboradores puderam descobrir como o subs-trato se ajusta ao sítio ativo da enzima. Este sítio é uma profunda fenda na estrutura da lisozima(Fig.24.l5a). O oligossacarídeo é mantido nesta fenda através de ligações de hidrogênio e, quan-

do a enzima liga-se ao substrato, ocorrem duas mudanças importantes: a fenda da enzima se fecha

ligeiramente e o anel D do oligossacarídeo se "achata", deformando sua conformação estável de

cadeira. Este achatamento faz com que os átomos 1,2,5 e 6 do anel D fiquem coplanares; também

Moléculade substrato

\a) gCarbono6OxigênioffiHidrogênio@R = -CHzOH@R'= -NHCOCHa&R"= -CHCOzH

ICH:

"wMoléculade água

Lisozima

(c)

Fig. 24. I 5 (a) Este desenho mostra o esqueleto do complexo lisozima-substrato. O substrato (umheiassacarídeo, no desenho) entra numa fenda da estrutura da lisozima e é mantido em posição porligações hidrogôttio. À medida que a lisozima se liga ao oligossacaúdeo, a fenda em suaestrutura se_fechaligeiiamente. (Adaptado com autorização deAtlas of Protein Sequence and Structure, 1969;,Dayhotr,M.O-.. Ed.; National Biomedical Research Foundation: Washington, DC,1969. O desenho foi feito porIrving Geis, baseado na Íigura em perspectiva da molécula, publicada no Sci.entíftc American,emnovembro de 196ó. A pintura foi feita a partir de modelo real montado na Royal Insütution, Londres, porD. C. Phillips e colegas, baseado em resultados de cristalograÍia de raios X.) (b) Possível mecanismo deação da lisozima.0 desenho mostra uma porção expandida da paúe (a) e ilustra como pode oconer ahidrólise da ligação acetal entre os anéis D e E do substrato. O ácido glutâmico (resíduo 35) doa umpróton para o átomo de oxigênio interveniente, o que causa a formação de um carbocátion' que éõstabilizado pelo íon carboxilato do ácido aspártico (resíduo 52). Uma molécula de água fornece OII- aocarbocátion õ H+ ao ácido glutâmico. (Adaptado com autorização deThe Three-Dimensional Structure ofan Enzyme Molecule,porDaid C. Phillips, com direitos autorais @ l966,pela Scientiftt Amerinan,lnc.Todos os direitos reservados.) (c) Diagrama de Íita da lisozima, destacando o ácido aspártico 52(esquerda) e o ácido glutÍìmico 35 (direita) no modelo bola-e-vareta. @sta imagem e a que está namaigem no cabeçalho da Seção 24.10 foram criadas a paúir da estrutura de cristal de raios X, por Lim'K.; Nadarajah, A.; Forsythe, E. L.; Pusey, M. L., arquivo do Banco de Dados de Proteína lAZF.pdb.)

(b)


Uma protease serina.

Fig.24.l6 A tríadecatalítica nestâ proteaseserina (tripsina) estárepresentada por modelo.bola-e-vareta para o ácidoaspártico 52, a histidina 102e a serina 195. O inibidorfosfonato ligado no sítioativo está representado emforma de tubo. (Estaimagem e a do cabeçalho daSeção 24.11 foram criadas apartir da estrutura decristal de raios X, porBertrand, J. A.; Oleksyszn,J.; Kam, C.-M.; Boduszek,8., arquivo do Banco deDados de Proteína1MAX.pdb.)

distorce o anel D de tal modo, que a ligação glicosídica entre ele e o anel E fica mais sensível àhidrólise.*

A hidrólise da ligação glicosídica provavelmente segue o mecanismo ilustrado na Fig. 24.15b. Ogrupo carboxila do ácido glutâmico (resíduo de número 35) doa um próton para o oxigênio localiza-do entre os anéis D e E. A protonação leva à clivagem da ligação glicosídica e à formação de carbo-cátion no Cl do anel D. Este carbocátion é estabilizado pelo grupo carboxilato, com carga negativa.do ácido aspiírtico (resíduo de número 52), que está nas vizinhanças. A difusão de molécula de águadoa um íon OH- para o carbocátion e um próton para substituir o que foi perdido pelo ácido glutâmi-co. A estrutura de cristal de raios X da lisozima está representada na Fig.24.15c. O ácido glutâmico35 e o ácido aspártico 52 estão destacados na forma bola-e-vareta.

