AVALIAÇÃO DE DESEMPENHO DO PRÉ-TRATAMENTO COM...

AVALIAÇÃO DE DESEMPENHO DO PRÉ-TRATAMENTO COM

PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO PARA A HIDRÓLISE

ENZIMÁTICA DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

AUTORA: SARITA CÂNDIDA RABELO ORIENTADORA: Profa. Dra. ALINE CARVALHO DA COSTA CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. RUBENS MACIEL FILHO

Campinas – São Paulo Julho de 2007

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS QUÍMICOS

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE -

UNICAMP

R112a

Rabelo, Sarita Cândida Avaliação de desempenho do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino para a hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar / Sarita Cândida Rabelo.--Campinas, SP: [s.n.], 2007. Orientadores: Aline Carvalho da Costa e Rubens Maciel Filho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química. 1. Bagaço de cana. 2. Pré-tratamento. 3. Água oxigenada. 4. Hidrólise. I. Costa, Aline Carvalho da. II. Maciel Filho, Rubens. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. IV. Título.

Título em Inglês: Evaluation of performance with alkaline hydrogen

peroxide pretreatment for enzymatic hydrolisys of sugarcane bagasse.

Palavras-chave em Inglês: Sugarcane bagasse, Pretreatment, Hydrogen peroxide, Enzymatic hydrolysis.

Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Químicos. Titulação: Mestre em Engenharia Química Banca examinadora: Carlos Eduardo Vaz Rossell e Daniel Ibraim Pires

Atala. Data da defesa: 04/07/2007

Avaliação de Desempenho do Pré-Tratamento com Peróxido de Hidrogênio Alcalino para a Hidrólise Enzimática de Bagaço de Cana-de-Açúcar

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Dedico este trabalho aos

meus pais, João e Alda,

com muito amor e carinho.


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Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo ix

AGRADECIMENTOS

Nesta pesquisa contei com a colaboração e incentivo de várias pessoas, sendo

todas fundamentais na realização desse estudo tanto no sentido de me prestarem informação

quanto no incentivo pessoal.

Em primeiro lugar gostaria de agradecer meus pais, João e Alda, pelo carinho,

amor e apoio durante a realização desse projeto. Agradeço também aos meus irmãos,

Aldoflávio e Ábner, pelo companheirismo, incentivo e amor durante todos esses anos

longe. A decisão de iniciar essa nova etapa da minha vida e leva-lá adiante foi por incentivo

de vocês, que me conduziram na busca de novos caminhos para que eu alcançasse sempre

um maior desenvolvimento emocional e intelectual.

A toda minha família, pelo carinho e alegrias proporcionadas a cada visita a

Minas. Vocês sempre estiveram presentes em grande parte da minha vida e sempre estarão.

Tios, tias, primos e primas, obrigada. Agradeço em especial a minha avó, Alzira, que

sempre intercedeu por mim em suas orações, enviando vibrações positivas para que eu

pudesse prosseguir neste trabalho.

Ao meu namorado Flávio, que sempre acreditou no meu potencial, muitas vezes

até mais que eu mesma. Agradeço pelo amor, carinho, companheirismo, incentivo e

paciência durante todos esses anos. Suas palavras de apoio sempre foram fundamentais

para que eu pudesse prosseguir.

As minhas amigas da UNICAMP; Carol, Val, Eneida e Elis Regina, que fizeram

meus momentos nessa cidade mais felizes. Agradeço pela ajuda, amizade e alegrias

proporcionadas. As minhas amigas de Viçosa, Kamilla e Bruna, que até hoje fazem parte da

minha vida, ainda que distantes. As nossas memórias são comuns em épocas importantes de

nossas vidas. Espero que nossa amizade perdure e saibam que vocês moram no meu

coração.

As minhas amigas, Paula e Raquel, que foram muito importantes neste trabalho.

Agradeço à Paula pela contribuição nos cálculos da atividade enzimática, que mesmo

estando na Finlândia nunca se opôs a me ajudar. À Raquel, pela ajuda inicial antes mesmo

de ingressar no mestrado. Agradeço pela amizade, desabafos e conselhos valiosos.


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo x

A minha orientadora, Profa. Dra. Aline Carvalho da Costa, por sua orientação,

amizade, entusiasmo e otimismo. Ao Prof. Dr. Rubens Maciel Filho, pela orientação,

carinho e sugestões para solucionar os problemas encontrados.

A Usina São Luiz – Dedini S/A, pelo fornecimento do bagaço de cana-de-açúcar,

em especial ao Pesquisador Dr. Rossell, pela disposição de conseguir o material e pelo

carinho conferido a mim.

Ao CPQBA pelo empréstimo da estufa para secagem do bagaço, em especial ao

Prof. Dr. Silvio Andrietta.

Ao Prof. Dr. Martin Aznar e Profa. Dra. Sandra Rocha, pelo empréstimo de alguns

equipamentos.

A todos os amigos do LEPFE, pelo convívio e disposição de tornar o nosso local

de trabalho um ambiente agradável, palco de muitas alegrias e risadas. Em especial,

gostaria de agradecer a Laura e Sandra que foram meu braço direito na etapa final deste

trabalho. Aos meus amigos do LOPCA/LDPS onde passei o primeiro ano do projeto,

agradeço pela amizade, carinho e felicidades proporcionadas. Aos amigos do PQGe por me

receberem como uma “agregada” no laboratório, sempre me incluindo em tudo, os meus

sinceros agradecimentos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio financeiro, sem o qual a realização desse trabalho seria impossível.

Aos funcionários e professores da FEQ, em especial aos funcionários da

manutenção que sempre atenderam meus chamados com prontidão.

A Deus que me deu saúde e força para vencer mais esta etapa em minha vida

possibilitando conhecer um dos lados mais maravilhoso do ser humano: o

compartilhamento de conhecimento.

A todos aqueles que infelizmente não estão escritos aqui, mas que com seu auxílio

e colaboração, tornaram possível a realização desse trabalho.

Muito obrigada!


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xi

“Tua caminhada ainda não terminou....

A realidade te acolhe dizendo que pela frente

o horizonte da vida necessita de tuas palavras

e do teu silêncio.

Não faças do amanhã o sinônimo de nunca,

nem o ontem te seja o mesmo que nunca mais.

Teus passos ficaram. Olhes para trás....

mas vá em frente pois há muitos que precisam

que chegues para poderem seguir-te”.

- Charles Chaplin -


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Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xiii

RESUMO

Neste trabalho o desempenho do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino para

viabilizar a hidrólise enzimática de bagaço de cana foi avaliado. O objetivo é que os

açúcares obtidos sejam usados para produção de etanol. Planejamentos fatoriais 23 foram

realizados para avaliar a influência do tempo de pré-tratamento (h), temperatura (°C) e

concentração de peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2 alcalino) (%) no desempenho da

hidrólise, que foi medido pela liberação de glicose e açúcares redutores totais (ART). Os

planejamentos foram realizados utilizando o bagaço seco proveniente da moenda da

indústria de açúcar/álcool (bagaço não peneirado) e o bagaço peneirado com granulometria

de -12+60 mesh, com o objetivo de avaliar a influência do tamanho da partícula na

liberação dos açúcares fermentescíveis. Os resultados mostraram que os melhores

rendimentos em glicose são obtidos para o bagaço não peneirado. Um novo planejamento

22 + configuração estrela foi realizado para determinar as condições de pré-tratamento que

levam à máxima liberação de glicose após hidrólise enzimática com celulase e β-

glicosidase a 50ºC e pH 4,8. Nesta etapa foi usado somente o bagaço não peneirado e os

fatores considerados foram temperatura e concentração de H2O2 alcalino. O tempo de pré-

tratamento foi eliminado do planejamento, uma vez que não se mostrou estatisticamente

significativo na etapa anterior. Os resultados obtidos mostram que na nova faixa estudada, a

influência da temperatura na liberação de glicose após hidrólise também não foi

significativa no nível de 90% de confiança. Foram determinadas as condições ótimas de

pré-tratamento, que são 1 h de reação, temperatura de 25°C e concentração de 7,355% de

H2O2, e os resultados de massa de ART e glicose após 48 h de hidrólise foram 0,4899 g/g

biomassa bruta seca e 0,3740 g/g biomassa bruta seca, respectivamente. O rendimento de

glicose no ponto ótimo foi de 84,07 %.

