cromatografia-aula

CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA

LaboratLaboratóório rio

de Qude Quíímica mica

OrgânicaOrgânica

DefiniDefiniçção Geralão Geral

� A cromatografia é um método físico-químico de separação que se fundamenta na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis: fase móvel (gás, líquido ou um fluido supercrítico) e fase estacionária (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfície sólida).

Transporte dos componentes de Transporte dos componentes de

uma amostra por uma fase muma amostra por uma fase móóvel vel

atravatravéés de uma fase estacions de uma fase estacionááriaria

�A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação.

�A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura.

Histórico

� 1906 o botânico russo Mikhail Tswett descreveu suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas.

� Os termos cromatograma, cromatografia, método cromatográfico aparecem em dois trabalhos descrevendo suas experiências para separar pigmentos de um extrato de folhas (clorofila e xantofila) e gemas de ovo, utilizando uma coluna de vidro empacotada com CaCO3 finamente dividido (fase estacionária) e éter de petróleo (fase móvel). A separação dos componentes pode ser verificada por meio de faixas coloridas na coluna.

éter depetróleo

CaCO3

mistura depigmentos

éter depetróleo

CaCO3

mistura depigmentos

pigmentosseparadospigmentosseparados

Cromatografia (grego)

kroma [cor] + graph[escrever]

� Apesar do estudo de Tswett e de outros anteriores que poderiam ser considerados precursores do uso dessa técnica, a cromatografia foi praticamente ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticação, resultando no seu grande potencial de aplicação em várias áreas.

Mikhail Semenovich Tswett

(1872-1919)

ClassificaClassificaçção dos Mão dos Méétodos todos

cromatogrcromatográáficosficos

Cromatografia

Planar Coluna

Centrífuga(Chromatotron)

CPCCD Líquida GasosaCSC

Clássica CGCLAE CGAR

� Segundo a forma física do sistema cromatográfico: cromatografia planar, cromatografia em coluna e centrífuga.

� Segundo o modo de separação:adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.

Exemplos de fases estacionárias

� Segundo a fase estacionária utilizada: fase estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas.

Esqueletos fósseis

(SiO2 + óxidos

metálicos) de algas

microscópicas

� Segundo a fase móvel empregada:

Cromatografia líquida – Na cromatografia líquida clássica (CLC), a fase móvel é arrastada através da coluna apenas por força da gravidade, enquanto que na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para eluição da fase móvel.

Cromatografia gasosa - As separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa simples (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre as duas reside nos tipos de colunas utilizadas. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na coluna.

Cromatografia supercrítica (CSC) - Utiliza-se um vapor pressurizado, acima da sua temperatura crítica.

Partição entre líquidos e superfície ligada

Espécies quimicamente ligadas a uma superfície sólida

Fase líquido-ligado

Partição entre fluido supercrítico e superfície ligada

Espécies orgânicas ligadas a uma superfície sólida

Fase móvel fluido supercrítico

Cromatografia com fluido supercrítico

AdsorçãoSólidoGás-sólido

Partição entre o gás e superfície ligada

Espécies ligadas a uma superfície sólida

Gás-ligadoCromatografia gasosa

Partição entre gás e líquido

Líquido adsorvido em um sólido

Gás-líquido

Partição ou filtração

Liquido em interstícios de sólido polimérico ou gel polimérico

Exclusão por tamanho ou gel filtração

Troca iônicaResina de troca-iônica

Troca iônica

AdsorçãoSólidoLíquido-sólido ou adsorção

Cromatografia Líquida

Partição entre líquidos imiscíveis

Líquido adsorvido em um sólido

Líquido-líquido ou partição

Tipo de equilíbrio

Fase EstacionáriaMétodoClassificação

CentrCentríífuga fuga -- CHROMATOTRONCHROMATOTRON

� Chromatotron é uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente.

� Foi desenvolvida pelos autores do Compendium of Organic Synthetic Methods. Substitue as CCD preparativas, pequenas colunas e HPLC. Com dimensiões ~ 30 cm.

� US Patent no. 4139458. Pendentes em outros países

PrincPrincíípio de operapio de operaççãoão

� A amostra a ser separada é aplicada como uma solução no centro do disco giratório umedecido com o solvente.

� A eluição com solvente gera bandas circulares de separação dos componentes que são removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepção.

� Capacidade: 500 mg por componente, cerca de1 g total.

� Adsorventes: Silica gel, alumina e silica gel - nitrato de prata.

� Solventes: Compatível com todos os solventes comumente usados nas outras técnicas cromatográficas, inclusive ácido acético. Não apropriada para uso com ácidos minerais.

