JULIANA PATRÃO DE PAIVAobjdig.ufrj.br/59/teses/897742.pdf · 2020. 10. 23. · JULIANA PATRÃO DE...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

FACULDADE DE FARMÁCIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

JULIANA PATRÃO DE PAIVA

DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

FOTOPROTETORA DE NANOSSISTEMAS FORMADOS POR SILICATOS MINERAIS E

FILTROS SOLARES INORGÂNICOS

Rio de Janeiro

2019

JULIANA PATRÃO DE PAIVA

DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

FOTOPROTETORA DE NANOSSISTEMAS FORMADOS POR SILICATOS MINERAIS E

FILTROS SOLARES INORGÂNICOS

Orientador: Prof. Dr. Lucio Mendes Cabral

Co-orientadores: Prof. Dr. Marcelo de Pádula

Prof. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão

Rio de Janeiro

2019

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do

Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção

do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.

Ao meu pai Rubens e avó Sonia (in memoriam).

AGRADECIMENTOS

À Deus.

À minha querida família, principalmente aos meus pais Rubens e Neuza, ao meu irmão,

Gabriel, que sempre estiveram ao meu lado me apoiando e contribuindo para minha formação.

Agradeço por todo amor e incentivo. E também aos meus tios, primos e cunhada Nathália, pela

cumplicidade e alegria divididas.

Em especial, à minha avó Sonia por acreditar em mim e nos meus sonhos.

Ao Theo, meu noivo e amigo, obrigada pelo amor, paciência e companheirismo.

Aos professores orientadores Marcelo de Pádula, Alvaro Leitão e Lucio Mendes Cabral,

por me aceitarem como aluna, pela dedicação, oportunidade, confiança, conselhos,

ensinamentos, tempo e esforço dedicados.

Aos meus amigos do antigo Laboratório de Radiobiologia Molecular, do Laboratório de

Microbiologia e Avaliação Genotóxica e do Laboratório de Radiações em Biologia, pelas muitas

ajudas no laboratório e torcida constante, em especial, à Raiane Diniz, Janine Rurr, Claudia

Lage, Rita Albuquerque Tula Gonçalves e Leonardo Vidal, pelo carinho, apoio e por facilitarem

nosso trabalho do dia-a-dia.

A todos os meus amigos da Farmácia Universitária, da Faculdade de Farmácia e da

Homeopatia, em especial à Fortune Homsani, que foi fundamental durante esses 4 anos.

Aos professores Bianca Aloise e Rodrigo Fortunato pela importante participação e

colaboração no desenvolvimento deste trabalho.

Aos professores, alunos, colaboradores e funcionários do Programa de Pós Graduação

em Ciências Farmacêuticas.

Aos professores da banca de acompanhamento, banca de qualificação e banca

avaliadora pelas contribuições e por gentilmente aceitarem o convite.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para realização desta tese.

“Educação não transforma o mundo.

Educação muda as pessoas.

Pessoas transformam o mundo."

(Paulo Freire)

RESUMO

PAIVA, Juliana Patrão de. Desenvolvimento, caracterização e avaliação da atividade

fotoproterora de nanossistemas formados por silicatos minerais e filtros solares

inorgânicos. Rio de Janeiro, 2019. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de

Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2019.

Diferentes agentes físicos e/ou químicos podem causar lesões no DNA celular, como a radiação

ultravioleta (UV) emitida pelo sol, que é capaz de induzir estes danos e contribuir para

carcinogênese, mesmo em células proficientes em mecanismos de reparo do DNA. Assim, uma

estratégia utilizada para diminuir estes danos é o uso de fotoprotetores. Porém, sob radiação UV,

alguns componentes usados em formulações para fotoproteção possuem características

controversas, como o dióxido de titânio (TiO2) e o óxido de zinco (ZnO) que podem gerar

espécies reativas de oxigênio (ERO). O presente trabalho teve como objetivo preparar,

caracterizar e avaliar a citotoxicidade, eficácia, segurança e efeito antioxidante de filtros solares

inorgânicos, em duas cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae, selvagem e mutante ogg1,

deficiente no reparo por excisão de bases (BER). Foram obtidas misturas físicas (MF) e um

nanossistema (NS) formados por Montmorilonita sódica (MMT-Na) mais diferentes amostras de

TiO2 e ZnO. O ZnO e a mistura de ZnO + TiO2 foram citotóxicos para as cepas, porém a adição

de MMT-Na protegeu as cepas deste efeito citotóxico no escuro. Somente foi obtido NS com

MMT-Na e TiO2 (Sigma) de menor tamanho de partícula (195,1 nm). O tratamento com NS

obtido foi mais seguro (menor mutagênese induzida) e eficaz (maior fração de sobrevivência

celular) quando a cepa mutante ogg1 foi irradiada com UVB e luz solar simulada (LSS). Ainda, o

tratamento com NS apresentou perfil antioxidante (menor geração de ERO), quando a cepa

selvagem foi irradiada com UVB, LSS ou tratada com peróxido de hidrogênio (H2O2). Foram

desenvolvidas formulações fotoprotetoras utilizando filtros solares orgânicos mais o NS e a MF

formados por MMT-Na + TiO2 (Sigma) e testada sua eficácia de fotoproteção in vitro. As

formulações cosméticas desenvolvidas apresentaram fator de proteção solar (FPS) acima de 50,

além dos efeitos antimutagênico e antioxidante, principalmente conferidos ao NS. Assim, o

modelo de S. cerevisiae utilizado é uma alternativa econômica e cientificamente viável na

avaliação da cito e/ou genofototoxicidade e no desenvolvimento de novos ativos fotoprotetores.

Palavras-chave: Fotoproteção. Filtros solares inorgânicos. Nanossistemas. Saccharomyces

cerevsiae. Fotomutagenicidade; Fotogenotoxicidade.

ABSTRACT

PAIVA, Juliana Patrão de. Development, characterization and photoprotective evaluation of

nanosystems formed by mineral silicates and inorganic sunscreens. Rio de Janeiro, 2019.

Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do

Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2019.

Different physical and/or chemical agents can cause structural damage to cellular DNA, such as

sunlight ultraviolet (UV) radiation, which can induce these damages and contribute to

carcinogenesis, even in cells proficient in DNA repair mechanisms. Thus, a strategy used to

reduce the damage caused by solar radiation is the use of sunscreen. However, under UV

radiation, some components used in photoprotection formulations have controversial

characteristics, such as titanium dioxide (TiO2) and zinc oxide (ZnO) which can generate reactive

oxygen species (ROS). The present work aimed to prepare, to characterize and to evaluate the

cytotoxicity, efficacy, safety and antioxidant effect of inorganic sunscreens in two

Saccharomyces cerevisiae yeast strains, wild type and ogg1 mutant, which is deficient in base

excision repair (BER). They were obtained physical mixtures (MF) and a nanosystem (NS)

formed by sodium Montmorillonite (MMT-Na) plus different TiO2 and ZnO samples. ZnO and

ZnO + TiO2 mixture were cytotoxic to the strains, but the addition of MMT-Na protected the

strains from this dark cytotoxic effect. Is was formed only one NS with MMT-Na and TiO2

(Sigma) within smaller particle size (195.1 nm). The NS treatment was safer (lower induced

mutagenesis) and effective (higher cell survival fraction) when the ogg1 mutant strain was

irradiated with UVB and simulated sunlight (LSS). In addition, the NS treatment showed

antioxidant profile (lower ROS generation), when the wild type strain was irradiated with UVB,

LSS or treated with hydrogen peroxide (H2O2). Photoprotective formulations were developed

using organic sunscreens plus NS and MF formed by MMT-Na + TiO2 (Sigma) and their in vitro

photoprotection efficacy was tested. The developed cosmetic formulations presented high sun

protection factor (SPF) above 50, besides the antimutagenic and antioxidant effects, mainly

conferred to NS. Thus, the S. cerevisiae model used is an economically and scientifically viable

alternative in the evaluation of cyto and/or genophototoxicity and in the development of new

photoprotective actives.

Keywords: Photoprotection. Inorganic sunscreens. Nanosystems. Saccharomyces cerevsiae.

Photomutagenicity; Photogenotoxicity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema das camadas da pele.......................................................................... 23

Figura 2. Parte do espectro da radiação solar.................................................................. 25

Figura 3. Esquema ilustrativo da capacidade de penetração da radiação solar nas

diferentes camadas da pele...............................................................................................

27

Figura 4. Alguns danos causados pela radiação UV........................................................ 29

Figura 5. Exemplos de lesões causadas pela radiação UV.............................................. 33

Figura 6. Esquema ilustrativo dos mecanismos NER e BER.......................................... 35

Figura 7. Esquema ilustrativo da atuação da proteína Ogg1 no BER............................. 36

Figura 8. ABCD do câncer de pele.................................................................................. 38

Figura 9. Estrutura da Montmorilonita sódica (MMT-Na).............................................. 46

Figura 10. Fotografia do Simulador Solar Oriel/Newport®, Modelo 91192.................. 62

Figura 11. Representação esquemática dos compartimentos internos do Simulador

Solar marca Oriel/Newport®, Modelo 91192..................................................................

63

Figura 12. Tamanho médio de partícula da amostra TiO2 (Sigma)................................. 69

Figura 13. Tamanho médio de partícula da amostra TiO2 (Eusolex T - Merck)............. 70

Figura 14. Tamanho médio de partícula da amostra ZnO (Sigma)................................. 70

Figura 15. Tamanho médio de partícula da amostra ZnO (Vetec).................................. 71

Figura 16. Padrões de difração da MMT-Na, mistura física, produto da reação de

intercalação MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e TiO2 (Sigma) em intervalo de 2 θ entre 2

e 20º..................................................................................................................................

72


intercalação MMT-Na mais TiO2 (Merck) e TiO2 (Merck) em intervalo de 2 θ entre 2

e 20º..................................................................................................................................

73


intercalação MMT-Na mais ZnO (Sigma) e ZnO (Sigma) em intervalo de 2 θ entre 2 e

20º.....................................................................................................................................

73


intercalação MMT-Na mais ZnO (Vetec) e ZnO (Vetec) em intervalo de 2 θ entre 2 e

20º.....................................................................................................................................

74

Figura 20. Fração de sobrevivência (N/N0) das cepas (A) selvagem FF18733 e (B)

mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com 100 µg/mL dos filtros

solares físicos isolados durante tratamento de 6 h sem irradiação...................................

76



solares físicos em associação durante tratamento de 6 h sem irradiação..........................

77




78




79

Figura 24. Representação gráfica das condições ambientais de temperatura e variação

da emissão solar de UVA e UVB que atinge a cidade do Rio de Janeiro/RJ em um dia

de verão durante 9 h de experimento................................................................................

82

Figura 25. Fração de sobrevivência (N/N0) da cepa CD138 (ogg1) após tratamento

com UVB e 100 µg/mL dos filtros solares físicos............................................................

85


com UVB e 100 µg/mL da associação de TiO2 mais ZnO...............................................

86


com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 ou ZnO..........................

88


com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 e ZnO............................

90


com LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma).........

92

Figura 30. Fração de sobrevivência (N/N0) da cepa selvagem FF18733 após

tratamento com UVB e 100 µg/mL dos filtros solares físicos..........................................

96


tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de TiO2 mais ZnO.............................

97


tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 ou ZnO.......

99


tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 e ZnO..........

100


tratamento com LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2

(Sigma)..............................................................................................................................

102

Figura 35. Cinética de geração de ERO por meio da detecção da emissão de

fluorescência usando o reagente CM-H2DCF-DA e as cepas mutante CD138 (ogg1)

(A) e selvagem FF18733 (B) de S. cerevisiae, pós-tratamento com MF ou NS

formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma).....................................................................

106




formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e 200 mM de H2O2......................................

108




formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e radiação UVB na DL37.............................

110




formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e radiação com LSS na DL37......................

112

Figura 39. Aspecto da formulação final.......................................................................... 115

Figura 40. Esquema proposto para o nanossistema obtido pela reação de intercalação

entre MMT-Na mais TiO2 (Sigma)...................................................................................

Figura 41. Esquema ilustrativo da fotoativação de óxidos de metais semicondutores

após exposição à radiação UV..........................................................................................

119

124

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores de DL37 (kJ/m2) e mutagênese induzida na DL37 da cepa mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL dos filtros

solares físicos....................................................................................................................

85


CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação

de TiO2 mais ZnO.............................................................................................................

87



de MMT-Na mais TiO2 ou ZnO.......................................................................................

89



de MMT-Na mais TiO2 e ZnO..........................................................................................

90

Tabela 5. Comparação entre os valores de DL37 (kJ/m2), mutagênese induzida na

DL37 e diminuição do incremento de fotomutagênese da cepa mutante CD138 (ogg1)

de S. cerevisiae após tratamento com UVB ou LSS e 100 µg/mL da MF ou NS


93

Tabela 6. Valores de DL37 (kJ/m2) e mutagênese induzida na DL37 da cepa selvagem

FF18733 de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL dos filtros solares

físicos................................................................................................................................

96


FF18733 de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de

TiO2 mais ZnO..................................................................................................................

98



MMT-Na mais TiO2 ou ZnO............................................................................................

99



MMT-Na mais TiO2 e ZnO..............................................................................................

101

Tabela 10. Comparação entre os valores de DL37 (kJ/m2), mutagênese induzida na

DL37 e manutenção do incremento de fotomutagênese da cepa selvagem FF18733 de

S. cerevisiae após tratamento com UVB ou LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados

por MMT-Na mais TiO2 (Sigma).....................................................................................

103

Tabela 11. Comparação dos resultados obtidos para as cepas mutante CD138 (ogg1) e

selvagem FF18733 de S. cerevisiae pós tratamento com UVB ou LSS e o NS ou MF


113

Tabela 12. Análise das formulações obtidas para fotoproteção....................................... 116

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Solução de glicose a 20% (p/v)...................................................................... 55

Quadro 2. Meio de cultivo - YPG líquido....................................................................... 55

Quadro 3. Meio de cultivo - YPG sólido......................................................................... 56

Quadro 4. Soluções de aminoácidos e/ou base................................................................ 56

Quadro 5. Meio de cultivo - YNBD sólido com Canavanina (Sigma) 60 mg/L............. 57

Quadro 6. Cepas de S. cerevisiae.................................................................................... 57

Quadro 7. Doses de UVB (kJ/m2) por tempo de irradiação............................................ 61

Quadro 8. Doses de UVB (kJ/m2) e UVA (kJ/m2) por tempo de irradiação obtidas

com o simulador solar.......................................................................................................

62

Quadro 9. Componentes das formulações para proteção solar utilizados em diferentes

concentrações....................................................................................................................

68

Quadro 10. Dados referentes às condições ambientais de variação de temperatura e

radiação solar UVA e UVB em um dia de verão na cidade do Rio de

Janeiro/RJ..........................................................................................................................

81

Quadro 11. Concentração máxima permitida e faixa de absorção UV de diferentes

filtros orgânicos e inorgânicos a serem utilizados em formulações para proteção

solar...................................................................................................................................

128

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

•OH Radical hidroxil

6-4PP Pirimidina (6-4) Pirimidona

8-oxoG 7,8-dihidro-8-oxoguanina

A Adenina

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BER Reparo por excisão de bases

C Citosina

CAN1 Gene que codifica a proteína Arginina Permease

Can1p Transportador aminoácido-permease

CanR Mutantes resistentes à Canavanina

CD138 Cepa mutante (ogg1) de Saccharomyces cerevisiae

CM-H2DCF-DA Carboxi-2',7'- diacetato de diclorofluoresceína

CNRS Centre National de la Recherche Scientifique

-CO2• Radical carboxil

CPD cis-syn dímero de pirimidina ciclobutano

D.O. Densidade ótica

DCF Diclorofluoresceína

DHHB Dietilamino hidroxibenzoil hexil benzoato

DL37 Dose letal que permite sobrevivência de 37% da população

DLS Espalhamento de luz dinâmico

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DNAmt Ácido Desoxirribonucléico mitocondrial

DRX Difração de raios X

EMA European Medicines Agency

ERO Espécie reativa de oxigênio

EUA Estados Unidos da América

F1 Formulação 1

F2 Formulação 2

F3 Formulação 3

F4 Formulação 4

F5 Formulação 5

FDA Food and Drug Administration

FF18733 Cepa selvagem de Saccharomyces cerevisiae

FPS Fator de proteção solar

G Guanina

GLC Golpe letal por célula

H2O Água

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

His Histidina

IBCCF Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

INCI International Nomenclature of Cosmetic Ingredient

IV Infravermelha

L-can L-canavanina (Canavanina)

Leu Leucina

Lis Lisina

LSS Luz solar simulada

MF Mistura física

MMT Montmorilonita

MMT-Na Montmorilonita Sódica

N Número de células após tratamento

N/N0 Fração de sobrevivência

N0 Número inicial de células

Na+ Íon sódio

NER Reparo por excisão de nucleotídeos

NOX NADPH-oxidase

NS Nanossistema

O2 Oxigênio molecular

O2•- Radical superóxido

OC Octocrileno

Ogg1 Oxo Guanina Glicosilase

OGG1 Gene que codifica a proteína Oxo Guanina Glicosilase

-OH Grupamento hidroxila

OMC Octil-metóxicinamato

PdI Índice de polidispersividade

q.s.p. Quantidade suficiente para

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

REDOX Redução-Oxidação

RNA Ácido Ribonucléico

RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro

RPM Rotações por minuto

SCCS Scientific Committee on Consumer Safety

T Timina

TiO2 Dióxido de titânio

Trp Triptofano

TRP1 Gene que codifica a produção de Fotoribosilantranilato isomerase

UE União Europeia

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

Ura Uracila

UV Ultravioleta

UVA Ultravioleta do tipo A

UVB Ultravioleta do tipo B

UVC Ultravioleta do tipo C

VIS Visível

YBND Meio de Cultura (Yeast Nitrogen Base Dextrose)

Yno1 Yeast NADPH-oxidase

YNO1 Gene que codifica a proteína Yeast NADPH-oxidase

YPG Meio de Cultura (Yeast Extract Peptone Glucose)

ZnO Óxido de zinco

LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES

% Percentual

~ Aproximadamente

< Menor

> Maior

® Marca registrada

Å Angstrom(s)

d001 Distância entre as folhas lamelares (Å)

nº Número

Ɵ Ângulo teta

λ Medida para comprimento de onda

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................

1.1.A PELE E SUAS FUNÇÕES...............................................................................

1.2.A RADIAÇÃO SOLAR.......................................................................................

1.3.A RADIAÇÃO UV E SEUS EFEITOS...............................................................

1.3.1. A radiação UVB........................................................................................

1.3.2. A radiação UVA.......................................................................................

1.4.MECANISMOS DE REPARO DE FOTOLESÕES NO DNA...........................

1.4.1. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)............................................

1.4.2. Reparo por excisão de bases (BER)........................................................

1.5.CÂNCER DE PELE.............................................................................................

1.6.FORMULAÇÕES PARA PROTEÇÃO SOLAR................................................

1.6.1. TiO2............................................................................................................

1.6.2. ZnO............................................................................................................

1.7.NANOTECNOLOGIA E NANOPARTÍCULAS FOTOPROTETORAS...........

1.7.1. Montmorilonita (MMT)...........................................................................

1.7.2. Complexos de inclusão: MMT e filtros solares......................................

1.8.RELAÇÃO ENTRE EFICÁCIA E SEGURANÇA DE FOTOPROTETORES..

1.9.AVALIAÇÃO DA FOTOPROTEÇÃO EM LEVEDURA Saccharomyces

cerevisiae..............................................................................................................

2. JUSTIFICATIVA...................................................................................................

3. OBJETIVO..............................................................................................................

3.1.OBJETIVO GERAL.............................................................................................

3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS...............................................................................

4. METODOLOGIA...................................................................................................

4.1.MATERIAL.........................................................................................................

4.1.1. Ativos fotoprotetores................................................................................

4.1.2. Soluções e meios de cultivo......................................................................

4.1.3. Cepas de S. cerevisiae...............................................................................

4.1.4. Equipamentos...........................................................................................

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4.2.MÉTODOS...........................................................................................................

4.2.1. Avaliação do tamanho de partícula de filtros solares inorgânicos

por espalhamento de luz dinâmico (DLS)..............................................

4.2.2. Preparo dos nanossistemas para fotoproteção utilizando química de

intercalação e ativos fotoprotetores........................................................

4.2.3. Caracterização dos nanossistemas para fotoproteção por Difração

de raios X (DRX)......................................................................................

4.2.4. Manutenção das cepas de S. cerevisiae...................................................

4.2.5. Obtenção das culturas de S. cerevisiae para os experimentos..............

4.2.6. Determinação dos parâmetros de irradiação para UVB e LSS...........

4.2.7. Avaliação da citotoxicidade em cepas selvagem FF18733 e mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae de nanossistemas e ativos

fotoprotetores na ausência de radiação UVB e LSS.............................

4.2.8. Avaliação da sobrevivência celular das cepas selvagem FF18733 e

mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, após tratamento com

nanossistemas e ativos fotoprotetores sob radiação UVB ou LSS.......

4.2.9. Avaliação da mutagênese direta das cepas selvagem FF18733 e



4.2.10. Quantificação da produção de ERO em cepas selvagem FF18733 e



4.2.11. Obtenção de formulações para proteção solar e teste parâmetros de

fotoproteção in vitro pelo método Labsphere®......................................

4.2.12. Análise estatística.....................................................................................

5. RESULTADOS.......................................................................................................

5.1.AVALIAÇÃO DO TAMANHO DE PARTÍCULA DE FILTROS SOLARES

INORGÂNICOS (TiO2 OU ZnO) POR DLS.......................................................

5.2.PREPARO DE NANOSSISTEMAS PARA FOTOPROTEÇÃO USANDO

SILICATOS MINERAIS E ATIVOS FOTOPROTETORES POR MEIO DA

QUÍMICA DE INTERCALAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO POR DRX...........

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5.3.AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE EM CEPAS SELVAGEM FF18733

E MUTANTE CD138 (ogg1) DE S. cerevisiae DE NANOSSISTEMAS E

ATIVOS FOTOPROTETORES...........................................................................

5.4.DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DE IRRADIAÇÃO ARTIFICIAL

COM UVB E LSS E COMPARAÇÃO COM AS MEDIDAS AMBIENTAIS..

5.5.AVALIAÇÃO DA SOBREVIVÊNCIA CELULAR E MUTAGÊNESE

ESPONTÂNEA E INDUZIDA DE CEPAS SELVAGEM FF18733 E

MUTANTE CD138 (ogg1) DE S. cerevisiae, APÓS TRATAMENTO COM

NANOSSISTEMAS E ATIVOS FOTOPROTETORES, SOB RADIAÇÃO

UVB OU LSS.......................................................................................................

5.5.1. Uso da cepa mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae.............................

5.5.1.1.Avaliação da sobrevivência celular e mutagênese induzida da cepa

mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após radiação UVB................


mutante CD138 (oog1) de S. cerevisiae após uso de LSS.....................

5.5.2. Uso da cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae....................................


selvagem FF18733 de S. cerevisiae após radiação UVB.......................


selvagem FF18733 de S. cerevisiae após uso de LSS...........................

5.6.QUANTIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ERO EM CEPAS SELVAGEM

FF18733 E MUTANTE CD138 (ogg1) DE S. cerevisiae, APÓS

TRATAMENTO COM NANOSSISTEMA E ATIVOS FOTOPROTETORES,

SOB RADIAÇÃO UVB OU LSS........................................................................

5.7.PREPARO DE FORMULAÇÕES PARA PROTEÇÃO SOLAR E

AVALIAÇÃO DE PARÂMENTROS DE FOTOPROTEÇÃO IN VITRO.........

6. DISCUSSÃO...........................................................................................................

7. CONCLUSÕES.......................................................................................................

REFERÊNCIAS............................................................................................................

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1. INTRODUÇÃO

1.1. A PELE E SUAS FUNÇÕES

A pele é o maior órgão do corpo humano e representa cerca de 15% da massa corporal

total, ocupando área aproximada de 2 m2 no homem adulto. A pele humana é constituída de uma

porção epitelial, a epiderme e de uma porção conjuntiva, a derme e, abaixo da derme, encontra-se

a hipoderme, que a separa do tecido subcutâneo (Figura 1). A pele desempenha diversas funções,

tais como a proteção contra a perda excessiva de água, defesa contra o atrito e contra as radiações

solares, termorregulação, captação de estímulos sensoriais, etc. A proteção e homeostase do

organismo dependem de diversos fatores dentre os quais se destacam a forma como ele responde

às constantes exposições e agressões externas, sejam fatores físicos, químicos e/ou biológicos

(LEITÃO et al., 2005; KHAVKIN & ELLIS, 2011; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2013).

Figura 1. Esquema das camadas da pele (adaptado de ZISKIN, 2013).

A epiderme, camada mais superficial que protege a pele contra as agressões do meio

ambiente, é constituída por quatro camadas (córnea, granulosa, espinhosa e basal). Nesta região,

os queratinócitos, passam por processo de divisão, diferenciação e morte, completando um ciclo

celular de aproximadamente 28 dias (RIBEIRO, 2006; NEVES, 2008). Na epiderme, também

24

existem outros tipos de células, como exemplo, os melanócitos, responsáveis pela pigmentação

da pele, cabelos e olhos, e determinam a fotoproteção natural, ao produzirem melanina, pigmento

responsável pela proteção contra radiação ultravioleta (UV) (HEARING, 2011; JUNQUEIRA &

CARNEIRO, 2013).

A derme possui espessura de alguns milímetros e apresenta interface com a epiderme,

mantendo a função de nutri-la, além de possuir fibras elásticas, reticulares, e de colágeno, vários

tipos de células, tais como, fibroblastos, macrófagos, mastócitos, e leucócitos, vasos sanguíneos,

linfáticos, nervos, estruturas como pêlos, glândulas sebáceas, sudoríparas, unhas, etc. A irrigação

sanguínea dessa camada garante aporte de nutrientes e oxigenação da epiderme (LEITÃO et al.,

2005; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2013).

A hipoderme é a camada responsável pelo depósito de gordura e água e tem como função

proteger o tecido subjacente contra o frio e choques mecânicos (LEITÃO et al., 2005;

JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2013).

O sistema tegumentar é uma via bastante empregada para a aplicação de cosméticos e

dermocosméticos, cujo uso é externo e destina-se à proteção ou ao embelezamento das diferentes

partes do corpo, e também encontra grande utilização no que se refere à terapia medicamentosa,

por meio do emprego da via transdérmica (SILVA et al., 2010).

1.2. A RADIAÇÃO SOLAR

O sol é responsável por emitir ampla quantidade de radiações de diferentes comprimentos

de onda (λ) e graus energéticos. As radiações mais energéticas e com menor λ, tais como os raios

cósmicos, gama e X não atingem a superfície terrestre, pois são refletidas e/ou absorvidas

completamente pela atmosfera que envolve o planeta Terra. Assim, a luz solar que efetivamente

atinge a superfície terrestre é composta pelas radiações menos energéticas e com maior λ, sendo

estas a radiação UV, visível (VIS) e infravermelha (IV) (HOLICK, 2016).

A radiação IV (λ entre 700 nm e 1 mm) é capaz de penetrar profundamente na pele,

podendo provocar a dilatação dos vasos sanguíneos, deixando grande quantidade de energia na

derme, o que estimula a circulação do sangue e é percebida sob a forma de calor no corpo

humano (MANCEBO et al., 2014; YOUNG et al., 2016; SCHUCH et al., 2017).

25

O espectro da radiação VIS (λ entre 400 e 700 nm) é percebido por meio das diferentes

cores detectadas pelo sistema óptico (MANCEBO et al., 2014; YOUNG et al., 2016; SCHUCH et

al., 2017).