Palavras chaves: Bagaço de cana-de-açúcar, pré-tratamento, peróxido de hidrogênio,

hidrólise enzimática.


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Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xv

ABSTRACT

The performance of alkaline hydrogen peroxide pretreatment to enable the enzymatic

hydrolysis of sugar cane bagasse was evaluated. The objective is that the fermentable

sugars obtained be used to ethanol production. 23 factorial designs were performed to

evaluate the influence of pretreatment time (h), temperature (°C) and alkaline hydrogen

peroxide concentration (alkaline H2O2) (%) on hydrolysis performance, which was

measured by glucose and total reducing sugars (TRS) release. The designs were performed

using the bagasse as it comes from a sugar/ethanol factory (bagasse not screened) and

bagasse screened to -12+60 mesh. The objective was to evaluate the influence of particle

size in the release of the fermentable sugars. The results have shown that the best glucose

yields were obtained for not-screened bagasse. A new factorial design 22 + star

configuration was performed to determine the pretreatment conditions that lead to

maximum glucose release after enzymatic hydrolysis with celulase and β-glucosidase at

temperature of 50 ºC and pH 4,8. In this stage only not-screened bagasse was used and the

considered factors were temperature and alkaline H2O2 concentration. Pretreatment time

was eliminated from the design because it was not considered statistically significant in the

earlier stage. The obtained results show that in the new evaluated range, influence of

temperature on glucose release after hydrolysis was also not significant at the 90%

confidence level. Optimum conditions of pretreatment were determined, 1 h of reaction,

temperature of 25°C and H2O2 concentration of 7,355%. The results of ART and glucose

mass after 48 h of hydrolysis was 0,4899 g/g raw dry biomass and 0,3740 g/g raw dry

biomass, respectively. The glucose yield in the optimum point was of 84,07 %.

Keywords: Sugarcane bagasse, pretreatment, hydrogen peroxide, enzymatic hydrolysis.


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Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xvii

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA ..................................................................................................................vii

AGRADECIMENTOS ..........................................................................................................ix

EPÍGRAFE ............................................................................................................................xi

RESUMO ............................................................................................................................xiii

ABSTRACT .........................................................................................................................xv

SUMÁRIO..........................................................................................................................xvii

LISTA DE FIGURAS .........................................................................................................xxi

LISTA DE TABELAS .....................................................................................................xxvii

CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO............................................................................................ 1

1.1. Objetivo .......................................................................................................................... 2

1.2. Organização do trabalho................................................................................................. 3

CAPÍTULO 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................... 4

2.1. A cana-de-açúcar ............................................................................................................ 4

2.2. Composição química dos materiais lignocelulósicos ..................................................... 6

2.2.1. Celulose ....................................................................................................................... 7

2.2.2. Hemicelulose ............................................................................................................. 10

2.2.3. Lignina....................................................................................................................... 12

2.2.4. Outros componentes: extrativos ................................................................................ 14

2.3. Estrutura e ultraestrutura da parede celular vegetal...................................................... 14

2.4. Pré-tratamento .............................................................................................................. 16

2.4.1. Tipos de pré-tratamento............................................................................................. 18

2.4.1.1. O pré-tratamento químico....................................................................................... 20

2.4.1.1.1. Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino.......................................... 20

2.5. Hidrólise ....................................................................................................................... 25

2.5.1. Hidrólise enzimática .................................................................................................. 26

2.5.1.1. As enzimas celulases .............................................................................................. 28

2.5.1.1.1. Degradação enzimática da celulose..................................................................... 29

2.5.1.1.2. Sistema celuloltico produzido pelo Trichoderma reesei...................................... 30

2.5.1.1.3. Modo de ação das celulases: sinergismo ............................................................. 32

2.6. Conversão de biomassa a álcool................................................................................... 35


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xviii

2.6.1. Microrganismos fermentativos .................................................................................. 38

2.7. Colorimetria e espectrofotometria ................................................................................ 39

2.7.1. Métodos colorimétricos ............................................................................................. 40

2.8. Planejamento experimental........................................................................................... 42

CAPÍTULO 3 - METODOLOGIA EXPERIMENTAL....................................................... 44

3.1. Materiais ....................................................................................................................... 44

3.1.1. Reagentes................................................................................................................... 44

3.1.2. Equipamentos ............................................................................................................ 45

3.1.3. Matéria prima ............................................................................................................ 46

3.1.3.1. Preparação do bagaço de cana-de-açúcar ............................................................... 46

3.1.3.2. Separação da amostra ............................................................................................. 47

3.1.3.3. Caracterização química do material ....................................................................... 47

3.1.4. Enzima....................................................................................................................... 48

3.2. Procedimento experimental .......................................................................................... 48

3.2.1. Determinação do comprimento de onda de máxima absorção da glicose................. 48

3.2.2. Determinação da concentração dos açúcares redutores totais (ART) ....................... 49

3.2.2.1. Preparação da solução de DNS............................................................................... 50

3.2.2.2. Quantificação dos ART .......................................................................................... 51

3.2.2.2.1. Construção da curva-padrão de glicose ............................................................... 51

3.2.3. Determinação da concentração de glicose................................................................. 52

3.2.3.1. Quantificação da glicose......................................................................................... 52

3.2.4. Determinação da atividade das enzimas.................................................................... 53

3.2.4.1. Preparo do tampão citrato....................................................................................... 53

3.2.4.2. Determinação da atividade da celulase................................................................... 53

3.2.4.3. Determinação da atividade da β-glicosidase .......................................................... 55

3.2.5. Efeito do pH na atividade enzimática........................................................................ 56

3.2.6. Efeito da temperatura na atividade enzimática.......................................................... 57

3.2.7. Planejamento experimental do pré-tratamento .......................................................... 59

3.2.7.1. Reações do pré-tratamento ..................................................................................... 59

3.2.7.2. Hidrólise do bagaço pré-tratado ............................................................................. 60

3.2.7.3. Quantificação dos ART e glicose ........................................................................... 61

3.2.7.4. Análise dos resultados através do Statistica ........................................................... 61


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xix

CAPÍTULO 4 - RESULTADOS E DISCUSSÕES.............................................................. 62

4.1. Cálculo do teor de umidade do bagaço de cana-de-açúcar........................................... 62

4.2. Análise granulométrica................................................................................................. 64

4.3. Análise da composição química do bagaço.................................................................. 66

4.4. Determinação do comprimento de onda de máxima absorção da glicose.................... 67

4.5. Construção da curva-padrão para o método DNS ........................................................ 69

4.6. Determinação da atividade da enzima celulase ............................................................ 71

4.7. Determinação da atividade da enzima β-glicosidase.................................................... 74

4.8. Efeito do pH na atividade enzimática........................................................................... 76

4.9. Efeito da temperatura na atividade enzimática............................................................. 79

4.10. Planejamento fatorial 23 do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino .... 81

4.10.1. Determinação dos efeitos principais e de interação das variáveis........................... 88

4.10.1.1. Análise da massa de ART – bagaço não peneirado.............................................. 90

4.10.1.1.1. Análise da massa de ART – bagaço peneirado ................................................. 95

4.10.1.1.2. Análise da massa de glicose – bagaço não peneirado ....................................... 98

4.10.1.1.3. Análise da massa de glicose – bagaço peneirado ............................................ 102

4.11. Otimização do pré-tratamento .................................................................................. 106

4.11.1. Planejamento fatorial 22 + configuração estrela do pré-tratamento ...................... 108

4.11.1.1. Determinação dos efeitos principais e de interação das variáveis após

planejamento fatorial 22 + configuração estrela ................................................................. 113

4.11.1.1.1. Análise da massa de ART................................................................................ 115

4.11.1.1.2. Análise da massa de glicose ............................................................................ 118

4.11.2. Estudo do tempo de pré-tratamento....................................................................... 122

4.11.3. Estudo da temperatura de pré-tratamento.............................................................. 126

4.12. Análise do pré-tratamento otimizado ....................................................................... 129

4.13. Análise da composição química do bagaço no processo otimizado......................... 131

CAPÍTULO 5 - CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA PRÓXIMOS TRABALHOS ..133

5.1. Sugestões para trabalhos futuros ................................................................................ 134

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 136


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xx


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1: A cana-de-açúcar (TRIANA et al., 1990)............................................................ 5

Figura 2.2: Composição média do bagaço de cana-de-açúcar................................................ 7