� Vantagens especiais: * Não aplicação de “spot” ou raspagem de bandas. * Separações são rápidas, cerca de 20 min. * Permite a observação direta por UV ou de compostos coloridos durante a eluição. * Camadas finas de 1, 2 or 4 mm apresentam alta capacidade.* Utiliza-se pouco solvente e a eluição por gradiente é fácil. O solvente é regenerado in situ, podendo ser re-utilizado. * Atmosfera de nitrogênio previne oxidação das amostras. * Compacta (facilmente removida de um laboratório para outro), poucos controles e não necessita altas pressões. * Baixo preço. Chromatotrons custam menos que um simple HPLC preparativo.

Cromatografia em PapelCromatografia em Papel

� A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição líquido–líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido. O suporte é saturado em água e a partição se dá devido à presença de água em celulose (papel de filtro). Este método, embora menos eficiente que a CCD, é muito útil para a separação de compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica.

� Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, etc)

� Cromatografia em papel com fase normal (papel ésaturado com a fase estacionária polar, p. ex. água) e com fase reversa (papel é tratado com outro líquido, p.ex.: acetona e dimetilformamida, parafina, óleo, silicone, solventes orgânico).

Cromatografia em Camada DelgadaCromatografia em Camada Delgada

� A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação dos componentes da mistura ocorre em função da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixo numa superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquido ou misturas de líquidos).

� O fenômeno é principalmente de adsorção (partição ou troca iônica), a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária. Os adsorventes comerciais mais utilizados são: sílica, alumina, celulose, terra diatomácea e poliamida.

� Utiliza-se pequena quantidade de amostra (microgramas a miligramas). As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.

� A CCD pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa.

� Por ser um método simples, rápido, visual e econômico, a CCD é a técnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reações orgânicas, sendo também muito utilizada para a purificação de substâncias e para a identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica.

� O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6.

Cromatografia em ColunaCromatografia em Coluna

� A cromatografia em coluna é uma técnica usada para a separação de muitos compostos orgânicos. Essa técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas.

� Utiliza-se tubos de vidro compactado com um material polar finamente dividido (suporte sólido ou fase estacionária), em geral, alumina ou silicagel, empacotado com um solvente orgânico ou uma mistura de solventes.

� Uma solução contendo o composto que se deseja purificar é aplicada na superfície superior da fase estacionária, e após eluição coletar frações com volume predeterminados, as quais muito provavelmente conterão os componentes da mistura separados.

� Velocidade na qual um composto éeluido da coluna depende de sua polaridade, da polaridade da fase estacionária e da polaridade do solvente utilizado como eluente. Se o composto é mais atraído pela fase estacionária do que pelo solvente, ele migrará mais lentamente da coluna. Caso contrário, se o composto tiver maior afinidade pelo solvente ele migrará mais rapidamente da coluna, gastando menos tempo e solvente. O êxito de uma coluna dependerá então da escolha de um suporte e solvente adequados para a sua realização.

� Atualmente a técnica mais utilizada pelos químicos orgânicos para a separação de uma mistura de compostos é a cromatografia rápida: Coluna Cromatográfica Rápida (flash-column chromatography) e Coluna Cromatográfica Rápida e a Seco (dry-column flash chromatografy)

Variantes rápidas da cromatografia em coluna

Cromatografia Gasosa de Alta Cromatografia Gasosa de Alta

ResoluResoluçção (CGAR) e Cromatografia ão (CGAR) e Cromatografia

LLííquida de Alta Eficiência (CLAE)quida de Alta Eficiência (CLAE)

Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa

� O principal mecanismo de separação da Cromatografia Gasosa (CG) está baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida. A utilização de fases estacionárias sólidas, as quais levariam à separação por adsorção, apresenta poucas aplicações.

� A cromatografia gasosa é uma das técnicas analíticas mais utilizadas. Além de possuir um alto poder de resolução, émuito atrativa devido à possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas (10–9 a 10-12 g).

� A grande limitação deste método é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente, embora amostras não voláteis ou instáveis possam ser derivadas quimicamente.

Modelo de um CG moderno

Funcionamento do CromatFuncionamento do Cromatóógrafo Gasosografo Gasoso

� A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás adequado denominado de fase móvel ( FM) ou gás de arraste.

� O fluxo de gás com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase estacionária FE (coluna cromatográfica), onde ocorre a separação da mistura.

� A FE pode ser um sólido adsorvente (Cromatografia Gás-Sólido) ou, mais comumente, um filme de um líquido pouco volátil, suportado sobre um sólido inerte (Cromatografia Gás-Líquido com Coluna Empacotada ou Recheada) ou sobre a própria parede do tubo (Cromatografia Gasosa de Alta Resolução).

Esquema de um CG e de um cromatograma

Equipamento bEquipamento báásico de um sico de um

cromatcromatóógrafo a ggrafo a gáás s

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

� Na cromatografia gás-líquido (CGL), os dois fatores que governam a separação dos constituintes de uma amostra são:

� a solubilidade na FE: quanto maior a solubilidade de um constituinte na FE, mais lentamente ele caminha pela coluna.