A radiação UV é caracterizada como radiação eletromagnética não ionizante (λ entre 100

e 400 nm), responsável por diferentes reações fotoquímicas e fotobiológicas, e pode ser

subdividida em três faixas: UVA, UVB e UVC. Os primeiros (λ de 400 a 320 nm) são bastante

empregados em alguns procedimentos terapêuticos, os do tipo B (λ de 320 a 290 nm) apresentam

elevada eficiência para a formação de vitamina D, pigmentação e eritema, e os do tipo C (λ de

290 a 100 nm) caracterizam-se pelo efeito germicida (MANCEBO et al., 2014; YOUNG et al.,

2016; SCHUCH et al., 2017).

A distribuição dos comprimentos de onda que chegam à superfície terrestre depende da

composição dos gases que envolvem o planeta, pois estes tem a capacidade de absorver

determinadas faixas do espectro solar. Além disso, a quantidade total de radiações recebidas em

determinada região e a composição do espectro variam com diversos fatores, tais como a estação

do ano, o período do dia, a latitude, a altitude, a presença de nuvens, a poluição, a reflexão pela

neve; areia ou água, etc. (MANCEBO et al., 2014). Após análise espectral da energia recebida

pelo planeta verificou-se que cerca de 50% do total energético recebido é composto pela radiação

IV, aproximadamente 40% de VIS, cerca de 6% da combinação de UVA e UVB, e 4% atribuído

a outros tipos de radiações como as ondas eletromagnéticas (HOLICK, 2016), de acordo com a

Figura 2.

Figura 2. Parte do espectro da radiação solar (adaptado de FRIEDBERG et al., 2006).

26

1.3. A RADIAÇÃO UV E SEUS EFEITOS

O inicio da utilização terapêutica da radiação UV data da antiguidade e sua classificação e

efeitos terapêuticos são determinados segundo o tipo de radiação utilizada (UVA ou UVB),

variável de acordo com os comprimentos de onda (ROELANDTS, 2002).

A fototerapia tornou-se uma das práticas clínicas mais utilizadas no tratamento de

desordens cutâneas, como a psoríase, dermatite atópica, vitiligo e micose fungóide. A fototerapia

costuma ser utilizada para qualquer ação médica visando determinado efeito curativo das

radiações não ionizantes, encontrando exemplo no uso da radiação IV no tratamento de artralgias

e mialgias, ou do UV no combate ao raquitismo. Outro exemplo de procedimento fototerápico é

dado pelo tratamento, mediante a exposição à luz visível, de pacientes acometidos de icterícia

neonatal. Já a fotoquimioterapia consiste na utilização do UV ou VIS, após a aplicação tópica, ou

administração sistêmica, de determinado composto químico, visando o tratamento de diversas

doenças. Esta forma de ação médica exige a presença de um sensibilizador, capaz de atuar por

ação fotodinâmica (MARTIN et al., 2007; BATYCKA-BARAN et al., 2016; ESMAT et al.,

2017).

Dentre os efeitos da radiação UV, destaca-se a produção de vitamina D. Apesar de vários

alimentos da dieta humana serem naturalmente ricos em vitamina D, a maior fonte de obtenção

desta para o ser humano é por meio da exposição à luz solar. Esta vitamina aparece

frequentemente na natureza sob a forma de precursores inativos, as provitaminas D, cuja

transformação é consequência da exposição ao UVB. Nesse sentido, sugere-se que a redução da

exposição à luz solar e, consequentemente, dos níveis de vitamina D, está associada com a perda

de cartilagem e patologias ósseas como osteoartrite. Além disso, a vitamina D está envolvida na

modulação do sistema imunológico (HOLICK, 2016).

Também é descrito na literatura o aumento na expressão e produção de β-endorfina,

hormônio relacionado ao bem-estar, relaxamento e alívio de dores, após exposição a níveis

controlados de UV (JUSSILA et al., 2016; HOLICK, 2016).

Apesar dos efeitos benéficos da exposição à radiação UV, seus efeitos nocivos ainda são

de maior relevância para a saúde pública quando se trata de exposição ao sol. Esses efeitos são

classificados como agudos, de curto e médio prazo ou crônicos, de longo prazo. Eritema ou

queimaduras solares e pigmentação da pele são exemplos de efeitos agudos, enquanto a

27

fotocarcinogênese e o fotoenvelhecimento são efeitos crônicos atribuídos ao UV. Sabe-se que a

radiação UV gera danos diretos ao DNA e espécies reativas de oxigênio (ERO), oxida lipídeos e

produz radicais livres, causa inflamação, rompe a comunicação celular, modifica a expressão

gênica em resposta ao estresse e enfraquece a resposta imune da pele (YOUNG et al., 2016).

Na Figura 3, encontra-se uma ilustração da capacidade de penetração da radiação solar na

pele de acordo com seu comprimento de onda.

Figura 3. Esquema ilustrativo da capacidade de penetração da radiação solar nas diferentes

camadas da pele (adaptado de ROELANDTS, 2007).

Para exercer seus efeitos biológicos, os fótons da radiação UV devem ser primeiramente

transmitidos através das camadas da pele e absorvidos por alguma molécula celular, denominada

cromóforo ou fotossensibilizador (CADET et al., 2015; SCHUCH et al., 2017). Os fótons são

descritos como a quantidade de energia sob a forma de radiação eletromagnética emitida ou

absorvida pela matéria ou pelos cromóforos. Os cromóforos são moléculas capazes de absorver a

energia da radiação UV ou VIS e cada cromóforo possui um espectro de absorção característico

(LEWIS, 1926).

Com isso, a radiação UV induz danos por meio de dois mecanismos diferentes. Um deles

é por meio da reação de fotossensibilização do tipo I na qual há absorção direta de fótons pelos

cromóforos celulares que assumem estado de energia excitado, tornando-se instáveis. Tal

instabilidade pode resultar em mudança estrutural favorecendo a ligação do cromóforo a outras

biomoléculas e a reações foto-induzidas, sendo este o chamado efeito direto. Como exemplo,

28

estes tipos de lesões são mais susceptíveis de ocorrer em bases do DNA. Já o segundo mecanismo

é denominado indireto, ou reação de fotossensibilização do tipo II, e inclui processos de

fotossensibilização, no qual o cromóforo instável pode atuar como mediador sensibilizante e

gerar ERO e radicais livres (CADET et al., 2009; CADET et al., 2015).

A radiação UVA, com maior comprimento de onda e menos energética que a radiação

UVB, penetra mais profundamente na pele. Isto ocorre, uma vez que a pele contém grande

variedade de cromóforos incluindo DNA, RNA e proteínas cujo espectro de absorção

compreende a faixa de UVB, sendo estes fótons absorvidos pelas macromoléculas na epiderme

(HOLICK, 2016).

Os cromóforos endógenos mais conhecidos são o DNA, melanina, aminoácidos

aromáticos, flavinas, porfirinas, dentre outras biomoléculas. Já os exógenos incluem fármacos

fotossensibilizantes como, as fluoroquinolonas, azatioprina, 8-metoxipsoraleno e os filtros

fotoprotetores (BALOGH et al., 2011).

As lesões no DNA são as mais importantes em termos biológicos, pois podem

comprometer processos vitais como a replicação celular e a transcrição. Dentre as lesões no DNA

produzidas pela radiação UV, o dímero de pirimidina ciclobutano (CPD) foi a primeira lesão a

ser descoberta (BEUKERS et al., 2008).

Além de possuírem estratégias de reparo, as células possuem também mecanismos de

sinalização de processos que contribuem para a proteção natural contra os efeitos da radiação UV

de forma preventiva. É o caso da melanogênese induzida por UV, processo que resulta no

aumento do número de melanócitos ativos e da taxa de síntese de melanina. Dessa forma, maior

quantidade de melanina produzida favorece a proteção natural contra radiação UV e seus efeitos

deletérios (PAWELEK et al., 1992).

A maior parte dos danos fotoinduzidos impede a transcrição da informação genética no

RNA mensageiro (RNAm) e bloqueia a replicação semiconservativa, desta forma, em células

desprovidas de qualquer mecanismo de reparo das lesões, um único dano no DNA pode acarretar

na morte celular (FRIEDBERG et al., 2006). A radiação UV também induz danos no RNA, o que

leva a mudanças estruturais em genes expressos e causa produção de proteínas não funcionais

(HECK et al., 2004).

As roturas provocadas pelo UV no DNA são dependentes de oxigênio e mediadas por

foto-oxidações, que conduzem à formação de ERO, moléculas resultantes da redução do oxigênio

29

molecular. As quebras nas moléculas de DNA causadas por ERO são, predominantemente,

simples, mas se esta quebra simples está próxima a uma ERO, pode gerar uma quebra dupla

(DAVYDOV et al., 2003).

O estresse oxidativo é um termo genérico que designa o estresse associado à detecção,

resposta e proteção de células ou de organismos às ERO. São chamadas ERO quaisquer

moléculas contendo oxigênio capaz de gerar radicais ou espécies químicas cujo último orbital

quântico possua um elétron desemparelhado (FANG et al., 2002). O estresse oxidativo decorre de

uma situação de desbalanço entre os processos de geração de ERO e os sistemas antioxidantes ou

reparação dos danos, levando à ruptura de processos importantes, tais como proliferação e

apoptose celular (FRIEDBERG et al., 2006).

A formação de ERO é inerente ao anabolismo e catabolismo de tecidos, incluindo os da

pele (DARR & FRIDOVICH, 1994), porém, pode ser de origem exógena, por meio da presença

de compostos químicos sintéticos (LANDIS & TOWER, 2005). Algumas das consequências da

exposição à radiação UV estão representadas na Figura 4.

Figura 4. Alguns danos causados pela radiação UV (adaptado de INAL et al., 2001; LEITÃO et

al., 2005; SVOBODOVA et al., 2006).

30

1.3.1. A radiação UVB

O UVB foi inicialmente identificado com a capacidade de induzir danos ao DNA, já que

seu espectro de emissão equivale ao espectro de absorção do DNA (JEAN et al., 2011),

apresentando efeitos predominantes na epiderme, sendo responsável pelas reações agudas, como

eritema (vermelhidão e bolhas) e queimadura solar. Em longo prazo, pode provocar o câncer de

pele (NEVES, 2008; JEAN et al., 2011), devido à formação de lesões no DNA por efeito direto

que, se não reparadas, acumulam-se e dão início ao processo carcinogênico (MATSUMURA &

ANANTHASWAMY, 2004).

As principais lesões oxidativas produzidas pela radiação UVB descritas na literatura

incluem as roturas em fita simples e em fita dupla, e várias bases modificadas, como por

exemplo, 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), Timinaglicol, 5,6-Diidrotimina (CADET et al.,

2005). A geração de ERO por UVB é detectada por meio de técnicas que envolvem a formação

de radicais superóxido (O2•-) e peróxido de hidrogênio (H2O2), após irradiação nesta faixa de

comprimento de onda e ativação de enzimas, como a NADPH-oxidase (NOX) (SCHUCH et al.,

2017).

Os fótons emitidos por UVB são absorvidos diretamente pelo DNA e causam a formação

de CPDs e de pirimidina (6-4) pirimidona (6-4PP) como fotoprodutos (KOZMIN et al., 2005). O

6-4PP é formado, preferencialmente, em sequências 5´-TC e 5´-CC, e é produzido em níveis

menores do que os CPDs (PFEIFER et al., 2005). Esse fotoproduto é formado a partir da ligação

do C6 de uma pirimidina com o C4 de uma pirimidina adjacente. Esse tipo de lesão gera uma

distorção no DNA bastante proeminente devido à forte angulação criada entre as bases ligadas

(FRIEDBERG et al., 2006). A lesão 6-4PP pode dar origem ainda a outro fotoproduto, o isômero

de Dewar, que é produzido quando o 6-4PP, formado pelo UV mais curto, é irradiado com

comprimentos de onda próximos a 320 nm ou utilizando-se Luz Solar Simulada (LSS) (PERDIZ

et al., 2000).

Contra o estresse oxidativo, as células são equipadas com várias defesas antioxidantes

naturais, incluindo superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase. A

exposição da pele humana à radiação UVB conduz à depleção destes antioxidantes cutâneos, à

desregulação da expressão gênica e finalmente, ao desenvolvimento de doenças de pele. Porém,

este ainda é necessário para fixação de Vitamina D (SCHUCH et al., 2017).

31

1.3.2. A radiação UVA

A radiação UVA é pouco absorvida pelo DNA, mas possui ação genotóxica indireta,

promovendo a formação de ERO e radicais livres que causam danos ao DNA, via processos

oxidativos, induzindo a formação de câncer de pele (NEVES, 2008; JEAN et al., 2011). Valencia

e Kochevar (2008) demonstraram que queratinócitos irradiados com doses não letais de UVA

exibem um perfil de geração de ERO posterior ao estímulo, indicando a participação de enzimas

geradoras de ERO neste processo (VALENCIA & KOCHEVAR, 2008).

Geralmente, aceita-se que o UVA danifica o DNA, resultando em modificações de bases,

tais como a 8-oxoG (CADET et al., 2005), que ocorre quando radicais hidroxil (•OH) interagem

com a guanina, gerando um radical redutor neutro que reage com o oxigênio molecular (O2) e,

por meio de transferência eletrônica, forma-se a 8-oxoG (BELANGER et al., 2016). Assim, a

guanina acaba por parear com a adenina ao invés de citosina, fazendo com que o par de bases

passe a ser Adenina-Timina no lugar de Citosina-Guanina. Este fenômeno não ativa a proteína

p53 e, com isso, não há apoptose celular, sendo, portanto, uma lesão mutagênica (KOZMIN et

al., 2005; PINTO et al., 2010).

Alguns estudos demonstraram a geração de CPDs e 6-4PPs no DNA, induzidos

diretamente por UVA e com mesmo efeito dos induzido por UVB, indicando que tais lesões não

são geradas exclusivamente por UVB (DOUKI et al., 2003; MOURET et al., 2010). A radiação

UVA tem participação importante em fotoalergias e potencializa a ação da radiação UVB,

induzindo a formação de câncer de pele (NEVES, 2008).

O fotoenvelhecimento é conhecido por ser causado majoritariamente pela radiação UVA,

que alcança a derme e interage com os fibroblastos dessa camada causando um fenômeno de

reticulação da rede de colágeno e elastina, resultando em danos e enrugamento da pele, além de

danos em membranas celulares, enzimas e outras proteínas da matriz extracelular (HAN et al.,

2014). Dois processos, intrínseco e extrínseco, contribuem com todas as alterações que resultam

no envelhecimento cutâneo. O primeiro (cronológico) é proveniente da degeneração lenta, mas

parcialmente reversível dos tecidos conectivos. O segundo é proveniente de fatores extrínsecos,

principalmente, por danos da radiação UV (WLASCHEK et al., 2001).

Como resposta ao fotoenvelhecimento ocorre mudanças no aspecto da pele, como

manchas, descamações, aspereza e ressecamento, rugas profundas, flacidez devido às alterações

32

nas fibras elásticas e talangiectasia (dilatação anormal dos vasos sanguíneos) (WLASCHEK et

al., 2001; SVOBODOVA et al., 2006; NEVES, 2008). Outro fator que contribui bastante para o

fotoenvelhecimento é o declínio da função mitocondrial, que ocorre devido à alta frequência de

mutações encontradas no DNA mitocondrial (DNAmt) de células irradiadas. Foram observadas

deleções no DNAmt, atribuídas à produção de ERO pela radiação UV (BERNEBURG et al.,

2000). Na Figura 5 estão ilustradas as principais alterações descritas na cadeia de DNA

associadas à radiação UV.

33

Figura 5. Exemplos de lesões causadas pela radiação UV (adaptado de MATSUMURA &

ANANTHASWAMY, 2004; PATTISON & DAVIES, 2006; SVOBODOVA et al., 2006).

1.4. MECANISMOS DE REPARO DE FOTOLESÕES NO DNA

O papel biológico desempenhado pelas moléculas de DNA exige que elas possuam duas

propriedades fundamentais: autorreplicação e preservação da informação genética. Para que o

conteúdo informacional do DNA seja preservado e corretamente transmitido, de geração em

geração, é indispensável que haja identidade na replicação semiconservativa e que existam

mecanismos capazes de reparar modificações estruturais produzidas no material genético por

agentes físicos ou químicos do meio ambiente. Para evitar que estes agentes causem mutações ou

morte celular, os organismos desenvolveram diversos mecanismos para prevenir e reparar as

lesões (FRIEDBERG et al., 2006).

O genoma humano é constantemente agredido por agentes endógenos e exógenos, assim

às estratégias celulares de remoção ou tolerância a estes danos denominam-se sistemas ou

mecanismos enzimáticos de reparo (FRIEDBERG et al., 2006). Após radiação UV, diferentes

mecanismos celulares podem ocorrer: (1) as células podem reparar as lesões e assumir suas

funções normais; (2) podem ser eliminadas via apoptose ou necrose; (3) apesar das lesões no

DNA, sobrevivem, no entanto, estão suscetíveis a processos mutagênicos em potencial. Acredita-

34

se que o principal mecanismo responsável seja a indução de apoptose, principalmente em células

do sistema imunológico (KORECK et al., 2007; RUNGER, 2012).

Mediante a presença de sistemas de reparo funcionantes, a lesão ou dano ao DNA é

reparado levando ao retorno da integridade biológica. Caso os sistemas de reparo estejam

ausentes ou ocorrendo de forma incorreta, as lesões pré-mutagênicas não são eficientemente

eliminadas, podendo conduzir à fixação de mutações. Define-se mutação como mudança

hereditária na sequência do genoma de um organismo. Dá-se o nome de agente mutagênico

àquele agente, seja físico (radiação UV, por exemplo), químico (substâncias mutagênicas) ou

biológico (vírus, bacteriófagos e outros), que aumenta a frequência de ocorrência de mutações ou

de mutantes em uma população em relação ao espontâneo. O processo pelo qual as mutações são

produzidas é referido como mutagênese, podendo ser espontânea (erros de replicação, por

exemplo) ou após exposição a estes agentes, chamada mutagênese induzida. Lesões no DNA

potencialmente geradoras de mutação são chamadas de lesões pré-mutagênicas, como a 8-oxoG

citada anteriormente, que, se não reparada, pode originar uma mutação (FRIEDBERG et al.,

2006).

1.4.1. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

O NER é uma via de reparo adaptada para remover grande variedade de lesões no DNA,

particularmente aquelas que causam distorções na dupla hélice, como os danos induzidos pela

radiação UV (PRAKASH & PRAKASH, 2000). O NER pode ser subdividido em duas vias:

reparo global do genoma e reparo acoplado à transcrição. Após o reconhecimento da lesão,

ocorrem duas incisões flanqueando o dano, o fragmento de fita simples contendo a lesão é

liberado, a lacuna gerada é polimerizada pela DNA polimerase e posteriormente o fragmento é

ligado ao pré-existente pela DNA ligase (BOITEUX & ROBERTSON, 2013), como representado

na Figura 6.

Lesões como os CPDs e os fotoprodutos 6-4PPs são removidas principalmente por meio

do NER, como evidenciado ao se observar pacientes com xeroderma pigmentoso, doença na qual

o NER encontra-se ausente ou prejudicado por mutações nas enzimas envolvidas nesse tipo de

reparo, favorecendo a permanência de CPDs e fotoprodutos 6-4PPs no DNA irradiado (YOUNG

et al., 2016; SCHUCH et al., 2017).

35

1.4.2. Reparo por excisão de bases (BER)

O BER é fundamental na reparação de lesões oxidativas, bases modificadas, sítios com

perda de bases, quebras simples e pequenas lacunas de DNA (KOZMIN et al., 2005;

ZHARKOV, 2008; BOITEUX & ROBERTSON, 2013). É a principal via de reparo de lesões

geradas por desaminação, agentes alquilantes, radiação ionizante, metabólitos celulares e ERO

(RASTOGI et al., 2010; BOITEUX & ROBERTSON, 2013).

O sistema BER é composto das seguintes etapas: liberação da base lesada ou mal

emparelhada por uma DNA glicosilase especifica que quebra a ligação entra a base e o açúcar;

incisão da cadeia açúcar fosfato no sitio abásico resultante, por uma liase ou por uma

endonuclease; remoção do terminal criado; síntese de reparo; e ligação do DNA neossintetizado

ao pré-existente, restabelecendo a integridade da fita de DNA (SANCAR et al., 2004), como

ilustrado na Figura 6.

Figura 6. Esquema ilustrativo dos mecanismos NER e BER (Disponível em:

https://www.studyblue.com/notes/note/n/chapter-5-dna-replication-repair-and-

recombination/deck/6250485. Acesso em: 05/08/2019).

https://www.studyblue.com/notes/note/n/chapter-5-dna-replication-repair-and-recombination/deck/6250485

https://www.studyblue.com/notes/note/n/chapter-5-dna-replication-repair-and-recombination/deck/6250485

36

Quando uma guanina é oxidada, é formada a lesão 8-oxoG, que pode parear tanto com a

citosina quanto com a adenina, assim o sistema BER está envolvido com a atenuação dos efeitos

mutagênicos desses erros de emparelhamento, evitando as transversões GC TA e AT CG

(Figura 7). Uma das linhas de defesas contra esta lesão é composta de diversas DNA glicosilases,

capazes de remover estas lesões do DNA. O sistema melhor estudado e quantitativamente

dominante é a Ogg1 (Oxo Guanina Glicosilase) (SANCAR et al., 2004).

Já é bem consolidado na literatura que a lesão 8-oxoG não é um potente bloqueador das

enzimas RNA e DNA polimerase (EINOLF & GUENGERICH, 2001; AVKIN & LIVNEH,

2002; SCHUCH et al., 2017). Dentre as lesões no DNA geradas por ERO, a 8-oxoG é a mais

frequente, devido ao baixo potencial redox da guanina quando comparada às outras bases

nitrogenadas (MARGOLIN et al., 2006). A formação de 8-oxoG envolve o ataque de 1O2 e •OH,

resultantes das reações de fotossensibilização dos tipos II e I durante exposição à radiação UV

(CADET et al., 2009). O acúmulo destas lesões não reparadas no DNA contribui para a

carcinogênese, já que o acúmulo de lesões 8-oxoG pode levar ao aumento de mutações

ocasionadas pela troca do par de bases GC para TA, por exemplo (SCHUCH et al., 2017). É

importante ressaltar que a proteína Ogg1 é essencial, já que é a única capaz de remover a lesão 8-

oxoG do DNA, sendo esta a maior ameaça à sobrevivência celular (PÁDULA et al., 2004).

Figura 7. Esquema ilustrativo da atuação da proteína Ogg1 no BER (adaptado de DAVID et al.,

2007).

37

1.5. CÂNCER DE PELE

Diversos fatores contribuem na causa do câncer de forma geral. Muitos autores admitem

que a cancerização seja devida ao acúmulo de lesões no DNA provocadas por agentes

genotóxicos, especialmente pelas substâncias capazes de produzir oxidações, alquilações,

desaminações e depurinações, etc. Embora quase sempre existam mecanismos de reparação

funcionantes contra estas lesões, eles não conseguem eliminar todos os danos produzidos, o que

leva ao acúmulo progressivo de lesões (FRIEDBERG et al., 2006).

Embora o câncer de pele seja o tipo mais frequente, correspondendo a cerca de 25% de

todos os tumores malignos registrados no Brasil, quando detectado precocemente, apresenta altos

percentuais de cura. As neoplasias cutâneas estão associadas a alguns fatores de risco, como

exposição à radiação ionizante, processo irritativo crônico, genodermatoses e exposição à

radiação UV (INCA, 2018).

Existem dois grupos distintos de câncer de pele: não melanoma, mais frequente e menos

agressivo, e melanoma, mais agressivo, porém mais raro. As diferentes linhagens de câncer de

pele recebem denominações específicas, de acordo com as células das quais são originários. O

câncer não melanoma é uma neoplasia de bom prognóstico, com alta taxa de cura quando

identificado precocemente e tratado de forma adequada. O melanoma é o menos frequente e

representa apenas 4% das neoplasias malignas do órgão. No entanto, sua letalidade é a mais

elevada, além de ser o mais grave devido à sua alta possibilidade de metástase. Indivíduos de pele

clara são os mais propensos a esse tipo de câncer, bem como aqueles que tiveram episódios de

queimadura solar com bolhas quando crianças ou histórico familiar de melanoma. Pode se

apresentar como uma lesão enegrecida, de bordas mal delimitadas, com cores e diâmetros que se

alteram com o tempo (INCA, 2018), de acordo com a Figura 8.

38

Figura 8. ABCD do câncer de pele (Disponível em:

http://www.spazioperfetto.com.br/tag/dermatoscopia/. Acesso em: 09/10/2018).

O processo de malignização celular ou carcinogênese é desenvolvido em três estágios,

iniciação, promoção e progressão tumoral, mediados por várias alterações celulares, bioquímicas

e moleculares, que podem ter o envolvimento de ERO. A iniciação é o primeiro estágio e envolve

a indução de alterações estruturais no DNA, podendo originar as mutações. A radiação UV pode

causar danos ao DNA por alteração direta causada pela sua absorção, ou pela formação de ERO,

via processos oxidativos. O segundo estágio da carcinogênese, a promoção tumoral, é a etapa

mais lenta, na qual ocorre uma seletiva hiperplasia, que conduz à expansão clonal das células

iniciadas. A progressão, terceiro e último estágio, se caracteriza pela multiplicação descontrolada

e irreversível das células alteradas (ALMEIDA et al., 2005).

Basicamente, as mutações podem ser divididas em duas categorias: mutações gênicas e

cromossômicas. As mutações gênicas são alterações que ocorrem na sequência de nucleotídeos

do DNA. Já as cromossômicas são as que produzem alterações no número ou na estrutura dos

cromossomos e são detectadas através de análises citogenéticas (GASPARRI, 2005). As células

de um organismo são suscetíveis a sofrer alterações no DNA ao longo da vida, as quais podem

ser revertidas pelo próprio organismo, por meio dos mecanismos de reparo do DNA e ação

enzimática (INCA, 1996).

Um composto é dito mutagênico quando é capaz de aumentar a taxa de mutação em um

organismo, além da espontânea. Além disso, muitos compostos potencialmente mutagênicos

podem ser carcinogênicos, ou seja, capazes de induzir câncer (ALVES, 2001). Se uma mutação

genética ocorre em genes especiais, como os protooncogenes, ativando-os, tem-se a sua

transformação em oncogenes, estes que são carcinogênicos e causam multiplicação celular

excessiva. Quando há um crescimento desordenado das células, ocasionado pela oncogênese, há

http://www.spazioperfetto.com.br/tag/dermatoscopia/

39

o câncer (INCA, 1996). Vários genes com papel importante na fotocarcinogênese tem sido

estudados, dentre eles destaca-se o TP53. A perda ou mutação de TP53 foi detectada em

aproximadamente 50% dos tumores e em câncer de pele não melanoma (MATSUMURA &

ANANTHASWAMY, 2004).

Fatores de estresse como as radiações UV e IV, fumo e o consumo de quantidade elevada

de álcool, bem como fadiga e doenças, levam à formação de radicais livres na pele humana

(DARVIN et al., 2008). Altas quantidades destas moléculas reativas podem destruir células e

compartimentos celulares. Como consequência, pode ocorrer o envelhecimento da pele,

imunossupressão e o câncer de pele (DARVIN et al., 2009).

