Aula de Cromatografia Gasosa e GC/MS

Prof. Dr. Nilson Assuno

Lab. de Radicais Livres em Sistemas

Biolgicos

Lab. de espectrometria de Massas

http://www.unifesp.br/centros/proteomica/disciplina-de-pos-graduacao_espectrometria-de-massas

Tpicos

Introduo de mtodos cromatogrficos

Introduo de espectrometria de massas

Introduo da LC-MS

O que cromatografia?

AAAA

AAAA

AAA

BBBB

BBBB

BBB

CCCC

CCCC

CCC

Amostra Analitos separados

CLASSIFICAO

Cromatografia

em coluna

Cromatografia

gasosa

Fase Reversa

Inica

Fase normal Cromatografia

lquida

Excluso

molecular

Cromatografia

supercrtica

Um sistema de HPLC

Definio A cromatografia um mtodo fsico-qumico que permite a separao de componentes de uma mistura, atravs da

distribuio destes componentes em duas fases, que esto em contato.

Em todas as separaes cromatogrficas, a amostra dissolvida numa fase mvel (lquido, gs ou fluido supercrtico).

A fase mvel ento forada atravs de uma fase imiscvel, fase estacionria, a qual fixa na coluna ou em uma

superfcie slida.

Os componentes que so fortemente retidos pela fase estacionria movem devagar com o fluxo da fase mvel.

Em contraste, os componentes que interagem fracamente com a fase estacionria movem mais rapidamente.

Como conseqncia dessas migraes diferenciadas, os vrios componentes da mistura se separam em bandas

discretas e podem ser analisados qualitativamente ou quantitativamente.

HISTRICO I

Mtodo desenvolvido por Mikhail Tswett (1903);

Amostra: extrato vegetal;

Fase Mvel: ter de petrleo;

Fase estacionria: CaCO3.

EXPERIMENTO DE TSWETT

Cromatografia (chroma: cor; grafein: grafia)

HPLC /CLAE Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

HPLC High Perfomance (pressure) Liquid

Chromatography

Tipo de cromatografia que emprega uma fase mvel

lquida e uma fase estacionria finamente dividida e

que, para ter um fluxo razovel, opera a presses

elevadas.

HPLC Critrios de escolha Uma boa separao representa sempre um

balano entra as foras intramoleculares que se estabelecem entre amostra e fases estacionria e mvel.

Usar uma fase estacionria com polaridade semelhante amostra e uma fase mvel de polaridade muito diferente.

Alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separao.

HPLC Aspectos experimentais

Temperatura estvel para Tempos de Retenes reprodutveis.

Desgaseificao dos solventes Limite de deteco: menor concentrao detectvel

Limite de quantificao: menor concentrao determinda sem ambiguidade

Tailing: arrastamento do pico

Fonte:http://portuguese.alibaba.com/product-free-img/syringe-for-gc-hplc-275924568.html. Acesso 12/02/2011 s 21:58

Fonte:http://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/cromatografos/lc_ms/images/uflc11.jpg. Acesso: 16/02/2010 s 15:30.

http://www.environmental-expert.com/files/8995/images/vials1.jpg. Acesso 12/02/2011 s 21:50.

A B

C D Imagem frontal do empacotamento de uma coluna C18,

tamanho de partcula, porosidade 30 nm. Ampliao: A = 3000

vezes; B = 5000 vezes (1015 m); C = 4000 vezes e D =

8000 vezes (3,5 m)

Cromatografia de fase normal Fase estacionria polar/ fase mvel no polar o soluto

menos polar elui primeiro

Cromatografia de fase reversa + de 75% das aplicaes

Fase estacionria no polar / fase mvel polar / soluto mais polar elui primeiro

Pr-colunas Aumento da vida das colunas

Mesma (similar) composio da fase estacionria / maior granulometria

Remoo de particular e contaminantes dos solventes. Saturao da fase mvel com a fase estacionria.

Forno de colunas TA 150c (temperatura ambiente ou

ligeiramente acima- na maioria das aplicaes) Maior a temperatura menores os tempos de reteno Maiores temperatura causam maior degradao da

coluna

Fonte:http://www.stecinstruments.com/produtos/equipamentos/analiticos/cromatog_liquida/hplc.htm. Acesso 12/02/2011 s 21:32.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 min

0

10 0

20 0

30 0

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50 0

60 0

70 0

mV

ch3

1

2

3 45

6

7

Volume/tempo morto

Pico

Linha de base

Integrao

Escala do detector

Tempo de corrida

Interpretao de Resultados

HPLC - Detectores Um detector ideal deve ter: Alta sensibilidade e baixo limite de deteco; Resposta rpida a todos os solutos; Insensibilidade a mudanas nas temperatura e na

vazo da fase mvel;

Resposta independente da fase mvel; Resposta que aumente linearmente com a

quantidade do soluto;

No destruio do soluto; Segurana e convenincia de uso; Informao qualitativa do pico desejado.