� a volatilidade: quanto mais volátil a substância (ou, em outros termos, quanto maior a pressão de vapor), maior a sua tendência de permanecer vaporizada e mais rapidamente caminha pelo sistema.

� As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas no gás de arraste e passam por um detector; dispositivo que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluido. O registro deste sinal em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias aparecem nele como picos com área proporcional à sua massa, o que possibilita a análise quantitativa

Exemplo de um cromatograma.

Constituintes bConstituintes báásicos de um sistema sicos de um sistema

cromatogrcromatográáfico e cuidados especiaisfico e cuidados especiais

� Reservatório de Gás de Arraste. O gás de arraste fica contido em cilindros sob pressão. O parâmetro mais importante para escolha do gás é a sua compatibilidade com o detector. Os gases mais empregados são H2, He e N2 e a vazão do gás de arraste, que deve ser controlada, é constante durante a análise.

� Sistema de Introdução de Amostra. A a introdução da amostra éfeita no injetor (ou vaporizador). Na versão mais simples, trata-se de um bloco de metal conectado à coluna cromatográfica e àalimentação de gás de arraste. Este bloco contém um orifício com um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostraslíquidas ou gasosas podem ser injetadas com microseringas hipodérmicas. Amostras sólidas podem ser dissolvidas em um solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a uma temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da amostra, para que a amostra se volatilize completa e instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposição da amostra.

� A quantidade de amostra injetada depende da coluna e do detector empregado. Para colunas empacotadas, volumes de 0,1 µl a 3,0 µl de amostra líquida são típicos. Volumes altos prejudicam a qualidade de injeção (alargamento dos picos) ou saturam a coluna cromatográfica. Para a cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR), os volumes de injeção deveriam ser da ordem de nanolitros.

� Coluna Cromatográfica e Controle de Temperatura da Coluna. A amostra deve entrar na coluna na forma de um segmento estreito, para evitar alargamento dos picos. Após injetada e vaporizada, a amostra éintroduzida na coluna cromatográfica, onde é efetuada a separação. Na CG a "afinidade" de um soluto pela FM édeterminada pela volatilidade do soluto, sua pressão de vapor, que é função da estrutura do composto e da temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se também a pressão de vapor e, por conseguinte, a "afinidade" de uma substância pela FM. O controle da temperatura deve ser rigoroso.

� Detector - Um dispositivo que indica e quantifica os componentes separados pela coluna. Um grande número de detectores têm sido descritos e usados em CG. Existem, entretanto, algumas características básicas comuns para descrever seu desempenho:

1. Seletividade. Alguns detectores apresentam resposta para qualquer substância diferente do gás de arraste que passe por ele. Estes são os chamados detectores universais. Por outro lado, existem detectores que respondem somente a compostos que contenham um determinado elemento químico em sua estrutura, que são os detectores específicos. Alguns detectores respondem a certas classes de compostos (detectores seletivos).

2. Ruído. São os desvios e oscilações na linha de base (sinal do detector quando só passa o gás de arraste). Pode ser causado por problemas eletrônicos, impurezas e sujeiras nos gases e no detector, etc.

3. Tipo de Resposta. Alguns detectores apresentam um sinal que é proporcional à concentração do soluto no gás de arraste; em outros, o sinal é proporcional à taxa de entrada de massa do soluto no detector.

4. Quantidade Mínima Detectável (QMD). É a quantidade de amostra mínima para gerar um sinal duas vezes mais intenso que o ruído. É uma característica intrínseca do detector. Quanto menor a QMD, mais sensível o detector.

5. Fator de Resposta. É a intensidade de sinal gerado por uma determinada massa de soluto, que depende do detector e do composto estudado. Pode ser visualizado como a inclinação da reta que correlaciona o sinal com a massa de um soluto (curva de calibração). Quanto maior o fator de resposta, mais confiável a análise quantitativa.

6. Faixa Linear Dinâmica. É a razão entre a menor e a maior massa entre as quais o fator de resposta de um detector para um soluto é constante, isto é, onde a curva de calibração é linear. Os dois detectores mais significativos em CG são o Detector por Condutividade Térmica (DCT) e o Detector por Ionização em Chama (DIC).

Detector por Condutividade TDetector por Condutividade Téérmica (DCT)rmica (DCT)

� O funcionamento do DCT é baseado no fato de que a velocidade de perda de calor de um corpo quente para um corpo mais frio éproporcional, dentre outros fatores, à condutividade térmica do gás que separa estes corpos. Um filamento metálico muito fino (de W, Au ou liga W-Re) é aquecido pela passagem de uma corrente elétrica constante. Este filamento fica montado dentro de um orifício em um bloco metálico (cela), aquecido à uma temperatura mais baixa que aquela do filamento, por onde o gás de arraste proveniente da coluna passa continuamente.