Além dos sistemas de reparo, as células possuem também estratégias de proteção natural

contra os efeitos da radiação UV, como exemplo, a melanogênese induzida por UV, processo que

resulta no aumento do número de melanócitos ativos e da taxa de síntese de melanina. Dessa

forma, maior quantidade de melanina produzida favorece a proteção natural contra os raios UV e

seus efeitos deletérios (PAWELEK et al., 1992). Porém, esta não garante fotoproteção adequada

para todos os tipos de pele visto que cada tom de pele possui quantidade diferente de melanina e,

consequentemente, níveis de proteção natural também diferente (FITZPATRICK, 1988), ou seja,

pele com baixa taxa de melanina é mais suscetível ao risco de câncer de pele (YOUNG et al.,

2016).

Ainda, a fotoproteção é uma atividade preventiva contra o câncer de pele e o

fotoenvelhecimento. As medidas recomendadas incluem evitar a exposição solar durante as horas

de maior incidência de radiação UV, uso de roupas adequadas, chapéus ou bonés, óculos escuros

e protetor solar adequado (GONZÁLEZ et al., 2008).

1.6. FORMULAÇÕES PARA PROTEÇÃO SOLAR

Para prevenir os danos causados pela exposição solar, é necessário que as pessoas se

protejam usando os protetores solares, que devem ser seguros para o organismo humano e

ambiente, que indiretamente entram em contato com estes após sua eliminação (GONZÁLEZ et

al., 2008).

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) por meio da Resolução

da Diretoria Colegiada (RDC) n° 30 de 1 de junho de 2012 e RDC n° 47 de 16 de março de 2006,

40

protetores solares são formulações cosméticas com finalidade de proteger a pele por meio de

mecanismos de absorção, dispersão e/ou reflexão da radiação UV. Já os filtros solares são

substâncias que entram nestas preparações com ação de filtrar certos raios solares assim

protegendo a pele dos efeitos da radiação UV (BRASIL, 2006; BRASIL, 2012).

Com relação à regularização técnica dos fotoprotetores, segundo a RDC n° 237 da

ANVISA, de 16 de julho de 2018, os fotoprotetores são classificados na categoria de produtos

cosméticos de grau 2 por possuírem indicações específicas, cujas características exigem

comprovação de segurança e/ou eficácia, bem como informações, cuidados, modo e restrições de

uso (BRASIL, 2018).

A eficiência de um fotoprotetor é determinada pelo seu fator de proteção solar (FPS),

definido como a relação entre as doses limiares eritematógenas, para exposições à radiação UV

(ou ao sol) com ou sem a aplicação tópica de um produto em análise. Assim, por exemplo, um

creme que possua fator de proteção igual a 8 permite exposição de uma pessoa ao sol por tempos

oito vezes maiores que os capazes de gerar efeitos idênticos em ausência de proteção química

(FLOR et al., 2007). A ANVISA recomenda o uso de protetor solar com FPS de no mínimo 15

para a prevenção do câncer de pele e envelhecimento precoce (BRASIL, 2012).

Os primeiros protetores solares desenvolvidos apresentavam eficácia fotoprotetora com o

objetivo de proteger a pele contra as queimaduras solares, isto é, cobrindo o espectro apenas da

radiação UVB e com pouco ou nenhum efeito fotoprotetor para radiação UVA (PLANTA, 2011).

Com o conhecimento dos efeitos genotóxicos indiretos pela geração de ERO da radiação UVA,

inclusive no desenvolvimento de câncer de pele, tornou-se evidente a necessidade de se proteger

a pele de toda a faixa UVA/UVB, assim as formulações fotoprotetoras atuais apresentam

proteção também contra esse tipo de radiação (FLOR et al., 2007; BRASIL, 2010; BALOGH et

al., 2011).

De acordo com González e col. (2008), os constituintes ideais para um protetor solar de

uso tópico devem:

Proteger contra radiação UVB;

Proteger contra radiação UVA;

Eliminar ERO;

Ser estáveis e seguros (GONZÁLEZ et al., 2008).

41

Estes devem atender, para que sejam realmente úteis e inócuos, a alguns requisitos

básicos, tais como: não sofrerem fotodecomposição rápida; não serem absorvidos pela pele, nem

produzirem reações locais tóxicas, irritantes ou alérgicas; não serem facilmente removidos pela

água ou pelo suor (LEITÃO et al., 2005; GONZÁLEZ et al., 2008).

Formulações fotoprotetoras normalmente contem filtros UV, que são moléculas ou

complexos moleculares capazes de absorver, refletir ou dispersar a radiação UV, atuando,

portanto, como cromóforos em detrimento das biomoléculas (DNA, RNA, proteínas, dentre

outras) da pele e preservando-as do dano causado pela radiação UV (FLOR et al., 2007).

Os filtros solares são classificados em orgânicos e inorgânicos dependendo da sua

natureza química. Os filtros inorgânicos, como os óxidos metálicos dióxido de titânio (TiO2) e

óxido de zinco (ZnO), atuam refletindo e dispersando da radiação UV, já os filtros orgânicos são

formados por moléculas orgânicas que possuem como característica a absorção de um ou mais

comprimento de onda específico (RUSZKIEWICZ et al., 2017).

No entanto, existem no mercado filtros orgânicos que podem, além de absorver, também

refletir a radiação UV, assim como filtros UV inorgânicos podem absorver a radiação

dependendo do seu tamanho de partícula. Cada filtro UV possui espectro de absorção

característico, sendo comum que mais de um filtro componha uma formulação, visando aumentar

o espectro de proteção pela ação sinérgica ou aditiva (GONZÁLEZ et al., 2008).

O mecanismo de ação de filtros inorgânicos ocorre dependendo de suas propriedades de

absorção, espalhamento e reflexão determinadas por seu índice de refração intrínseco, tamanho

das partículas, a dispersão na base de emulsão e a espessura da formulação na epiderme

(SERPONE et al., 2007). Já o mecanismo de ação dos filtros orgânicos envolve a transmissão da

energia da absorção dos fótons UV para elétrons de sua estrutura molecular. Ao absorver a

radiação UV, os elétrons situados no orbital π HOMO (orbital molecular preenchido de mais alta

energia) são excitados para orbital π* LUMO (orbital molecular vazio de mais baixa energia) e,

ao retornarem para o estado inicial, o excesso de energia é liberado em forma de calor ou luz em

comprimento de onda mais longo e menos nocivo ao organismo (MANCEBO et al., 2014).

Diversos estudos demonstraram que o uso diário de fotoprotetores pode prevenir o

desenvolvimento de câncer de pele (DARLINGTON et al., 2003; VAN DER POLS et al., 2006;

GREEN et al., 2011) e o envelhecimento precoce (HUGHES et al., 2013). Porém, devido a

aspectos controversos entre a necessidade de fotoproteção e o risco de uso de filtro solar, como

42

fotoinstabilidade, fotoalergias, fototoxicidade, fotomutagenicidade e/ou fotogenotoxicidade, é

essencial garantir avaliação rígida da eficácia e segurança dessas moléculas e formulações

(DINARDO & DOWNS, 2018). Até o filtro UV mais fotoestável pode ser degradado sob

diferentes condições, por exemplo, calor, tempo, densidade de aplicação, etc. (NASH &

TANNER, 2014).

Hossy e col. (2013) descreveram alterações morfológicas compatíveis com a pele

fotoenvelhecida quando camundongos hairless foram tratados com LSS mais o veículo das

formulações para proteção solar. Dentre diferentes alterações, observaram neovascularização,

espessamento epidérmico, hiperplasia da glândula sebácea, queratose folicular e aumento da

celularidade dérmica, que representam o padrão real produzido pela luz solar na pele (HOSSY et

al., 2013).

Além disso, os filtros UV apresentam vários riscos ecológicos para os ecossistemas

marinhos, inclusive promovendo o branqueamento de corais e afetando negativamente a

reprodução em peixes (KIM & CHOI, 2014; DOWNS et al., 2016).

Dentre estas controvérsias, destaca-se o fato de alguns filtros UV orgânicos e inorgânicos

gerar ERO após a exposição à luz solar, contribuindo não apenas para os danos celulares, mas

também para a carcinogênese da pele, como já foi descrito atividade pró-oxidante para os filtros

inorgânicos TiO2 e ZnO (TROUILLER et al., 2009; ZHANG et al., 2014).

1.6.1. TiO2

O TiO2 é largamente utilizado para gerar coloração branca e opacidade em produtos como

tintas, plásticos, papéis, corantes, corantes alimentícios e pastas de dente. O TiO2 é também

utilizado em produtos cosméticos e para pele, particularmente em protetores solares, nos quais

ajuda a proteger a pele da radiação UV, especialmente sob a forma de nanopartículas

(TROUILLER et al., 2009). Protetores físicos são feitos de partículas que espalham, refletem ou

absorvem a radiações UV, VIS e a IV. Diferentes técnicas, como a encapsulação, permitiram o

desenvolvimento de protetores inorgânicos de melhor qualidade (GONZÁLEZ et al., 2008).

O TiO2 é um material inerte e inorgânico com elevada estabilidade, não é decomposto

pela radiação UV (CHUNG et al., 2010), absorvendo-a de forma eficiente, catalisando a

formação de O2•- e •OH que podem iniciar a oxidação (SERPONE et al., 2007; FUJISHIMA et

43

al., 2008; WANG & FAN, 2014; GALI et al., 2016). Os elétrons reagem com o O2 pré-adsorvido

para produção de O2•-, enquanto os espaços vazios da banda de valência oxidam os grupos de

hidroxila (-OH) para gerar radicais •OH (SERPONE et al., 2007). Quando radicais •OH são

produzidos dentro do citoplasma celular, originam radicais carboxil (CO2•-) que, posteriormente,

oxidam outros componentes celulares e formam outros radicais prejudiciais às células (DODD &

JHA, 2009).

Já é bem documentado na literatura que, paradoxalmente, protetores solares mesmo sendo

a primeira opção em fotoproteção, podem também gerar radicais livres e ERO após radiação UV

e as ERO por sua vez desencadeiam reações que levam à genotoxicidade, imunotoxicidade,

neurotoxicidade e carcinogênese (SKOCAJ et al., 2011; SHI et al., 2013). Sua toxicidade é

resultado dos tamanhos dessas partículas que favorecem a penetração percutânea tornando-se

sistêmicas, habilidade de escapar dos mecanismos de defesa imunológica, de formar complexos

com proteínas e de induzirem à formação de radicais livres (NEWMAN et al., 2009; BALOGH et

al., 2011).

Os resultados obtidos por Pinto e col. (2010) demonstram que, apesar do TiO2 proteger

células contra o dano letal induzido pela luz UVB, esta associação de TiO2 mais UVB

potencializa os danos oxidativos gerados no DNA, possivelmente por meio de reações de Fenton

envolvendo a produção de produtos da oxidação da guanina, como a lesão 8-oxoG (PINTO et al.,

2010).

Dois estudos demonstraram interação química direta entre nanopartículas de TiO2 e DNA,

através do grupamento fosfato do DNA (ZHU et al., 2007; LI et al., 2008). Trouiller e col. (2009)

sugerem em seu estudo que nanopartículas de TiO2 são genotóxicas in vivo (TROUILLER et al.,

2009). Contudo, até 2016, os mecanismos por trás desses efeitos biológicos atribuídos ao TiO2

não tinham sido completamente elucidados (GALI et al., 2016).

1.6.2. ZnO

Entre os nanomateriais, as nanopartículas de ZnO são amplamente utilizadas em produtos

industriais, incluindo cosméticos, protetores solares, tintas, alimentos, etc (HACKENBERG et

al., 2011). O ZnO é um composto inorgânico e apresenta-se como pó fino, amorfo, de cor branca

e caráter anfótero. É de fácil cristalização e quando está na forma de nanopartícula apresenta

44

mudanças em suas propriedades, tais como, área superficial e estrutural. Para aplicações em

ciência dos materiais, o ZnO tem alto índice de refração, condutividade térmica elevada,

propriedades antibacterianas e proteção UV (CHIANG et al., 2011). Ainda, o ZnO é um

semicondutor com energia de 3,37 eV, correspondente ao comprimento de onda de 368 nm. Um

fóton com energia acima de 3,37 eV, ou seja, comprimento de onda inferior a 368 nm, tem o

potencial de fotoativar o material e promover a geração de ERO (DIAMOND et al., 2002).

Em células de mamíferos, vários estudos in vitro demonstraram potencial genotóxico de

nanopartículas de ZnO, conforme demonstrado em linhagem celular de epiderme humana (A431)

(SHARMA et al., 2009) e em queratinócitos epidérmicos humanos (SHARMA et al., 2011).

Segundo Lóden e col. (2011), o ZnO na forma micronizada (< 200 nm) mostrou-se

fotomutagênico em células de mamíferos in vitro (LÓDEN et al., 2011).

Lewicka e col. (2013) estudaram a fotoatividade de oito protetores solares comerciais que

continham filtros inorgânicos (TiO2 e/ou ZnO), usando diferentes ensaios para medir a eficiência

e capacidade de geração de ERO. Todos os métodos revelaram que o ZnO presente nestes

protetores solares comerciais podem gerar espécies ERO após radiação UV (LEWICKA et al.,

2013). Babele e col. (2018) observaram que a morte celular de S. cerevisiae foi atribuída a danos

na parede celular, geração de ERO e estresse oxidativo induzidos por nanopartículas de ZnO de

forma dose-dependente (BABELE et al., 2018).

1.7. NANOTECNOLOGIA E NANOPARTÍCULAS FOTOPROTETORAS

As nanopartículas são sistemas carreadores de fármacos que apresentam diâmetro menor

do que 1 µm (ALLÉMANN et al., 1993). Há mais de uma década, o campo da nanotecnologia

voltado para liberação de fármacos é de grande interesse para pesquisa, já que cerca de 95% dos

novos fármacos produzidos possuem algum tipo de propriedade farmacocinética ou

biofarmacêutica que necessita de aprimoramento (KOO et al., 2005).

O princípio da nanotecnologia é que os materiais na escala nanométrica podem apresentar

propriedades químicas, físico-químicas e comportamentais diferentes daquelas apresentadas em

escalas maiores (ROSSI-BERGMANN, 2008). O interesse em sistemas nanoparticulados de

liberação controlada de fármacos vem crescendo na área cosmética (WEIR et al., 2012) e para

administração parenteral, oral ou tópica (SCHAFFAZICK et al., 2006).

45

As principais vantagens do uso de nanopartículas em produtos cosméticos são: melhorar a

estabilidade de vários ingredientes cosméticos como ácidos graxos insaturados, vitaminas ou

antioxidantes encapsulados; promover a penetração de certos ativos, tais como vitaminas e outros

antioxidantes, aumentar a eficácia e tolerância de filtros UV sobre a pele e tornar o produto mais

agradável esteticamente (PADAMWAR & POKHARKAR, 2006).

Nos últimos anos, os fabricantes de cosméticos começaram a usar as formas micro ou

nanométricas de óxidos metálicos, pois, além de melhorar a uniformidade do filme sobre a pele, o

mesmo se torna invisível devido ao menor tamanho de partícula. A eficácia fotoprotetora também

é melhorada, pois a redução do tamanho de partícula diminui a reflexão da radiação visível

(diminui o branco), porém aumenta a reflexão e absorção da radiação UV (RIBEIRO, 2006;

FLOR et al., 2007; SERPONE et al., 2007). Além disso, houve aumento significativo do FPS, até

aproximadamente 50, após o encapsulamento de TiO2 em nanopartículas lipídicas

(VILLALOBOS-HERNANDEZ & MÜLLER-GOYMANN, 2005).

A segurança de nano e micropartículas de filtros solares inorgânicos, como o TiO2 e ZnO

é questionada. Estas partículas são amplamente utilizadas em estudos toxicológicos, uma vez que

sua atividade fotocatalítica pode ser empregada como antipoluente e antimicrobiana, além de

apresentar risco para saúde humana e meio ambiente, como exemplo ao inibir a fotossíntese e

degradar o fitoplâncton (MILLER et al., 2012; HOU et al., 2018; MORIYAMA et al., 2018;

HOU et al., 2019). Para nanomateriais utilizados em protetores solares, é necessário fazer uma

avaliação fototoxicológica para determinar se as nanopartículas/nanomateriais possuem a

capacidade de gerar radicais livres em presença de luz solar e se a adição de antioxidantes na

formulação pode eliminar os danos dos radicais livres (MU & SPRANDO, 2010). Embora as

vitaminas A, C e E já tenham sido aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para

serem usadas em produtos cosméticos e protetores solares como antioxidante (JANSEN et al.,

2013), elas não garantem necessariamente que o produto acabado seja fotoestável e menos

oxidável (DAMIANI et al., 2010). Wang e Tooley (2011) descrevem que muitos produtos que

contem ativos antioxidantes apresentam pouca ou nenhuma capacidade de eliminação, devido à

falta de estabilidade das moléculas (WANG & TOOLEY, 2011).

46

1.7.1. Montmorilonita (MMT)

As argilas minerais apresentam diferentes aplicações e uso, devido à facilidade com que

são modificadas e ao seu baixo custo. Em formulações para uso tópico, as argilas minerais podem

atuar como agentes protetores da pele, pois são capazes de aderir à pele e formar um filme

protetor mecânico contra agentes químicos e físicos externos (CARRETERO, 2002). Dentre as

argilas minerais, a MMT tem sido extensamente usada, devido a excelentes propriedades, como:

elevada capacidade de troca iônica, intumescimento, propriedades de adsorção e grande

superfície de contato (PAIVA et al., 2008).

A MMT (Figura 9) é uma argila aniônica, isto é, apresenta carga negativa nas lamelas que

são equilibradas por contra-íons positivos, geralmente, por cátions sódio (Na+), localizados no

espaço interlamelar da argila. As lamelas são mantidas por forças de Van der Waals e forças

polares fracas. Além de possuir muitos grupamentos hidroxila e grande área superficial no espaço

interlamelar, apresentando boa capacidade de troca catiônica, sendo a substituição isomórfica

responsável por 80% do total desta capacidade (PAIVA et al., 2006; COELHO et al., 2007).

Além disso, a MMT contém átomos de silício e oxigênio em formatos tetraédricos e átomos de

alumínio e oxigênio em formatos octaédricos que resultam em folhas tetraédricas e octaédricas

sendo classificadas como filossilicatos (PAIVA et al., 2006; CORRÊA, 2013).

Figura 9. Estrutura da Montmorilonita sódica (MMT-Na) (adaptado de PAUL & ROBESON,

2008).

Vários estudos tem aplicado a MMT com função de carrear ativos farmacêuticos, a fim de

criar novos sistemas de liberação modificada ou de se obter diferentes materiais com

47

propriedades melhoradas (DEL HOYO et al., 2001; COELHO et al., 2008; CUNHA et al., 2010;

AMBROGI et al., 2014). A combinação desses materiais pode gerar propriedades que não são

encontradas em um único constituinte (JOSÉ & PRADO, 2005), como exemplo, para melhorar a

fotoestabilidade de fármacos fotolábeis (AMBROGI et al., 2014) ou de ativos fotoprotetores

(PAIVA et al., 2014).

1.7.2. Complexos de inclusão: MMT e filtros solares

A intercalação de compostos orgânicos ou inorgânicos em silicatos lamelares permite o

desenvolvimento de compósitos, ou seja, híbridos que possuem propriedades de ambos

componentes em um único material (JOSHI et al., 2009). Os nanocompósitos são um tipo de

nanomateriais híbridos (MÉNESI et al., 2008; DVININOV et al., 2009), sendo que um deles

possui dimensões na ordem de nanômetro. Essa combinação mantem as características estruturais

de cada componente separadamente, ao mesmo tempo em que as propriedades do material

formado são superiores às propriedades de cada componente em separado (DORNELAS, 2008).

A principal vantagem da inclusão de fotoprotetores em cavidades de MMT é o baixo

custo. Além de melhorar propriedades como fotoestabilidade, substantividade, absorção da

radiação UVA e UVB, facilitar a formulação, reduzir o contato dos filtros com a pele e melhorar

a distribuição do filme formado pelo protetor solar na pele (PERIOLI et al., 2006; PAIVA et al.,

2014).

1.8. RELAÇÃO ENTRE EFICÁCIA E SEGURANÇA DE FOTOPROTETORES

A eficácia de um fotoprotetor está relacionada à sua capacidade em aumentar a

fotoproteção, evitando a influência dos efeitos deletérios induzidos por UV. Já a segurança de um

fotoprotetor está relacionada à sua inocuidade, ou seja, sua habilidade de não causar reações

nocivas, tais como fotoalergias, fototoxicidade, fotomutagenicidade/fotogenotoxicidade, dentre

outras (FLOR et al., 2007).

Segundo a RDC nº 30/2012 da ANVISA, para avaliação da eficácia fotoprotetora os

métodos exigidos são:

Determinação do FPS em voluntários humanos;

48

Determinação da resistência à àgua;

Determinação do nível da proteção UVA;

Amplitude da proteção UV avaliada por meio do comprimento de onda crítico (BRASIL,

2012).

Porém, o Scientific Committee on Consumer Safety (SCCS) em Notes of Guidance for the

Testing of Cosmetic Ingredients and their Safety Evaluation (SCCS, 2012), elaborado pela União

Européia (UE), afirma que o FDA e a European Medicines Agency (EMA) não recomendam que

ensaios de fotogenotoxicidade e/ou fotomutagenicidade façam parte dos testes obrigatórios para o

desenvolvimento, segurança e controle de qualidade de fotoprotetores (LÓDEN et al., 2011).

Além da necessidade de se incluir testes de fotomutagenicidade e fotogetonoxicidade à

bateria de testes que avaliem o potencial genotóxico e segurança de produtos cosméticos,

principalmente devido à interação dos fótons da luz UV com os filtros dos fotoprotetores (DOKE

& DHAWALE, 2015), despertou-se a ideia de substituir o uso de animais por metodologias

alternativas. Em 1959, o Princípio dos 3R’s (reduction, replacement e refinement) foi

apresentado à comunidade científica que preconizava o refinamento, redução e substituição da

experimentação in vivo pela in vitro (RUSSELL & BURCH, 1959).

Paradoxalmente, alguns testes in vitro apresentam limitações cruciais, como a não

influência da capacidade metabólica de um organismo vivo, baixa especificidade de linhagens

celulares utilizadas, alta sensibilidade à faixa de comprimento de onda da radiação UV de

linhagens celulares usadas, dentre outros (NESSLANY, 2017).

Com isso, há crescente demanda de agências regulatórias por testes que utilizem modelos

celulares resistentes aos efeitos citotóxicos de todo espectro da radiação UV com taxas de dose e

tempos de irradiação compatíveis às condições ambientais externas (HOSSY et al., 2017; DINIZ

et al., 2019; SILVA et al., 2019).

1.9. AVALIAÇÃO DA FOTOPROTEÇÃO EM LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae

Uma área de grande interesse é o estudo para identificação e caracterização de genes

envolvidos em patologias humanas empregando-se leveduras (MAGER & WINDERICKX,

2005). Este foi o primeiro organismo eucarioto a ter seu genoma totalmente sequenciado,

49

organizado em 16 cromossomos e em média um gene a cada 2000 pares de bases, mostrando-se

extremamente importante para o desenvolvimento de novas técnicas e servindo como referência

para análise evolutiva e comparativa de outros organismos eucariotos superiores (GOFFEAU,

2000; LITI & LOUIS, 2005; GARFINKEL, 2005).

A S. cerevisiae possui um ciclo eucariótico bem definido, podendo ser induzida tanto a

um ciclo meiótico quanto ao mitótico de crescimento. Suas células se dividem por brotamento

logo após a duplicação do seu DNA, quando incubadas a temperatura entre 28-30ºC

(ZIMMERMANN et al., 1984). É capaz de se desenvolver em condições anaeróbicas e aeróbicas

de crescimento, sendo assim um organismo anaeróbico facultativo que utiliza fontes fermentáveis

de carbono, como frutose e glicose, e fontes não fermentáveis de carbono, como etanol, glicerol,

piruvato e lactato (MARIS et al., 2000; ROLLAND et al., 2002).

A S. cerevisiae é um fungo ascomiceto bastante estudado e notavelmente semelhante às

células de mamíferos no que se refere à presença de macromoléculas, organelas e proteínas com

homologia às proteínas humanas, tornando-a um organismo importante nas pesquisas sobre

mutagênese, reparo de DNA e mecanismos que respondem ao estresse oxidativo (COSTA &

FERREIRA, 2001).

Os estudos utilizando a S. cerevisiae como modelo eucariótico se justificam pela

similaridade existente entre seus genes de reparo de DNA e os presentes em humanos (GIRARD

& BOITEUX, 1997). Como exemplo, comparando o genoma humano com o de S. cerevisiae,

verificou-se que, aproximadamente, 30% dos genes conhecidos como causadores de doenças

humanas apresentam homólogos funcionais com genes dessa levedura (FOURY, 1997).

Apesar da disponibilidade de metodologias para se estudar a mutagênese em organismos

superiores, utilizando-se ratos como modelo, por exemplo, alguns aspectos ainda são

desfavoráveis, tais como, o ciclo de vida longo e a complexidade da realização de estudos

genéticos. Adicionalmente, as técnicas de genética e biologia molecular disponíveis, sua ampla

caracterização e conservação genética em relação ao genoma de mamíferos, são fortes fatores que

contribuem para a escolha de S. cerevisiae como modelo em estudos do processo de

envelhecimento e de doenças (PARRELLA & LONGO, 2008).

Desde 1992, diferentes cepas de levedura já eram um modelo bastante explorado em

estudos fotobiológicos para a avaliação de fototoxicidade e fotogenotoxicidade/

fotomutagenicidade. Ainda nesta época passou-se a observar que o emprego de cepas de S.

50

cerevisiae mutantes podia fornecer diversas evidências acerca do mecanismo pelo qual ocorrem

as lesões induzidas pela radiação UV (MONDON & SHAHIN, 1992).

Adicionalmente, outras características tornam esse micro-organismo um bom modelo

experimental para testes in vitro, sendo elas: não patogenicidade; fácil manipulação em

laboratório; baixo custo de manutenção; rápido crescimento celular; facilidade de integração de

sequências exógenas de DNA no seu genoma por meio de recombinação homóloga; presença de

grande número de cepas mutantes em diversos mecanismos de reparo (BARR, 2003) e atende às

exigências das agências regulatórias, que preconizam testes alternativos de cito e genotoxicidade

baseando-se no princípio dos 3R’s ao uso de animais para análise da toxicidade de substâncias

para uso cosmético e farmacêutico (FDA, 2013).

Outras razões tornam a levedura S. cerevisiae um dos melhores modelos de sistema

eucariótico unicelular para estudos de estresse oxidativo, entre eles destaca-se o fato de ser

provido de núcleo e de organelas, com metabolismo semelhante à de eucariotos superiores e

cujos resultados, obtidos através de estudos de mutagenicidade e genotoxicidade, mostram

correlação de, aproximadamente, 80% com aqueles observados em humanos (TERZIYSKA et

al., 2000).

Cepas de leveduras deficientes nos genes OGG1 e YNO1 demonstram-se particularmente

úteis como bioindicadores de sensibilidade a danos oxidativos. É valido ressaltar que ambos os

genes mencionados são homólogos e ortólogos a genes de humanos. A proteína Ogg1 é está

envolvida no BER (THOMAS et al., 1997; PADULA et al., 2004) e a proteína Yno1 é descrita

como reguladora de resposta celular ao estresse oxidativo, está presente na membrana do retículo

endoplasmático e é responsável pela produção superóxido mediada por NADPH (AGUIRRE &

LAMBETH, 2010; RINNERTHALER et al., 2012).