Quando o polissacarídeofazparte da parede celular bacteriana a lisozima se liga primeiro, prova-velmente, à parede celular através de ligações hidrogênio. Depois de a hidrólise ocoÍïer, a lisozimase afasta, deixando para trás uma bactéria com a membrana celular rompida.

24.1| PnoreasEs SERTNA

Quimotripsina, tripsina e elastina são enzimas digestivas secretadas pelo pâncreas nointestino delgado para catalisar a hidrólise das ligações peptídicas. Estas enzimas são cha-madas proteases serina, pois o mecanismo da sua atividade proteolítica (o que elas têmem comum) envolve um resíduo de serina específico que é essencial para a atividadeenzimáttica. Como outro exemplo da ação enzimática, examinaremos o mecanismo de açãoda quimotripsina.

A quimotripsina é formada a partir de uma molécula precursora chamadaquimotripsinogênio, que possui 245 resíduos de aminoácidos. A clivagem de duas unida-des dipeptídicas do quimotripsinogênio produz a quimotripsina. A quimotripsina se do-bra de modo que a histidina na posição 57 , o âçido aspártico na posição lo2 e a serina naposição 195 se aproximam. Juntos, estes resíduos formam a chamada tríade catalítica dosítio ativo (Fig. 24.16). Próximo de um sítio ativo há um sítio de ligação hidrofóbica,

uma bolsa em forma de fenda que acomoda, preferencialmente, as cadeias laterais apolares deFen, Tir e Tri.

Após a quimotripsina ter se ligado ao respectivo substrato de proteína, o resíduo de serina, na posição195, está em posição ideal para atacaÍ o carbono acílico da ligação peptídica (Fig.24.17). Este resí-duo de serina torna-se mais nucleofílico, transferindo seu próton para o nitrogênio imidazóliço doresíduo de histidina na posição 57. O íon imidazolônio que se forma é estabilizado pelo efeito depolarização do íon carboxilato do ácido asprírtico na posição 102. (Estudos por difração de nêutrons,

*R. H. Lemieux e G. Huber, qumdo trabalhavam no Conselho Nacional de Pesquisa do Cmadá, mostrtrm que qumdo uma aldexose é con-vertida em carbocátion, o anel do crbocátion assume exatamenÍe esta confomação achatada.


Asp\102i

YCH,

o-C

tor..H-

His

YCHoI Ser

\ ìY-N? .zclF.'H7o

Hl ' .o.,tè.OR'R

A.p

Y?cH2-c\

Sítio de ligação numbolsão hidrofóbico

Intermediáriotetraédrico

o-.H-

\Ï

Resíduode serinaacilado

Fig.24.17 A túade catalítica da qúmotripsina causa quebra da ligação peptídica pela acilação doresíduo serina 195 da quimotripsina. Próximo ao sítio ativo há um sítio de ligação hidrofóbico queacomoda as cadeias laterais apolares da proteína.

Hisq7

ICHoI

N\-N.

Asp

Y?cr{r-c:. Ser

qpI

CH"dI

R'


que mostram a posição dos átomos de hidrogênio, confirmam que o íon carboxilato permanece imu-

tável o tempo todo e não aceita um próton do imidazol.) O ataque nucleofflico pela serina forma a

serina acilada, passando por intermediário tetraédrico. A nova extremidade N-terminal da cadeia po-

lipeptídica quebrada se dispersa e é substituída por uma molécula de água.A regeneração do sítio ativo da quimotripsina está representada na Fig. 24.78. Neste processo a

água atua como o nucleófilo e, numa série de etapas análogas às da Fig.24.11 , hidrolisa a ligaçào

acila-serina. A enzima então está pronta para repetir todo o processo.