� Quando um componente é eluido da coluna, ele sai misturado com o gás de arraste e passa pelo detector. Se a condutividade desta mistura for diferente daquela do gás de arraste puro, o filamento passa a perder calor para o bloco numa taxa diferente daquela do equilíbrio. O aquecimento do filamento quando a amostra é eluida causa uma variação na sua resistência elétrica e a resistividade de um metal aumenta com a temperatura. O filamento é montado em um circuito de ponte de Wheatstone, que converte a variação na resistência elétrica do filamento numa variação de voltagem, que é coletada em um registrador gerando o cromatograma.

1. Bloco metálico; 2. Entrada de gás; 3. Saída de gás; 4. Filamento metálico; 5. Alimentação de corrente

� O DCT é um detector universal, sensível à concentração do soluto no gás de arraste. Geralmente, quando se usa DCT, o gás de arraste é He ou H2. Pelo fato destes gases terem condutividades térmicas altíssimas, as misturas gás de arraste mais o soluto sempre terão condutividades térmicas menores que a do gás de arraste puro, o que impede sinais negativos, além de se obter maiores fatores de resposta.

� Entretanto, o DIC é considerado um detector pouco sensível. A QMD de um modelo moderno, para propano, éde 400 pg/ml de gás de arraste, com faixa linear de 106. Apesar disso, o fato de ser universal, barato e de operação simples, o faz extremamente útil para análises que não necessitem de alta sensibilidade.

� Durante a queima de um composto orgânico, são formados diversos íons e como conseqüência, a chama resultante torna-se condutora de eletricidade. O funcionamento do DIC baseia-se neste fenômeno.

� O gás de arraste saindo da coluna cromatográfica é misturado com H2 e queimado com ar ou O2. A chama resultante fica contida entre dois eletrodos, polarizados por uma voltagem constante. Como a chama de H2 forma poucos íons, ela é um mau condutor elétrico e quase nenhuma corrente passa entre os eletrodos. Ao eluir um composto orgânico, ele é queimado e são formados íons na chama, que passa a conduzir corrente elétrica. A corrente elétrica resultante, da ordem de pA, é amplificada e constitui o sinal cromatográfico.

Cela de um detector por ionização de chama

Detector por IonizaDetector por Ionizaçção em Chama (DIC).ão em Chama (DIC).

� Quase todos compostos orgânicos podem ser detectados pelo DIC.

� Apenas substâncias não inflamáveis (CCl4, H2O) ou algumas poucas que não formam íons na chama (HCOOH) não dão sinal. Assim, ele é um detector praticamente universal. De um modo geral, quanto ligações C-H tiver o composto, maior a sua resposta (maior sensibilidade). Ele é muito mais sensível que o DCT, pois dependendo do composto, podem ser detectados entre 10 pg e 400 pg, com faixa linear dinâmica de 107. Provavelmente é o detector mais usado em CG.

Parâmetros fundamentais de um sistema de CGParâmetros fundamentais de um sistema de CG

� Retenção - O tempo de retenção (tr) é definido como o tempo transcorrido entre a injeção da amostra e o máximo do pico cromatográfico. Porém, mesmo que a substância não interagisse de forma alguma com a FE, o seu tempo de retenção não seria nulo, pois transcorreria algum tempo entre a sua injeção e a sua passagem pelo detector. O parâmetro que realmente reflete as características físico-químicas de retenção tempo de retenção ajustado (t’r), que é determinado composto é o tempo de retenção descontado do tempo morto, tm, (tempo que o gás de arraste demora para percorrer a coluna).

� Seletividade - Capacidade de um sistema diferenciar dois compostos, é definida por α, sendo uma característica que, na CG, é mais associada à coluna cromatográfica.

� Eficiência - A eficiência é expressa pelo número de pratos teóricos (n), que é calculada usando-se um parâmetro de retenção (o tr) e a largura do pico cromatográfico - no caso, a largura de base, wb. A altura equivalente a um prato teórico (h) édada pela razão entre o comprimento da coluna cromatográfica (L) e n.

� Resolução - A resolução entre duas substância é a razão entre a diferença das distâncias de migração e a média das larguras das bandas.

Se as larguras dos picos forem próximas, pode-se utilizar a simplificação

Na CG existe um grande nNa CG existe um grande núúmero de fases estacionmero de fases estacionáárias rias

llííquidas e squidas e sóólidas disponlidas disponííveis comercialmente, de modo veis comercialmente, de modo

que a natureza da FE que a natureza da FE éé a varia variáável mais importante na vel mais importante na

otimizaotimizaçção da seletividade.ão da seletividade.