Adicionalmente, cepas de S. cerevisiae são suficientemente resistentes à radiação UV

ambiental e/ou artificial, permitindo exposições a doses comparáveis àquelas que podem ser

encontradas sob a luz solar natural (PAIVA et al., 2014; HOSSY et al., 2017; SILVA et al., 2019;

DINIZ et al., 2019). De acordo com Pinto e col. (2010), a radiação UVB causa efeitos letais e

mutagênicos em levedura S. cerevisiae (PINTO et al., 2010). Com isso, a avaliação da

participação de ativos fotoprotetores nos efeitos causados pela radiação UVB em modelo S.

cerevisiae permite a investigação do seu potencial fotoprotetor (PAIVA et al., 2014, HOSSY et

al., 2017; DINIZ et al., 2019; SILVA et al., 2019). Este potencial fotoprotetor pode ser avaliado

51

por meio da observação dos efeitos letais e mutagênicos induzidos pela radiação UVB ou pela

LSS em leveduras pré-tratadas com os ativos que se deseja estudar em comparação com as não

tratadas, sendo um bom modelo bioindicador de danos ao DNA (PINTO et al., 2010; PAIVA et

al., 2014, HOSSY et al., 2017; SILVA et al., 2019; DINIZ et al., 2019).

Ainda, Paiva e col. (2014) indicaram efeito fotoprotetor sinérgico do complexo de

inclusão de TiO2 e MMT-Na resultante do aumento da fração de sobrevivência e diminuição da

mutagênese da cepa mutante ogg1 de S. cerevisiae em relação à radiação UVB. Ou seja, além de

ser capaz de evidenciar o potencial fotomutagênico, esta cepa também foi útil em indicar efeito

antifotomutagênico (PAIVA et al., 2014).

A aplicabilidade do mutante ogg1 de S. cerevisiae em particular, vai além da avaliação de

substâncias fotoprotetoras, sendo também capaz de identificar o potencial fototóxico de

excipientes usados em formulações, como os parabenos e seus derivados (HOSSY et al., 2017).

Como muitos dos efeitos nocivos da radiação UV é decorrente do efeito indireto mediado pela

geração de ERO, a cepa mutante ogg1 de S. cerevisiae pode ainda ser utilizada na avaliação do

efeito fotoprotetor de antioxidantes com potencial uso em formulações fotoprotetoras (SILVA et

al., 2019).

Os testes in vitro preconizados para análise da fototoxicidade apresentam limitações

cruciais: a influência da capacidade metabólica não é considerada em alguns casos, baixa

especificidade, uso de linhagens celulares não relevantes para prever os desfechos genotóxicos,

levando a resultados falso-negativos, as fontes de radiação UV indicadas pelos testes não

refletem o espectro completo da luz solar natural, dentre outros (NESSLANY, 2017). Os dados

de fototoxicidade são especificamente exigidos quando o produto cosmético é esperado ou

destinado a ser usado na pele exposta à luz solar. A notificação de produtos cosméticos contendo

nanomateriais tornou-se obrigatória a partir de 11 de janeiro de 2013 (SCCS, 2012).

Portanto, o potencial bioindicador das cepas de S. cerevisiae para eventos oxidativos

induzidos pela radiação UV juntamente com o uso de filtros solares reforçam a ideia que estas

são uma ferramenta simples e útil não somente para avaliar eficácia (em termos de fotoproteção),

como também para análise da segurança (em termos de fotomutagênese/fotogenotoxicidade)

tanto de filtros já usados em formulações quanto de novos candidatos a fotoprotetores. Assim, o

uso de leveduras poderiam antever as mutações que ocorrem na iniciação, sendo este o primeiro

evento no processo de malignização celular.

52

2. JUSTIFICATIVA

No Brasil, estima-se a ocorrência de aproximadamente 600 mil novos casos de câncer no

biênio 2018-2019, incluindo os casos de pele não melanoma, que será o mais incidente na

população brasileira com cerca de 180 mil casos novos. A prevenção e o controle do câncer

precisam adquirir foco e atenção, pois o crescente aumento do número dos casos fará com que

não haja recursos suficientes para diagnóstico, tratamento e acompanhamento da doença (INCA,

2018).

Estudos sobre danos ao DNA causados por moléculas candidatas a fármacos constituem

uma área essencial da toxicologia genética, uma vez que mutação é um evento importante na

carcinogênese (FENECH, 2005). Os protetores solares presentes no mercado não são totalmente

seguros e eficazes na prevenção do câncer de pele, como exemplo há formação de ERO induzida

pelo TiO2, ZnO e filtros orgânicos quando irradiados por UV. Assim, estudos de fotoestabilidade

de protetores solar devem ser requisitos antes de sua comercialização (MAIER et al., 2001).

O Guia para a Avaliação e Segurança de Produtos Cosméticos da ANVISA sugere que

sejam realizados diversos testes in vitro e in vivo para se avaliar a segurança dos ativos

fotoprotetores, porém, não são mandatórios para registro de formulações fotoprotetoras. A

avaliação da segurança desses filtros solares isolados contra fotogenotoxicidade e

fotomutagenicidade não é conclusiva devido aos modelos experimentais indicados nestes testes

(BRASIL, 2012).

Como exemplo, o Teste de Fototoxicidade in vitro 3T3 NRU, apesar de indicado, não

fornece informação quanto à fotogenotoxicidade do composto testado, indicando apenas aspectos

de fotocitotoxicidade. Mesmo usando um simulador solar como fonte de irradiação, todo o

comprimento de onda correspondente ao UVB é filtrado do espectro emitido, formado apenas por

UVA e VIS, não sendo compatível com a composição do espectro da luz solar natural, indicando

que os resultados obtidos por este teste subestimam os potenciais efeitos da radiação UVB, maior

carcinógeno ambiental descrito (NARAYANAN et al., 2010).

Outro exemplo é o Teste de Ames é usado para avaliação da mutagenicidade de

compostos e não prevê a avaliação da fotomutagenicidade/fotogenotoxicidade. Existe uma

variação deste teste que inclui a irradiação das cepas bacterianas expostas ao composto

potencialmente mutagênico a fontes de UV, o chamado Teste FotoAmes. Entretanto, o principal

53

fator limitante desse ensaio é a alta sensibilidade das cepas bacterianas usadas frente à radiação

UVB, impossibilitando a conclusão dos resultados (NESSLANY, 2017). Cabe ressaltar, ainda,

que as enzimas de reparo bacterianas não são homólogas ou ortólogas às das células de

mamíferos (FRIEDBERG et al., 2006), evidenciando a pouca correlação desse teste com modelos

em eucariotos superiores.

Ainda, os testes do Micronúcleo em célula de mamífero in vitro e o Ensaio Cometa,

apesar de usarem modelo celular de eucarioto superior, não detectam fotoclastogenicidade e

fotoaneuploidia e danos ao DNA que são reparados em curto período de tempo, respectivamente

(SCCS, 2012).

Já a levedura S. cerevisiae é um dos micro-organismos mais explorados como modelo de

estudo alternativo ao uso de animais e células de mamíferos. Como algumas cepas de S.

cerevisiae são resistentes a altas doses de radiação UV (tanto ambiental como o artificial)

permite-se exposições a doses comparáveis às encontradas sob a luz solar natural e posterior

análise de fotogenotoxicidade/fotomutagenicidade. O emprego de cepas de S. cerevisiae pode

fornecer diversas evidências acerca do mecanismo pelo qual ocorrem as lesões induzidas pela

radiação UV (MONDON & SHAHIN, 1992; THOMAS et al., 1997; PADULA et al., 2004).

Desta forma, é fundamental que sejam usados testes rápidos e eficazes para avaliação do

potencial fotoprotetor e fotomutagênico de ativos e excipientes usados em formulações para

proteção solar, visando à prevenção conta o câncer de pele. Paiva e col (2014) desenvolveram e

caracterizaram um novo nanossistema formado por MMT-Na e TiO2 e testaram seu potencial

fotoprotetor pós-radiação UVB em modelo de levedura S. cerevisiae. Assim, gerou-se a

necessidade de avaliar este novo ativo para fotoproteção utilizando a LSS como fonte de

irradiação, mimetizando as condições ambientais de exposição solar, e cepas de levedura de

diferentes backgrounds genéticos. Ainda, é proposto que novas misturas físicas formadas por

MMT-Na e filtros solares inorgânicos e novos fotoprotetores sejam desenvolvidos a fim de se

obter novas formulações que atendam aos pré-requisitos necessários para a fotoproteção, agregue

qualidade e segurança aos produtos e não cause danos à saúde da população.

54

3. OBJETIVO

3.1. OBJETIVO GERAL

Preparar e caracterizar nanossistemas formados por silicatos minerais e filtros solares

inorgânicos e seus efeitos sobre a sobrevivência celular (eficácia de fotoproteção) e mutagênese

direta (segurança de fotoproteção e potencial antifotogenotóxico) em leveduras Saccharomyces

cerevisiae, a fim de desenvolver novas formulações para fotoproteção.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o tamanho de partícula de filtros solares inorgânicos (TiO2 ou ZnO);

Preparar e caracterizar nanossistemas para fotoproteção utilizando silicatos minerais e

ativos fotoprotetores;

Avaliar a citotoxicidade em cepas selvagem FF18733 e mutante CD138 (ogg1) de S.

cerevisiae de nanossistemas e ativos fotoprotetores;

Determinar os parâmetros de irradiação artificial com UVB e LSS em comparação com as

medidas ambientais;

Avaliar a sobrevivência celular de cepas selvagem FF18733 e mutante CD138 (ogg1) de

cerevisiae, após tratamento com nanossistemas e ativos fotoprotetores, sob radiação UVB ou

LSS;

Avaliar a mutagênese espontânea e induzida de cepas selvagem FF18733 e mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, após tratamento com nanossistemas e ativos fotoprotetores, sob

radiação UVB ou LSS;

Quantificar a produção de ERO em cepas selvagem FF18733 e mutante CD138 (ogg1) de

S. cerevisiae, após tratamento com nanossistemas e ativos fotoprotetores, sob radiação UVB ou

LSS;

Preparar formulações para proteção solar e avaliar parâmentros de fotoproteção in vitro.

55

4. METODOLOGIA

4.1. MATERIAL

4.1.1. Ativos fotoprotetores

Os ativos fotoprotetores testados foram: TiO2 anatase (Sigma), TiO2 revestido (Eusolex T

- Merck), ZnO (Sigma), ZnO (Vetec) e MMT-Na (Bentec). Foi preparada solução-mãe de cada

filtro na concentração de 10 mg/mL em água estéril e armazenada em eppendorfs sob

refrigeração (~ 2ºC). Para a dispersão dos filtros foi utilizado polissorbato (Tween 80 - Merck).

4.1.2. Soluções e meios de cultivo

Quadro 1. Solução de glicose a 20% (p/v).

Reagentes Quantidade Preparo

Glicose (Merck)

Água estéril (q.s.p.)

100 g

500 mL

Distribuir 100 mL/frasco, autoclavar por 20 min

a 121○C e estocar em temperatura ambiente

(THOMAS et al., 1997).

Quadro 2. Meio de cultivo - YPG líquido.


Bacto-Peptona (BactoTM)

Extrato de levedura (BactoTM)


10 g

10 g

900 mL

Distribuir 90 mL/frasco, autoclavar por

20 min a 121○C e estocar em temperatura

ambiente. Para utilização do meio YPG

líquido, acrescentar ao frasco, 10 mL de

solução de glicose a 20% (p/v)

(THOMAS et al., 1997).

56

Quadro 3. Meio de cultivo - YPG sólido.


Bacto-Peptona (BactoTM)

Extrato de levedura (BactoTM)

Agar (BactoTM)


10 g

10 g

20 g

900 mL

Distribuir 900 mL/frasco, autoclavar por

20 min a 121○C e manter em solução a

60○C. Acrescentar ao frasco, 100 mL de

solução de glicose a 20% (p/v). Distribuir

~ 20 mL por placa de Petri (THOMAS et

al., 1997).

Quadro 4. Soluções de aminoácidos e/ou base.

Soluções Reagentes (Sigma) Quantidade Preparo

Ura

Lis

Leu

His*

Trp*

Uracila


Lisina


Leucina


Histidina


Triptofano


0,2 g

100 mL

0,4 g

100 mL

1,0 g

100 mL

2,0 g

100 mL

0,2 g

100 mL

Distribuir as soluções em diferentes

frascos, autoclavar por 20 min a

121○C e estocar em temperatura

ambiente (THOMAS et al., 1997).

* frasco protegido da luz

57

Quadro 5. Meio de cultivo - YNBD sólido com Canavanina (Sigma) 60 mg/L.

Soluções Reagentes Quantidade Preparo

1

2

3

YNB (DifcoTM)


Agar (BactoTM)


Glicose (Merck)


7 g

200 mL

20 g

500 mL

20 g

250 mL

Distribuir as soluções 1, 2 e 3 em

diferentes frascos, autoclavar por 20

min a 121○C, misturar as soluções em

frasco de 1000 mL e manter a 45○C.

Acrescentar ao frasco final, 10 mL das

soluções de aminoácidos e/ou base de

acordo com a auxotrofia das cepas,

mais 60 mg de Canavanina (Sigma).

Agitar o frasco até completa

dissolução e distribuir ~ 20 mL por

placa de Petri (THOMAS et al., 1997).

4.1.3. Cepas de S. cerevisiae

Quadro 6. Cepas de S. cerevisiae.

Designação

das cepas Genótipo relevante Fenótipo Origem

FF18733

CD138

MATa, leu2-3-112,

trp1-289, his7-2,

ura3-52, lys1-1

FF18733 com

ogg1::TRP1

Selvagem

ogg1

F. Fabre (Fontenay aux Roses,

France)

D. Thomas (CNRS,

Gif/Yvette, France)

CNRS: Centre National de la Recherche Scientifique.

Estas cepas foram selecionadas em função de suas características genotípicas, assim a

proficiência ou deficiência no BER servem como indicativo da ocorrência de lesões pré-

mutagênicas no DNA após tratamento com agentes fotogenotóxicos, como exemplo a radiação

UV ou filtros UV. A cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae é proficiente em todos os sistemas

58

de reparo de DNA, permitindo a comparação dos efeitos de agentes externos, como a radiação

UV e substâncias testadas, na presença ou ausência de mecanismos de reparo (THOMAS et al.,

1997). Já a cepa mutante CD138 (ogg1) por ser deficiente no gene OGG1, responsável pela

codificação da enzima Ogg1 que repara lesões de caráter oxidativo como a 8-oxoG, acumula

transversões GC TA devido à ausência de reparo, portanto, é mais sensível às lesões

oxidativas (THOMAS et al., 1997; PADULA et al., 2004).

4.1.4. Equipamentos

Balança analítica - Denver Instrument APX-200

Centrífuga Thermo Scientific - Sorvall Legend XTR Centrifuge

Fotocolorímetro Bausch & Lomb - Spectronic 70

Placa de agitação/aquecimento - Cientec CT-103

Autoclave Vertical - Phoenix

Ultrassom UP100H - Hielscher

Liofilizador L101 - Liotop

Difratômetro de raios X - XDR-6100 Shimadzu

Zetasizer Nano ZS - Malvern

Lâmpada UVB - Vilber-Loumart VL-215 LM com duas lâmpadas de 15 W com

comprimento de onda entre 280-320 nm e pico em 312 nm

Dosímetro Vilber Lourmat - VLX-3-W acoplado a fotocélula Vilber-Lourmat -

CX-312 ou Vilber-Lourmat - CX-365

Simulador Solar 91192 - Oriel/Newport® com lâmpada de xenônio de 900 W

contendo os filtros Newport AMO (atenuador atmosférico que retira o excesso de

infravermelho) e 87066 (bloqueia parte da luz visível)

Leitor de microplacas Victor3 - PerkinElmer

Agitador mecânico tipo hélice

Espectrofotômetro por transmitância com esfera de integração - Labsphere® UV-

2000S

59

4.2. MÉTODOS

4.2.1. Avaliação do tamanho de partícula de filtros solares inorgânicos por

espalhamento de luz dinâmico (DLS)

Para determinação do tamanho de partícula por DLS, os filtros solares inorgânicos foram

dispersos em água destilada e processados em ultrassom na potência de 100 W a 100% de

amplitude por 30 min. Em seguida, as amostras foram transferidas para cubetas de plástico e o

tamanho médio de partícula foi analisado no aparelho Zetasizer Nano ZS.

4.2.2. Preparo dos nanossistemas para fotoproteção usando química de intercalação

e ativos fotoprotetores

O ensaio de intercalação do TiO2 ou ZnO em MMT-Na foi feito em triplicata utilizando

metodologia descrita por Paiva e col. (2014). Em 200 mL de água destilada, foi realizada

dispersão de 1 g de TiO2 ou ZnO e 1 g de MMT-Na. A suspensão foi submetida ao ultrassom por

1 h na potência de 60 W. Em seguida, o material foi liofilizado por 96 h, triturado com auxílio de

gral e pistilo e calibrado em tamis de malha 70 mesh (tamanho padronizado pela ABNT).

4.2.3. Caracterização dos nanossistemas para fotoproteção por Difração de raios X

(DRX)

Para caracterização por DRX, as amostras foram analisadas em difratômetro de raios X

operado a 30 kV, 15 mA, 0,05 mm, 1ºC/min, em temperatura ambiente. Foi utilizada radiação

CuKα como fonte de raios X (comprimento de onda de 0,15418 nm). O ângulo de difração (2 ϴ)

foi registrado no intervalo entre 2° a 20°. O espaçamento interlamelar da MMT-Na foi calculado

por meio da aplicação da Lei de Bragg, representada pela equação: n λ = 2 d sen ϴ. Sendo, d a

distância entre os planos lamelares da argila (espaçamento interlamelar, Å), λ equivale ao

comprimento de onda dos raios X difratado (1,5418 Å) e o valor de ϴ é a metade do ângulo de

espalhamento referente ao pico d (KOO, 2006).

60

4.2.4. Manutenção das cepas de S. cerevisiae

As cepas foram mantidas em estoque contendo a cultura na fase estacionária, em glicerol

estéril a 87% (Merck) na proporção de 1:1, a – 80⁰C, sendo renovados a cada 12 meses.

4.2.5. Obtenção das culturas de S. cerevisiae para os experimentos

As culturas utilizadas nos experimentos foram obtidas transferindo-se uma alíquota dos

estoques a – 80°C para erlenmeyer contendo 10 mL de meio YPG líquido (~ 30°C/24 h sob

agitação). Em seguida, 100 µL foram repicados em 10 mL de YPG líquido (~ 30°C/48 h sob

agitação) até fase estacionária e plaquedas em placa de Petri para verificação da auxotrofia, a fim

de confirmar o genótipo/fenótipo de cada cepa.

Após verificação da auxotrofia, as culturas utilizadas nos experimentos foram obtidas

transferindo-se uma alíquota dos estoques em placa de Petri para erlenmeyer contendo 10 mL de

meio YPG líquido (~ 30°C/24 h sob agitação). Em seguida, 100 µL foram repicados em 10 mL

de YPG líquido (~ 30°C/48 h sob agitação) até fase estacionária. As culturas foram centrifugadas

por 10 min a 7000 rotações por minuto (rpm) em temperatura ambiente e ressuspendidas em 10

mL de água estéril, 3 vezes. Foi verificada a densidade ótica (D.O.) em 600 nm e as células foram

diluídas a 107 células/mL (D.O. = 1). Em seguida, foram avaliadas a citotoxicidade,

sobrevivência celular e mutagênese direta de cepas selvagem FF18733 e mutante CD138 (ogg1)

de S. cerevisiae, como descrito a seguir.

4.2.6. Determinação dos parâmetros de irradiação para UVB e LSS

Para definir os parâmetros de radiação com UVB e LSS foi feita coleta de dados

referentes às condições ambientais de variação de temperatura e radiação UVA e UVB emitidas

naturalmente pela luz solar em um dia de verão na cidade do Rio de Janeiro/RJ (DINIZ et al.,

2019; RURR et al., 2019). A análise foi feita em intervalos de 30 min e correlacionada com a

taxa de dose de UVA e UVB utilizadas nos experimentos. Assim, para radiação com lâmpada de

UVB, foi utilizada taxa de dose de 15 J/m2/s.

61

Quadro 7. Doses de UVB (kJ/m2) por tempo de irradiação.

Dose UVB (kJ/m2) Tempo de irradiação

0

5

10

15

20

25

30

0

5min 33s

11min 07s

16min 40s

22min 13s

27min 46s

33min 20s

O simulador solar (Figuras 10 e 11) emite radiações que simulam o espectro da radiação

solar que atinge a superfície terrestre, ou seja, permite a exposição a um espectro que contenha

UVA, UVB, IV e VIS, simulando dias mais ou menos ensolarados dependendo da potência

utilizada. A taxa de dose para UVB foi de 1,2 J/m2/s e para UVA de 20 J/m2/s. Foi realizado

tratamento com LSS e diferentes doses de UVA e UVB na proporção de, aproximadamente, 17:1

(UVA:UVB), mimetizando condições de exposição solar ambiental, de forma controlada, sem as

flutuações sazonais típicas de quando se utiliza a exposição à luz solar direta em diferentes

períodos do ano (SILVA et al., 2019; DINIZ et al., 2019).

Cabe ressaltar que, ao se utilizar um simulador solar, as doses de UVB e UVA emitidas

devem ser determinadas e relatadas separadamente, usando dosímetros detectores do

comprimento de onda de UVA e UVB de forma individual (BRENDLER-SCHWAAB et al.,

2004).

62

Quadro 8. Doses de UVB (kJ/m2) e UVA (kJ/m2) por tempo de irradiação obtidas com o

simulador solar.

Dose UVB (kJ/m2) Dose UVA (kJ/m2) Tempo de irradiação

0

2,5

3

4

5

7,5

10

0

41,64

49,98

66,70

83,30

124,98

166,64

0

34min 42s

41min 39s

55min 35s

1h 09min 25s

1h 44min 09s

2h 18min 52s

Figura 10. Fotografia do Simulador Solar Oriel/Newport®, Modelo 91192.

63

Figura 11. Representação esquemática dos compartimentos internos do Simulador Solar marca

Oriel/Newport®, Modelo 91192 (Disponível em: http://assets.newport.com/webDocuments-

EN/images/Solar_Simulation.PDF. Acesso em: 09/10/2018).

4.2.7. Avaliação da citotoxicidade em cepas selvagem FF18733 e mutante CD138

(ogg1) de S. cerevisiae de nanossistemas e ativos fotoprotetores na ausência de radiação

UVB e LSS

Para análise da citotoxicidade dos ativos fotoprotetores, as culturas foram obtidas como

descrito anteriormente. Em seguida, foi realizado o tratamento que consistiu em manter alíquotas

das cepas FF18733 ou CD138 a ~ 30°C/6 h sob agitação em erlermeyer contendo 107 células/mL

e 100 µg/mL de cada substância testada com volume final de 10 mL. Em intervalos de 1 h, foram

retiradas alíquotas para determinação da sobrevivência celular.

Foram feitas diluições seriadas em água estéril, a fim de obter em torno de 100

colônias/placa de Petri, e alíquotas foram plaqueadas em duplicata em meio YPG sólido e

mantidas em estufa a ~ 30°C. As colônias foram contadas após o período de aproximadamente 96

h. Em seguida, foi plotada a média dos resultados (mais ou menos o erro padrão) em gráficos de

fração de sobrevivência (N/N0) x tempo, onde N0 representa o número inicial de células e N é o

http://assets.newport.com/webDocuments-EN/images/Solar_Simulation.PDF

http://assets.newport.com/webDocuments-EN/images/Solar_Simulation.PDF

64

número de células após tratamento. Todos os experimentos de citotoxicidade foram realizados de

forma independente pelo menos três vezes.

4.2.8. Avaliação da sobrevivência celular das cepas selvagem FF18733 e mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, após tratamento com nanossistemas e ativos fotoprotetores

sob radiação UVB ou LSS

Para análise da sobrevivência celular, as culturas foram obtidas como descrito

anteriormente. Em seguida, alíquotas das cepas FF18733 ou CD138 foram expostas a doses

crescentes de radiação UVB ou LSS, em placas de Petri de vidro (5 cm de diâmetro) contendo

107 células/mL e 100 µg/mL de cada filtro solar testado, com volume final de 10 mL, em água

estéril.

Foram feitas diluições seriadas em água estéril, a fim de obter em torno de 100

colônias/placa de Petri, e alíquotas foram plaqueadas em duplicata em meio YPG sólido e

mantidas em estufa a ~ 30°C. As colônias foram contadas após o período de aproximadamente 96

h. Em seguida, foi plotada a média dos resultados (mais ou menos o erro padrão) em gráficos de

fração de sobrevivência (N/N0) x tempo, onde N0 representa o número inicial de células e N é o

número de células após tratamento. Todos os experimentos de sobrevivência celular foram

realizados de forma independente pelo menos três vezes.

O incremento de fotoproteção foi calculado pela razão:

Incremento de fotoproteção = DL37 UVB (kJ/m2) tratado

DL37 UVB (kJ/m2) controle

4.2.9. Avaliação da mutagênese espontânea e induzida das cepas selvagem FF18733

e mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, após tratamento com nanossistemas e ativos

fotoprotetores sob radiação UVB ou LSS

Para análise da mutagênese direta, as culturas foram obtidas como descrito anteriormente.

Em seguida, alíquotas das cepas FF18733 ou CD138 foram expostas a doses crescentes de

radiação UVB ou LSS, em placas de Petri de vidro (5 cm de diâmetro) contendo 107 células/mL e

65

100 µg/mL de cada filtro solar testado, com volume final de 10 mL, em água estéril, como

descrito anteriormente. Após cada dose, foram retiradas alíquotas de 100 µL e estas plaqueadas

diretamente em meio YNBD sólido com Canavanina (60 mg/mL), em duplicata, e mantidas em

estufa a ~ 30°C.

O sistema de resistência à Canavanina é um sistema de mutagênese direta que detecta

todas as mutações que inativam o gene da arginina permease, CAN1. Este gene presente na

levedura S. cerevisiae codifica um aminoácido-permease (Can1p), responsável pelo importe de

arginina do meio extracelular. No entanto, esta permease também transporta o análogo tóxico da

arginina, L-canavanina (L-can) e em altas concentrações de Canavanina no meio de cultivo

haverá incorporação deste antibiótico, inativando a célula. As células que possuem o gene CAN1

não funcionante irão sobreviver, pois não utilizarão a Canavanina do meio. O gene CAN1 é

utilizado em estudos de mutagênese provocada por sistema de reparo onde é analisada a

frequência de mutação neste lócus. Este sistema de seleção é possível, uma vez que S. cerevisiae

é prototrófica para arginina (DZIERZBIKI et al., 2004; SOUZA, 2009; PINTO et al., 2010). O

gene CAN1 é utilizado em diversos estudos de mutagênese devido à sua robustez para detecção

de eventos mutagênicos, uma vez que possui mais de 60 alvos independentes passíveis de

mutação causadoras de inativação gênica, englobando todos os tipos de transições, transversões,

além de inserções, deleções, acompanhadas de mudança de quadro de leitura (frameshift)

(OHNISHI et al., 2004).

As colônias foram contadas após o período de aproximadamente 96 h. Em seguida, foi

plotada a média dos resultados (mais ou menos o erro padrão) em gráficos de mutagênese/107

células x dose, somente na dose letal de 37% (DL37). O número de mutantes resistentes à

Canavaniva (CanR) foi calculado fazendo-se a razão entre o número de mutantes encontrados

após cada tratamento pelo número de células viáveis e os resultados obtidos foram padronizados

e expressos por número de mutantes em 107 células (CanR/107 células). Todos os experimentos de

mutagênese direta foram realizados de forma independente pelo menos três vezes.