Ultra Violeta (UV)

Comprimento de onda:180 600 nm;

Faixa de concentrao - ug/L;

DAD (arranjo de diodos);

Adequado para a grande maioria dos compostos orgnicos;

Praticamente universal

HPLC - Detectores Detectores eletroqumicos

Amperomtrico O elemento flui pela superfcie do eletrodo onde uma frao das espcies

eletroativas oxidada ou reduzida (15-20%).

Coulomtrico O elemento flui atravs de um eletrodo de grafite poroso onde praticamente

100% das espcies eletroativas so oxidadas ou reduzidas e portanto a sensibilidade muito maior

(10-15mol=fentomol) .

vantagens Alta sensibilidade Alta seletividade bons para as anlises de traos.

Desvantagens Neste tipo de deteco, a amostra tem que ser constituda de ons ou

compostos que sofram ou oxidao ou reduo

HPLC - Detectores

Curva de calibrao (calibrao externa):

Uma tcnica comparativa de padro em relao a

amostra atravs da criao de equaes de 1o ou 2o grau;

Injeo de padres de concentrao conhecida;

Recomendvel a utilizao de 6 pontos com repetibilidade e determinao da faixa de anlise.

Anlise Quantitativa

Parmetros da curva de calibrao:

Desenvolvendo um mtodo

Amostras (padro)

Introduo LC/MS

1. Producao de ions oriundos de uma amostra em um fonte de ions;

2. Separar estes ions de acordo com a relacao massa/carga pelo analisador de massas;

3. Eventualmente fragmentar estes ions selecionados atraves de um secundo analisador;

4. Detectar estes ions oriundo do sistema de deteccao e informando em razao a abundancia dos mesmos atraves da conversao

desta intensidade em sinal eletrico;

5. Este processo atualmente e realizado com auxilio de computadores e softaware dependendo da complexidade da amostras

existe uma grande quantidades dos mesmo.

6. A Analise (tratamento de dados) pode ser rapida ou extramente longa.

Espectrometria de Massas

Analyzer Detector

Data system

Source

Inlet

Ionization Analiser (m/z) Detector

Sample introduction

m/z

0 50 100 150 200 250

Ion

Ab

un

dan

ce (

%)

0

20

40

60

80

100

- EI (GC/MS)

- IC (GC/MS)

- ESI (LC/MS)

- APCI (LC/MS)

- APPI (LC/MS)

- MALDI

- HPLC

- GC

- CE

- Quadrupole

- Ion trap

- TOF (time of flight)

- Hybrids (Quad-Tof)

- QqQ

- Electron multiplier

- MCP (microchannel

plate)

Mass spectrum

Espectrometro de Massas

H

+

Ionizacao positiva

[M+H]+ = 181

-

Ionizacao negativa

[M-H]- = 179

MM = 180 Da

C9H8O4

181

m/z

I

Mass Spectrum 179

m/z

I

Mass Spectrum

Resultado

Intensidade do carater ionico;

Constante de Ionizacao (Ka ou Kb);

(pKa=4, pka = 200);

Condicao do meio reacional;

Volatilidade.

Natureza das moleculas

(propriedades)

Identificar composto somente?

Quantificar?

Os dois?

Objetivo do meu experimento

Pequenas moleculas (Metabolitos);

Media moleculas (peptideos);

Grandes Moleculas (proteinas, DNA);

Lipideos;

Glicoproteinas, lipoproteinas

Caracteristicas da amostra

Um grande numero de cientistas tem desenvolvido a espectrometria de massas, mas

os grandes pioneiros foram E. GOLDSTEIN

que descobriu o raios anodicos (ions em fase

gasoso) e em 1897: J.J. THOMSON discobriu o

eletron e determinou sua relacao

massas/carga.

1913 - Thompson demonstrou um equipamento que foi considerado o primeiro

especrometro de massas.

O experimento inicial

A origem

Introduo

LC provm a separao, em fase lquida, de misturas complexas, porm dificilmente fornece

a identificao positiva de componentes

individuais.