Figura 2.3: Estrutura da celulose, parte central da cadeia molecular (FENGEL e

WEGENER, 1989). ................................................................................................ 8

Figura 2.4: Reações de hidrólise da celulose. R e R' são as semicadeias do polímero de

celulose. A ligação em zig-zag representa a ligação ß-D (1,4) glicosídica. ........... 8

Figura 2.5: Representação do hemiacetal (a) e do aldeído (b) do grupo terminal redutor. R é

a semicadeia do polímero de celulose. ................................................................... 9

Figura 2.6: Estrutura dos monossacarídeos que formam as hemiceluloses (FENGEL e

WEGENER, 1989). .............................................................................................. 11

Figura 2.7: Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando alguns

grupos substituintes: Xyl (1,4-D-xilopiranose); Ara (L-arabinofuranose); Ac

(acetil); (4-Me)-GlcA (ácido (4-O-metil)-D-glucopiranurônico); FA (ácido

ferúlico); DDFA (ácido desidroferúlico) (McDOUGALL et al., 1993). ............. 12

Figura 2.8: Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler (FENGEL e

WEGENER, 1989). .............................................................................................. 13

Figura 2.9: Precursores da biossíntese da lignina: (I) álcool p-cumarílico; (II) álcool

coniferílico; (III) álcool sinapílico (FENGEL e WEGENER, 1989). .................. 13

Figura 2.10: Ilustração esquemática morfológica da célula, parede secundária e a relação da

lignina, hemicelulose, e celulose na parede secundária da célula. Diâmetro da

célula de aproximadamente 25 µm. S1-S3, paredes secundárias da célula; P,

parede primária; M.L., lamela média (KIRK e CULLEN, 1998). ....................... 15

Figura 2.11: Esquema da associação celulose-hemicelulose-lignina na parede celular

vegetal: (A) vista transversal e (B) vista longitudinal (FENGEL e WEGENER,

1989). Ligações-PL, ligações poliose – lignina.................................................... 15

Figura 2.12: Pré-tratamento nos materiais lignocelulósicos (adaptado por HSU et al., 1980).

.............................................................................................................................. 16

Figura 2.13: Esquema representativo dos passos do pré-tratamento. A transformação entre

celulose cristalina (C) e amorfa (C*) é reversível. Ambas formas rendem


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxii

oligossacarídeos, na qual hidrolisam obtendo a glicose. A degradação da glicose

pode então se transformar em inibidores da fermentação (WEIL, 1992)............. 17

Figura 2.14: Representação esquemática de uma celulase (PAULO, 1995). ....................... 32

Figura 2.15: Regiões específicas da celulose. ...................................................................... 32

Figura 2.16: Representação esquemática da hidrólise da celulose e da ação do CBHs, EGs,

e ß-glicosidases (ß-gluc) de Trichoderma reesei. C define a região altamente

ordenada (região cristalina), R os grupos terminais redutores (círculos

preenchidos), e NR os grupos terminais não redutores (círculos não-preenchidos).

EGs ataca as estruturas mais desordenadas da celulose. A ação da ß-glicosidase

produz a glicose. Modificado de TEERI (1997). ................................................. 33

Figura 2.17: Calibração através de um método colorimétrico.............................................. 41

Figura 3.1: Reação para quantificação de açúcares redutores totais por DNS. .................... 50

Figura 4.1: Porcentagem da fração mássica retida em função do diâmetro médio da

partícula. ............................................................................................................... 65

Figura 4.2: Porcentagem da fração mássica acumulada em função do diâmetro médio da

partícula. ............................................................................................................... 65

Figura 4.3: Bagaço não peneirado e peneirado..................................................................... 66

Figura 4.4: Varredura da amostra de glicose aplicando o método DNS. ............................. 68

Figura 4.5: Varredura da amostra de glicose aplicando o método Glicose GOD-PAP........ 69

Figura 4.6: Curva-padrão de glicose (açúcar redutor). ......................................................... 70

Figura 4.7: Gráfico do logarítimo da concentração da enzima em cada diluição em função

da massa de glicose liberada por 0,5 mL da enzima celulase diluída, nas

condições reacionais pré-determinadas. ............................................................... 73

Figura 4.8: Gráfico da concentração da enzima em cada diluição em função da massa de

glicose liberada por 1,0 mL da enzima β-glicosidase diluída, em condições

reacionais pré-determinadas. ................................................................................ 75

Figura 4.9: Gráfico da atividade relativa em função dos valores de pHs............................. 78

Figura 4.10: Gráfico da atividade relativa em função da temperatura. ................................ 81

Figura 4.11: Massa de bagaço não peneirado e peneirado após cada ensaio partindo de 4 g

de bagaço peneirado e não peneirado. .................................................................. 83

Figura 4.12: Massa de bagaço não peneirado e peneirado pré-tratados restante após o

processo de hidrólise. ........................................................................................... 84


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxiii

Figura 4.13: Perfil de hidrólise do ensaio 1.......................................................................... 85








Figura 4.21: Perfil de hidrólise dos ensaio 9, 10 e 11 para ART.......................................... 86

Figura 4.22: Perfil de hidrólise dos ensaios 9, 10 e 11 para glicose..................................... 86

Figura 4.23: Perfil de hidrólise do bagaço N e P sem pré-tratamento.................................. 86

Figura 4.24: Rendimento de glicose após hidrólise enzimática para cada um dos ensaios.. 89

Figura 4.25: Gráfico de Pareto para a massa de ART liberada após hidrólise enzimática do

bagaço não peneirado. .......................................................................................... 90

Figura 4.26: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.2.

Tempo 6 h............................................................................................................. 93


Tempo 24h............................................................................................................ 94


bagaço peneirado. ................................................................................................. 95

Figura 4.29: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.3. ...... 98

Figura 4.30: Gráfico de Pareto para a massa de glicose liberada após hidrólise enzimática

do bagaço não peneirado. ..................................................................................... 99


Tempo 6 h........................................................................................................... 101


Tempo 24h.......................................................................................................... 102


do bagaço peneirado. .......................................................................................... 103

Figura 4.34: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.5. .... 105

Figura 4.35: Massa do bagaço restante após pré-tratamento segundo o planejamento fatorial

22 + configuração estrela, partindo-se de 4g de bagaço não peneirado.............. 109


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxiv

Figura 4.36: Massa de bagaço restante após o processo de hidrólise segundo planejamento

fatorial 22 + configuração estrela........................................................................ 110

Figura 4.37: Perfil de hidrólise do ensaio 1*...................................................................... 111








Figura 4.45: Perfil de hidrólise dos ensaios 9*, 10* e 11*................................................. 112

Figura 4.46: Rendimento de glicose após hidrólise enzimática para cada um dos ensaios do

planejamento fatorial 22 + configuração estrela. ................................................ 114

Figura 4.47: Gráfico de Pareto para a massa de ART liberada após hidrólise enzimática das

amostras do planejamento fatorial 22 + configuração estrela. ............................ 115


Figura 4.49: Gráfico de Pareto para a massa de glicose liberada após hidrólise enzimática.

............................................................................................................................ 118


Figura 4.51: Massa restante após a etapa de pré-tratamento para avaliar a variação de tempo

do pré-tratamento................................................................................................ 123

Figura 4.52: Massa de bagaço restante após o processo de hidrólise para avaliar a variação

de tempo do pré-tratamento................................................................................ 124

Figura 4.53: Perfil de hidrólise para cada um dos ensaios em relação a variação do tempo

de pré-tratamento................................................................................................ 125

Figura 4.54: Massa restante após a etapa de pré-tratamento para avaliar a variação de

temperatura do pré-tratamento. .......................................................................... 127


da temperatura do pré-tratamento....................................................................... 128

Figura 4.56: Perfil de hidrólise para cada um dos ensaios em relação a variação da

temperatura de pré-tratamento............................................................................ 129

Figura 4.57: Perfil de hidrólise nas condições ótimas de pré-tratamento........................... 130


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxv

Figura 4.58: Amostras do bagaço antes do pré-tratamento, após o pré-tratamento e após

hidrólise nas condições ótimas. .......................................................................... 131


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxvi


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1: Composição física média do bagaço de cana-de-açúcar (CARASCHI, 1997).... 6

Tabela 2.2: Métodos de pré-tratamentos de materiais lignocelulósicos para hidrólise

enzimática (SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996)................................................ 19

Tabela 2.3: Comparação das condições e desempenho dos três processos de hidrólise

(HAMELINCK et al., 2005). ............................................................................... 26

Tabela 2.4: Propriedades e organização estrutural das celulases produzidas pelo T. reesei

(SALOHEIMO et al., 1997; SRISODSUK, 1994)............................................... 31

Tabela 3.1: Algumas características dos reagentes utilizados nos experimentos................. 44

Tabela 4.1: Porcentagem de umidade no bagaço de cana-de-açúcar antes do processo de

secagem. ............................................................................................................... 62

Tabela 4.2: Porcentagem de umidade no bagaço de cana-de-açúcar após secagem por 24 h.