Uma das melhores abordagens para comparar sobrevivência e mutagênese é a estratégia

de um golpe letal por célula (GLC). Neste modelo, com 37% de sobrevivência da população, o

número médio de GLC é 1. Isto estabelece um limiar para eventos letais e tende a maximizar a

mutagênese. Porém, o conceito de golpe letal não significa o número real de lesões que levam à

morte celular, pois isso dependerá diretamente da capacidade de reparo de uma determinada cepa.

66

Se a mutagênese é avaliada em nível mais elevado do que 37% de sobrevivência, a quantidade de

danos induzidos no DNA será menor que 1 GLC e favorecerá a sobrevivência celular, quando as

lesões tendem a ser geridas por sistemas de reparo que levam a baixo ou sequer qualquer nível

mutagênese induzida. Por outro lado, sobrevivência muito inferior a 37%, nas quais o número de

GLC é maior que 1, haverá favorecimento da morte celular em detrimento dos eventos de

mutação (KOCH-PAIZ et al., 2004).

O incremento de fotomutagênese foi calculado pela razão:

Incremento de fotomutagênese = CanR/107 células na DL37 tratado

CanR/107 células na DL37 controle

4.2.10. Quantificação da produção de ERO em cepas selvagem FF18733 e mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, após tratamento com nanossistemas e ativos fotoprotetores

sob radiação UVB ou LSS

Para este teste, as cepas FF18733 e CD138 de S. cerevisiae foram cultivadas como

descrito anteriormente. Em seguida, foi realizado o esquema experimental do teste de avaliação

da sobrevivência celular. O controle positivo foi feito com peróxido de hidrogênio (H2O2 - QM)

na concentração de 200 mM.

Para quantificar a produção de ERO, foi medida a fluorescência do reagente Diacetato de

Dihidrodiclorofluoresceína (CM-H2DCF-DA - Sigma). Alíquotas de 0,2 mL das culturas

contendo, aproximadamente, 106 células foram tratadas com 10 µL de CM-H2DCF-DA

solubilizado em 8,65 µL de DMSO (Merck), com concentração final de 10 µM, e incubadas por

30 min a 28ºC. Em seguida, foram lavadas com 0,2 mL de tampão PBS e transferidas para placas

de 96 poços. A fluorescência foi detectada em 485/530 nm de excitação/emissão usando um leitor

de microplacas (Victor3, PerkinElmer) e plotada a média dos resultados (mais ou menos o erro

padrão) em gráficos de Absorbância x Tempo (0, 1, 2, 4 e 24 h).

O reagente CM-H2DCF-DA não fluorescente é um éster lipofílico que se difunde

facilmente pela membrana plasmática. No citosol é clivado por esterases inespecíficas, gerando a

molécula H2DCF. A oxidação do H2DCF gera o fluoróforo DCF que emite fluorescência quando

67

excitado com luz azul (535 nm). Assim, podem-se inferir os níveis de ERO a partir da correlação

com a quantidade de fluorescência emitida em cada tratamento (KARLSSON et al., 2010).

O incremento de geração de ERO foi calculado pela razão:

Incremento de geração de ERO = Geração de ERO tratado

Geração de ERO controle

4.2.11. Obtenção de formulações para proteção solar e teste parâmetros de

fotoproteção in vitro pelo método Labsphere®

Foram desenvolvidas formulações compostas por duas fases, uma aquosa e uma oleosa,

que continha basicamente filtros solares orgânicos com agentes emulsificantes que promovem a

interação dessas fases, de acordo com o Quadro 9. Nestas emulsões foram incorporados os ativos

fotoprotetores desenvolvidos em diferentes concentrações. Assim, as duas fases foram aquecidas

até solubilização total dos componentes e quando se atingiu a mesma temperatura,

aproximadamente 70ºC, a fase oleosa foi incorporada rapidamente sobre a fase aquosa, sob

agitação até completa emulsificação.

O teste de FPS in vitro por espectrofotometria por transmitância com esfera de integração

foi realizado em equipamento Labsphere® UV-2000S com uso de suportes de 25 cm² de quartzo

com fita Transpore™ de mesma área, aderida a uma das superfícies, sobre a qual as formulações

foram depositadas e uniformemente espalhadas, com aplicação de 2 mg/cm2 de cada formulação.

Em seguida, o espalhamento foi realizado com dedeira de látex, em movimentos padronizados até

obter uma camada uniforme. Após 15 min, ao abrigo da luz, as amostras em triplicata foram lidas

no equipamento. Foram calculados a média do FPS e o desvio padrão para cada formulação para

fotoproteção obtida.

68

Quadro 9. Componentes das formulações para proteção solar utilizados em diferentes

concentrações.

Filtros inorgânicos

TiO2

MMT-Na

Nanossistema (NS)

Fase oleosa

Dietilamino hidroxibenzoil hexilbenzoato (DHHB - BASF)

Octilmetoxicinamato (OMC - Sarfam)

Octocrileno (OC - Sarfam)

Polissorbato (Tween 80 - Merck)

Fase aquosa

Conservante (Conserv NE® - Biovital)

Silicone volátil (Pharma Special)

Aristoflex (Pharma Special)

Água destilada q.s.p.

4.2.12. Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism version 6.00

para Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com. Foram

adotados os testes não-paramétricos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis (seguido pelo teste Dunn's

multiple comparisons) para demonstrar as diferenças estatísticas (p < 0,05).

http://www.graphpad.com/

69

5. RESULTADOS

5.1. AVALIAÇÃO DO TAMANHO DE PARTÍCULA DE FILTROS SOLARES

INORGÂNICOS (TiO2 OU ZnO) POR DLS

A determinação da distribuição do tamanho de partícula de diferentes filtros solares

inorgânicos foi realizada e, para evitar a aglomeração do material, a dispersão foi submetida ao

ultrassom por 60 min e adicionou-se o tensoativo Tween 80, em triplicata. As Figuras 12, 13, 14

e 15 apresentam a distribuição de tamanho de partícula diferentes amostras de TiO2 e ZnO.

Para a amostra de TiO2 (Sigma) o tamanho médio de partícula encontrado foi de 195,1 nm

(Figura 12) e para amostra de TiO2 (Eusolex T - Merck) o tamanho médio de partícula

encontrado foi 452,1 nm (Figura 13). Já para a amostra de ZnO (Sigma) o tamanho médio de

partícula encontrado foi de 338,4 nm (Figura 13) e para amostra de ZnO (Vetec) o tamanho

médio de partícula encontrado foi 570,3 nm (Figura 14). Todas as análises apresentaram índice

de polidispersão (PdI) menor ou igual a 0,3.

Figura 12. Tamanho médio de partícula da amostra TiO2 (Sigma).

70

Figura 13. Tamanho médio de partícula da amostra TiO2 (Eusolex T - Merck).

Figura 14. Tamanho médio de partícula da amostra ZnO (Sigma).

71

Figura 15. Tamanho médio de partícula da amostra ZnO (Vetec).

5.2. PREPARO DE NANOSSISTEMAS PARA FOTOPROTEÇÃO USANDO SILICATOS

MINERAIS E ATIVOS FOTOPROTETORES POR MEIO DA QUÍMICA DE

INTERCALAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO POR DRX

Os padrões de difração dos produtos das reações entre MMT-Na mais diferentes amostras

de TiO2 ou ZnO, misturas físicas (MF), MMT-Na, TiO2 e ZnO isolados foram agrupados e são

mostrados nas Figuras 16, 17, 18 e 19. O padrão de DRX da MMT-Na possibilita a avaliação

comparativa dos ângulos 2 θ referentes ao pico d001 (distância entre as folhas lamelares em Å).

Aplicou-se a Lei de Bragg e obtiveram-se as distâncias interlamelares das amostras analisadas e

os valores estão mostrados nos gráficos.

De acordo com a Figura 16, os valores do ângulo 2 θ referentes ao pico d001 da MMT-Na

e da mistura física MMT-Na mais TiO2 (Sigma) são semelhantes e equivalem ao espaçamento

basal de 13,15 Å e 13,31 Å, respectivamente. Para o NS obtido por meio da reação MMT-Na

mais TiO2 (Sigma), é possível observar o desaparecimento do pico basal (d001) no intervalo de 2 θ

entre 2 e 20°, evidenciado pelo aumento de d001 e consequentemente do espaçamento interlamelar

da MMT-Na, sugerindo que houve intercalação da MMT-Na pelo TiO2 (Sigma), resultado

reproduzido descrito por Paiva e col. (2014).

72

Figura 16. Padrões de difração da MMT-Na, mistura física, produto da reação de intercalação

MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e TiO2 (Sigma) em intervalo de 2 θ entre 2 e 20º.

De acordo com as Figura 17, 18, 19 os valores do ângulo 2 θ referentes ao pico basal d001

da MMT-Na mantiveram-se constantes e equivalem ao espaçamento basal médio de 13,55 Å.

Ao se comparar todas as misturas físicas com seus respectivos produtos de reações entre

MMT-Na, TiO2 (Merck), ZnO (Sigma) e ZnO (Vetec), não foram observadas alterações

significativas nos valores do ângulo 2 θ, o que indica que processo reacional não promoveu

alteração do espaçamento interlamelar da argila, ou seja, não houve formação de novos

nanossistemas e/ou esfoliação da MMT-Na por estes filtros inorgânicos. Cabe ressaltar que, para

fins comparativos, todos os filtros físicos foram processados em ultrassom por 60 min a 60 W de

potência.

73


MMT-Na mais TiO2 (Merck) e TiO2 (Merck) em intervalo de 2 θ entre 2 e 20º.


MMT-Na mais ZnO (Sigma) e ZnO (Sigma) em intervalo de 2 θ entre 2 e 20º.

74


MMT-Na mais ZnO (Vetec) e ZnO (Vetec) em intervalo de 2 θ entre 2 e 20º.

5.3. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE EM CEPAS SELVAGEM FF18733 E

MUTANTE CD138 (ogg1) DE S. cerevisiae DE NANOSSISTEMAS E ATIVOS

FOTOPROTETORES

Foram realizados testes usando-se os filtros inorgânicos isolados, as MF e somente o NS

formado pela reação entre MMT-Na mais TiO2 (Sigma), uma vez que não houve formação de NS

após reação entre MMT-Na, TiO2 (Merck), ZnO (Sigma) e ZnO (Vetec).

Inicialmente, foi verificada a citotoxicidade das amostras testadas nas cepas selvagem

FF18733 e mutante CD138 (ogg1), quando não irradiadas com UVB ou LSS, por meio da fração

de sobrevivência (N/N0) das cepas. A concentração de cada substância testada (individualmente

ou em associação) em todos os experimentos foi de 100 µg/mL em água estéril sob agitação,

sendo esta previamente estabelecida por Pinto e col. (2010), uma vez que não sofre precipitação

durante o tempo de tratamento e não altera a viabilidade celular e/ou a mutagênese das cepas,

quando não irradiadas (PINTO et al., 2010; PAIVA et al., 2014).

Como pode ser observado na Figura 20, ambas as cepas não foram sensíveis aos filtros

TiO2 (Sigma), TiO2 (Merck) e MMT-Na, sendo estes, portanto, não tóxicos para a levedura, uma

75

vez que esta manteve a fração de sobrevivência semelhante ao controle durante as 6 h de

tratamento (p > 0,05). Porém, os filtros ZnO (Sigma) e ZnO (Vetec) apresentaram perfil

citotóxicos para ambas as cepas, evidenciado pela diminuição da fração de sobrevivência, sendo

para cepa selvagem FF18733 após 1 h de tratamento e para cepa mutante CD138 (ogg1) após 2 h

de tratamento, quando comparados ao controle (p < 0,05).

Em seguida, foi feita a mesma análise agora associando os filtros físicos TiO2 e ZnO. De

acordo com a Figura 21, as cepas foram sensíveis ao tratamento combinado de TiO2 mais ZnO,

sendo estes tóxicos para a levedura, uma vez que houve diminuição da fração de sobrevivência

para as duas cepas após 1 h de tratamento, quando comparado ao controle (p < 0,05).

Em seguida, foram feitos testes para análise da citotoxicidade em levedura com a MF e o

NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) obtido por Paiva e col. (2014), assim como as

associações entre MMT-Na e ZnO. De acordo com a Figura 22, as cepas não foram sensíveis ao

tratamento com MF e o NS formado por MMT-Na mais TiO2 ou ZnO, sendo estes, portanto, não

tóxicos para a levedura, uma vez que não houve diminuição da fração de sobrevivência durante

as 6 h de tratamento, quando comparado ao controle (p > 0,05). Sugere-se, portanto, que a MMT-

Na foi capaz de neutralizar a toxicidade do ZnO, evidenciado pela diminuição da fração de

sobrevivência, quando comparados ao controle, como demonstrado anteriormente na Figura 20.

Finalmente, foram feitos testes para análise da citotoxicidade em levedura com a

associação entre os três filtros físicos MMT-Na mais TiO2 e ZnO. De acordo com a Figura 23, as

cepas não foram sensíveis ao tratamento combinado com MMT-Na mais TiO2 e ZnO, sendo

estes, portanto, não tóxicos para a levedura, uma vez que não houve diminuição da fração de

sobrevivência durante as 6 h de tratamento, quando comparado ao controle (p > 0,05). Ainda,

sugere-se que a MMT-Na foi capaz de neutralizar a toxicidade do ZnO mais TiO2, evidenciado

pela diminuição da fração de sobrevivência, quando comparados ao controle, como demonstrado

anteriormente na Figura 21.

76

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

çã

o d

e S

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1

1) FF18733 (Controle)

2) TiO2 (Sigma)

3) TiO2 (Merck)

4) ZnO (Sigma)

5) ZnO (Vetec)

6) MMT-Na

Citotoxicidade da cepa selvagem FF18733 após diferentes tratamentos

A

*

* *

* *

*

*

* *

* *

*

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

çã

o d

e S

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1

1) CD138 (Controle)

2) TiO2 (Sigma)

3) TiO2 (Merck)

4) ZnO (Sigma)

5) ZnO (Vetec)

6) MMT-Na

Citotoxicidade da cepa CD138 (ogg1) após diferentes tratamentos

B

* *

* *

*

* * *

* *

Figura 20. Fração de sobrevivência (N/N0) das cepas (A) selvagem FF18733 e (B) mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com 100 µg/mL dos filtros solares físicos

isolados durante tratamento de 6 h sem irradiação. Estes resultados representam a média ± erro

padrão de 3 experimentos independentes. * apresentou diferença estatística com relação ao

controle (p < 0,05).

77

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

çã

o d

e S

obre

viv

ên

cia

(N

/N0)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1


2) TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma)

3) TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec)


A

* *

*

*

*

*

*

* *

* * *

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

ção d

e S

obre

viv

ência

(N

/N0)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1

1) CD138 (Controle)




B

*

* *

* *

*

*

*

*

*

*

*


CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com 100 µg/mL dos filtros solares físicos em

associação durante tratamento de 6 h sem irradiação. Estes resultados representam a média ± erro

padrão de 3 experimentos independentes. * apresentou diferença estatística com relação ao


78

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

ção d

e S

obre

viv

ência

(N

/N0)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1


2) MMT-Na + TiO2 (Sigma)

3) NS (MMT-Na + TiO2 (Sigma))

4) MMT-Na + TiO2 (Merck)

5) MMT-Na + ZnO (Sigma)

6) MMT-Na + ZnO (Vetec)


A

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

ção

de

Sobre

viv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1

1) CD138 (Controle)







B




padrão de 3 experimentos independentes. Os tratamentos não apresentaram diferença estatística

com relação ao controle (p > 0,05).

79

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

ção d

e S

obre

viv

ência

(N

/N0)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1


2) MMT-Na + TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma)

3) MMT-Na + TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec)


A

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5 6

Fra

çã

o d

e S

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-2

1e-1

1e+0

1e+1

1) CD138 (Controle)

2) MMT-Na + TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma)



B




padrão de 3 experimentos independentes. Os tratamentos não apresentaram diferença estatística

com relação ao controle (p > 0,05).

80

Esta etapa de controle no escuro é fundamental para avaliar se as substâncias testadas

possuem potencial citotóxico para as cepas de S. cerevisiae, na ausência de qualquer interação

com radiação UV, evitando que tal propriedade seja atribuída erroneamente à possível

fotoinstabilidade do composto.

Assim, em seguida, foram determinadas as condições de irradiação para determinar a

eficácia e inocuidade de fotoproteção dos filtros solares físicos em levedura S. cerevisiae.

5.4. DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DE IRRADIAÇÃO ARTIFICIAL COM

UVB E LSS E COMPARAÇÃO COM AS MEDIDAS AMBIENTAIS

Os resultados descritos foram publicados por RURR et al., 2019 e DINIZ et al., 2019.

Inicialmente, foi estabelecida a taxa de dose de UVB de 15 J/m2/s, atingindo, então, a

dose final acumulada de 30 kJ/m2 ao final dos tratamentos (PINTO et al., 2010; PAIVA et al.,

2014; DINIZ et al., 2019). Como exemplo, se uma pessoa se expõe diretamente ao sol de 11 h às

12 h no verão, ela terá recebido uma taxa de dose média de UVB de 7,86 J/m2/s e, após 60 min

(ou 3600 s) de exposição, a dose final acumulada será de, aproximadamente, 29 kJ/m2 de UVB,

ratificando a taxa de dose escolhida para realização dos experimentos.

Em seguida, foi estabelecida a taxa de dose de UVB e UVA que constaria o tratamento

com LSS. A taxa de dose de UVB utilizada para os experimentos foi igual a 1,2 J/m2/s, atingindo,

então, a dose final acumulada de 10 kJ/m2 ao final do tratamento. Já a taxa de dose de UVA

utilizada para os experimentos foi igual a 20 J/m2/s, atingindo, então, a dose final acumulada de

166,64 kJ/m2 ao final do tratamento (RURR et al., 2019; DINIZ et al., 2019; SILVA et al., 2019).

Como exemplo, se uma pessoa se expõe diretamente ao sol de 12:30 h às 13 h no verão, ela terá

recebido uma taxa de dose média de UVB de 6,9 J/m2/s e taxa de dose média de UVA de 92,87

J/m2/s. Assim, após 30 min (ou 1800 s) de exposição ao sol, a dose final acumulada será de,

aproximadamente, 12,4 kJ/m2 de UVB e 167 kJ/m2, ratificando a taxas de dose de UVA e UVB

escolhidas para realização dos experimentos.

O Quadro 10 e a Figura 24 foram montados a fim de quantificar as doses de UVB e UVA

emitidas pelo sol em um dia de verão intenso e sem nuvens na cidade do Rio de Janeiro/RJ.

81

Quadro 10. Dados referentes às condições ambientais de variação de temperatura e doses de

radiação solar UVA e UVB em um dia de verão na cidade do Rio de Janeiro/RJ (adaptado de

RURR et al., 2019; DINIZ et al., 2019).

Hora Temperatura

Ambiente (°C) UVB (J/m2) UVA (J/m2)

8:00

8:30

9:00

9:30

10:00

10:30

11:00

11:30

12:00

12:30

13:00

13:30

14:00

14:30

15:00

15:30

16:00

16:30

17:00

25,0

28,0

33,0

33,0

33,0

34,0

36,0

36,0

38,0

39,0

40,0

41,0

41,0

40,0

40,0

40,0

40,0

39,0

34,0

1,25

1,93

2,90

4,80

6,35

7,80

7,50

8,15

5,93

8,20

5,60

4,00

2,90

1,71

1,50

1,20

0,80

0,51

0,24

23,00

32,00

45,00

61,00

98,00

96,60

89,16

104,02

96,60

104,02

81,73

74,30

52,00

42,00

37,00

33,00

24,00

16,00

6,50

82

Figura 24. Representação gráfica das condições ambientais de variação da emissão solar de

UVA e UVB que atinge a cidade do Rio de Janeiro/RJ em um dia de verão durante 9 h de

experimento (adaptado de RURR et al., 2019).

5.5. AVALIAÇÃO DA SOBREVIVÊNCIA CELULAR E MUTAGÊNESE ESPONTÂNEA

E INDUZIDA DE CEPAS SELVAGEM FF18733 E MUTANTE CD138 (ogg1) DE S.

cerevisiae, APÓS TRATAMENTO COM NANOSSISTEMAS E ATIVOS

FOTOPROTETORES, SOB RADIAÇÃO UVB OU LSS

Resultados descritos foram publicados por SILVA et al., 2019 e DINIZ et al., 2019.

5.5.1. Uso da cepa mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae

Inicialmente, foi utilizada cepa mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, uma vez que esta

possui alta taxa de mutagênese espontânea e é mais sensível a lesões oxidativas, devido à

ausência da proteína Ogg1, responsável por remover lesões 8-oxoG do DNA causadas após

radiação UV. A cepa CD138 serve, portanto, como bioindicador para fotoproteção, uma vez que

se pode quantificar o incremento de fotoproteção pelo aumento da fração de sobrevivência

(N/N0), além da redução ou aumento da frequência de mutantes CanR, pela mutagênese induzida

por diferentes tratamentos comparados ao controle (PINTO et al., 2010; PAIVA et al., 2014).

83

5.5.1.1.Avaliação da sobrevivência celular e mutagênese induzida da cepa mutante

CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após radiação UVB

Para análise da sobrevivência celular, foi calculada a fração de sobrevivência (N/N0),

sendo N0 o número inicial de células no início do tratamento e N o número de células obtido

após radiação UVB mais os filtros solares inorgânicos e suas associações. Quanto maior a fração

de sobrevivência, menores são os efeitos fototóxicos destes filtros às cepas quando irradiadas,

indicando, portanto, maior eficácia de fotoproteção.

Para análise da mutagênese induzida das cepas, foi calculado o número de mutantes CanR

em 107 células em 1 mL, após radiação UVB mais os filtros solares inorgânicos e suas

associações, somente na DL37. Quanto menor a mutagênese induzida na DL37, menores são os

efeitos fotogenotóxicos destes filtros às cepas quando irradiadas, indicando, portanto, maior

segurança de fotoproteção.

Foi utilizada fonte de radiação UVB, uma vez que este é o agente físico descrito como o

maior carcinógeno ambiental. A concentração de cada substância testada, individualmente ou em

associação, foi de 100 µg/mL em água estéril sob agitação, previamente estabelecida por Pinto e

col. (2010). Considera-se como potencial ativo fotoprotetor o filtro UV capaz de,

simultaneamente, aumentar a dose da DL37 de UVB e reduzir mutagênese induzida na DL37. Ou

seja, a triagem para moléculas fotoprotetoras usando modelo de levedura se dá em nível de

eficácia e segurança de fotoproteção, concomitantemente.

Inicialmente, os filtros solares físicos testados foram o TiO2 e o ZnO e a MMT-Na. De

acordo com o apresentado na Figura 25 e Tabela 1, a fração de sobrevivência somente da cepa

mutante CD138 (ogg1) controle irradiada com UVB é muito baixa, indicando morte celular de,

aproximadamente, 70% logo no inicio do tratamento com DL37 de 10 kJ/m2. Além disso, a

mutagênese induzida pela radiação UVB é muito elevada, em relação à mutagênese espontânea,

sendo este agente físico letal e genotóxico para a S. cerevisiae.

O TiO2 (Sigma) aumentou a fração de sobrevivência celular para doses maiores do que 15

kJ/m2 de UVB, quando comparado ao controle (p < 0,05), porém sugere-se que seja responsável

por gerar ERO no meio e, consequentemente, aumentar a mutagênese induzida na DL37 (p <

0,05), ou seja, sua eficácia como fotoprotetor é alta, porém este não é inócuo à célula em termos

genotóxicos. O TiO2 (Merck) aumentou a fração de sobrevivência celular, principalmente em

84

altas doses de UVB (acima de 25 kJ/m2) quando comparado ao controle (p < 0,05), e diminuiu a

mutagênese induzida na DL37, sendo mais seguro em termos de fotoproteção, quando comparado

ao controle (p < 0,05), porém com menor DL37. Ou seja, a maior sobrevivência celular está

atrelada ao maior número de mutantes gerados. Cabe ressaltar que o TiO2 (Sigma) possui menor

tamanho de partícula que o TiO2 (Merck), por tanto, maior superfície de contato, sendo capaz de

refletir de forma mais eficaz a radiação UVB (evidenciado pela maior fração de sobrevivência),

aumentando, porém, o incremento relativo de mutagênese, devido a sua maior reatividade.

Com o ZnO (Sigma) não houve diferença estatisticamente significativa em comparação ao

controle tanto para a fração de sobrevivência quanto para a mutagênese induzida por UVB (p >

0,05). Já o ZnO (Vetec), apesar de apresentar efeito antimutagênico quando comparado ao

controle (p < 0,05), não aumentou a fração de sobrevivência celular que se manteve igual ao

controle em todas as doses de UVB (p > 0,05).

A MMT-Na também foi utilizada como possível filtro físico em formulações para

proteção solar e foi capaz de aumentar a fração de sobrevivência da cepa CD138 em altas doses

de UVB (acima de 25 kJ/m2) (p < 0,05), porém aumentou ainda mais mutagênese induzida na

DL37, sendo também considerada genotóxica para a levedura, quando comparada ao controle (p <

0,05). Resultado semelhante ao descrito por Paiva e col. (2014).

85

Dose UVB (kJ/m2

)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

çã

o d

e S

obre

viv

ên

cia

(N

/N0)

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0

1) CD138 (Controle)

2) TiO2 (Sigma)

3) TiO2 (Merck)

4) ZnO (Sigma)

5) ZnO (Vetec)

6) MMT-Na

Sobrevivência celular da cepa CD138 (ogg1) após radiação UVB e diferentes tratamentos

*

*

*

**

*

* *

Figura 25. Fração de sobrevivência (N/N0) da cepa mutante CD138 (ogg1) após tratamento com

UVB e 100 µg/mL dos filtros solares físicos. Estes resultados representam a média ± erro padrão

de no mínimo 3 experimentos independentes. * apresentou diferença estatística com relação ao


Tabela 1. Valores de DL37 (kJ/m2) e mutagênese induzida na DL37 da cepa mutante CD138

(ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL dos filtros solares físicos. Estes

resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos independentes. *

apresentou diferença estatística com relação ao controle (p < 0,05).

Tratamento DL37 de UVB (kJ/m2) Mutagênese induzida na DL37

CD138 (Controle) 10 3742 ± 400

TiO2 (Sigma) 15* 4924 ± 589*

TiO2 (Merck) 5 1873 ± 303*

ZnO (Sigma) 10 2453 ± 343

ZnO (Vetec) 10 1268 ± 249*

MMT-Na 10 6202 ± 478*

Em seguida, foram analisadas diferentes misturas físicas de TiO2 mais ZnO. Como visto

na Figura 26 e Tabela 2, ambas as misturas apresentaram aumento da fração de sobrevivência em

86

doses acima de 15 kJ/m2 de UVB quando comparadas ao controle (p < 0,05). Como são filtros

físicos, são capazes de refletir a radiação UVB de forma mais eficaz, porém, ambos os

tratamentos foram genotóxicos, quando comparadas ao controle (p < 0,05), indicando que o ZnO

potencializa o efeito oxidativo para a cepa CD138 descrito para o TiO2 após irradiação UVB

(PINTO et al., 2010; PAIVA et al., 2014). Além disso, a associação de TiO2 mais ZnO se

mostrou citotóxico para a S. cerevisiae na ausência de irradiação UVB, como descrito

anteriormente (Figura 20).

Dose (kJ/m2

)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

çã

o d

e s

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0

1) CD138 (Controle)




*

* * *

*

*

*

*


UVB e 100 µg/mL da associação de TiO2 mais ZnO. Estes resultados representam a média ± erro

padrão de no mínimo 3 experimentos independentes. * apresentou diferença estatística com

relação ao controle (p < 0,05).