His

YAsp

Y?cH2-c\

otl

-C\

o

Asp\102/

YCH,

Resíduode serinaacilado

lntermediáriotetraédrico

Sítio ativoregenerado

Asp\r021YCHt

Serqp

ICH

*o/' \ l-CEõ

R

Hisq'7

ICHoI

' . .H-ú\ \ /-*ls

tí

/o

Hisq7

ICHoI

fr\\:N.

otl

-Cto.. .H-

'H-

T

o-c:oRFig. 24. | 8 Regeneração do

sítio ativo da quimotripsina.Água provoca hidrólise daligação acila-serina.

Produto,ácido carboxílico

CHoSer

-'.-,\ \195/o"'H-\ ) _ Y\:ND /cH"'s?

\-:sl ê/o c\+o

Serqp

I

,/CHo

\minoácic los e Protcrnr. 131

Há mais evidências para este mecanismo mas, por razões de espaço, teremos que i-snorá-la:. L mrt

delas, no entanto, merece menção. Há compostos, como o diisopropilfosfofluoridato (si-sÌa enl rn-glês DIPF), que inibem irreversivelmente a protease serina. Mostrou-se que conseguem este eÍeito

reagindo exclusivamente com a Ser 195.

cH(cH.),t ' -o

\ lSer 195*CH,OH + F-P:O,,/ I

cH(cH.).Io

oI

cH(cHr),Diisopropilfosfo-fluoridato (DIPF)

Um hapteno relacionado aoaducto de Diels-Alder,formado entre ocicloexadieno e amaleimida, aprisionado nointerior de um anticorpocatalítico Diels-Alderase.(Esta imagem e a da foto deabertura do Cap. 24 foramcriadas a partir daestrutura de cristal de raiosX, por Romesburg, F. E.;Spiller, B.; Schultz, P. G.;Stevens, R. C., arquivo doBanco de Dados de Proteína1A4K.pdb.) orc

Hapteno

R:_^N-^r-- .^; ,z\

CorHl l I" , - ' -Nr*

-orCorC-

Estado de transição

\ lSer 1e5|CHr-o-ï :o

IoI

cH(cHr)2

DIP-Enzima

Anticorpos são defensores químicos do sistema imunológico. Cada anticorpo é uma prote-

ína produzida especificamente em resposta a alguma espécie química invasora (p. ex., molécu-

las na superfície de um vírus ou grão de pólen). O objetivo dos anticorpos é ligar-se a estes

agentes eitrangeiros e caÌrsar sua remoção do organismo. Normalmente, a ligação de cada an-

ticorpo com seu alvo (o antígeno) é altamente específica.Um caminho que os anticorpo s catalíticos desenvolveram é induzindo uma resposta imunológi-

ca à espécie química semelhante ao estado de transição para uma reação. De acordo com esta idéia,

se for õriado um anticorpo que se ligue, preferencialmente, com uma molécula estável, que tenha

esÍ1Ìtura semelhante ao estado de transição, outras moléculas capazes de reagirem atrattés deste

estado de transição, o farão, a princípio, mais rápido em conseqüência da ligação com o anticorpo.(Facilitando a associação entre os reagentes e favorecendo a fotmação da estrutura do estado de

transição, o aÍÌticorpo atua de modo semelhante a uma enzima.) Esta estratégia funciona, de modo

formidável, na produção de anticorpos catalíticos; precisamente, paÍa certas reações de Diels-Alder,

rearanjos de Claisen e hidrólise de ésteres. Os químicos sintetizaram moléculas estáveis semelhan-

tes aos estados de transição destas reações, permitiram a formação de anticorpos contra estas molé-

culas (chamadas haptenos), e então isolaram os anticorpos resultantes. Os anticorpos assim produ-

zidos atuam como catalisadores quando moléculas de substratos reais são fomecidas.Os exemplos seguintes são haptenos usados como análogos de estados de transição para incitar

anticorpos câtalíticoì para um rearranjo de Claisen, uma hidrólise de carbonato e uma reação de Diels-

Alder. A reação catalisada pelo anticorpo gerado a partir de cada hapteno também é mostrada.