� As FE líquidas são as mais empregadas em CG. FE sólidas (carvão ativo, sílica, peneiras moleculares e polímeros porosos) são aplicadas para separação de gases e compostos de baixo massa molar. Em princípio, para um líquido ser usado como FE em CG ele deve ser pouco volátil (pressão de vapor até 0,1 mmHg ou 13,332 Pa na temperatura de trabalho) e termicamente estável. Para esta fase ser empregada em uma separação em particular, ela precisa:

1. ser um bom solvente para os componentes da amostra, caso contrário o efeito será o mesmo de temperaturas de coluna excessivamente altas (os compostos ficarão quase que o tempo todo no gás de arraste, sendo eluidos muito rapidamente e sem separação);

2. ser um bom solvente diferencial, isto é, além de dissolver bem todos os constituintes da amostra, fazê-lo com solubilidades suficientemente diferentes para que eles possam ser separados; e

3. ser quimicamente inerte em relação à amostra.

� As FE mais populares são os silicones. Silicones são polímeros extremamente estáveis e inertes, o que os torna especialmente adequados à CG. Nesta classe, as polidimetilsiloxanas são os menos polares. A substituição dos grupos metila na cadeia por outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil, etc.) fornece FE com polaridades crescentes. Comercialmente, são disponíveis sob diversas denominações, muitas delas praticamente equivalentes. SE-30, OV-1 e DC-200 são nomes comerciais para polidimetilsiloxano de fabricantes diferentes.

� Outra classe de FE importante é a dos poliglicóis. São polímeros de etilenoglicol e epóxido, preparados com diferentes tamanhos de cadeia polimérica. São FE moderadamente polares, adequadas para separação de álcoois, aldeídos, éteres, etc. A denominação comercial "Carbowax" designa a série de poliglicóis mais conhecida (p.ex., Carbowax 20M é polietilenoglicol com massa molar média de 20.000.000 g/mol).

� Um terceiro grupo importante de FE é o dos poliésteres. São obtidos por condensação de diácidos com glicóis. São fases altamente polares. As fases mais comuns desta categoria são o succinato dedietilenoglicol (DEGS) e o adipato de dietilenoglicol (DEGA).

� A coluna cromatográfica é o local onde ocorre a interação entre a amostra e a FE. Existem duas geometrias básicas de colunas para CG: as colunas empacotadas (ou recheadas), e as colunas tubulares abertas (ou capilares).

� Nas colunas empacotadas, a FE líquida é depositada sob a forma de um filme fino e uniforme sobre partículas de um suporte adequado. O suporte deve ser um sólido poroso com grande área superficial, inerte e de boa resistência mecânica. O tamanho das partículas e dos poros deve ser o mais uniforme possível. O material mais empregado como suporte é a diatomite, esqueletos fósseis de algas microscópicas (diatomáceas), compostos principalmente de SiO2amorfa e traços de óxidos metálicos. A diatomite preparada para suporte de CG é comercializada com o nome de "Chromosorb", dentre outros.

� Para preparar uma coluna empacotada, o material de enchimento (FE sobre suporte) é colocado da forma mais uniforme e compacta possível ("empacotado") em um tubo de comprimento e diâmetro adequados. Os materiais mais usados para os tubos de colunas sãoo aço inox e o vidro, sendo o primeiro preferido pelo manuseio mais fácil. Se o material de enchimento não for colocado na coluna de forma compacta e uniforme, os espaços vazios resultantes funcionarão como câmaras de diluição para a amostra. O resultado serão picos mais largos e menor eficiência.

� O tamanho da coluna é variável. Tipicamente são usadas colunas com diâmetros internos de 1 mm a 4 mm e 1 m a 3 m de comprimento. Quanto maior a coluna, maior a eficiência; entretanto, também aumenta o tempo de análise. Colunas muito longas oferecem uma resistência muito alta à passagem de gás, exigindo pressões excessivamente altas. Além da natureza da FE e da qualidade do empacotamento, existem duas variáveis importantes que influem no desempenho de uma coluna empacotada:

A percentagem de FE no material de enchimento. A percentagem de FE sobre o suporte é um parâmetro que deve ser rigidamente controlado. Se a quantidade de FE for muito baixa, partes da superfície do suporte ficarão expostas à amostra, que poderá ser adsorvida. O resultado é o alargamento ou deformação dos picos. Quanto mais FE, maior a retenção. A seletividade também aumenta, porém às custas de aumento do tempo de análise e diminuição da eficiência.

O diâmetro das partículas do suporte. Quanto menor o diâmetro das partículas do suporte, maior a eficiência da coluna. A uniformidade das partículas também é importante. Recheios com partículas cuja distribuição de tamanho seja muito grande serão pouco eficientes. Se for usado suporte com partículas excessivamente finas, a resistência à passagem de gás será muito alta.