MS uma tcnica que auxilia na elucidao estrutural de compostos em fase gasosa, porm

dificilmente apropriado para a anlise de

misturas.

LC opera em fase lquida enquanto que MS opera em fase gasosa, sob alto vcuo.

Introduo

O uso de uma interface necessrio para ter compostos seqencialmente

separados em LC e introduzidos para

anlise no MS.

Um bom sistema LC/MS pode fornecer informaes quali e quantitativas,

geralmente com diminutas quantidades de

material.

Cromatografia Lquida

Misturas em MS

Combinando LC com MS

Aquisio dos Dados

Velocidade de varredura

Aquisio dos Dados

Nmero de espectros por pico

Melhorando os Resultados

Obter a maior eficincia possvel


Apresentao de cromatograma de

on selecionado


Monitoramento de on selecionado (SIM)

Sumrio

O interfaceamento de LC com MS resulta em um poderoso instrumento de LC/MS

que pode ser usado para anlises de

misturas complexas, originada das mais

variadas fontes.

Aplicaes de interesse nas reas de meio ambiente, arqueologia, mdica, e

forense, alm de qumica e bioqumica.

0

1

2

3

4

5

Int. 744.5

586.3

100 200 300 400 500 600 700 m/z 0

0.5

1

1.5

2

Int. 586.4

528.2

186.1

686.3

MS

MS/MS of m/z 744

Cromatografia Lquida Acoplada


LC/MS

Espectrometria de Massas Interfaces Analisadores de Massas

I. Espectrometria de Massas (MS)

A espectrometria de massas uma

tcnica analtica instrumental utilizada

para a anlise, em fase gasosa, de tomos

ou molculas de uma amostra que so

ionizados e separados de acordo com a

razo massa/carga quando submetidos a

condies especficas de um campo

eltrico e/ou magntico.

I. Espectrometria de Massas (MS)

A determinao da massa molecular;

A caracterizao estrutural;

O estudo da reatividade em fase gasosa;

A anlise qualitativa e quantitativa dos componentes de uma

mistura complexa;

A estrutura de compostos inorgnicos, orgnicos e biolgicos;

A estrutura e composio de superfcie slida;

A razo isotpica de tomos na amostra.

II. O Espectro de Massas Processo de ionizao e/ou fragmentao

Separao dos ons

Deteco e anlise

Amostra

Sistema de

introduo

de amostra

Fonte

de ons

Analisador

de massas Detector

Proc. de

dados

Sistema

de vcuo

Etil benzeno: MM = 106 Da

C6H5CH2CH3 + e- C6H5CH2CH3

+ + 2e-

Informaes do Espectro de

Massas

Separao dos ons pela razo massa/carga

Pico do on molecular

Pico do on base (100%)

Padro de fragmentao

Razo isotpica

III. Fontes (Processos) de

Ionizao

Tipo

Bsico

Nome e Sigla Agente Ionizante

Fase Gasosa Impacto Eletrnico (EI) eltrons energticos

Ionizao Qumica (CI) ons gasosos

Ionizao de Campo (FI) eletrodo alta voltagem

Dessoro Dessoro de Campo (FD) eletrodo alta voltagem

Ionizao electrospray (ESI) alto campo eltrico

Ionizao/dessoro laserassistido por matriz

(MALD/I)

feixe de laser

Bombardeamento de tomosrpidos (FAB)

feixe tomosacelerados

Ionizao termospray (TS) alta temperatura

Impacto Eletrnico

A amostra passa por uma cortina de eltrons acelerados por um campo de 70 eV

E = 70 eV 7 103 kJ mol-1

Energia de ligao tpica 200 - 600 kJ mol-1

Fragmentao

Impacto Eletrnico

Impacto Eletrnico

Alta produo de ons - boa sensibilidade

Fragmentao auxilia na identificao

Requer amostra voltil

Pico on molecular nem sempre evidente

Uso de Ionizao Qumica (CI):

produo de on molecular e a fragmentao mais amena

Reprodutibilidade de fragmentao

Ionizao Presso Atmosfrica (API)

Ionizao Electrospray (ESI)

Ionizao Qumica Presso Atmosfrica (APCI)

Vantagens API

Informao sobre a massa molecular (MM) dos

compostos, inclusive grandes biopolmeros.

Sensvel; MM obtida com baixos nveis de analitos.

A tcnica compatvel com molculas volteis, no volteis, polares e apolares.

Excelente para confirmao de compostos conhecidos.