Rearranio de Claisen

o

Ouímica

./


rrapreno o,*{-}:>t'{,.---,.^ 1.o'- \-r' c)

or*Ootl

Co--- \ocH,

+HO

o. OH

l l -,-tn,Y"-"t, -----

o

DienóÍìlo

Hidrólise de carbonuto

l>.<31"J*lo.NL

Estado de transição

Reação de Diels-Alder

oll -CH,C-N:

-cH.,

HN__r.(CHr)3COOH

tlo

Hapteno

(

ì

"<:i.,,ocooHDieno

oProduto exo

Este casamento entre enzimologia e imunologia, que resulta em descendência química, é ape-nas uma entre as áreas de pesquisas interessantes, situadas na interface da química e da biologia.

O reconhecimento do efeito desativador do DIPF foi resultado da descoberta de que o DIpF.e compostos relacionados, seriampoderosos venenos neurológicos. lSão os "gases de nervosde uso militar, embora sejam líquidos que se dispersam em gotículas, e não gases.) O diisopro-pilfosfofluoridato desativa a acetilcolinesterase (Seção 20.4), reagindo com ela do mesmo modoque reage com a quimotripsina. Acetilcolinesterase é uma esterase serina e não uma proteaseserina.

ffi'"'o*o",,]*Estado de transição

oll _-cH,

-.'\-lC-N.-I I -CH,

\-, il-ro-.r,OcooHr l l l

il

24.12 HemocloBtNA: Uma Pnoreírua ConruGADAAlgumas proteínas, denominadas proteínas conjugadas, contêm, çomo parte de sua estrutura,

o- grì1po nãõ-protéico chamado de grupo prostético. Um exemplo é a proteína transpoÍadora de

oxigéni,o, hemoglobina. Cada uma das quatro cadeias polipeptídicas da hemoglobina está unida a um

grupo prostético chamado h eme (Fig.24.19).As quatro cadeias polipeptídicas enovelam-se de modo

ã d* a h"-oglobina um formato aproximadamente esférico (Fig. 24.20). Além disto, cada grupo heme

está numa úda com os grupos vinila hidrofóbicos de sua estrutura porfirínica rodeados por cadeias

laterais hidrofóbicas dos resíduos de aminoácidos. As duas çadeias laterais de propanoato da heme

se acomodam próximas aos grupos amino carregados positivamente dos resíduos de lisina e de argi-

nina.O ferro do grupo heme está no estado de oxidação 2* (ferroso) e forma uma ligação coordenada

com um nitrog6nio do grupo imidazolila da histidina da cadeia polipeptídica. Isto deixa uma valên-

cia do íon ferroso liwe para se combinar com o oxigênio, do seguinte modo:

\ ?'/^Fe

,/ . \;NN (imidazol)

Uma parte dahemoglobina oxigenada

O fato de que o íon ferroso do grupo heme combina-se com o oxigênio não é particularmente

notável; muitoì compostos semelhantes fazemo mesmo. O que é notável sobre a hemoglobina é que

quando a heme se combina çom o oxigênio o íon ferroso não se oxida prontamente ao estado férrico.

Éstudos com modelos de compostos heme em água, por exemplo, mostram que sofrem uma rápida

combinação com o oxigênio, mas também sofrem rápida oxidação do ferro, de Fe*2 para F:]'. 9uun-do estes mesmos compostos estão embutidos no ambiente hidrofóbico de uma resina de poliestireno,

porém, o ferro é facilmente oxigenado e desoxigenado, sem mudança do seu estado de oxidação. A

ãsrc respeito, é especialmente interessante notar que investigações da hemoglobina por raios X reve-

laram que as cadèias polipeptídicas fornecem a cada grupo heme um ambiente hidrofóbico seme-

lhante.