� A capacidade de processamento de amostra das colunas capilares é menor que aquela das empacotadas. Dependendo da coluna, ela pode ser saturada com quantidades tão pequenas quanto 0,001 µl de amostra. Como a injeção direta de volumes de amostra desta ordem de grandeza é inviável, deve-se recorrer ao artifício da divisão de amostra na injeção. Um inconveniente dessa metodologia é ajustar reprodutivelmente a razão de divisão (fração da amostra injetada que entra na coluna) o que pode acarretar erros na análise quantitativa. Além disso, amostras contendo constituintes com volatilidades muito diferentes podem ser alteradas pela divisão: a fração da amostra que realmente vai para a coluna fica enriquecida com os componentes menos voláteis.

� Dada a grande eficiência das colunas capilares, podem ser realizadas separações de misturas extremamente complexas: frações de petróleo, essências, amostras biológicas, etc. No caso específico de análises de interesse ambiental (poluentes em águas e ar, por exemplo), é quase que obrigatório o seu uso. A tendência atual é que a maioria das análises seja feita com o uso de colunas capilares. Isto não significa que as colunas empacotadas estão sendo abandonadas, porém o seu uso deve ficar restrito à aplicações específicas.

Cromatografia LCromatografia Lííquida de Alta Eficiência quida de Alta Eficiência

(CLAE)(CLAE)

� Em contraste à CG, o principal mecanismo de separação da cromatografia gasosa estábaseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel líquida e a fase estacionária sólida.

� A versatilidade desta técnica reside no grande número de fases estacionárias existentes, as quais possibilitam análises e separações de uma ampla gama de compostos com alta eficiência.

Modelo esquemModelo esquemáático de um equipamento btico de um equipamento báásico sico

de CLAEde CLAE

a) reservatório da fase móvel; b) bomba de altapressão; c) válvula de injeção; d) coluna;

e) detector e f) registrador.

Exemplo de cromatogramaExemplo de cromatograma

Perfil cromatográfico de uma análise registrada automaticamente, de padrões de aminoácidos. Fonte: Lehninger, 1990.

Funcionamento do cromatFuncionamento do cromatóógrafo lgrafo lííquidoquido

� As fase móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e degaseificadas antes de uso.

� A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado. A necessidade de uma bomba de alta pressão para eluição da fase móvel na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tendo sido no princípio denominada de cromatografia líquida de alta pressão.

� As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 mL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para preparativas.

� O comprimento das colunas é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação.

� As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas.

� O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de indíce de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente àluz plano-polarizada.

Registro de Dados na Cromatografia Registro de Dados na Cromatografia

LLííquidaquida

� O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador.

� Tanto na cromatografia gasosa (CG) quanto na cromatografia líquida (comumente de alta eficiência, CLAE) e a banda é registrada como um pico, que idealmente deve ter formato gaussiano.

Cromatograma mostrando aseparação dos enantiômeros do tetramisol,princípio ativo de vários medicamentosusados para ascaridíase.

Mecanismos das separaMecanismos das separaçções em CLAEões em CLAE

� As separações em CLAE podem se dar por adsorção, partição ou ambos. O suporte mais comumente utilizado é a sílica. O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.

� As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos. Na cromatografia em fase normal, a fase estacionária é mais polar que a fase móvel, e em fase reversa, a fase móvel é mais polar.

� Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa, sendo a fase C18 (octadecilsílica) a mais usada, ao passo que são preferidas fases que atuem no modo normal para fins preparativos, em vista de que separações no modo reverso utilizam fases móveis aquosas.

� Entre as fases quimicamente ligadas, merecido destaque deve ser dado às fases estacionárias quirais, as quais possibilitam a separação direta de enantiômeros. Para tanto, é necessária a presença de um seletor quiral como parte integrante da fase estacionária.

� Tem sido utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações.

UtilizaUtilizaçção da HPLC acoplado a tão da HPLC acoplado a téécnicas cnicas

espectroscespectroscóópicas na elucidapicas na elucidaçção estrutural ão estrutural

de produtos naturaisde produtos naturais

CromatCromatóógrafos acoplados grafos acoplados àà Espectrofotômetros Espectrofotômetros

de Massa: GCde Massa: GC--MS e HPLCMS e HPLC--MSMS

ESI and APCI HPLC/MS

HPLC - Diagrama esquemático

Exemplos desenvolvidos no IQExemplos desenvolvidos no IQ

Espectro de massa (CG/MS)Espectro de massa (CG/MS)

OCH3

I

I

C15H31

MM = 570

AnAnáálise quantitativa por cromatografialise quantitativa por cromatografia

� A análise quantitativa em cromatografia é baseada em estabelecer o valor da área da banda cromatográfica. Na cromatografia em coluna, isto é, gasosa (CG) e em cromatografia líquida (comumente de alta eficiência, CLAE) a banda é registrada como um pico que, idealmente deve ter formato gaussiano. Em cromatografia gasosa de alta resolução, onde são usadas colunas capilares, não é incomum que os picos tenham perfil gaussiano.