.............................................................................................................................. 63


.............................................................................................................................. 63

Tabela 4.4: Fração mássica retida e acumulada após análises em triplicata. ....................... 64

Tabela 4.5: Composição química do bagaço não peneirado e peneirado............................. 66

Tabela 4.6: Absorbância da solução de glicose após reação com DNS ............................... 70

Tabela 4.7: Concentração das soluções diluídas da enzima celulase. .................................. 71

Tabela 4.8: Valores das absorbâncias e massa de glicose liberada em cada diluição da

enzima celulase..................................................................................................... 72

Tabela 4.9: Concentrações das soluções da enzima β-glicosidase. ...................................... 74

Tabela 4.10: Valores das absorbâncias e massas de glicose liberadas por cada diluição da

enzima β-glicosidase. ........................................................................................... 75

Tabela 4.11: Valores das absorbâncias encontradas e calculada após realização da hidrólise

em diferentes valores de pH. ................................................................................ 77

Tabela 4.12: Valores da massa de glicose, atividade enzimática e atividade relativa

calculados após reação de hidrólise e quantificação por DNS em diferentes

valores de pH. ....................................................................................................... 78


em cada uma das temperaturas analisadas............................................................ 79


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxviii


calculados após reação de hidrólise e quantificação das amostras por DNS em

diferentes temperaturas......................................................................................... 80

Tabela 4.15: Faixa de valores estudados no planejamento experimental 23 com peróxido de

hidrogênio alcalino. .............................................................................................. 81

Tabela 4.16: Valores das variáveis em cada um dos ensaios. .............................................. 82

Tabela 4.17: Atividade das enzimas específicas e concentração de proteína do complexo

enzimático (JUHÁSZ et al., 2005). ...................................................................... 87

Tabela 4.18: Matriz de planejamento com os resultados da massa de ART e glicose

liberadas em cada um dos ensaios após hidrólise................................................. 89

Tabela 4.19: Análise dos efeitos principais e de interação no planejamento fatorial 23,

utilizando o erro puro para a massa de ART liberada – bagaço não peneirado. .. 91

Tabela 4.20: Análise da variância (ANOVA) para o ajuste do modelo aos dados do

planejamento fatorial 23, ART – bagaço não peneirado....................................... 92


utilizando o erro puro para a massa de ART liberada – bagaço peneirado. ......... 95


planejamento fatorial 23, ART – bagaço peneirado.............................................. 97

Tabela 4.23: Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do planejamento 23,

utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada – bagaço não peneirado.99


planejamento fatorial 23, glicose – bagaço não peneirado. ................................ 100


utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada – bagaço peneirado..... 103


planejamento fatorial 23, glicose – bagaço peneirado. ....................................... 104

Tabela 4.27: Faixa de valores estudados no planejamento fatorial 22 + configuração estrela

para determinação do ponto ótimo. .................................................................... 108

Tabela 4.28: Valores das variáveis em cada um dos ensaios do planejamento fatorial 22 +

configuração estrela............................................................................................ 109


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxix


liberadas em cada um dos ensaios do planejamento fatorial 22 + configuração

estrela.................................................................................................................. 113

Tabela 4.30: Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do planejamento

fatorial 22 + configuração estrela, utilizando o erro puro para a massa de ART

liberada. .............................................................................................................. 115

Tabela 4.31: Análise de regressão dos coeficientes das variáveis do planejamento fatorial 22

+ configuração estrela, utilizando o erro puro, para a massa de ART liberada.. 116


planejamento fatorial 22 + configuração estrela, massa de ART........................ 117


fatorial 22 + configuração estrela, utilizando o erro puro para a massa de glicose

liberada. .............................................................................................................. 119

Tabela 4.34: Análise de regressão dos coeficientes das variáveis do planejamento fatorial 22

+ configuração estrela, utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada.

............................................................................................................................ 119


planejamento fatorial 22 + configuração estrela – massa de glicose. ................. 120

Tabela 4.36: Valores das variáveis em cada um dos ensaios mantendo a temperatura e a

concentração fixas no ponto ótimo..................................................................... 123

Tabela 4.37: Valores das variáveis em cada um dos ensaios mantendo o tempo e a

concentração fixas no ponto ótimo..................................................................... 126

Tabela 4.38: Composição química do bagaço não peneirado antes e após pré-tratamento nas

condições ótimas. ............................................................................................... 131


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo xxx


Dissertação de Mestrado – Sarita Cândida Rabelo 1

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Atualmente há um grande interesse, tanto por parte da sociedade como por parte

das indústrias, na utilização de recursos renováveis. Por este motivo, estão sendo cada vez

mais estudados métodos que utilizam resíduos agrícolas para a obtenção de produtos

químicos de maior valor agregado como, por exemplo, etanol combustível, polpa celulósica

e outros derivados de celulose - acetato de celulose, carboximetilcelulose e xantato de

celulose. Por sua vez, os excedentes da indústria de cana-de-açúcar, como a palha e a parte

do bagaço que não é queimado para a obtenção de energia, constituem um problema

ambiental e ao mesmo tempo uma fonte renovável de recursos.

A matéria-prima usada para produção de etanol é a sacarose da cana-de-açúcar.

Muitas pesquisas vêm sendo feitas para viabilizar o uso de bagaço de cana-de-açúcar

hidrolisado como matéria-prima, com o objetivo de baixar os custos da produção de etanol

e viabilizar a produção de maior quantidade de etanol com menor área plantada.

Considerando a grande disponibilidade deste tipo de matéria-prima no Brasil a custos muito

baixos quando comparados a outros países, esta é uma opção bastante atraente, sendo a

possibilidade de obtermos resultados viáveis enorme.

O uso do bagaço apresenta uma série de vantagens: já vem processado das

moendas; está disponível em grandes quantidades; tem custo mínimo; está pronto para uso

no local, evitando aumento de custo devido ao transporte (OLIVÉRIO e HILST, 2005).

Em geral, os materiais lignocelulósicos são resistentes a bioconversão e requerem

um pré-tratamento para aumentar sua digestibilidade e tornar a celulose mais acessível às

enzimas celulolíticas.



O pré-tratamento é visto como uma das etapas do processo mais caras na

conversão da biomassa em açúcares fermentescíveis e por isso, esta etapa apresenta um

grande potencial para melhorar a eficiência e baixar o custo no processo de pesquisa e

desenvolvimento (LEE et al., 1994; LYND et al., 1996; MOSIER et al., 2003a, b).

Por várias décadas a hidrólise eficiente de material lignocelulósico e a fermentação

posterior dos açúcares resultantes tem sido um grande desafio. As rotas mais conhecidas

são a hidrólise ácida e a hidrólise enzimática.

Embora a hidrólise ácida de biomassa seja eficiente e relativamente barata, gera

resíduos poluentes e produtos que inibem a fermentação posterior. Por isso, a sacarificação

enzimática tem sido objeto da maior parte dos estudos hoje no mundo. O processo

enzimático oferece potencial de redução de custos em longo prazo, pois é possível se

atingir rendimentos próximos dos estequiométricos e em condições menos críticas de

temperatura, pressão e agressividade química, além do processo ser menos poluente

(SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996; WYMAN, 1999; RILEY, 2002; LEATHERS, 2003).

No entanto, no estágio de desenvolvimento atual, o processo ainda é economicamente

inviável, o que justifica o interesse pelo estudo.

As tecnologias de conversão da biomassa a etanol estão evoluindo rapidamente e

os obstáculos sendo identificados e superados, o que provavelmente possibilitará uma

comercialização difundida do produto em um futuro próximo.

1.1. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi estudar uma forma alternativa para aproveitamento

do bagaço de cana-de-açúcar através da produção de etanol. Em especial, foram avaliadas

as etapas de pré-tratamento e hidrólise com ênfase na otimização da primeira etapa.