Fig.24.19 Estrutura daheme, o grupo prostético dahemoglobina. A heme temestrutura semelhante à daclorofila (Fig. 22.1) poistambém é derivada do anelheterocíclico, a porÍirina. Oferro da heme está noestado de oxidação ferroso(2+').

CH:CHz

Fig. 24.2O Hemoglobina.(Imagem criada daestrutura de cristal de raiosX, por Tame, J. R.; Wilson'J. C.; Weber' R. E., arquivodo Banco de Dados deProteína lOUU.pdb.)

CH" CH"I

CH,I

COH

o

J


Estrutura primáriaEstrutura secundária, a-hélice, lâmina

B'pregueada, enovelamento aleatórioEstrutura terciáriaEstrutura quaternáriaLigações dissulfetoIons dipolares, zwitterionsPonto isoelétrico (pI)Equação de Henderson-HasselbalchLigação peptídica, laço peptídicoResíduo de aminoácidoEnzimaSíntese assimétrica (enantiosseletiva)PolipeptídioProteínaAnrílise do resíduo terminalHidrólise parcialGrupos de proteçãoSubstratoHipótese da chave e fechadura ou

ajustamento induzidoInibidorGrupo prostéticoCoenzimaSítio ativoProteínas conjugadas

Seções 24.1, 24.5 e4.6Seções 24.1 e?A.8A.

Seções 24.1 e?"4.88Seções 24.1 e24.8CSeção Z.2ASeção24.2CSeqão24.2CSeção24.2CSeção24.4Seção 24.4Seções Z.3D e 2.9Seções 5.98 e24.38Seção24.4Seção?A.4Seção Z.5ASeção 24.58Seção 24.7ASeção 24.9Seção 24.9

Seção 24.9Seção 24.9Seção 24.9Seção 2.9Seção?"4.12

P no g L E M A s 24.16 (a) Que aminoácidos daTabela24.l possuemmais deumestereocentro? (b) Escrevaproje-A o I c I o N A I s * ções deFischerparaos isômeros de cadaumdesses aminoácidos quetenhamaconfiguração

L no carbono a. (c) Que tipo de isômero você deseúou em cada caso?

24.17 (a) Que aminoácido da Tabela 24.1 pode reagir com ácido nitroso (isto é, solução de NaNO,e HCI) para daÍ ácido lático? (b) Todos os aminoácidos da Tabela 24.1, exceto dois deles,liberam nitrogênio quando tratados com ácido nitroso; quais são eles? (c) Que produto vocêesperaria obter pelo tratamento da tirosina com água de bromo em excesso? (d) Que produtovocê esperaria que fosse formado pela reação da fenilalanina com etanol na presença de clo-reto de hidrogênio? (e) Que produto você esperaria da reação da alanina com cloreto de ben-zoíla, em meio básico aquoso?

24.18 (a) Com base na seguinte seqüência de reações, Emil Fischer pôde mostrar que a (-)-serinae a L-(*)-alanina têm a mesma configuração. Represente projeções de Fischer para os inter-medirírios A-C.

(-)-Serina a#=t A (c4Hl'clNor) 5 B (c4Hecl2No2

c (qH6clNo; ffiffi> L-(*)-alanina(b) A configuração da L-(-)-cisteína pode ser relacionada à da L-(-!serina através das re-ações a seguir. Escreva projeções de Fischer para D e E.

B [da paÍe (u)] !5 D (c4HsclNor) I%.

(l) HrO*, H2O, calor

(2) oH-

E (C4HeNO2S

(c) A configuração da L-(-)-asparagina pode ser relacionada à da L-(-)-serina do seguintemodo. Qual é a estrutura de F?

1 -(-)-Asparuginu ffi* F (c3H7N2or )

""oilïl" tc [da parte (a)] -J

NH'

(1) H3Q*, HrO, calor-cisteína(2) OH-

*Os problemas marcados com asterisco são "problemc de desafio".