87


(ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de TiO2 mais ZnO.

Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos independentes.

* apresentou diferença estatística com relação ao controle (p < 0,05).

Tratamento DL37 de UVB

(kJ/m2) Mutagênese induzida na DL37

CD138 (Controle) 10 3742 ± 400

TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma) 15* 5350 ± 640*

TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec) 20* 5262 ± 466*

Em seguida, a cepa CD138 foi tratada com associações entre MMT-Na mais TiO2 ou

ZnO, em MF ou NS, a fim de se avaliar a possível aditividade destas suas substâncias a serem

utilizadas em formulações para proteção solar.

De acordo com a Figura 27 e Tabela 3, com a MF de MMT-Na mais TiO2 (Sigma) houve

aumento na fração de sobrevivência em comparação ao controle para doses maiores que 10 kJ/m2

de UVB (p < 0,05), assim como grande diminuição da mutagênese induzida por UVB (menor que

a metade da frequência de mutação do controle, p < 0,05), sendo esta combinação sinérgica em

termos de proteção contra genotoxicidade e muito promissora em termos de eficácia de

fotoproteção, uma vez que os efeitos da mistura são cinéticos.

Na presença do NS de MMT-Na mais TiO2 (Sigma) houve aumento da resistência ao

UVB para doses acima de 15 kJ/m2 de UVB quando comparado ao controle (p < 0,05). Ainda, a

mutagênese das leveduras tratadas com o NS foi reduzida drasticamente, superando a proteção

contra os efeitos mutagênicos da radiação UVB observada nas leveduras tratadas com a MF de

MMT-Na mais TiO2 (Sigma) quando comparado ao controle (p < 0,05). Sugere-se que o NS

obtido a partir da reação entre a MMT-Na e o TiO2 (Sigma) é promissor para a prevenção de

danos causados pela radiação UVB, ratificando os resultados obtidos por Paiva e col. (2014).

Já a MF de MMT-Na mais TiO2 (Merck) foi capaz de proteger as células de morte celular

em altas doses de UVB, quando comparado ao controle (p < 0,05, acima de 25 kJ/m2), e não

alterou a frequência de mutantes CanR obtidos após radiação UVB, quando comparado ao

controle (p > 0,05). Com a MF de MMT-Na mais ZnO (Sigma), mesmo com aumento da fração

de sobrevivência em altas doses de UVB, quando comparado ao controle (p < 0,05 em 30 kJ/m2),

não houve diminuição da frequência de mutantes CanR (p > 0,05), quando comparado ao

88

controle. Com o uso da MF de MMT-Na mais ZnO (Vetec), não houve aumento na eficácia de

proteção (p > 0,05) e a radiação UVB potencializou os efeitos fototóxicos do ZnO (Vetec) ao

aumentar a mutagênese induzida (p < 0,05), quando comparado ao controle. Portanto, estes

tratamentos não foram eficazes e/ou seguros em termos de fotoproteção, não sendo indicado para

o uso nestas condições.

Dose UVB (kJ/m2)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

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ên

cia

(N

/N0

)

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0

1) CD138 (Controle)







*

**

*

*

*

*

*

*

*

*

**


UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 ou ZnO. Estes resultados representam a

média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos independentes. * apresentou diferença

estatística com relação ao controle (p < 0,05).

89


(ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais

TiO2 ou ZnO. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos

independentes. * apresentou diferença estatística com relação ao controle (p < 0,05).



CD138 (Controle) 10 3742 ± 400

MMT-Na + TiO2 (Sigma) 25* 1468 ± 94*

NS (MMT-Na + TiO2 (Sigma)) 15* 630 ± 152*

MMT-Na + TiO2 (Merck) 10 2795 ± 110

MMT-Na + ZnO (Sigma) 10 3532 ± 596

MMT-Na + ZnO (Vetec) 10 6697 ± 469*

Dos tratamentos apresentados na Tabela 3, tanto a MF como o NS formados por MMT-

Na mais TiO2 (Sigma) podem ser considerados como potenciais ativos para fotoproteção, uma

vez que apresentaram efeito cinético em relação à eficácia e inocuidade em termos de

fotoproteção, sendo capazes de, simultaneamente, aumentar a DL37 e reduzir a mutagênese

induzida na DL37, corroborando os resultados obtidos por Paiva e col. (2014).

Cabe ressaltar que o TiO2 da marca Sigma possui menor tamanho de partícula que o da

marca Merck, por tanto, maior superfície de contato, sendo capaz de refletir de forma mais eficaz

a radiação UVB (evidenciado pela maior fração de sobrevivência), porém neste caso, a MMT-Na

neutralizou a reatividade do TiO2, diminuindo a mutagênese induzida por UVB mais MF ou NS.

Em seguida, foram analisadas a MF de MMT-Na mais TiO2 e ZnO. De acordo com a

Figura 28 e Tabela 4, a MF de MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e ZnO (Sigma) aumentou a tanto a

fração de sobrevivência da cepa CD138 frente à radiação UVB (p < 0,05, acima de 15 kJ/m2 de

UVB) quanto a mutagênese induzida (p > 0,05), quando comparado ao controle, evidenciando o

efeito tóxico da mistura após radiação UVB.

Ao misturar MMT-Na mais TiO2 (Merck) e ZnO (Vetec) não houve variação na fração de

sobrevivência quando comparado ao controle (p > 0,05), possivelmente devido à formação de

grumos na dispersão de filtros durante o tratamento, devido ao elevado tamanho de partícula, e a

frequência de mutantes CanR aumentou (p < 0,05), quando comparado ao controle. Estes

resultados ratificam o efeito tóxico do ZnO encontrado nos ensaios de citotoxicidade no escuro,

90

indicando, assim, possível aumento na formação de ERO após uso da radiação UVB. Neste caso,

a MMT-Na não foi capaz de neutralizar o efeito fotocatalítico do ZnO ao ser irradiado com UVB.

Dose UVB (kJ/m2)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

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(N

/N0

)

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0

1) CD138 (Controle)

2) MMT-Na +TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma)



*

*

*

*


UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 e ZnO. Estes resultados representam a




(ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais

TiO2 e ZnO. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos



(kJ/m2)

Mutagênese induzida

na DL37

CD138 (Controle) 10 3742 ± 400

MMT-Na + TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma) 15* 4273 ± 411

MMT-Na + TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec) 5 5040 ± 130*

91

5.5.1.2.Avaliação da sobrevivência celular e mutagênese induzida da cepa mutante

CD138 (oog1) de S. cerevisiae após uso de LSS

Em seguida, a fim de mimetizar as condições ambientais foi utilizado o aparato Simulador

Solar que emite LSS e diferentes comprimentos de onda correspondentes ao UVB, UVA, IV e

VIS. Foram utilizadas as associações de filtros solares inorgânicos que produziram melhor

resposta em relação ao UVB, de acordo com Figuras 25-28 e Tabelas 1-4, sendo estes a MF e o

NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e a cepa mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae,

com o objetivo de avaliar os efeitos de fotoproteção e genotoxicidade destas associações de

filtros após irradiação com LSS.

De acordo com o apresentado na Figura 29, a fração de sobrevivência somente da cepa

CD138 controle irradiada com LSS é baixa, com morte celular elevada após 55 min de

tratamento (DL37 de 4 kJ/m2 de UVB e 66,7 kJ/m2 de UVA). Portando, é evidenciado o efeito

sinérgico letal quando associados os diferentes comprimentos de onda emitidos pela LSS, uma

vez que a DL37 para cepa mutante CD138 quando irradiada somente com UVB é de 10 kJ/m2, ou

seja, 2,5 vezes maior.

Além disso, a mutagênese induzida pela LSS é muito elevada, uma vez que para gerar

aproximadamente o mesmo número de mutantes CanR foi necessária uma dose 2,5 vezes menor

de UVB, quando comparado ao tratamento isolado em 312 nm. Evidenciando também efeito

fotomutagênico da LSS, devido principalmente aos fótons emitidos pelo comprimento de onda

correspondente ao UVA, capazes de gerar majoritariamente lesões indiretas (mediadas por ERO)

no DNA, sendo este, portanto, caracterizado como agente físico genotóxico para a S. cerevisiae.

Tanto a MF como o NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) aumentaram a fração

de sobrevivência celular após 55 min de tratamento (DL37 de 4 kJ/m2 de UVB e 66,7 kJ/m2 de

UVA), quando comparados ao controle (p < 0,05), apresentando, portanto, elevada eficácia de

fotoproteção. Ainda, se mostraram antifotomutagênicos para a cepa CD138, quando comparada

ao controle (p < 0,05).

92

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120 140

Fra

çã

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(N

/N0

)

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0

1) CD138 (Controle)


3) NS (MMT + TiO2 (Sigma))

Sobrevivência celular da cepa CD138 (ogg1) após LSS e diferentes tratamentos

*

* * *

*

* *

*


LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma). Estes resultados

representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos independentes. * apresentou

diferença estatística com relação ao controle (p < 0,05).

A Tabela 5 compara os valores de DL37 (kJ/m2), mutagênese induzida na DL37 e

incremento de mutagênese da cepa mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae após tratamento com

UVB ou LSS.

De acordo com a Tabela 5, quando se irradia somente com LSS é necessário dose de UVB

inferior para se atingir a DL37 quando comparado ao tratamento somente com UVB,

corroborando o efeito sinérgico e letal e mutagênico do UVA presente na LSS.

Os resultados obtidos, ao se comparar o incremento de mutagênese da associação MMT-

Na mais TiO2 (Sigma), indicam que a MF e o NS foram mais vantajosos para levedura quando

comparados ao controle, uma vez que diminuíram o potencial fotogenotóxico da radiação UVB e

LSS, portanto são promissores no desenvolvimento de novos ativos para proteção solar.

93

Tabela 5. Comparação entre os valores de DL37 (kJ/m2), mutagênese induzida na DL37 e

diminuição do incremento de fotomutagênese da cepa mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae

após tratamento com UVB ou LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2

(Sigma). Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos


Tratamento

DL37 de

UVB

(kJ/m2)

Mutagênese

induzida na

DL37 de

UVB

Incremento de

fotomutagênese

DL37 de

UVB

(kJ/m2)

com

LSS

Mutagênese

induzida na

DL37 de

UVB com

LSS

Incremento de

fotomutagênese

CD138

(Controle) 10 3742 ± 400 1,0 4 3187 ± 278 1,0

MMT-Na +

TiO2

(Sigma)

25* 1468 ± 94* 0,4 5* 1388 ±

124* 0,4

NS (MMT-

Na + TiO2

(Sigma))

15* 630 ± 152* 0,15 5* 1554 ±

132* 0,5

5.5.2. Uso da cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae

Em seguida, foi utilizada cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae para análise dos danos

causados após radiação UV e diferentes tratamentos. Uma vez que as amostras testadas são

eficazes e inócuas em uma cepa deficiente no mecanismo de reparo BER, é necessário avaliar se,

em células proficientes em todos os mecanismos de reparo do DNA, estas substâncias poderão

ser consideradas bons fotoprotetores ou se o perfil genotóxico de alguns filtros solares

inorgânicos é confirmado. Ainda, é necessário avaliar se a cepa selvagem FF18733, assim como

o mutante CD138, pode ser utilizada como bioindicador em testes in vitro para análise da eficácia

e segurança de candidatos a novos fotoprotetores ou substâncias já utilizadas em formulações

para fotoproteção, uma vez que a mutagênese, às vezes, para ocorrer, depende de mecanismos de

reparo de DNA funcionantes.

94

5.5.2.1.Avaliação da sobrevivência celular e mutagênese induzida da cepa selvagem

FF18733 de S. cerevisiae após radiação UVB

Da mesma forma, para a análise da sobrevivência celular, foi calculada a fração de

sobrevivência (N/N0), após radiação UVB mais os filtros solares inorgânicos e suas associações.

Quanto maior a fração de sobrevivência, menores são os efeitos fototóxicos destes filtros às cepas

quando irradiadas, indicando, portanto, maior eficácia de fotoproteção.

Para a análise da mutagênese induzida, foi calculado o número de mutantes CanR, após

irradiação UVB mais os filtros solares inorgânicos e suas associações, somente na DL37. Quanto

menor a mutagênese induzida, menores são os efeitos genotóxicos destes filtros à cepa quando

irradiada, indicando, portanto, maior segurança de fotoproteção. A concentração de cada

substância testada, individualmente ou em associação, foi de 100 µg/mL em água estéril sob

agitação, previamente estabelecida por Pinto e col. (2010).

Inicialmente, os filtros solares físicos testados foram o TiO2 e o ZnO e a MMT-Na. De

acordo com o apresentado na Figura 30 e Tabela 6, a fração de sobrevivência somente da cepa

FF18733 controle irradiada com UVB é muito baixa, indicando morte celular de mais de 70% da

população logo no inicio do tratamento com dose de 5 kJ/m2. Além disso, a mutagênese induzida

pela radiação UVB, indicou que este agente físico é letal e genotóxico para a cepa selvagem S.

cerevisiae.

Ao se comparar as cepas selvagem FF18733 (5 kJ/m2) e mutante CD138 (ogg1) (10

kJ/m2), a DL37 da selvagem é 2 vezes menor, o que indica maior letalidade do UVB para esta

cepa. Isto ocorre uma vez que, com o aumento de lesões induzidas no DNA pelo UVB, a célula

proficiente em todos os mecanismos de reparo, ou seja, com o reparo ativo de Ogg1, há aumento

da toxicidade celular após radiação UVB, pois a lesão 8-oxoG no DNA pode ser menos tóxica (e

mais mutagênica) do que as quebras de DNA introduzidas pela proteína Ogg1 na etapa inicial de

reparo da remoção de 8-oxoG (PINTO et al., 2010).

Quando o TiO2 (Sigma) foi usado, houve aumento considerável da fração de

sobrevivência celular, em doses acima de 5 kJ/m2 de UVB quando comparado ao controle (p <

0,05), e aumento da frequência de mutação, quando comparado ao controle (p < 0,05),

possivelmente devido à formação de ERO no meio. Ou seja, sua eficácia como fotoprotetor é

95

alta, porém este não é inócuo à célula em termos genotóxicos e a maior sobrevivência celular está

atrelada ao maior número de mutantes gerados.

Quando o TiO2 (Merck) foi usado houve aumento da fração de sobrevivência celular em

doses acima de 10 kJ/m2 de UVB (p < 0,05) e manutenção dos níveis de mutagênese induzida na

DL37 (p > 0,05), quando comparado ao controle. Cabe ressaltar que o TiO2 (Sigma) possui menor

tamanho de partícula que o TiO2 (Merck), portanto, maior superfície de contato, sendo capaz de

refletir de forma mais eficaz a radiação UVB (evidenciado pela maior fração de sobrevivência),

aumentando, porém, o incremento relativo de mutagênese, devido a sua maior reatividade.

Tanto o ZnO (Sigma) quanto o ZnO (Vetec) aumentaram a fração de sobrevivência

celular acima de 5 kJ/m2 de UVB (p < 0,05) para o Sigma e acima de 20 kJ/m2 de UVB para o

Vetec (p < 0,05) e não aumentaram a mutagênese induzida pela radiação UVB (p > 0,05), quando

comparados ao controle.

A MMT-Na também foi utilizada como possível filtro físico em formulações para

proteção solar e não alterou a fração de sobrevivência (p > 0,05) e aumentou a mutagênese

induzida por UVB (p < 0,05), sendo considerada genotóxica para a levedura, quando comparada

ao controle.

Ao comparar o tratamento com ZnO mais UVB nas cepas mutante CD138 e selvagem

FF18733, observou-se que de fato a cepa CD138 é mais sensível a lesões oxidativas, uma vez que

estes tratamentos foram citotóxicos, devido a diminuição da fração de sobrevivência e do número

de mutantes CanR. Diferentemente de cepa selvagem FF18733 que apresentou aumento da fração

de sobrevivência e mesma frequência de mutação, quando comparados ao controle, indicando

que o tratamento com ZnO mais UVB pode ativar o sistema de reparo de lesões oxidativas no

DNA de S. cerevisiae.

96

Dose UVB (kJ/m2

)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

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ên

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(N

/N0

)

1e-7

1e-6

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0


2) TiO2 (Sigma)

3) TiO2 (Merck)

4) ZnO (Sigma)

5) ZnO (Vetec)

6) MMT-Na

Sobrevivência celular da cepa selvagem FF18733 após radiação UVB e diferentes tratamentos

* * * *

*

* *

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Figura 30. Fração de sobrevivência (N/N0) da cepa selvagem FF18733 após tratamento com

UVB e 100 µg/mL dos filtros solares físicos. Estes resultados representam a média ± erro padrão

de no mínimo 3 experimentos independentes. * apresentou diferença estatística com relação ao


Tabela 6. Valores de DL37 (kJ/m2) e mutagênese induzida na DL37 da cepa selvagem FF18733 de

S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL dos filtros solares físicos. Estes resultados



Tratamento DL37 de UVB (kJ/m2) Mutagênese induzida na DL37

FF18733 (Controle) 5 709 ± 157

TiO2 (Sigma) 10* 1364 ± 174*

TiO2 (Merck) 5 522 ± 124

ZnO (Sigma) 5 778 ± 105

ZnO (Vetec) 5 744 ± 108

MMT-Na 5 1207 ± 101*

Considera-se como potencial fotoprotetor o filtro UV capaz de, simultaneamente,

aumentar a DL37 e reduzir a mutagênese induzida na DL37, para os resultados apresentados,

97

nenhum dos tratamentos apresentou, simultaneamente, aumento da eficácia e segurança de

fotoproteção ao se utilizar modelo biológico de levedura.

Em seguida, foram analisadas diferentes misturas físicas de TiO2 mais ZnO. Como visto

na Figura 31 e Tabela 7, ambas as misturas apresentaram melhor eficácia de fotoproteção, uma

vez que a fração de sobrevivência aumentou, quando comparadas ao controle (p < 0,05), devido à

maior reflexão da radiação. Porém, a frequência de mutantes CanR induzidos por UVB mais do

que dobrou quando comparadas ao controle (p < 0,05), indicando que estes filtros físicos quando

combinados foram tóxicos à cepa selvagem FF18733, ou seja, apresentaram efeito sinérgico

negativo em relação a genotoxicidade. Portanto, o ZnO potencializa o efeito oxidativo para cepas

de S. cerevisiae descrito para o TiO2 após irradiação UVB (PINTO et al., 2010; PAIVA et al.,

2014).

Dose UVB (kJ/m2

)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

ção

de

So

bre

viv

ência

(N

/N0)

1e-7

1e-6

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0





*

*

*

* *

*

* *

*

* *

*


UVB e 100 µg/mL da associação de TiO2 mais ZnO. Estes resultados representam a média ± erro

padrão de no mínimo 3 experimentos independentes. * apresentou diferença estatística com

relação ao controle (p < 0,05).

98


S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de TiO2 mais ZnO. Estes

resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos independentes. *

apresentou diferença estatística com relação ao controle (p < 0,05).



FF18733 (Controle) 5 709 ± 157

TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma) 15* 2018 ± 188*

TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec) 10* 1888 ± 188*

Em seguida, a cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae foi tratada com associações entre

MMT-Na mais TiO2 ou ZnO, em MF ou NS, a fim de se avaliar a possível aditividade destas

substâncias a serem utilizadas em formulações para proteção solar.

De acordo com a Figura 32 e Tabela 8, tanto com a MF e o NS de MMT-Na mais TiO2

(Sigma) houve aumento na fração de sobrevivência para todas as doses de UVB (p < 0,05) e não

houve alteração na mutagênese induzida por UVB (p > 0,05), quando comparado ao controle.

Já a MF de MMT-Na mais TiO2 (Merck) foi capaz de proteger as células de morte celular

somente para doses acima de 25 kJ/m2 de UVB (p < 0,05) e não houve alteração na mutagênese

induzida por UVB (p > 0,05), quando comparado ao controle.

Com a MF de MMT-Na mais ZnO (Sigma), mesmo com aumento da fração de

sobrevivência em altas doses de UVB (p < 0,05, acima de 25 kJ/m2), houve aumento expressivo

da frequência de mutantes CanR em mais de 6 vezes (p > 0,05), quando comparado ao controle.

Com o uso da MF de MMT-Na mais ZnO (Vetec) houve aumento na eficácia de proteção (p <

0,05, acima de 15 kJ/m2) e aumento de quase 3 vezes da mutagênese induzida por UVB (p <

0,05), quando comparado controle. Assim, a radiação UVB, potencializou os efeitos tóxicos do

ZnO, portanto, ambos os tratamentos não foram eficazes e/ou seguro em termos de fotoproteção,

não sendo indicado para o uso nestas condições.

99

Dose UVB (kJ/m2)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

çã

o d

e S

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-7

1e-6

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0


2) MMT+TiO2 (Sigma)

3) NS (MMT+TiO2 (Sigma))

4) MMT+TiO2 (Merck)

5) MMT+ZnO (Sigma)

6) MMT+ZnO (Vetec)


* *

* *

*

*

* * *

*

*

*

* *

*

* *

*

*

*


UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 ou ZnO. Estes resultados representam a




S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 ou

ZnO. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos




FF18733 (Controle) 5 709 ± 157

MMT-Na + TiO2 (Sigma) 10* 754 ± 96

NS (MMT-Na + TiO2 (Sigma)) 10* 789 ± 81

MMT-Na + TiO2 (Merck) 5 930 ± 127

MMT-Na + ZnO (Sigma) 5 4495 ± 137*

MMT-Na + ZnO (Vetec) 5 1981 ± 117*

100

Em seguida, foram analisadas a MF de MMT-Na mais TiO2 e ZnO. De acordo com a

Figura 33 e Tabela 9, ambas as MF de MMT-Na mais TiO2 e ZnO aumentaram a fração de

sobrevivência da cepa selvagem FF18733 frente à radiação UVB quando comparado ao controle

(p < 0,05, acima de 5 kJ/m2), porém este aumento de eficácia está atrelado ao aumento número de

mutantes CanR, já que aumentaram a mutagênese induzida por UVB em mais de 5 vezes (p <

0,05), evidenciando o efeito tóxico da mistura após radiação UVB. Estes resultados ratificam o

efeito tóxico do ZnO encontrado nos ensaios de citotoxicidade no escuro, indicando, assim,

possível aumento na formação de ERO após uso da radiação UVB. Neste caso, a MMT-Na não

foi capaz de neutralizar o efeito fotocatalítico do ZnO ao ser irradiado com UVB.

Dose UVB (kJ/m2)

0 5 10 15 20 25 30

Fra

çã

o d

e S

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0

)

1e-7

1e-6

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0


2) MMT+TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma)

3) MMT+TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec)


* *

* *

* *

*

* *

*

*

*


UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 e ZnO. Estes resultados representam a



101


S. cerevisiae após tratamento com UVB e 100 µg/mL da associação de MMT-Na mais TiO2 e

ZnO. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos



(kJ/m2)

Mutagênese induzida

na DL37

FF18733 (Controle) 5 709 ± 157

MMT-Na + TiO2 (Sigma) + ZnO (Sigma) 15* 4271 ± 128*

MMT-Na + TiO2 (Merck) + ZnO (Vetec) 10* 5605 ± 215*

De acordo com os resultados obtidos, a MF e NS formados por MMT-Na mais TiO2

(Sigma) apresentaram efeito sinérgico em relação à eficácia de fotoproteção, ou seja, aumento de

2 vezes da eficácia de fotoproteção, sem modificação quantitativa do número de mutantes CanR

induzido pelo UVB. Assim, são candidatos mais promissores no desenvolvimento de

formulações que diminuam os efeitos genotóxicos causados pela radiação UVB.

5.5.2.2.Avaliação da sobrevivência celular e mutagênese induzida da cepa selvagem

FF18733 de S. cerevisiae após uso de LSS

Em seguida, a fim de mimetizar as condições ambientais foi utilizado o aparato Simulador

Solar que emite LSS e comprimentos de onda correspondentes ao UVB, UVA, IV e VIS. Foram

utilizadas a MF e o NS de MMT-Na mais TiO2 (Sigma) que obtiveram melhor resposta em

relação ao UVB, de acordo com Figuras 30-33 e Tabelas 6-9, e a cepa selvagem FF18733 de S.

cerevisiae, com o objetivo de avaliar os efeitos de fotoproteção e genotoxicidade destas

associações de filtros após irradiação com LSS.

De acordo com o apresentado na Figura 34 e Tabela 10, a fração de sobrevivência

somente da cepa FF18733 controle irradiada com LSS é baixa, com morte celular de mais de

70% após 55 min de tratamento (DL37 de 4 kJ/m2 de UVB e 66,7 kJ/m2 de UVA). Portando, é

evidenciado maior efeito letal quando associados os diferentes comprimentos de onda emitidos

pela LSS. Além disso, a mutagênese induzida pela LSS é muito elevada, uma vez que dobrou

número de mutantes CanR, quando comparado ao tratamento isolado com UVB. Evidenciando

também efeito fotomutagênico da LSS, devido principalmente aos fótons emitidos pelo

102

comprimento de onda correspondente ao UVA, capazes de gerar majoritariamente lesões

indiretas (mediadas por ERO) no DNA, sendo este, portanto, caracterizado como agente físico

genotóxico para a S. cerevisiae.

Ainda, tanto a MF quanto o NS de MMT-Na mais TiO2 (Sigma) apresentaram maior

eficácia de fotoproteção após 30 min de tratamento (DL37 de 2,5 kJ/m2 de UVB e 41,64 kJ/m2 de

UVA, p < 0,05) e diminuição da frequência de mutantes CanR (p < 0,05), quando comparados ao

controle.

Ao comparar o tratamento isolado com UVB (Figura 32), houve aumento de 2 vezes do

número de mutantes CanR. A radiação UVA é a radiação majoritariamente responsável pela

formação de ERO, portanto, apesar de não ser eficientemente absorvida pelo DNA, possui ação

genotóxica indireta sobre esta molécula provocando danos celulares (MARIONNET et al., 2015).

Ambas as misturas foram mais vantajosas para o sistema quando comparadas ao controle, uma

vez que aumentaram a eficácia de fotoproteção após irradiação com LSS.

Tempo (min)

0 20 40 60 80 100 120 140

Fra

çã

o d

e S

ob

reviv

ên

cia

(N

/N0)

1e-6

1e-5

1e-4

1e-3

1e-2

1e-1

1e+0


2) MMT + TiO2 (Sigma)

3) NS (MMT + TiO2 (Sigma))

Sobrevivência celular da cepa selvagem FF18733 após LSS e diferentes tratamentos

* * *

* *

* *

* *

* *

*


LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma). Estes resultados



103

A Tabela 10 compara os valores de DL37 (kJ/m2), mutagênese induzida na DL37 e o

incremento de mutagênese da cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae após tratamento com

UVB ou LSS.

De acordo com a Tabela 10, quando se irradia somente com LSS é necessário dose

inferior para se atingir a DL37 quando comparado ao tratamento somente com UVB. Ainda, a

relação de mutantes induzidos na DL37/kJ de UVB com LSS é, aproximadamente, 4 vezes maior

para o controle, 6 vezes maior para a MF e 4 vezes maior para o NS. Porém, não houve

incremento de mutagênese para os tratamentos com NS ou MF.

Assim, para ambas as fontes de irradiação, os tratamentos com MF e NS de MMT-Na

mais TiO2 (Sigma) apresentaram maior eficácia de fotoproteção e se mantiveram inócuos, quando

utilizada cepa FF18733 de S. cerevisiae, portanto são promissores para o desenvolvimento de

novos ativos para proteção solar.