� Similarmente ao que ocorre na cromatografia em camada delgada (CCD), onde as manchas observadas tendem ao perfil gaussiano, isto é, aumentam das bordas para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro para a outra borda. Isto é mostrado na ao lado, em que as quantidades de analito numa mancha foram obtidas para secções verticais.

� Nas correspondentes bandas cromatográficas as quantidades dos analitos tendem ao perfil gaussiano, isto é, aumentam das bordas para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro para a outra borda.

� Quando a banda cromatográfica é registrada na forma de pico, a sua área pode ser calculada, como mostrado abaixo, como a área do triângulo isósceles que “engloba” o pico cromatográfico.

� Na cromatografia em camada delgada a área da mancha éestabelecida pelo princípio de densitometria. A densitometria faz a contagem do número de pontos de uma imagem.

� O procedimento e princípio de obter áreas em CCD a partir de imagens digitalizadas e arquivadas em computador . O número de pontos que define a mancha (como “vista”por um densitômetro ou computador) é proporcional áárea da mancha.

O princípio da densitometria

� As placas – no caso com manchas visíveis de corantes –são digitalizadas e com o arquivo gerado realiza-se a contagem dos pontos (pixeis é o termo usado na área de computação) que compõem cada mancha. A contagem pode ser feita manualmente – com muita paciência – ou por meio de um programa que conte os pixeis.

� O número de pontos éproporcional à área da correspondente mancha e, conseqüentemente, proporcional à quantidade de analito nela existente. Esta metodologia representa o princípio de estabelecimento de áreas cromatográficas.

Princípio do estabelecimento de área de uma mancha de CCD por meio de escaneamento da placa cromatográfica.

� Apesar do método de determinar áreas ser diferente para CG e CLAE, o princípio é o mesmo do usado em CCD. O princípio básico da quantificação é que a área dos picos registradas no cromatograma é proporcional à massa do composto injetada. Assim, é fundamental para a confiabilidade da análise que a área dos picos seja medida o mais exata e reprodutível possível. Existem vários modos de se medir a área de um pico cromatográfico:

1. Técnicas Manuais. Quando o cromatograma é coletado por um registrador analógico, usualmente a área dos picos (~triângulo isósceles) é medida manualmente. O procedimento mais empregado consiste em medir a altura do pico (h) e a sua largura de base (wb) ou à meia-altura (wh), e calcula-se a área pelas fórmulas usadas para cálculo de área de triângulo:

ou

2. Integradores Eletrônicos. Integradores são dispositivos baseados em microprocessadores que coletam o sinal cromatográfico, digitalizam-no (transformam o sinal elétrico em números), detectam a presença de picos e calculam a sua área. Integradores são muito mais precisos e rápidos que qualquer método manual de medida, desde que empregados convenientemente. Embora sejam dispositivos caros, quando é necessária rapidez na produção de resultados, o seu uso é quase mandatório.

3. Computadores. O integrador pode ser substituído por um computador, desde que este tenha um dispositivo para converter o sinal elétrico em números que possam ser guardados em memória (conversor analógico-digital), e se disponha de programas adequados para fazer a análise do cromatograma digitalizado. O custo de um computador com os acessórios necessários para coletar e analisar cromatogramas é, via de regra, inferior ao de um bom integrador. Além disso, com um software e operação adequada, pode fornecer resultados mais confiáveis que este último.

� Qualquer que seja o modo usado para medir a área dos picos, o procedimento geral de uma análise quantitativa por CG envolve a obtenção do cromatograma da amostra, a medida da área dos picos de interesse e o cálculo da massa correspondente a cada um dos picos. Este cálculo deve ser feito empregando uma curva de calibração: um gráfico correlacionando a área do pico com a massa do composto.

� A curva de calibração é obtida cromatografando-se padrões contendo massas conhecidas dos compostos a serem quantificados. Para cada substância, deve ser feita uma curva de calibração própria, já que cada composto responde de maneira diferente ao detector.

� O esquema geral proposto acima é chamado de padronização externa. Como é muito difícil conseguir boa reprodutibilidade entre injeções diferentes, ele é muitas vezes sujeito à grande imprecisão e inexatidão. Para contornar este problema, pode-se usar a chamada padronização interna, onde a cada solução a ser injetada adiciona-se uma quantidade exatamente igual de um composto que seja separável dos componentes da amostra, e que não exista nela (padrão interno).

O uso das O uso das ááreas cromatogrreas cromatográáficas ficas ––

A curva analA curva analííticatica

� É medindo-se as áreas cromatográficas que se estabelecem as quantidades de analitos em amostras analisadas e a melhor forma de realizar quantificações é a baseada numa Curva Analítica. A Curva Analítica é a relação entre sinais – no caso as áreas – e quantidades do analito a ser quantificado.