Aminoácídos e Proteínas

24.19 (a) O ácido Dl-glutâmico foi sintetizado a partir do acetamidomalonato de dietila. do seguintemodo. Esboce as reações envolvidas.

otl

CH3CNHCH(CO2C2H5)2 +

Acetamidomalonatode dietila

NaOC.H.CH":(H-C-N...--:::-- '- - -t c2H5oH

(rendimento 957o)

HCIconcenÍâdo | . . - -

G (C,,H,"N,O.) Ë Acido Dl-glutâmict' reÍluxo por o n

(rendimento 667o)

(b) O composto G também foi usado paÍa prepaÍar o aminoácido Dl-ornitina, através da se-guinte rota. Descreva as reações envolvidas.

HCI

c (c,2H,8N2or) *+#' H(Ct0Ht6N2o4, uÍrÌâ ô-lactama) *Ïffiït

(rendimento 907o) (rendimento 97%)

Hidrocloreto da Dl-ornitina (C5H13CIN2O2)

(L-ornitina é um aminoácido natural, mas não é encontrado nas proteínas. Em um certo cami-nho metabólico, a L-ornitina serve como precursora para a L-arginina.)

24,20 Abradicinina é um nonapeptídio liberado pelas globulinas do plasma sanguíneo em respostaa uma ferroada de vespa. E um potente agente algesiógeno. Sua fórmula moleculaÍ é Áugt,Gli, Fenr, Pror, Ser. O uso de 2,4-dinitrofluorbenzeno e de carboxipeptidase mostra que osdois resíduos terminais são da arginina. A hidrólise ácida parcial da bradicinina fornece osseguintes di e tripeptídios:

Fen'Ser * Pro'Gli'Fen * Pro'Pro * Ser'Pro'Fen * Fen'Arg * Arg'Pro

. Qual é a seqüência de aminoácidos da bradicinina?

24,21 Hidrólise completa de um heptapeptídio mostrou que ele tinha a seguinte fórmula:

24.22

Alar, Glu, Leu, Lis, Fen, Val

Deduza a seqüência de aminoácidos deste heptapeptídio a partiÍ das seguintes informações:1. Tratamento do heptapeptídio com 2,4-dinitrofluorbenzeno, seguido de hidrólise incom-

pleta forneceu, entre outros produtos: valina miìrcada no grupo a-amino, lisina marcadano grupo €-amino e um dipeptídio, DNP-Val'Leu (DNP : 2,4-dinitrofenil-).

2. Hidrólise do heptapeptídio com carboxipeptidase deu uma concentração inicial alta de ala-nina, seguida por uma concentração crescente de ácido glutâmico.

3. Hidrólise eruimáútcaparcial do heptapepídio fomeceu um dipeptídio (A) e um tripepúdio (B).a. Tratamento de A com 2,4-dinitrofluorbenzeno, seguido de hidrólise, deu leucina mar-

cada com DNP- e lisina marcada apenas no grupo e-amino.b. Hidrólise completa de B deu fenilalanina, ácido glutâmico e alanina. Quando B reagiu

com carboxipeptidase, a solução mostrou uma alta concentração inicial de ácido glutâ-mico. O tratamento de B com 2,4-dinitrofluorbenzeno, seguido de hidrólise, deu feni-lalanina marcada.

Ácido poliglutâmico sintético existe na forma de a-hélice em solução depH2-3. Quando opH desta solução é elevado gradualmente, pela adição de base, ocoÍïe uma mudança drásticana rotação óptica em pH 5. Associa-se esta mudança ao desdobramento da o-hélice e forma-

ção de um novelo randômico. Que característica estrutural do ácido poliglutârnico e que mo-dificação química você sugere como explicação para estas transformações?