Tabela 10. Comparação entre os valores de DL37 (kJ/m2), mutagênese induzida na DL37 e

manutenção do incremento de fotomutagênese da cepa selvagem FF18733 de S. cerevisiae após

tratamento com UVB ou LSS e 100 µg/mL da MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2

(Sigma). Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos


Tratamento

DL37 de

UVB

(kJ/m2)

Mutagênese

induzida na

DL37 de

UVB

Incremento de

fotomutagênese

DL37 de

UVB

(kJ/m2)

com

LSS

Mutagênese

induzida na

DL37 de

UVB com

LSS

Incremento de

fotomutagênese

FF18733

(Controle) 5 709 ± 157 1,0 4 2096 ± 147 1,0

MMT-Na +

TiO2

(Sigma)

10* 754 ± 96 1,0 5* 2171 ± 89 1,0

NS (MMT-

Na + TiO2

(Sigma)

10* 789 ± 81 1,0 7,5* 2161 ± 127 1,0

104

Ao se comparar os resultados obtidos com uso da cepa selvagem FF18733 e mutante

CD138 de S. cerevisiae após uso da LSS, não houve diferença estatisticamente significativa entre

o número de mutantes CanR obtido para os tratamentos controle, MF e NS (p > 0,05). Já para a

fração de sobrevivência, o tratamento com o NS foi estatisticamente diferente para as duas cepas

após, aproximadamente, 1 h 40 min de tratamento com LSS (p < 0,05 para doses acima de 7,5

kJ/m2 de UVB e 124,98 kJ/m2 de UVA), de acordo com as Tabelas 5 e 10.

5.6. QUANTIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ERO EM CEPAS SELVAGEM FF18733 E

MUTANTE CD138 (ogg1) DE S. cerevisiae, APÓS TRATAMENTO COM

NANOSSISTEMAS E ATIVOS FOTOPROTETORES, SOB RADIAÇÃO UVB OU

LSS

Avaliou-se a geração de ERO pós-radiação UVB ou LSS em cepas selvagem FF18733 e

mutante CD138 (ogg1) de S. cerevisiae, utilizando-se CM-H2DCF-DA sensível à oxidação. Para

isso, o CM-H2DCF-DA foi adicionado à cultura imediatamente após a irradiação (0 h) e a

fluorescência emitida pelo DCF foi medida até 24 h pós-tratamento.

Os resultados foram expressos em gráfico correlacionando-se o incremento de geração de

ERO (emissão de fluorescência) com o tempo de incubação pós-tratamento com UVB ou LSS e a

MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma). Foi analisada a geração de ERO

espontânea de células não irradiadas (controle negativo) e tratadas com o H2O2 na concentração

de 200 mM (controle positivo).

Para fins comparativos, foi testada a viabilidade celular das cepas por meio da fração de

sobrevivência celular (N/N0) e não houve alteração do número de colônias formadas e/ou da

viabilidade celular após os tratamentos (dados não mostrados). E para cada tratamento, a geração

basal de ERO pelas cepas foi considerada como 100% (dados não mostrados).

De acordo com a Figura 35 (A), a geração espontânea de ERO pela cepa CD138

apresentou aumento nos tempos de 1 h (106,3%), 2 h (105,5%) e 4 h (109,5%) (p < 0,05),

atingindo o nível basal de ~ 100% após 24 h de crescimento celular (p > 0,05). A exposição da

cepa CD138 ao NS formado por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) induziu ao incremento intracelular

de ERO somente nos tempos de 1 h (107,8%) e 2 h (108,1%) pós-tratamento (p < 0,05). Já com o

uso da MF formada por MMT-Na mais TiO2 (Sigma), houve diminuição estatisticamente

105

significativa da formação de ERO após 2 h (77,1%), 4 h (80,3%) e 24 h (79,0%) de tratamento (p

< 0,05). Ou seja, a ausência do reparo pela proteína Ogg1 e o acúmulo de lesões oxidativas no

DNA mantem a célula em níveis elevados em relação à produção de ERO no meio intracelular,

indicando possível saturação do BER. Ao se comparar os tratamentos em determinado intervalo

de tempo, a geração endógena de ERO se manteve semelhante com e sem o NS e a MF

apresentou diminuição da formação de ERO, quando comparado ao controle (p < 0,05).

De acordo com a Figura 35 (B), para a geração espontânea de ERO pela cepa selvagem

FF18733 houve incremento nos tempos de 1 h (114,8%) e 2 h (104,7%) (p < 0,05) e diminuição

nos tempos de 4 h (86,2%) e 24 h (90,5%) (p < 0,05), da produção basal de ERO. A exposição da

cepa FF18733 ao NS formado por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) induziu à diminuição da

formação intracelular de ERO em todo o tratamento sendo nos tempos de 0 h (77,2%), 1 h

(84,4%), 2 h (66,5%), 4 h (59,6%) e 24 h (57,6%), pós-tratamento (p < 0,05). Com o uso da MF

formada por MMT-Na mais TiO2 (Sigma), houve diminuição da formação de ERO, após 0 h

(61,1%) e 1 h (83,3%) e aumento da produção de ERO após 2 h (121,9%), 4 h (171,6%) e 24 h

(142,4%) de tratamento (p < 0,05). Ao se comparar os tratamentos em determinado intervalo de

tempo, o NS apresentou diminuição durante todo o tratamento (p < 0,05) e a MF apresentou

aumento (p < 0,05) da formação de ERO a partir de 2 h de tratamento, quando comparado ao

controle.

Com uso da cepa selvagem, proficiente em todos os mecanismos de reparo do DNA, é

possível observar e quantificar a diminuição da formação de ERO ao longo do tempo e o efeito

sinérgico e positivo relacionado à diminuição da formação de ERO no meio intracelular pelo NS

e, consequentemente, maior segurança deste fotoprotetor, quando comparado à MF. Ainda, cabe

ressaltar que, para obtenção do NS, o TiO2 (Sigma) foi intercalado na MMT-Na, o que diminui a

sua reatividade quando comparado à MF, na qual o TiO2 (Sigma) permanece disperso no meio

reacional (PAIVA et al., 2014), contribuindo para aumento da formação de ERO intracelular.

106

Cinética de geração de ERO

Tempo

0 h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

me

nto

de

ge

raçã

o d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200

CD138 (Controle)

CD138 + NS

CD138 + MF

A

* * *

* *

* * *

* * * * *

Cinética de geração de ERO

Tempo

0 h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

me

nto

de

ge

raçã

o d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200

FF18733 (Controle)

FF18733 + NS

FF18733 + MF

B

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

* *

*

* *

*

*

*

*

*

*

*

Figura 35. Cinética de geração de ERO por meio da detecção da emissão de fluorescência

usando o reagente CM-H2DCF-DA e as cepas mutante CD138 (ogg1) (A) e selvagem FF18733

(B) de S. cerevisiae, pós-tratamento com MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma).

Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3 experimentos independentes.

* apresentou diferença estatística (p < 0,05).

107

Em seguida, foi analisada a cinética de geração de ERO pós-tratamento das cepas mutante

CD138 (ogg1) e selvagem FF18733 de S. cerevisiae com H2O2 (200 mM). De acordo com a

Figura 36 (A), a cepa CD138 apresentou aumento na geração ERO nos tempos de 0 h (296,1%),

1 h (214,5%), 2 h (185,0%), 4 h (132,8%) e 24 h (113,6%) (p < 0,05). Para o tratamento da cepa

CD138 com o H2O2 mais o NS formado por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) houve incremento

intracelular de ERO nos tempos de 0 h (228,3%), 1 h (197,8%) e 2 h (127,9%) e diminuição na

geração de ERO após 4 h (95,9%) do tratamento (p < 0,05). Já com o uso da MF, houve indução

do incremento intracelular de ERO nos tempos de 0 h (195,3%), 1 h (176,2%) e 2 h (115,5%) e

diminuição na geração de ERO após 4 h (89,3%) do tratamento (p < 0,05). Portanto, nestas

condições, o NS e a MF foram capazes de induzir resposta adaptativa, devido ao retorno das

condições basais da cepa, em um meio pró-oxidante, após 4 h. Ao se comparar os tratamentos em

determinado intervalo de tempo, ambos os filtros apresentaram diminuição significativa na

formação endógena de ERO, quando comparado ao controle (p < 0,05).

De acordo com a Figura 36 (B), para a geração de ERO pela cepa selvagem FF18733 pós-

tratamento com H2O2 houve diminuição nos tempos de 0 h (51,8%), 1 h (24,6%), 2 h (19,2%), 4

h (16,8%) e 24 h (13,0%) (p < 0,05). A exposição da cepa FF18733 ao NS induziu diminuição da

formação intracelular de ERO nos tempos de 0 h (29,4%), 1 h (18,6%), 2 h (17,8%), 4 h (13,0%)

e 24 h (11,0%), pós-tratamento (p < 0,05). Nestas condições, o NS permitiu que a cepa atingisse

geração de 13,0% de ERO, após 4 h de tratamento, diferentemente da cepa controle, na qual esta

resposta ocorreu em 24 h, gerando resposta adaptativa ao meio mais rapidamente. Com o uso da

MF, houve diminuição da formação de ERO, após 0 h (54,7%), 1 h (30,3%), 2 h (26,8%), 4 h

(27,2%) e 24 h (30,8%) (p < 0,05). Ao se comparar os tratamentos em determinado intervalo de

tempo, o NS apresentou diminuição imediatamente após tratamento (p < 0,05), quando

comparado ao controle, e a MF apresentou aumento (p < 0,05) da formação de ERO após 4 h de

tratamento, quando comparado ao controle.

Como o H2O2 é responsável por produzir ERO no meio intracelular, esta indução é mais

evidenciada na cepa mutante CD138 (ogg1), uma vez que com a ausência do reparo pela proteína

Ogg1, a célula mantem em níveis elevados à produção de ERO no meio intracelular, indicando

possível saturação do BER. Para a cepa selvagem, a diminuição da formação de ERO

imediatamente após tratamento com H2O2 ocorre devido à ativação de enzimas antioxidantes

como a catalase e as peroxidases.

108

Cinética de geração de ERO pós tratamento com H2O2

Tempo

0 h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

me

nto

de

ge

raçã

o d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200

250

300

CD138 (Controle)

CD138 + NS

CD138 + MF

A

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Cinética de geração de ERO pós tratamento com H2O2

Tempo

0 h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

mento

de g

era

ção d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200

250

300FF18733 (Controle)

FF18733 + NS

FF18733 + MF

B

*

* *

*

* * * *

*

*

* *

* *

* *

*

*



(B) de S. cerevisiae, pós-tratamento com MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) e

200 mM de H2O2. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3

experimentos independentes. * apresentou diferença estatística (p < 0,05).

109


CD138 e selvagem FF18733 de S. cerevisiae com UVB mais o NS e a MF formados por MMT-

Na e TiO2 (Sigma) na DL37 de cada tratamento.

De acordo com a Figura 37 (A), para cepa mutante CD138 (ogg1), a diminuição da

geração de ERO só é evidenciada após 2 h (88,0%), 4 h (92,3%) e 24 h (93,5%) de tratamento

com uso da MF (p < 0,05). E a geração de ERO pós-tratamento com NS se manteve constante

durante nas condições apresentadas (p > 0,05).

De acordo com a Figura 37 (B), a cepa selvagem FF18733, permite distinguir efeitos de

diminuição da formação de ERO ao longo de 24 h pós-tratamento com UVB e os filtros solares.

Com a MF houve incremento na geração de ERO após 4 h (128,9%) e 24 h (108,3%) de

tratamento (p < 0,05). E com o NS houve diminuição da geração intracelular de ERO em 0 h

(58,2%), 1 h (65,1%), 2 h (62,2%), 4 h (57,2%) e 24 h (58,3%), pós-tratamento (p < 0,05).

Ao se comparar a cinética de geração de ERO em determinado intervalo de tempo, o NS

foi mais eficaz na diminuição durante todo o tratamento (p < 0,05), já a MF apresentou

diminuição com 0 h e 1 h de tratamento (p < 0,05), porém, aumentou a formação de ERO a partir

de 4 h de tratamento (p < 0,05), quando comparado ao controle.

110

Cinética de geração de ERO pós tratamento com UVB

Tempo

0h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

mento

de g

era

ção

de

ER

O (

%)

0

50

100

150

200CD138 (Controle)

CD138 + NS

CD138 + MF

A

* *

* * *

* *

B

Cinética de geração de ERO pós tratamento com UVB

Tempo

0h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

mento

de g

era

ção d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200

FF18733 (Controle)

FF18733 + NS

FF18733 + MF

B

*

*

*

*

* *

*

*

*

* * *

*

* *

*

*

*

* *




radiação UVB na DL37. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3


111


CD138 (ogg1) e selvagem FF18733 de S. cerevisiae com LSS mais o NS e a MF formados por

MMT-Na e TiO2 (Sigma) na DL37 de cada tratamento.

De acordo com a Figura 38 (A), houve incremento da produção tardia de ERO para cepa

CD138, ou seja, após 24 h de tratamento com LSS (106,6%), LSS mais NS (108,8%) e LSS mais

MF (116,9%) (p < 0,05). Sendo, neste caso, a cepa deficiente na proteína Ogg1 mais sensível às

lesões oxidativas, conferidas majoritariamente pela radiação UVA, já que esta geração tardia de

ERO não foi observada pós-radiação UVB, que causa majoritariamente lesões do tipo CPDs e

fotoproduto 6,4-PPs. Ao se comparar os tratamentos em determinado intervalo de tempo,

somente a MF apresentou aumento na produção de ERO após 1 h de tratamento, quando

comparado ao controle (p < 0,05).

De acordo com a Figura 38 (B), a cepa selvagem FF18733 permite distinguir efeitos de

diminuição da formação de ERO ao longo de 24 h pós-tratamento com LSS e os filtros solares.

Com a MF houve incremento na geração de ERO no início do tratamento com 0 h (61,1%) e 1 h

(83,3%). Porém, após 2 h (121,3%), 4 h (142,1%) e 24 h (171,1%) de tratamento houve aumento

da geração de ERO e maior toxicidade da MF à cepa irradiada com LSS (p < 0,05). Já com o NS

houve diminuição da geração intracelular de ERO em todo o tratamento, sendo para 0 h (59,9%),

1 h (63,6%), 2 h (68,8%), 4 h (69,2%) e 24 h (91,7%), pós-tratamento (p < 0,05).

Ao se comparar a cinética de geração de ERO em determinado intervalo de tempo, o NS

foi mais eficaz na diminuição durante todo o tratamento (p < 0,05). A MF apresentou diminuição

com 0 h e 1 h de tratamento (p < 0,05), porém, aumentou a formação de ERO a partir de 2 h de

tratamento (p < 0,05), quando comparado ao controle. Assim, é possível que o NS atue como

sequestrador de ERO, promovendo efeito protetor antioxidante às cepas.

Ao se comparar os tratamentos com LSS e UVB, o efeito antioxidante do NS é mais

evidenciado para o UVB isolado, já que com a LSS há aumento da geração de ERO,

principalmente devido ao comprimento de onda correspondente ao UVA, sendo este efeito

antioxidante ainda evidenciado, porém, em menor proporção.

A Tabela 11 foi criada para comparar os resultados obtidos com as cepas CD138 e

FF18733, após irradiação com UVB e LSS, geração de ERO inicial, ou seja, imediatamente após

irradiação, e geração de ERO após 24 h de irradiação, com o objetivo de ratificar a escolha do NS

como novo candidato a fotoprotetor a ser veiculado em formulações cosméticas.

112

Cinética de geração de ERO pós tratamento com LSS

Tempo

0h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

me

nto

de

ge

raçã

o d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200 CD138 (Controle)

CD138 + NS

CD138 + MF

* * * *

* *

*

A

B

Cinética de geração de ERO pós tratamento com LSS

Tempo

0h 1 h 2 h 4 h 24 h

Incre

me

nto

de

ge

raçã

o d

e E

RO

(%

)

0

50

100

150

200FF18733 (Controle)

FF18733 + NS

FF18733 + MF

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

B

* * *

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*




radiação com LSS na DL37. Estes resultados representam a média ± erro padrão de no mínimo 3


113

Tabela 11. Comparação dos resultados obtidos para as cepas mutante CD138 (ogg1) e selvagem FF18733 de S. cerevisiae pós

tratamento com UVB ou LSS e o NS ou MF formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) (* p < 0,05).

Tratamento

UVB+CD138

DL37 UVB

(kJ/m2)

Incremento de

fotoproteção

CanR/107

células/DL37

Incremento de

fotomutagênese

Geração inicial de

ERO pós UVB

Incremento de

geração de ERO

Geração final de

ERO pós UVB

Incremento de

geração de ERO

Controle 10 1,0 3742 ± 400 1,0 102,06% 1,0 96,24% 1,0

MF 25* 2,5 1468 ± 94* 0,40 96,26% 0,9 93,50%* 0,9

NS 15* 1,5 630 ± 152* 0,15 106,81% 1,0 100,26% 1,0

Tratamento

UVB+FF18733

DL37 UVB

(kJ/m2)

Incremento de

fotoproteção

CanR/107

células/DL37

Incremento de

fotomutagênese


ERO pós UVB

Incremento de

geração de ERO

Geração final de

ERO pós UVB

Incremento de

geração de ERO

Controle 5 1,0 709 ± 157 1,0 103,81% 1,0 95,25% 1,0

MF 10* 2,0 754 ± 96 1,0 61,84%* 0,6 108,30%* 1,1

NS 10* 2,0 789 ± 81 1,0 58,25%* 0,6 58,30%* 0,6

Tratamento

LSS+CD138

DL37 LSS

(kJ/m2)

Incremento de

fotoproteção

CanR/107

células/DL37

Incremento de

fotomutagênese


ERO pós LSS

Incremento de

geração de ERO

Geração final de

ERO pós LSS

Incremento de

geração de ERO

Controle 4 1,0 3187 ± 278 1,0 99,45% 1,0 106,62% 1,0

MF 5* 1,25 1388 ± 124* 0,45 106,47% 1,1 116,90%* 1,1

NS 5* 1,25 1554 ± 132* 0,50 100,92% 1,0 108,80%* 1,0

Tratamento

LSS+FF18733

DL37 LSS

(kJ/m2)

Incremento de

fotoproteção

CanR/107

células/DL37

Incremento de

fotomutagênese


ERO pós LSS

Incremento de

geração de ERO

Geração final de

ERO pós LSS

Incremento de

geração de ERO

Controle 4 1,0 2096 ± 147 1,0 98,19% 1,0 110,07% 1,0

MF 5* 1,25 2171 ± 89 1,0 61,10%* 0,6 171,10%* 1,5

NS 7,5* 1,90 2161 ± 127 1,0 59,96%* 0,6 91,70%* 0,8

114

De acordo com a Tabela 11, tanto a MF quanto o NS formados por MMT-Na

mais TiO2 (Sigma) apresentaram aumento do incremento de fotoproteção pós tratamento

com UVB e LSS, sendo este incremento maior com o uso de UVB. Já foi descrito

anteriormente que a LSS, por conter outros comprimentos de onda como o UVA, é mais

letal às cepas, exercendo, portanto, maior efeito sinérgico e deletério à levedura,

evidenciado pelo menor incremento de fotoproteção (DINIZ et al., 2019). Mesmo assim,

os filtros solares foram capazes de aumentar e eficácia de fotoproteção no modelo

biológico utilizado.

Ainda de acordo com a Tabela 11, houve diminuição do incremento de

fotomutagênese ao se utilizar o NS e a MF, quando testados na cepa mutante CD138

(ogg1) irradiada com UVB ou LSS. De fato, como a mutagênese espontânea dessa cepa é

elevada, é possível se avaliar o perfil fotomutagênico de um filtro solar. Sendo assim,

tanto o NS quanto a MF formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) apresentaram caráter

antifotomutagênico no modelo biológico utilizado, portanto, foram mais seguros em

termos de fotoproteção, corroborando os resultados obtidos por Paiva e col. (2014). Para

cepa selvagem FF18733 a fotomutagênese induzida por UVB ou LSS simulada se

manteve semelhante ao controle, sendo, portanto, o NS e a MF inócuos à cepa.

Finalmente, de acordo com a Tabela 11, o incremento de geração de ERO

imediatamente após uso da radiação UVB ou LSS, e 24 h após, não apresentou diferença

ao se utilizar a cepa mutante CD138 (ogg1). Como esta cepa não apresenta o reparo BER

funcionante, é possível que o estresse oxidativo elevado seja uma resposta adaptativa que

direcione a outros mecanismos de reparo do DNA, a fim de manter a viabilidade celular,

como exemplo ativando sistemas antioxidantes enzimáticos. Sendo, portanto, evidenciado

para a cepa selvagem FF18733 a diminuição do incremento de ERO, ao se utilizar o NS,

imediatamente após a radiação com UVB e LSS, sendo esta diminuição mantida por 24 h,

evidenciando, então, efeito antioxidante do NS. Já com o uso da MF, houve diminuição

inicial da geração de ERO e incremento tardio, após 24 h, conferindo efeito pró-oxidantes

deste ativo fotoprotetor para o modelo de levedura utilizado.

115

5.7. PREPARO DE FORMULAÇÕES PARA PROTEÇÃO SOLAR E AVALIAÇÃO

DE PARÂMENTROS DE FOTOPROTEÇÃO IN VITRO PELO MÉTODO

LABSPHERE®

Foram desenvolvidas 5 formulações para proteção solar, sendo estas: F1 (branco),

F2, F3, F4 e F5 contendo filtros UV orgânicos comumente utilizados pela Farmácia

Universitária/UFRJ e a MF ou NS formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma). A fase

aquosa continha conservante, silicone volátil, aristoflex (polímero responsável pela

formação de gel-creme), água e os filtros inorgânicos, e a fase oleosa continha o DHHB,

o OMC, OC e o tensoativo Tween 80.

Para escolha das concentrações dos filtros UV foram feitas simulações utilizando

o software Sunscreen Simulator (BASF®) que é uma ferramenta para estimar o FPS e visa

planejar a composição dos ingredientes ativos em uma formulação para proteção solar,

mas não substitui a análise do FPS in vitro e in vivo do produto final.

Após diferentes simulações, foi escolhida a mistura de filtros contendo DHHB

5%, OMC 10%, OC 5% e TiO2 10% que confere FPS teórico de 60. E para a formulação

branco, ou seja, somente com os filtros orgânicos, foi escolhida a mistura de filtros

contendo DHHB 5%, OMC 10% e OC 5% que confere FPS teórico de 30.

Ao final da etapa de emulsificação, obteve-se um gel-creme homogêneo de

coloração amarelo claro que foi distribuído em potes de polipropileno na cor preta,

conforme Figura 39.

Figura 39. Aspecto da formulação final.

116

Os resultados de FPS foram obtidos por espectrofotometria por transmitância com

esfera de integração e são indicativos da proteção alcançada pelo fotoprotetor. Cada

formulação foi usada na concentração de 2 mg/cm2 e as amostras foram lidas no

equipamento Labsphere® em triplicata, de acordo com a Tabela 12.

Tabela 12. Análise das formulações obtidas para fotoproteção.

Componentes F1

(branco) F2 F3 F4 F5

DHHB 5 % 5 % 5 % 5 % 5 %

OMC 10 % 10 % 10 % 10 % 10 %

OC 5 % 5 % 5 % 5 % 5 %

Tween 80 4 % 4 % 4 % 4 % 4 %

Aristoflex 1 % 0,3 % 0,8 % 0,2 % 1 %

MMT-Na - 5 % - 10 % -

TiO2 (Sigma) - 5 % 10 % - -

NS - - - - 10 %

Conservante 0,12 % 0,12 % 0,12 % 0,12 % 0,12 %

Silicone volátil 5 % 5 % 5 % 5 % 10 %

Água q.s.p. 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

FPS in vitro ± DP 20 ± 4,4 58 ± 17 56 ± 9,1 42 ± 11 54 ± 12

Razão UVA/UVB 0,49 0,55 0,56 0,59 0,56

λc (nm) 376 380 381 379 382

Como a função principal de uma formulação fotoprotetora é ser eficaz na proteção

contra a radiação UV que alcança a pele, os produtos obtidos devem possuir amplo

espectro de proteção contra a radiação UVA e UVB. Todas as formulações obtidas

apresentaram FPS maior que 15, razão UVA/UVB maior do que 1/3 e comprimento de

onda crítico maior que 370 nm.

O alto desvio padrão encontrado para cada amostra é comum nesse tipo de

análise, uma vez que a aplicação da amostra na placa de quartzo pode não ficar

completamente homogênea, dificultando a distribuição uniforme e a mesma quantidade

117

final de fotoprotetor sobre o substrato utilizado, o que mimetiza as condições normais de

aplicação dos produtos para fotoproteção por consumidores (FERRERO et al., 2010).

A formulação F1 (branco) apresentou menor FPS devido à ausência de filtros

inorgânicos, responsáveis por aumentar o FPS uma vez que refletem e/ou absorvem a

radiação UV. As formulações F2-F5 apresentaram o mesmo FPS, sendo que a F4

apresentou tendência a menor FPS devido à presença somente da MMT-Na, ou seja, a

presença do filtro inorgânico TiO2 (Sigma) aumentou o FPS das formulações. Tanto a

MF (F2) e o NS (F5) formados por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) apresentaram FPS

elevado e semelhante a F3, contendo um filtro inorgânico clássico, além dos filtros

solares orgânicos, com vantagem da F5 conter um novo filtro solar (NS) mais seguro,

eficaz e com propriedades antioxidantes.

118

6. DISCUSSÃO

No presente trabalho, foram desenvolvidos e caracterizados um nanossistema e

misturas físicas formados por silicatos minerais e filtros solares inorgânicos e,

posteriormente, feita avaliação da atividade fotoprotetora, em termos de eficácia e

segurança de fotoproteção, e perfil antioxidante, utilizando-se modelo de Saccharomyces

cerevisiae.

Existem diferentes modos de se modificar argilas minerais, dentre estes estão os

tratamentos físicos como liofilização e ultrassom (BERGAYA & LAGALY, 2001). A

delaminação de sólidos inorgânicoas atraiu atenção primária por causa das altas

possibilidades de criação de nanocompósitos e nanoestruturas funcionais (CHALASANI

et al., 2013).

A difração de raios-X é um dos principais métodos de caracterização da estrutura

dos nanocompósitos de silicatos lamelares. Trata-se de um método não destrutivo, com

fácil preparação da amostra e tem por objetivo avaliar o espaço entre as lamelas do

silicato lamelar e, dessa forma, predizer se houve inserção de moléculas entre as lamelas

da argila por meio da análise do deslocamento do pico característico de sua lamela (KOO,

2006). Com uso de DRX foi identificada formação de um nanossistema formado por

MMT-Na mais TiO2 (Sigma), por meio do deslocamento do pico basal característico da

MMT-Na, reproduzindo o resultado obtido por Paiva e col. (2014), de acordo com a

Figura 40.

Em relação à microestrutura da MMT-Na, cada dimensão lateral da lamela

apresenta diâmetro aproximado de 100 a 200 nm (PAUL & ROBESON, 2008), o que

justifica a não intercalação de moléculas com grande dimensão de partícula. Ou seja,

somente o TiO2 (Sigma) com 195,1 nm foi intercalado nas lamelas da MMT-Na. Para

todos as análises de tamanho de partículas de filtros inorgânicos usados no presente

trabalho, o PdI foi menor ou igual 0,3, indicando que as amostras se mantiveram

homogêneas (BALOGH et al., 2011) e, neste caso, em escala nanométrica com tamanho

inferior a 1 µm (ALLÉMANN et al., 1993).