Para isso, as seguintes etapas foram seguidas:

1) Análise do bagaço de cana-de-açúcar em relação a sua composição química,

umidade e granulometria,

2) Separação do material em duas partes para analisar a influência do tamanho da

partícula na liberação dos açúcares fermentescíveis após a etapa de hidrólise,



3) Determinação do comprimento de máxima absorção da glicose para possibilitar a

quantificação dos ART e glicose após a hidrólise,

4) Determinação da atividade das enzimas celulase e β-glicosidase além do efeito do

pH e da temperatura na atividade enzimática,

5) Estudo das condições de pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino

através do planejamento experimental,

6) Comparação da hidrólise do material lignocelulósico sem e com a etapa de pré-

tratamento,

7) Otimização das condições de pré-tratamento, isto é, tempo, temperatura,

concentração do reagente e tamanho da partícula.

1.2. Organização do trabalho

O Capítulo 2, “Revisão Bibliográfica”, apresenta os principais conceitos sobre a

composição química da cana-de-açúcar. Além disso, revisa os tipos de pré-tratamento mais

utilizados, bem como apresenta uma revisão sobre as enzimas celulases e sobre a conversão

da celulose. Uma revisão dos principais trabalhos consultados, tanto na análise do pré-

tratamento quanto na hidrólise enzimática, também foi apresentada. A conversão da

biomassa a etanol e os microrganismos fermentativos também foram abordados.

No Capítulo 3, “Metodologia Experimental”, é apresentada a descrição detalhada

da parte experimental.

São apresentados no Capítulo 4, “Resultados e Discussões”, os dados

experimentais obtidos em cada análise, além dos resultados das análises estatísticas com as

devidas observações pertinentes.

Por fim, no Capítulo 5, “Conclusões e Sugestões para Próximos Trabalhos”,

encontra-se a conclusão do trabalho, com destaque para o aprendizado e experiência

adquirida, além de sugestões para trabalhos futuros.



CAPÍTULO 2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

As tendências mundiais para o avanço científico e tecnológico na área de novos

combustíveis destacam a importância da utilização de resíduos agroindustriais como

matéria-prima nos processos de produção. A reutilização e reciclagem destes resíduos

podem minimizar os problemas ambientais ligados ao seu acúmulo e diminuir o uso de

combustíveis fósseis, além de resultar em uma melhora no aproveitamento da matéria-

prima, que é de grande interesse na atualidade. Entre as biomassas lignocelulósicas, o

bagaço de cana-de-açúcar destaca-se como sendo economicamente viável para a produção

de combustíveis “ambientalmente corretos”.

2.1. A cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar, Saccharum officinarum, é uma gramínea originária da Índia e

introduzida no Brasil na época colonial, sendo hoje muito cultivada em regiões tropicais e

subtropicais do país. As gramíneas constituem uma grande família de plantas da classe das

monocotiledôneas, de folhas envolventes e caule em geral oco. Desde a sua origem até os

dias atuais ela vem passando por modificações, o que resultou em várias espécies, as quais

diferem entre si principalmente quanto ao conteúdo de fibras e açúcares. Hoje, a maior

parte da cana-de-açúcar cultivada é um híbrido de planta original com outras espécies da

mesma família (JOAQUIM, 1997).

Como a maior parte das plantas, a cana-de-açúcar apresenta um eixo principal,

denominado talo, de onde emergem as raízes, as folhas e as inflorescências (Figura 2.1).



Dos constituintes da cana-de-açúcar, apenas o talo vem apresentando valor econômico por

sua capacidade de acumulação de açúcares e produção de fibras.

Figura 2.1: A cana-de-açúcar (TRIANA et al., 1990).

Estruturalmente, a cana consiste de vários tipos de tecidos, tais como o córtex (ou

casca), tecido parenquimatoso e hastes fibrovasculares. O córtex é composto de fibras

muito lignificadas, sendo caracterizado pela espessura da parede celular, comprimento e

rigidez de suas fibras. Este tecido confere proteção contra os efeitos mecânicos externos,

servindo de suporte para a planta. A parte interior do talo é constituída por um tecido

parenquimatoso (medula) de caráter não fibroso, o qual possui como principal função o

armazenamento do suco adocicado produzido pela planta. Imerso dentro deste tecido

encontram-se as hastes fibrovasculares, compostas de fibras curtas e vasos que atuam na

sustentação e condução dos alimentos e outros produtos ao longo da planta (PATURAU,

1989).

De um modo geral, o bagaço consiste de fibras e medula, nas proporções de

aproximadamente 65% e 35% respectivamente, conforme mostrado na Tabela 2.1. As

células que constituem as frações de fibra e de medula são bastante diferentes fisicamente.

As fibras possuem uma grande razão comprimento/diâmetro (cerca de 70) e um elevado

coeficiente de expansão e contração sob processos de umedecimento e secagem. Isto



ocasiona forte integração entre as fibras e contribui para força e coesão necessárias para a

produção de papel. As células da medula são de formas e tamanhos irregulares com a razão

diâmetro/comprimento por volta de 5.

Tabela 2.1: Composição física média do bagaço de cana-de-açúcar (CARASCHI, 1997).

Casca 50% Fibras

Vasos e vasculares 15%

Medula 30% Material não fibroso

Epiderme não fibrosa 5%

Assim como outros materiais lignocelulósicos, o bagaço de cana-de-açúcar é

constituído principalmente por celulose, hemicelulose e lignina, podendo ser utilizado na

produção de polpas celulósicas, das quais podem ser obtidos diversos produtos como, por

exemplo, o etanol.

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar para a indústria de açúcar e álcool.

Após a separação da garapa, da qual são produzidos o açúcar e o álcool etílico, o bagaço

que sobra é em parte queimado para a geração de calor e energia para a própria usina

(ARMAS e BIANCHI, 1990) e atualmente vem sendo comercializado para reduzir os

problemas da crise no fornecimento de energia elétrica.

Devido ao excedente, foi estimado que as usinas de açúcar e álcool podem liberar

de 30 a 50% do bagaço produzido para usos alternativos (MARTIN et al., 1999). Dessa

forma, o uso do bagaço de cana como matéria-prima para a produção de celulose e outros

produtos de maior valor agregado tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas,

particularmente em países onde há pouca ou quase nenhuma disponibilidade de madeira,

como Cuba, Índia e China (FERNANDEZ, 1996).

2.2. Composição química dos materiais lignocelulósicos

A biomassa lignocelulósica é composta de celulose, hemicelulose e lignina, além

de pequenas quantidades de outros componentes. Estes constituintes possuem



características químicas semelhantes à madeira, que são identificados em diferentes

quantidades percentuais, dependendo da espécie e condições de crescimento (FENGEL e

WEGENER, 1989). A composição média do bagaço de cana-de-açúcar pode ser vista na

Figura 2.2.

Figura 2.2: Composição média do bagaço de cana-de-açúcar.

2.2.1. Celulose

A celulose, respondendo isoladamente por aproximadamente 40% de toda reserva

de carbono disponível na biosfera, é a fonte mais abundante deste elemento base dos

componentes orgânicos. Está presente em todas as plantas, desde árvores altamente

desenvolvidas até em organismos mais primitivos e seu conteúdo nestas espécies varia de

20 a 99%.

A estrutura física e morfológica nativa da celulose é complexa, e os detalhes da

estrutura são dificilmente determinados experimentalmente (O’SULLIVAN, 1997).

Este polímero natural é um homopolissacarídeo linear cuja unidade repetitiva é a

celobiose ou anidroglicose sindiotática (Figura 2.3) que é formada por anéis de β-D-

glicopiranose unidas por ligações do tipo β-D (1→4) glicosídicas, de fórmula geral

(C6H10O5)n, proporcionando assim um crescimento linear da cadeia macromolecular

levando a uma elevada massa molecular, considerável grau de cristalinidade, insolubilidade

em água e estrutura rígida.

Celulose 38–50% Lignina

20–30%

Outros 5-20%

Hemicelulose 25–27%



Figura 2.3: Estrutura da celulose, parte central da cadeia molecular (FENGEL e

WEGENER, 1989).

O comprimento da cadeia varia entre 100 a 14000 resíduos conforme a origem da

celulose. Da hidrólise da celulose obtêm-se polímeros menores, oligossacarídeos com

cadeias terminais redutoras e não redutoras (Figura 2.4) que, após hidrólises mais extensas,

decompõem-se dando origem a celobiose (dissacarídeo redutor) e a glicose.