� Dispondo da equação da curva analítica pode-se calcular as quantidades do analito em amostras. As amostras a serem analisadas são preparadas da mesma maneira que as soluções-padrão, a corrida é realizada sob as mesmas condições usadas para o conjunto de padrões e as áreas do analito nas amostras são determinadas.

Esboço de uma Curva Analítica linear (representada pela equação de uma reta).

ObtendoObtendo--se uma curva analse uma curva analííticatica

� O primeiro passo para obter a curva analítica é preparar um conjunto de soluções com um padrão do analito que se deseja quantificar em amostras. Portanto, énecessário conhecer a identidade do analito e dispor dele na forma de padrão (puro ou, se isso não for possível, com pureza exatamente conhecida e determinada independentemente).

� Dispondo dos dados aplica-se a eles uma Regressão Linear para obter a equação da curva analítica, isto é, a relação funcional entre Sinais e Quantidades. Para o caso dos dados da Tabela, a equação de reta que relaciona as áreas com as concentrações do analito é:

Concentrações preparadas e áreas obtidas para as

correspondentes sinais cromatográficos

� Suponhamos que para uma amostra esta área foi estabelecida como de 184 pixeis. Este valor é substituído na equação da curva analítica e obtém-se a quantidade do analito na amostra (no caso a sua concentração).

� Note-se que a curva analítica édefinida como a relação entre sinais e quantidades; no entanto, na equação as quantidades são representadas pelas concentrações das soluções. Isto implica que os volumes de amostra aplicados na placa cromatográfica foram iguais, pois, C = Q / V (C= concentração; Q = quantidade; V =volume).

� Numa curva analítica interpolam-se resultados. As extrapolações não refletem resultados efetivamente quantitativos.

Gráfico da curva analítica obtida para os dados da tabelado.

Exemplos desenvolvidos no IQExemplos desenvolvidos no IQ

SeparaSeparaçção de mistura de oão de mistura de o-- e pe p--nitrofenol por CGnitrofenol por CG

� A separação do o- e p-nitrofenol por CG constitui-se um bom exemplo do efeito das interações intramoleculares sobre as propriedades físicas dos compostos. No isômero orto, os grupos OH e NO2 podem associar-se internamente por meio de ligações hidrogênio, transformando-se no componente menos polar.

OH

HNO3-H2O

OH

NO2

OH

NO2

+


Cromatogramas obtidos no CG-Varian, método 2. (a) CH2Cl2 puro. (b) o-Nitrofenol padrão dissolvido em

CH2Cl2.


Cromatogramas obtidos no CG-Varian, método 2: (a) p-Nitrofenol padrão dissolvido em CH2Cl2. (b) Mistura de o-e

p-nitrofenol dissolvido em CH2Cl2 obtida por meio da reação de nitração (HNO3-H2SO4).

Exemplos desenvolvidos no IQ Exemplos desenvolvidos no IQ

Acompanhamento de reaAcompanhamento de reaçção por anão por anáálise lise

cromatogrcromatográáfica no CGfica no CG

H2SO4

AcOH, H2O2

HO

OHO

HO

O

OH+

O

OOAntibiótico

macrolídeo

IBX,AcOEt,80oC

OI

O OH

OÁc. iodóxibenzóico

IBX



HO

OHO

HO

O

OH+



HO

OHO

O

OO

IBX,AcOEt,80oC

ExercExercíício de CLAE cio de CLAE -- ProvãoProvão

� A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos cromatográficos mais modernos utilizados em análise (CLAE analítica) e separação/purificação de misturas (CLAE preparativa). No próximo slide são dados os cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de compostos presentes em analgésicos: aspirina (A), cafeína (B), fenacetina (C) e paracetamol (D), utilizando três fases móveis diferentes, no modo isocrático, em uma mesma coluna. Avaliando esses cromatogramas, responda às perguntas abaixo.

(a) Qual a fase móvel mais apropriada para ser utilizada em escala preparativa, e a fase móvel mais adequada para utilização em escala analítica, considerando um grande número de amostras a serem analisadas? Justifique sua resposta.

(c) Sabendo-se que o composto mais polar elui primeiro, qual o composto de maior tempo de retenção? Justifique sua resposta.

(b) Qual o tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nestes três experimentos? Justifique sua resposta.

ReferênciasReferências

� COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográficos.5ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.

� DEGANI, A. L. G.; QUEZIA , B. C.; VIEIRA, P. C. Cromatografia – Um breve ensaio. Química Nova Na Escola. 1998, No. 7, 21.

� Pereira, A. S.; Radler, F. A. N. Estado da arte da cromatografia gasosa de alta resolução e alta temperatura. Química Nova, 2000, 23,

� ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDÃO, A.M. Determinação de cafeína em bebidas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Química Nova, 1995, 18, 379.

� Antônio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e Cássio Ricardo Fares Riedo - ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA Universidade Estadual de Campinas, Chemkeys.com.

� http://www.chromatotron.com/chromatotron/specs.html

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