Portanto, foi obtido um material denominado nanocompósito, no qual um dos seus

componentes fica disperso em escala nanométrica. Essa combinação mantem as

119

características estruturais de cada componente e as propriedades do novo material

formado são aprimoradas em relação às propriedades de cada componente separadamente

(MORELLI & RUVOLLO FILHO, 2010).

Figura 40. Esquema proposto para o nanossistema obtido pela reação de intercalação

entre MMT-Na mais TiO2 (Sigma) (adaptado de PAIVA et al., 2014).

A preocupação em torno do uso de nanomateriais é bastante relevante para o seu

emprego em formulações fotoprotetoras (WANG & TOOLEY, 2011). A necessidade de

se dar maior atenção à segurança dessas formulações vai ao encontro das diversas

controvérsias descritas na literatura a respeito do uso de fotoprotetores, dentre os quais se

destacam: fototoxicidade; penetração percutânea atingindo circulação sistêmica;

disrupção endócrina; alergias; prevenção da formação de vitamina D e aumento do risco

de melanoma devido à indução de processos fotomutagênicos e fotogenotóxicos

(LÓDEN et al., 2011).

A avaliação de toxicidade de um ingrediente cosmético está intimamente

relacionada à natureza físico-química do ingrediente e à metodologia de avaliação

utilizada. Por esta razão, é indicada a realização dos seguintes ensaios pré-clínicos:

mutagenicidade/genotoxicidade; efeitos tóxicos induzidos pela radiação UV

(fototoxicidade, fotogenotoxicidade, fotoalergia); carcinogenicidade; dentre outros

(SCCS, 2012).

Foram utilizadas 2 cepas de S. cerevisiae sendo elas: cepa selvagem FF18733

proficiente em todos os mecanismos de reparo de lesões no DNA e a cepa mutante

CD138 deficiente no gene OGG1 que codifica a enzima Ogg1, envolvida no BER

120

(FRIEDBERG et al., 2006). Um polimorfismo frequentemente encontrado em humanos

resulta na substituição da serina por uma cisteína na posição 326 da proteína Ogg1 e tem

sido associado ao maior risco de desenvolver vários tipos de câncer. O mecanismo

molecular subjacente a este aumento do risco ainda não foi estabelecido, mas foi

levantada a hipótese que pode ser devido à proteína hOGG1-Cys326 ter sua atividade de

reparação prejudicada, permitindo o acúmulo da lesão 8-oxoG no DNA, com o

consequente aumento das taxas de mutação (BRAVARD et al., 2009).

A 8-oxoG é uma lesão oxidativa que pode ser gerada por diversos agentes

exógenos, como a radiação UV, e é potencialmente mutagênica (THOMAS et al., 1997),

assim, se um filtro solar comumente utilizado for capaz de aumentar a frequência de

mutação na cepa mutante CD138 (ogg1), este pode favorecer os eventos de iniciação

celular, principalmente em indivíduos que apresentem este polimorfismo, sendo,

portanto, cancerígenos. E este evento pode ser confirmado na cepa selvagem FF18733

aumentando-se a frequência de mutação da cepa pós tratada (DINIZ et al., 2019).

Baseado na similaridade biológica entre S. cerevisiae e eucariotos superiores, a

levedura se mostra um modelo ideal, tanto bioquímico quanto molecular. Para estudo dos

mecanismos de lesões induzidas pela radiação UVB e LSS, foram analisadas a

fotocitotoxicidade, por meio da fração de sobrevivência (N/N0) das cepas, e

fotogenotoxicidade, por meio da mutagênese induzida pela radiação UV ou LSS

(mutantes CanR/ 107 células) ou fotomutagênese. A sobrevivência celular das cepas

indicou a eficácia das substâncias testadas e a mutagênese direta, a inocuidade em termos

de ausência de fotogenotoxicidade. Quanto ao critério de escolha da concentração do

composto teste, deve-se levar em consideração a toxicidade, na ausência de irradiação, do

composto ao modelo experimental e sua a precipitação, a fim de evitar concentrações

potencialmente citotóxicas no escuro (GOCKE et al., 2000).

Os tratamentos com diferentes amostras de ZnO e TiO2 mais ZnO apresentaram-

se citotóxicos para ambas as cepas de S. cereviviae, a MMT-Na foi associada aos filtros

inorgânicos e pareceu neutralizar efeito citotóxico conferido por estes à levedura.

Kasemets e col. (2009) avaliaram os efeitos tóxicos de nanopartículas de óxidos de

metais, dentre eles o TiO2 e o ZnO em S. cerevisiae. O TiO2 não se mostrou tóxico à

levedura. No que se refere ao potencial tóxico do ZnO, os autores descreveram perfil

121

citotóxico do ZnO, tanto na forma de micropartícula quanto na de nanopartícula

(KASEMETS et al., 2009).

Parece ser uma hipótese razoável que as partículas de ZnO exerçam suas

propriedades tóxicas através de íons Zn2+ solubilizados. Evidências de toxicidade do

ZnO, desta vez utilizando cultura de células de mamíferos, confirmaram que a dissolução

desempenha um papel importante na citotoxicidade induzida por ZnO e mostra que a

dissociação de ZnO interrompe a homeostase de zinco celular, levando a lesões

lisossômicas e mitocondriais e à morte celular (XIA et al., 2008).

Apesar o TiO2 não irradiado apresentar fraca ou nenhuma genotoxicidade, ensaios

cometa e de aberração cromossômica mostram que o TiO2 induz danos fotogenotóxicos

significativos após radiação UV (TIANO et al., 2010).

No presente trabalho, a radiação UVB e LSS, foram utilizadas como controle

positivo dos experimentos, uma vez que cepas de S. cerevisiae são altamente resistentes a

doses de radiação UV semelhantes às ambientais (RURR et al., 2019; DINIZ et al.,

2019). A radiação solar que atinge a superfície terrestre possui proporção aproximada de

1:20 (UVB:UVA) e um ponto importante para testes de triagem/screnning de novos

ativos fotoprotetores é que o espectro de irradiação deve ser o mais próximo possível do

espectro solar, a fim de torná-los confiáveis e passíveis de extrapolação (GOCKE et al.,

2000). As doses de UVA e UVB com LSS utilizadas nesse trabalho atingiram proporção

de 1:17 corroborando as doses descritas na literatura.

Após radiação UVB, a cepa selvagem FF18733 apresentou DL37 de 5 kJ/m2 com

baixa frequência de mutantes CanR, indicando que os mecanismos de reparo de lesões

oxidativas no DNA estão atuantes, favorecendo à sobrevivência celular com baixo índice

de mutação UV-induzida. A cepa mutante CD138 (ogg1) apresentou maior resistência ao

UVB (DL37 de 10 kJ/m2) com maior frequência de mutantes CanR, ou seja, a lesão

oxidativa 8-oxoG acumulada principalmente devido à ausência da proteína Ogg1 não é

letal para cepa, porém é pré-mutagênica e seu acúmulo no DNA está ligado ao aumento

do número de mutantes (PINTO et al., 2010; PAIVA et al., 2014; DINIZ et al., 2019). De

fato, cepas ogg1 acumulam transversões GC TA (THOMAS et al., 1997).

Ou seja, o excesso de sítios para reparo no DNA acaba por causar quebras duplas

nas fitas o que leva à morte celular (THOMAS et al., 1997), mais acentuada para a cepa

122

selvagem (DINIZ et al., 2019). Gonçalves (2014) indicou que o pós-tratamento com

tioureia foi capaz de suprimir o incremento da frequência de mutagênese somente na cepa

mutante CD138 (ogg1), indicando que possivelmente a frequência de mutagênese

aumentada nesta cepa ocorre via a geração endógena de ERO (GONÇALVES, 2014). De

fato, a falta da proteína Ogg1 não afeta sua sensibilidade a lesões tóxicas por LSS, mas

sensibiliza fortemente esta cepa a lesões mutagênicas (HOSSY et al., 2017; DINIZ et al.,

2019; SILVA et al., 2019).

Apesar das doses utilizadas de UVA e UVB com uso de LSS serem menores do

que as doses alcançadas com os tratamentos isolados (KOZMIN et al., 2005; PINTO et

al., 2010; PAIVA et al., 2014; DINIZ et al., 2019), o uso de LSS é fundamental para

diminuir os efeitos fotogenotóxicos superestimados de lâmpadas isoladas e deve ser

adotado para testes pré-clínicos de candidatos a novos fotoprotetores (GOCKE et al.,

2000). Esse diferente desfecho encontrado para a LSS pode ser atribuído ao sinergismo

dos diferentes comprimentos de onda de UVA, UVB e VIS presentes na LSS (DINIZ et

al., 2019).

Ainda, a cepa mutante CD138 (ogg1) apresentou maior mutagênese espontânea

quando comparada à cepa selvagem FF18733, o que possibilita seu uso como

bioindicador para análise de inocuidade de ativos fotoprotetores, uma vez que se pode

quantificar a diminuição ou aumento de mutantes CanR após diferentes tratamentos

(PINTO et al., 2010, PAIVA et al., 2014; HOSSY et al., 2017, SILVA et al., 2019;

DINIZ et al., 2019).

O aumento da eficácia com uso de TiO2 (Sigma) ocorreu tanto com UVB quanto

com LSS, pois o comprimento de onda preferencialmente disperso por um filtro

inorgânico é dependente do seu tamanho de partícula. Quanto menor o tamanho de

partícula, menor o comprimento de onda disperso. Essa relação entre o tamanho de

partícula e o espalhamento de luz é importante para se conseguir máximo benefício

fotoprotetor com melhor aparência, ou seja, maior dispersão da radiação UV com baixa

reflexão da radiação visível (HEWITT, 1992) e menor efeito de branqueamento do

produto final.

Uma vez que os filtros inorgânicos são pequenos cristais particulados, esses

materiais são semicondutores com alta energia (380-420 nm) entre a banda de valência e

123

a banda de condução. O que é inversamente proporcional ao tamanho das partículas, ou

seja, quanto menores as partículas primárias, maior sua energia e reatividade. Quando a

radiação UV é absorvida, um elétron migra da banda de valência para a banda de

condução. Assim, qualquer fóton com comprimento de onda maior que o intervalo da

banda não será absorvido pelo filtro solar e o gap de elétrons resultante pode ser

preenchido por elétrons de moléculas circundantes, levando a reações de oxidação,

também conhecidas como efeito fotocatalítico (OSTERWALDER et al., 2010).

Dependendo do seu tamanho de partícula, o TiO2 absorve a luz UV e, então, seus

elétrons reagem com o O2 para produção de O2•-, enquanto os espaços vazios da banda de

valência oxidam os grupos -OH para gerar radicais •OH, que, por sua vez, quando são

produzidos dentro do citoplasma celular originam radicais CO2•-, que, posteriormente,

oxidam outros componentes celulares e formam outros radicais prejudiciais à célula

(SERPONE et al., 2007; FUJISHIMA et al., 2008).

Quando ambas as cepas foram tratadas com TiO2 de menor tamanho de partícula,

maior foi a reflexao da radiação UV, conferindo maior fração de sobrevivencia celular,

porém maior foi a indução de mutantes CanR, conferindo a este filtro maior reatividade.

Os potenciais efeitos de citotoxicidade atribuídos às nanopartículas de filtros solares se

devem ao seu pequeno tamanho, à capacidade de escapar dos mecanismos de defesa

imunológica, à formação de complexos com proteínas e à geração de ERO. A toxicidade

das partículas é determinada pela sua reatividade superficial, o que significa que as

nanopartículas exibem uma área superficial de reatividade mais importante do que

partículas maiores e, portanto, são mais propensas a gerar ERO induzidas por UV

(GILBERT et al., 2013; SMIJS & PAVEL, 2011).

O aumento da mutagênese induzida destas cepas ocorre, pois na presença de

oxigênio, naturalmente encontrado nas células, o fotossensibilizador ativado pode reagir

com moléculas na sua vizinhança por transferência de elétrons ou hidrogênio, levando à

produção de radicais livres (reação do tipo I) ou por transferência de energia ao oxigênio

(reação do tipo II) (LAMBRECHTS et al., 2005; DEMIDOVA & HAMBLIN, 2005). Em

geral, a geração de 8-oxoG no DNA envolve o ataque de 1O2 e •OH, resultado de reações

de fotossensibilização dos tipos II e I (CADET et al., 2009).

124

Quando ambas as cepas foram irradiadas com UVB e a associação de TiO2 mais

ZnO, houve elevado aumento da eficácia de fotoproteção conferida pelo aumento da

dispersão da radiação UV pelos filtros inorgânicos, porém com elevado aumento da

indução de mutagênese. Lewicka e col. (2013) demonstraram que diferentes amostras de

TiO2 e ZnO quando irradiadas com UV são capazes de gerar ERO mesmo na ausência de

células, conferindo a estes atividade pró-oxidante per se (LEWICKA et al., 2013).

Ainda, eventos fotofísicos e fotoquímicos que ocorrem quando filtros inorgânicos,

tais como TiO2 e ZnO, são fotoativados pela absorção da radiação UV, conforme modelo

proposto pela Figura 41 (adaptado de SERPONE et al., 2007). In vitro, a fotoativação

destes filtros também é capaz de gerar danos DNA, especialmente nos resíduos de

guanina, que pode ser devido ao ataque por radicais •OH gerados através reações de

oxidação (HIRAKAWA et al., 2004).

Figura 41. Esquema ilustrativo da fotoativação de óxidos de metais semicondutores após

exposição à radiação UV (adaptado de SERPONE et al., 2007).

A combinação de ZnO/TiO2 é alarmante, uma vez que o ZnO é um fotocatalisador

capaz de aumentar a propriedade fotocatalítica do TiO2 e muitos filtros solares comerciais

contem mistura de nanopartículas de ZnO e TiO2 (GILBERT et al., 2013). Segundo a

ANVISA por meio da RDC n° 30 de 1 de junho de 2012, tanto o TiO2 o ZnO podem estar

presentes em formulações para proteção solar em até 25% (BRASIL, 2012), o que gera

uma controvérsia relacionada à segurança destes produtos e a necessidade de se

desenvolver novas formulações mais seguras para comercialização. De fato, o tratamento

com ambos os filtros foi citotóxico para levedura no escuro e gerou aumento expressivo

dos mutantes CanR formados pós radiação UVB ou LSS, sendo a mistura, portanto,

fotogenotóxica para a S. cerevisiae.

125

Diversos métodos tem sido propostos para reduzir a reatividade de nanopartículas

de TiO2 e a mais comum é revestí-la com substâncias orgânicas e/ou inorgânicas, que

inibem a formação de ERO e impedem o contato da superfície da molécula com água e

oxigênio (LEWICKA et al., 2013). No entanto, modificações químicas do TiO2 não

garantem eficácia na redução da fotorreatividade. Algumas partículas de TiO2

modificadas, desenvolvidas especialmente para formulações de proteção solar e

cosméticas, ainda mantem a atividade de toxicidade sob as condições experimentais

(TIANO et al., 2010).

Neste trabalho, foi feita associação de MMT-Na mais TiO2 ou ZnO, a fim de

diminuir a reatividade destas moléculas. Como a MMT-Na apresenta uma banda de

absorção larga na faixa do UV abaixo de 330 nm, atribuída a processos de transferência

de carga na estrutura cristalina da argila (DEL HOYO et al., 2001), quando se realiza a

intercalação do filtro na argila, é possível observar maior intensidade de absorção da

radiação UV no complexo formado do que nos materiais isolados (PAIVA et al., 2014).

Assim, ambas as cepas de S. cerevisiae foram tratadas com filtros inorgânicos

associados à MMT-Na e observou-se melhora na eficácia de fotoproteção para todas as

associações, porém houve acentuada diminuição na frequência de mutantes CanR quando

a MMT-Na foi associada às diferentes amostras de TiO2 e sob a forma de NS ou MF,

indicando maior inocuidade de fotoproteção. Aqui se destaca o NS que apresentou

atividade antifotomutagênica após radiação UVB. Nos ensaios da avaliação do potencial

fotoprotetor em leveduras, a presença do NS não aumentou a resistência ao UVB em

comparação com a MF desses materiais. Porém, a mutagênese das leveduras tratadas com

o NS reduziu drasticamente, superando a proteção contra os efeitos mutagênicos da

radiação UVB observada nas leveduras tratadas com a MF (PAIVA et al., 2014).

Para a tripla associação de MMT-Na mais TiO2 mais ZnO, houve aumento

expressivo de mutantes CanR, possivelmente devido à maior formação de ERO no meio

reacional e da elevada reatividade de ambos os filtros inorgânicos. De fato, já foi

demonstrado que a MMT-Na degrada corantes orgânicos pós-radiação UVA por meio da

formação de ERO e de oxidação via reação de Fenton (CHEN & ZHU, 2006). Sendo

assim, a MMT-Na que pode contribuir para o aumento do caráter oxidativo da tripla

associação.

126

Segundo o Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicologia e

segurança farmacológica necessários ao desenvolvimento de medicamentos publicado

pela ANVISA em 2013, os estudos de genotoxicidade para a associação de filtros solares,

geralmente, não são necessários se os componentes individuais da formulação tiverem

sido adequadamente testados com relação a esse aspecto (BRASIL, 2013). Porém,

observa-se neste trabalho que diferentes associações de filtros solares podem ser

prejudiciais ao modelo biológicos mesmo quando os filtros isolados apresentaram-se

inócuos.

Quando se compara os resultados obtidos para LSS com os obtidos para lâmpada

de UVB obtem-se diferenças nas respostas das cepas frente a um determinado

fotoprotetor. Esses resultados refletem a resposta fotobiológica diferencial a cada

espectro de radiação UV e às doses finais acumuladas nas irradiações com as lâmpadas

isoladas que são superiores as doses finais de cada espectro contido na LSS, o que

também contribui para essa variedade de resultados (DINIZ et al., 2019).

Após analisar os resultados obtidos com ambas às cepas tratadas com UVB e

LSS, somente a MF e NS formandos por MMT-Na mais TiO2 (Sigma) apresentaram

efeito cinético quanto à eficácia e inocuidade de fotoproteção. Paiva e col. (2014)

propuseram duas principais hipóteses plausíveis para as interações entre a MF e o NS: (i)

a mistura física de MMT e TiO2 pode reduzir a produção de ERO devido a um efeito de

eliminação mútua, provavelmente através de contato físico/aglomeração dificultando a

interação UV e levando a redução de mutagênese UV-induzida; (ii) O NS pode reduzir

em maior grau a quantidade de MMT e TiO2 livres e disponíveis, evitando a interação

com UV e levando a redução de mutagênese UV-induzida (PAIVA et al., 2014).

É plausivel afirmar que o NS formando por MMT-Na mais TiO2 (Sigma)

apresentou caráter antioxidante ao diminuir a geração endógena de ERO pós-tratamento

com LSS e radiação UVB. Este possível efeito é mais bem evidenciado ao se utilizar a

cepa selvagem FF18733, já que sendo a cepa mutante CD138 (ogg1) sensível ao estresse

oxidativo, não é possível verificar a diminuição na cinética de geração de ERO pós-

irradiação. Rowe e col. (2008) verificaram o acúmulo de ERO em células de S. cerevisiae

de diferentes backgrounds genéticos. Primeiramente, observaram que células deficientes

nos mecanismos de reparo NER e BER espontaneamente produzem mais ERO que a cepa

127

selvagem. Além disso, tal como observado no presente trabalho, esses pesquisadores não

atribuíram à geração de ERO papel somente no processo de morte celular, mas também

como uma resposta celular ao estresse genotóxico (ROWE et al., 2008).

A geração de ERO está envolvida na genotoxicidade e citotoxicidade causada por

nanopartículas (LONG et al., 2006; SINGH et al., 2009). Embora muitas ERO participem

de mecanismos de sinalização celular, a geração destas espécies em níveis elevados pode

danificar biomoléculas susceptíveis à oxidação, resultando em efeitos deletérios quanto à

integridade e funcionalidade das células. A peroxidação lipídica, por exemplo, pode

desestabilizar a membrana, o que pode conduzir à mutagênese e morte celular. Os

aldeídos insaturados, que são os produtos finais dessas reações, podem formar adutos de

DNA, lesões potencialmente mutagênicas, através da alquilação de bases nitrogenadas

(SCHUCH et al., 2017).

Diniz e col. (2019) compararam o uso de cepas selvagem e mutantes yno1, ogg1 e

duplo mutante ogg1yno1 tratadas com diferentes fontes de irradiação e observaram que a

ausência de determinados genes é capaz gerar maior incremento de mutação pós-LSS

e/ou pós-radiação UVB. Assim, o reconhecimento de lesões no DNA e sinalização para

reparo e síntese pela cepa selvagem FF18733 é importante para regular a resposta celular

ao estresse oxidativo (DINIZ et al., 2019). Dessa forma, foi necessário utilizar a cepa

selvagem FF18733 para confirmar o perfil antioxidante do NS formado por MMT-Na

mais TiO2 (Sigma) no modelo testado.

Era de se esperar que a diminuição da atividade pró-oxidante do UVB e LSS

conferida pelo uso do NS e MF, diminuísse também o incremento de mutagênese em

levedura, porém, como este resultado não foi obtido, sugere-se que a indução de mutantes

CanR ocorre não somente por lesões indiretas, como também por lesões diretas no DNA

das cepas. Vários estudos demonstraram a geração de CPDs e 6-4PPs no DNA,

diretamente induzidos por UVA com relevância comparável à mesma induzida por UVB,

indicando que tais lesões não são geradas exclusivamente por UVB (CORTAT et al.,

2013; MOURET et al., 2010).

Após avaliação da eficácia e segurança de fotoproteção e perfil antioxidante em

modelo de S. cerevisiae, diferentes formulações cosméticas contendo o NS ou MF foram

obtidas por emulsificação. Cada filtro UV possui seu espectro de absorção característico,

128

por isso é comum ter mais de um filtro por formulação para aumentar o espectro de

proteção por ação sinérgica ou aditiva (GONZÁLEZ et al., 2008).

Conforme especificados pela RDC 30/2012 da ANVISA (BRASIL, 2012), todas

as formulações obtidas apresentaram comprimento de onda crítico maior que 370 nm e

razão UVA/UVB de proteção maior que 0,33, configurando um produto que apresenta

ampla proteção UVA/UVB (BRASIL, 2012). O comprimento de onda crítico é um dos

parâmetros que descrevem até que ponto os produtos de proteção solar podem ser

considerados de amplo espectro. Com um fundo na curva de absorção (de 290 a 400 nm),

o comprimento de onda crítico é definido como o ponto em que 90% da área de radiação

UV é absorvida/refletida pelo produto (DIFFEY, 1994).

Além disso, de acordo com a RDC nº 47, de 16 de março de 2006, a concentração

de cada filtro solar presente nas formulações está dentro do limite máximo permitido pela

ANVISA para estes componentes (BRASIL, 2006), como observado no Quadro 11.

Quadro 11. Concentração máxima permitida e faixa de absorção UV de diferentes filtros

orgânicos e inorgânicos a serem utilizados em formulações para proteção solar (adaptado

de BRASIL, 2006).

Substância (Nomenclatura INCI)

Concentração

máxima

permitida

Faixa de

absorção

4–Metoxicinamato de 2–etilhexila

OCTIL METOXICINAMATO 10% UVB

2–Ciano–3, 3’–difenilacrilato de 2–etilhexila

OCTOCRILENO 10% UVB

Éster hexílico do ácido 2-[4-(dietilamino)-2-

hidroxibenzoil]-,benzoico

DIETILAMINO HIDROXIBENZOIL HEXIL

BENZOATO

10% UVA/UVB

Dióxido de titânio 25% UVA/UVB

Óxido de zinco 25% UVA/UVB

INCI: International Nomenclature of Cosmetic Ingredient.

129

De acordo com os resultados apresentados e discutidos, a formulação para

proteção solar contendo o NS formado por MMT-Na mais TiO2 (Sigma), apresentou

elevado FPS com a vantagem de ser mais eficaz e segura em termos de

fotogenotoxicidade, e com perfil antioxidante durante todo o tratamento, para o modelo

de S. cerevisiae utilizado. Assim, o modelo adotado permitiu distinguir a eficácia e

inocuidade das substâncias testadas, sendo a cepa mutante CD138 (ogg1) um bom

bioindicador a ser usado em estudos preditivos de fotoproteção, que avaliem o potencial

fotomutagênico de substâncias presentes em formulações tópicas ou de fármacos que

possam causar efeitos fototóxicos após exposição à luz solar, e a cepa selvagem FF18733

um bom bioindicador para efeito antioxidante conferido a estes filtros.

130

7. CONCLUSÕES

No presente trabalho foi caracterizada a MF e o NS formados por MMT-Na mais

TiO2 (Sigma) e avaliado o perfil fotoprotetor utilizando como modelo de estudo o micro-

organismo eucarioto S. cerevisiae.

Em relação aos filtros inorgânicos usados e o nanossistema e misturas físicas

obtidos, o conjunto de resultados apontou que:

A MMT-Na foi capaz de neutralizar efeitos citotóxicos de partículas de ZnO e

TiO2 não irradiados;

De forma geral, o TiO2 apresentou efeito majoritariamente genotóxico, devido ao

aumento do número de mutantes CanR e ZnO efeito majoritariamente citotóxico,

devido ao aumento da letalidade celular;

O TiO2, ZnO, em diferentes tamanhos de partícula, e MMT-Na não devem ser

utilizados como filtros físicos isoladamente ou em associação para fotoproteção;

A melhor associação para fotoproteção foi o NS obtido pela reação entre MMT-

Na mais TiO2 (Sigma);

NS formado pela reação de MMT-Na mais TiO2 (Sigma) pode atuar como

sequestrador de ERO protegendo as cepas irradiadas com UVB e LSS ou tratadas

com H2O2;

As formulações desenvolvidas para fotoproteção obtiveram FPS elevado com a

vantagem de apresentarem efeito antimutagênico e maior segurança em relação à

genotoxicidade e efeito antioxidante, principalmente conferidos ao NS.

Em relação ao modelo biológico de levedura utilizado para análise da eficácia,

segurança e perfil antioxidante dos ativos para fotoproteção, o conjunto de resultados

apontou que:

Ambas as cepas de S. cerevisiae são resistentes a doses de radiação UV

equiparáveis às doses obtidas pela radiação solar natural;

O modelo de levedura utilizado é sensível a ponto de evidenciar as diferenças

biológicas implicadas quando da irradiação com UVB e LSS;

131

O uso da cepa selvagem FF18733 revelou que a proficiência em todos os

mecanismos de reparo de DNA pode ser deletéria para a célula quando irradiada

na presença de agentes fotoprotetores geradores de danos oxidativos;

O dano gerado por UVB e LSS induz aumento intracelular de ERO nas cepas

FF18733 selvagem e mutante em CD138 (ogg1);

O modelo foi capaz de determinar a eficácia e inocuidade das substâncias

testadas, sendo a cepa mutante CD138 (ogg1) o melhor bioindicador para

triagem/screening da segurança, e a cepa selvagem FF18733 o melhor

bioindicador para avaliação do efeito antioxidante, de candidatos a novos ativos

para fotoproteção.

De forma geral, os dados apresentados indicam a importância da triagem de novos

ativos para fotoproteção que sejam não somente eficazes, mas também seguros para

utilização e comercialização, a fim de diminuir a incidência de câncer de pele na

população pela exposição solar elevada. Ainda, o modelo de S. cerevisiae utilizado

corrobora o Princípio dos 3R’s, sendo uma alternativa econômica e cientificamente viável

na avaliação da cito/fototoxicidade e geno/fototoxicidade de novos fármacos e

cosméticos e no desenvolvimento de novos ativos fotoprotetores.

132

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