Figura 2.4: Reações de hidrólise da celulose. R e R' são as semicadeias do polímero de

celulose. A ligação em zig-zag representa a ligação ß-D (1,4) glicosídica.

A cada quebra da ligação ß-D (1,4) glicosídica há a formação de uma cadeia

redutora e outra não redutora. Apesar das duas extremidades da cadeia serem grupos

hidroxílicos, o grupo C1–OH terminal da cadeia redutora é um grupo aldeído hidratado,

derivado da formação do anel piranose por ligação intramolecular hemiacetal (Figura 2.5).

Este grupo tem poder redutor, ao contrário do grupo alcoólico C4–OH terminal (grupo não

redutor).



Figura 2.5: Representação do hemiacetal (a) e do aldeído (b) do grupo terminal redutor. R

é a semicadeia do polímero de celulose.

Apesar da sua simplicidade química, a diversidade de origem e dos

processamentos tecnológicos subseqüentes a que a biomassa celulósica é sujeita conduz a

uma complexa gama de formas físicas de celulose. A descrição destes substratos inclui

propriedades como o tamanho, a forma, a porosidade, o grau de polimerização, a área

superficial, a associação com compostos não celulósicos, a conformação molecular e

cristalinidade, sendo todos eles relevantes para o processo de hidrólise (BEGUIN e

AUBERT, 1994).

As estruturas da celulose podem ser definidas em termos de três níveis

organizacionais (ATALLA et al., 1993). O primeiro é definido pela seqüência de ligações

covalentes, correspondendo a um homopolímero de anidroglicose com ligações β-D (1,4).

O segundo nível descreve a conformação molecular, isto é, a organização espacial das

unidades repetitivas, e é caracterizado pelas distâncias das ligações e respectivos ângulos, e

pelas ligações de hidrogênio intramoleculares. O terceiro nível define a associação das

moléculas formando agregados com uma determinada estrutura cristalina.

Muitos estudos sobre a hidrólise enzimática consideram a existência da celulose

nativa em duas formas extremas: amorfa e cristalina. As duas formas ocorrem em

proporções características em celuloses de diferentes origens, e o ataque enzimático pode

ser preferencial num dos tipos de estrutura (GAMA, 1996).

As moléculas de celulose tendem a formar ligações hidrogênio intramoleculares

(entre unidades de glicose da mesma molécula) e intermoleculares (entre unidades de

glicose de moléculas adjacentes). O primeiro tipo de interação é responsável por certa

rigidez das cadeias unitárias e o segundo pela formação da fibra vegetal (FENGEL e



WEGENER, 1989). Devido às suas fortes ligações de hidrogênio, a celulose é praticamente

insolúvel em água e em solventes orgânicos comuns (HON, 1996).

As fibras de celulose, quando colocadas em contato com a água e certos solventes

orgânicos, sofrem intumescimento. A extensão do intumescimento da celulose pode ser

intercristalino ou intracristalino. No primeiro caso o agente intumescedor penetra nas

regiões desordenadas (amorfas) da microfibrila de celulose e nos espaços entre elas. O caso

mais comum de intumescimento intercristalino é o inchamento da celulose em água. No

segundo caso o agente intumescedor penetra nas regiões ordenadas (cristalinas) das

microfibrilas. O intumescimento intracristalino pode ser efetuado pelo uso de soluções

concentradas de ácidos e bases fortes e de soluções de alguns sais (D.ALMEIDA, 1988).

A principal vantagem da celulose quando comparada com derivados de petróleo,

por exemplo, é sua grande disponibilidade, uma vez que ela provém de matéria-prima

renovável.

2.2.2. Hemicelulose

As hemiceluloses, também chamada de polioses, estão intimamente associadas à

celulose na parede da célula vegetal e são compostas por diferentes unidades de açúcares

formando cadeias ramificadas (FENGEL e WEGENER, 1989). As estruturas dos

monossacarídeos que formam as hemiceluloses são mostrados na Figura 2.6.

Estas diferentes unidades de açúcares são compostas por glicose, manose e

galactose (hexoses) além da xilose e arabinose (pentoses), podendo ainda apresentar

quantidades variáveis de ácidos urônicos e desoxi-hexoses em alguns tipos de vegetais.

As hemiceluloses apresentam-se na forma de homopolímeros como, por exemplo,

a xilana, formada por xiloses ou heteropolímeros como, por exemplo, a glico-manana

formada por glicose e manose. As madeiras moles (coníferas) apresentam maior proporção

de galactoglico-mananas do que de xilanas, enquanto as madeiras duras (folhosas) são ricas

em xilanas. O teor de hemicelulose em diferentes tipos de vegetais é bastante variável, com

um valor médio de 20%.



Figura 2.6: Estrutura dos monossacarídeos que formam as hemiceluloses (FENGEL e

WEGENER, 1989).

A Figura 2.7 mostra uma representação esquemática da composição das xilanas de

gramíneas, estudada por McDOUGALL et al. (1993).

As hemiceluloses se encontram no bagaço de cana-de-açúcar na proporção de 25 a

27% e quando sofrem hidrólise ácida podem ser decompostas em xilose, arabinose, ácido

urônico e furfural (PATURAU, 1989). O principal açúcar encontrado nas hemiceluloses do

bagaço é a xilose (FENGEL e WEGENER, 1989).



Figura 2.7: Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando alguns

grupos substituintes: Xyl (1,4-D-xilopiranose); Ara (L-arabinofuranose); Ac (acetil); (4-

Me)-GlcA (ácido (4-O-metil)-D-glucopiranurônico); FA (ácido ferúlico); DDFA (ácido

desidroferúlico) (McDOUGALL et al., 1993).

2.2.3. Lignina

A lignina, depois da celulose, é a macromolécula orgânica mais abundante dentre

os materiais lignocelulósicos. É uma substância que vai sendo incorporada durante o

crescimento do vegetal, sendo composta basicamente de unidades fenilpropano que formam

uma macromolécula tridimensional e amorfa (Figura 2.8). A lignina representa de 20 a 30%

da massa total do material lignocelulósico.

O acoplamento das unidades fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva,

o que é atribuído ao mecanismo da biossíntese da lignina. Esta se processa por via radicalar

a partir da reação de três diferentes álcoois cinamílicos precursores: álcool p-cumarílico,

álcool coniferílico e álcool sinapílico (Figura 2.9), que geram unidades p-hidroxibenzílicas,

guaiacílicas e siringílicas, respectivamente.



Figura 2.8: Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler (FENGEL e

WEGENER, 1989).

Figura 2.9: Precursores da biossíntese da lignina: (I) álcool p-cumarílico; (II) álcool

coniferílico; (III) álcool sinapílico (FENGEL e WEGENER, 1989).



2.2.4. Outros componentes: extrativos

Os extrativos do bagaço compreendem uma grande variedade de substâncias

químicas, que podem ser extraídas utilizando solventes polares e apolares. Estas

substâncias são terpenos/terpenóides, gorduras/ceras, vários tipos de compostos fenólicos,

assim como proteínas e cinzas.

A soma destes componentes varia em cada espécie de material lignocelulósico e

representa aproximadamente 5-20% de todo o material (FENGEL e WEGENER, 1989).

2.3. Estrutura e ultraestrutura da parede celular vegetal

A estrutura da parede celular vegetal é subdividida em parede primária (P), parede

secundária (S1, S2 e S3) e parede terciária (T). Essas camadas (P, S1, S2, S3 e T) são

compostas predominantemente por celulose com espessura da ordem de 5 µm e as células

encontram-se separadas pela lamela média (LM), que é uma camada fina (máximo 1 µm de

espessura), composta por elevada concentração de lignina. A parede primária (P) é a

camada mais fina da parede celular e a primeira a ser depositada nas células (menor do que

0,1 µm de espessura) (FENGEL e WEGENER, 1989).

A celulose e as hemiceluloses predominam na região da parede celular enquanto

que a lignina se distribui por toda a estrutura, apresentando máxima concentração na lamela

média. A distribuição da celulose, hemicelulose e lignina varia consideravelmente entre

essas camadas (FENGEL e WEGENER, 1989).

A Figura 2.10 mostra as várias camadas da parece celular e ilustra como a lignina

envolve as células.