Parte das evidências da rotação restrita em tomo da ligação carbono-nitrogônio, numa ligaçãopeptídica (veja Seção 24.B{),provém de estudos por tH RMN com amidas simples. Por exem-plo, na temperatura ambiente e com o instrumento operando a 60 MHz, o espectro lH RMN da

Mfl-dimetilformamida, (CH,)rNCHO, mostra um dubleto a ô 2,80 (3H), um dubleto aõ2,95(3H) e um multipleto a ô 8,05 (1H). Quando o espectro é determinado em uma força de campomagnético mais baixa (isto é, com o instrumento operando a 30 MHz), verifica-se que os dubletosdeslocam-se de modo que a distância (em hertz) que separa um do outro diminui. Quando seaumenta a temperatura da determinação do espectro, os dubletos persistem até que se atinja1 1 1"C; nesta temperatura os dois sinais coalescem num só sinal. Explique detalhadamente comoestas observações contribuem para a hipótese da existência de uma barreira de potencial relativamente grande à rotação em torno da ligação carbono-nitrogênio da DMF.

24.23


*24.24 Dada a seguinte seqüência de reações, estudadas na SRI Intemacional, durante a síntese decompostos com possível atividade anticâncer, considere as questões:

(cH.)_-s-s-(H,c)-^ ' l'\-'{ ì--<"

INHHNI1) KNCO

HOOCCH(CHJ.S-S(CH2).CHCOOH T.) *, *

t lNH, NH, B )í*"o

^ì(oA

cHr-cH2-so2clt .

ô l"Y'INHC

HNV\\o

lmn-t .

VH2C-CH2-SO2NR2

o\-{

tt{--)t E\o

cH2-so2clo\---{

ìNHD

"ì(o

J*'l- csJ

l"Ì{;lL"ï1 l

(a) Escreva um mecanismo para a conversão de um dos dissulfetos A (homocisteína, quan-do n : 2i cisteína quando n : 1) nos respectivos derivados bis-hidantoínas B.

(b) Escreva um mecanismo onde B, r : 2, é convertido no cloreto de sulfonila C.(c) O cloreto de sulfonila C é convertido normalmente em sulfonamidas do tipo E; sugira

um mecanismo que explique por que o resultado é muito diferente quando se usa o clo-- reto de sulfonila D. [Assuma que o produto seja o que está mostrado, mesmo que não se

tenha comprovação.l

*24.25 Quando o cloreto de sulfonila C do problema anterior reage com etanol em piridina, forma-se um produto com fórmula molecular C'2H17N3O5S. Qual é a sua estrutura?

*24,26A companhia japonesa Kaneka relatou o seguinte método de resolução dinâmica para obten-

ção de enantiômero puro de um aminoácido:CH"I

H3co\y,,\ HrN/rr-6\

l l I + ' l l I\r\-,1-.CorH (D-rr \2

tl

o1lI t

H3CO

+co2H co2H

(S)-p -Metoxihomofenilalanina, IV

Neste exemplo, a forma (S,S)- do aducto III, cristaliza no meio reacional, com 90Vc de rendi-

mento e 977o de excesso enantiomérico.(a) O que justifica a formação do produto com excesso enantiomérico tão elevado?

ÌUi q"ã pã"cípio estudado na química fundamental explica a predominância de um dos dois

produtos possíveis?(c)

^eue tipo ãe reação está duplamente ilustrado na conversão de (üS)-il em (.!-fV?

PnosLEMAsPARA

TnaEALHO EMGnupo

1.. A enzima lisozima e seu respectivo mecanismo estão descritos na Seção 24.10. Usando estas in-

formações (e talvez as informações adicionais de um livro de bioquímica), prepare uma apresen-

tação para sua turma sobre o mècanismo da lisozima. Considere especialmente a função da enzi-

-ã d"-f*o."cer a formação de intermediiário carbocátion, estabilizando-o, e de fornecer ou remo-

ver prótons onde for necessário.2. A quimotripsina é um membro da classe de enzimas protease serina. Seu mecanismo de ação está

aescrito na Seçao 24.1 1. Usando estas informações (e talvez as informações adicionais de um li-

vro de bioquímica), prepare uma apresentação para sua turma sobre o mecanismo da quimotripsi-

na. Considãre especialmente a funçao da"tríade catalítica",comrespeito à catálise ácido-base e à

tendência relativã de vários grupos a agirem como nucleófilos ou como grupos retirante'

Cap.24 - Aminoácidos e Proteínas

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