Ionizao por Electrospray (ESI)

Ionizao presso atmosfrica e temperatura ambiente

Aplicao de campo eltrico de vrios kV promove a ionizao das gotculas do spray

Um contra fluxo de gs secante reduz o tamanho das gotculas at o seu colapso

eletrosttico

Produo de ons com elevado nmero cargas

Interface ESI

Processo de Ionizao

Aplicaes do ESI

Anlise de compostos polares e com elevada massa

Molecular. Por Exemplo: Saponinas

O

HO

OH

OH

O

OHO

OH

O

O

OH

CH3

CH3CH3

CH3

CH3 OH

CH3

H

O

HOH

H

O

O

H

O

O

400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

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%

0

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1351.21391.9

1352.21394.0

1434.11395.1

1470.0


1271.61230.1

1188.0966.1923.9749.4520.7499.7 603.9 881.9 1002.1 1146.01041.8

1230.81272.9 1356.1 1392.0

1398.01436.0 1488.1

sep1162Fs 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ES- 1.81e5966.1

965.6924.0

749.5

603.4471.4863.6

750.5836.9

881.9

924.6

966.5

967.1

1008.0 1042.21407.41338.71141.0


923.6

882.0503.5

455.3863.9749.6603.3 665.4

883.1

924.5

965.7

945.0 1298.91019.9967.6 1041.8

1154.61097.3 1265.3 1468.4


882.0864.0749.4471.8440.7

966.1

945.1 966.6

1004.1 1386.81037.9 1080.0 1407.4

Figura 18: Conjunto de espectro de massas das fraes eludas com MeOH/H2O (1:1).

Debaixo para cima: frao 12, 24, 49 e 62.

Monitoramento da composio de fraes

obtidas de extratos de Sapindus saponaria

Ionizao Qumica Presso

Atmosfrica (APCI)

Bastante similar a ESI

Indicado para obteno de MM de compostos conhecidos (confirmao de sntese de

biblioteca combinatria), porm induo de

fragmentao tambm possvel

Compatvel com grande faixa de fluxos de fase mvel

Robusto para desenvolvimento de mtodo

Interface APCI

Principais Diferenas entre

APCI e ESI

Mecanismo de Ionizao:

Enquanto ESI tem voltagem aplicada ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador

aquecido e pneumaticamente assistido. A

voltagem (~3 kV) aplicada a uma agulha de

metal na sada do spray.

A descarga Corona ioniza as molculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos

por transferncia de prtons formando [M+H]+

ou [M-H]-


APCI e ESI

Razo de Fluxo:

APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0 mL/min, enquanto que ESI opera no

mximo at 1,0 mL/min.

ESI melhor indicado para fluxos to baixos quanto 5 L/min, compatvel com

acoplamentos capilares (LC ou CZE).


APCI e ESI

Fragmentao:

Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentao, enquanto que ESI pode at formar alguns ons pseudo-moleculares.

APCI no produz cargas mltiplas, portanto no adequado para compostos de alta MM.

Sensibilidade:

Sem ser uma regra, APCI tende a render melhor sensibilidade para solutos menos polares.

Dessoro/Ionizao Laser

Assistida com Matriz (MALD/I)

Processo de ionizao branda.

Apropriado para biomolculas de elevado peso molecular.

Pulso de laser incide sobre uma amostra co-cristalizada com uma matriz apropriada - derivados de cidos benzicos.

Anlise protemica.

Espectro MALD/I

IV. Analisadores de Massas

Setor magntico (B)

Duplo foco (EB ou B2)

Quadrupolo (Q)

Tempo de vo (TOF)

Captura de ons (MSn)

Ciclotron de ons (ICR)

Resoluo em MS

RS = 4000 400,0 e 400,1 (40,00 e (40,01)

A resoluo necessria depende da aplicao

m

mR

S

Analisador tipo Setor Magntico

V

erB

z

m

2

22

Analisador Quadrupolar (Q)

Analisador de varredura

Normalmente mais barato e robusto que setor magntico

Conjunto de 4 plos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqncia

entre pares, permitindo que apenas um

on atinja o detector de cada vez.

Analisador Quadrupolar (Q)

Tempo de Vo (TOF)

ons so produzidos em pulsos e injetados no tubo de deslocamento

Tempo de Vo (TOF)

Separao dos ons temporal e depende da energia cintica dos fragmentos

zmVd

vdt

f )21(

229,1 dt Vz

m

Analisador Trap Inico (ion trap)

Compacto & robusto

Funcionamento similar ao quadrupolo

Capacidade de efetuar MS tandem temporal

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