A Figura 2.11 apresenta o esquema da associação dos três principais componentes

na parede celular vegetal: celulose, hemicelulose e lignina. A celulose existe na forma de

microfibrilas, e os microcapilares que circundam a armação da parede celular são

preenchidos com hemicelulose e lignina. A Figura (A) mostra a vista transversal, isso

ocorre quando a seção é perpendicular ao eixo longitudinal da fibra e a Figura (B) mostra a

vista longitudinal em relação ao comprimento da fibra (FENGEL e WEGENER, 1989).



Figura 2.10: Ilustração esquemática morfológica da célula, parede secundária e a relação

da lignina, hemicelulose, e celulose na parede secundária da célula. Diâmetro da célula de

aproximadamente 25 µm. S1-S3, paredes secundárias da célula; P, parede primária; M.L.,

lamela média (KIRK e CULLEN, 1998).

Figura 2.11: Esquema da associação celulose-hemicelulose-lignina na parede celular

vegetal: (A) vista transversal e (B) vista longitudinal (FENGEL e WEGENER, 1989).

Ligações-PL, ligações poliose – lignina.

A hemicelulose liga-se através de ligações de hidrogênio as microfibrilas da

celulose, dando assim forma a uma rede que fornece a espinha dorsal estrutural da parede

celular da planta. A presença da lignina em algumas paredes celulares dá uma força



adicional, e fornece a resistência às pestes e às doenças. A celulose e a hemicelulose são

fontes potenciais de açúcares fermentescíveis (HINMAN et al., 1989; HO et al., 1998;

TAHERZADEH et al., 1999; SREENATH e JEFFRIES, 2000). A presença da lignina na

parede celular, entretanto, impede a hidrólise enzimática dos carboidratos.

2.4. Pré-tratamento

A biomassa lignocelulósica, no geral, é relativamente resistente à bioconversão e o

bagaço de cana-de-açúcar não é uma exceção. A utilização da biomassa como uma fonte de

carboidrato para produtos químicos e combustíveis tem sido severamente dificultada pela

baixa eficiência da população microbiana celulolítica.

Além disso, a menos que um excesso muito grande de enzimas seja usado, a

digestibilidade enzimática da celulose na biomassa nativa é baixa (< 20% de rendimento),

devido à característica estrutural do material lignocelulósico. Em vista disso, resíduos

agrícolas requerem um pré-tratamento para aumentar a digestibilidade da biomassa e fazer

com que a celulose torne-se mais acessível às enzimas que convertem os carboidratos em

açúcares fermentescíveis (CHANG et al., 1998), como representado no diagrama

esquemático da Figura 2.12.

Figura 2.12: Pré-tratamento nos materiais lignocelulósicos (adaptado por HSU et al.,

1980).



A cristalinidade da celulose, área de superfície acessível, proteção da celulose pela

lignina, o caráter heterogêneo das partículas da biomassa, e o fato da celulose estar

revestida pela hemicelulose contribuem para a resistência da biomassa lignocelulósica a

hidrólise (RYDHOLM, 1965; WENZEL, 1970; HSU et al., 1980; HSU, 1996; CHANG e

HOLTZAPPLE, 2000). A cristalinidade sozinha é insuficiente para impedir a hidrólise

significativa se uma quantidade de enzima suficiente for usada. Sendo assim, a soma de

todos estes fatores deve ser levada em consideração.

Os relacionamentos entre os fatores estruturais e composicionais refletem a

complexidade dos materiais lignocelulósicos. A variabilidade nestas características explica

a digestibilidade variando entre fontes diferentes de biomassa. No princípio, um pré-

tratamento eficaz causa o rompimento destas barreiras de modo que as enzimas hidrolíticas

possam penetrar e causar a hidrólise (Figura 2.12) e minimiza também a degradação

evitando a perda do açúcar (Figura 2.13) (LADISCH et al., 1983; LYND et al., 1991;

HOLTZAPPLE, 1993; MOSIER et al., 1999).

Figura 2.13: Esquema representativo dos passos do pré-tratamento. A transformação entre

celulose cristalina (C) e amorfa (C*) é reversível. Ambas formas rendem oligossacarídeos,

na qual hidrolisam obtendo a glicose. A degradação da glicose pode então se transformar

em inibidores da fermentação (WEIL, 1992).

O objetivo do pré-tratamento é quebrar o elo da lignina e romper a estrutura

cristalina da celulose. Um pré-tratamento eficaz é caracterizado por diversos critérios:

evitar a necessidade de reduzir o tamanho das partículas da biomassa, limitar a formação

dos produtos da degradação que inibem o crescimento dos microrganismos fermentativos,

minimizar a demanda de energia (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1999). Estas

propriedades, junto com outras, incluindo o baixo custo do reagente de pré-tratamento, a



possibilidade de ser reciclável e a geração de co-produtos da lignina de alto valor agregado

são uma base de comparação para as várias opções de pré-tratamento (LADISCH et al.,

1983, LYND et al., 1996; DELGENES et al., 1996; WYMAN, 1995b, 1999; PALMQVIST

e HAHN-HAGERDAL, 2000).

O pré-tratamento resulta na ampliação da área superficial interna das partículas do

substrato, realizada através da solubilização e/ou pela degradação parcial da hemicelulose e

da lignina. Isto conduz ao fracionamento dos três componentes e leva à abertura da

estrutura da celulose (PANDEY et al., 2000).

O pré-tratamento foi visto como uma das etapas do processo mais caras na

conversão da biomassa em açúcares fermentescíveis. Por isso, esta etapa apresenta um

grande potencial para melhorar a eficiência e baixar o custo no processo de pesquisa e

desenvolvimento (LEE et al., 1994; LYND et al.; 1996; MOSIER et al., 2003a, b).

2.4.1. Tipos de pré-tratamento

A taxa e a extensão da degradação enzimática da celulose são relacionadas

inversamente ao índice de lignina. Para a enzima celulase catalisar a hidrólise da celulose,

deve existir um contato direto entre as microfibras da celulose e o complexo enzimático, de

forma que a taxa de hidrólise enzimática da celulose é profundamente afetada pela estrutura

do material lignocelulósico. Existem vários tipos de pré-tratamento que podem ser usados

para aumentar a susceptibilidade da associação celulose-lignina e assim melhorar a

hidrólise enzimática.

Um pré-tratamento é considerado bom se a acessibilidade ao ataque biológico, isto

é, enzimas e microrganismos, é maximizada, e a formação dos co-produtos inibidores é

minimizada. A realização destes requerimentos é necessária para tornar um processo

economicamente viável.

O pré-tratamento da biomassa lignocelulósica pode ser agrupado em quatro

categorias: físico, químico, biológico ou uma combinação de todos esses, o que dependerá

do grau de separação requerido e do fim proposto (AZZAM, 1989; CLARK et al., 1989;

CÁPEK MÉNARD et al., 1992; KOKTA e AHMED, 1992).



A Tabela 2.2 resume algumas técnicas de pré-tratamentos avaliadas para os

materiais lignocelulósico com o objetivo de facilitar a hidrólise enzimática.

Tabela 2.2: Métodos de pré-tratamentos de materiais lignocelulósicos para hidrólise

enzimática (SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996).

Métodos Operações (fatores) que ocasionam mudança na estrutura do substrato

Tipo de mudança Referências

Físico Moagem e trituração (bola, energia vibratória, rolo duplo, pressão, martelo); radiação (raios de elétrons, raios γ, micro-ondas); altas temperaturas (pirólises, explosão a vapor).

Aumento da área superficial e tamanho dos poros da partícula, diminuição do grau de polimerização.

AZUMA et al. (1985), KOULLAS et al. (1992), RAMOS et al. (1993b).

Químico Bases, ácidos, gases, agentes oxidantes e redutores, solventes orgânicos.

Deslignificação, diminuição do grau de polimerização e cristalinidade da celulose associada com o inchaço da amostra, aumento da porosidade.

FARID et al. (1983), SZCZODRK et al. (1986), BES et al. (1989).

Biológico Bolor branco (Pleurorus, Pycnoporus, Ischnoderma, Phlebia, etc.).

Deslignificação e redução do grau de polimerização da celulose e hemicelulose.

ROLZ et al. (1986), MES-HARTREE et al. (1987)

Combinado Tratamento alcalino associado com explosão a vapor, moagem acompanhada com tratamento alcalino ou tratamento ácido.

Degradação da hemicelulose, deslignificação, aumento da área superficial e tamanho dos poros.

PURI e PEARCE (1989).

Os pré-tratamentos químicos têm recebido uma maior atenção, já que os pré-

tratamentos físicos são relativamente ineficientes no aumento da digestibilidade da

biomassa (FAN et al., 1982) e os tratamentos combinados raramente têm digestibilidade



melhorada quando comparados aos tratamentos simples (GHARPURAY et al., 1983).

Assim, o pré-tratamento químico foi escolhido como objeto de estudo para este trabalho.

2.4.1.1. O pré-tratamento químico

O pré-tratamento químico remove a lignina sem degradar a cadeia celulósica que

deve apresentar propriedades adequadas à sua posterior utilização. Como a lignina está

quimicamente ligada às hemiceluloses, uma degradação parcial das hemiceluloses ocorre

no processo de pré-tratamento. Além disso, há uma diminuição do grau de polimerização e

cristalinidade da celulose associada com o inchaço da amostra, aumentando assim a

porosidade do material.

Dentre os vários tipos de pré-tratamentos químicos destacaremos o que usa o

agente oxidante, peróxido de hidrogênio, para objeto de estudo.

2.4.1.1.1. Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino

Na natureza, a lignina é degradada por vários microrganismos, principalmente para

aumentar a acessibilidade da celulose para a digestibilidade enzimática. Apesar do

mecanismo de degradação natural da lignina ser desconhecido, é conhecido que os agentes

oxidantes, tal como o peróxido de hidrogênio, apresenta um importante papel neste

processo (FORNEY et al., 1982; KUTSUKI e GOLD, 1982).

Os pré-tratamentos oxidativos têm sido usados para dissolver os componentes da

matriz lignocelulósica e acelerar a hidrólise enzimática e a biodegradação. A oxidação é

empregada para degradar a lignina e a hidrólise para liberar os carboidratos, sendo que

juntos, eles tornam o processo mais eficiente.

O peróxido de hidrogênio reage com a lignina sob certas condições, e tem sido

largamente usado por vários anos como alvejante em polpas de madeira altamente

lignificadas para a produção de papel (REICHERT e PETE, 1949; BAILEY e DANCE,

1975).

A adição da base hidróxido de sódio ao peróxido de hidrogênio faz com que a

solução se torne um agente efetivo na deslignificação e solubilização da hemicelulose. Isto



é devido à formação do ânion hidroperóxido ( −HOO ), formado em pH alcalino, que se

apresenta como a principal espécie ativa no peróxido. Em contraste, peróxido de hidrogênio

é instável nas condições alcalinas e decompõe em radicais hidroxil ( OH⋅ ) e superóxido

( -2O⋅ ). Estes radicais são responsáveis pela oxidação da estrutura da lignina, na qual ataca

os grupos hidrofílicos, quebrando algumas ligações e, eventualmente, levando a dissolução

da lignina e hemicelulose (PAN et al., 1988; FANG et al., 1999; SUN et al., 2004).

Para o entendimento do mecanismo da reação de deslignificação utilizando

peróxido de hidrogênio alcalino é necessário examinar completamente as reações

envolvidas na sua decomposição (GOULD, 1985).

Em pH alcalino, a dissociação do peróxido de hidrogênio (H2O2) forma o ânion

hidroperóxido ( -HOO ):

++↔+ OHHOOOHOH 3-

222 (2.1)

Com o pH a 11,5, o ânion hidroperóxido pode reagir com o H2O2 não dissociado

para formar um radical hidroxila altamente reativo ( -OH⋅ ) e superóxido ( -2O⋅ ) como

mostra a reação 2.2.

OH OOH HOO OH 2-2

- 22 ++→+ ⋅⋅

(2.2)

Na ausência de outros reagentes, radicais hidroxílicos e superóxidos reagem entre

si formando oxigênio e água:

OH2 OOH OOH 223-2 +→++ +⋅⋅

(2.3)

Então, a reação geral de decomposição do peróxido de hidrogênio é demonstrada

na reação 2.4.

OH3 OOHHOOOH 223-

22 +→++ + (2.4)



Que de modo simplificado representa:

OH2 OO2H 2222 +→ (2.5)

Analisando a reação 2.5, fica claro que a quantidade máxima de 2O que pode estar

envolvida na solução alcalina de H2O2 é igual a metade da quantidade molar de H2O2

originalmente presente, ou seja, rendimento total de 0.5 mol de O2/mol de H2O2. Se outros

compostos que reagem com OH⋅ e/ou -2O estiverem presentes, haverá uma competição

com a reação 2.3, e poderá ser observado uma redução de 2O no meio reacional.

Quando o peróxido de hidrogênio se decompõe em condições alcalinas na

presença do substrato contendo lignina, uma menor quantidade de 2O é envolvida se

comparada com a quantidade teórica máxima, indicando que pelo menos alguns dos

intermediários reativos formados na reação de decomposição do peróxido foram

incorporados nos produtos oxidados da lignina. O fato que a extensão da deslignificação é

máxima em pH 11,5 sugere fortemente que estes intermediários são gerados via reação 2.2,

sendo a reação fortemente dependente do pH.

A diminuição na eficiência da deslignificação das amostras tratadas a pH maior

que 11,5 parece eliminar a possibilidade da oxidação direta significativa da lignina pelo

-HOO , porque a concentração de -HOO na mistura reacional seria aumentada em pH

maiores que 11,5 e isso ao invés de levar a um aumento da deslignificação acaba gerando

uma diminuição.

Com isso, fica claro que a lignina é provavelmente o principal alvo do ataque

químico na reação alcalina do peróxido de hidrogênio. As mudanças observadas nas

propriedades físicas e morfológicas das fibras de celulose sugerem que pelo menos uma

parcela das unidades de glicose pode também ser liberada durante o tratamento. Se isso for

verdade, a porcentagem de glicose total liberada deve ser pequena (< 5%) sendo que

aproximadamente 95% ou mais da celulose presente no resíduo insolúvel após o tratamento



alcalino com peróxido é liberado durante o processo de hidrólise com a enzima celulase. A

liberação de uma pequena porcentagem de unidades de glicose da celulose deve ser

suficiente para romper as ligações de hidrogênio proporcionando uma estrutura altamente

aberta que não poderia se transformar em regiões cristalinas mesmo após a secagem a altas

temperaturas, facilitando assim ainda mais o processo de hidrólise (GOULD, 1985).

O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino em resíduos

lignocelulósicos, como o bagaço de cana-de-açúcar, aumenta enormemente a

susceptibilidade para a hidrólise enzimática e conseqüentemente a produção de etanol.

Várias condições do processo têm sido estudadas para otimizar a efetividade enzimática

(AZZAM, 1989).

Segundo GOULD e FREER (1984), palha de trigo, casca de semente, kenaf e

outros materiais lignocelulósicos podem ser utilizados para obtenção de açúcares. Amostras

foram moídas e passadas por peneira de 2 mm de diâmetro e embebidas num total de 4

horas, com inúmeras trocas de água, para a remoção dos materiais solúveis. Após secagem,

foram tratadas com uma solução contendo 1% de H2O2. Hidróxido de sódio foi adicionado

à suspensão para manter o pH em 11,5 e o pré-tratamento efetuado a temperatura de 25°C

por 16 h. Após o período de tempo indicado, a fração insolúvel foi coletada, lavada

repetidamente com água destilada, e seca em uma estufa a 50°C. Ao final desse pré-

tratamento, pouco mais da metade da lignina foi solubilizada, deixando os resíduos

altamente suscetíveis à hidrólise enzimática. Ainda segundo os autores, aumentado a

concentração de peróxido de hidrogênio para mais que 1%, com pH alcalino, não há

grandes alterações na solubilidade da lignina. O que ocorre é um aumento na solubilidade

da hemicelulose.

GOULD (1984) afirmou que aproximadamente metade da lignina e grande parte

da hemicelulose presentes em resíduos agrícolas como palha de trigo e resíduos da colheita

de milho foram solubilizados quando tratados a 25°C com uma solução alcalina de 1%

(w/v) de peróxido de hidrogênio, com o pH ajustado para 11,5, por 18 a 24 horas. A

hidrólise da fração insolúvel com celulase de Trichoderma reesei apresentou um

rendimento de glicose de quase 100%, baseado no conteúdo de celulose contida no resíduo

antes do pré-tratamento.



Ainda segundo o autor, o início da deslignificação dos resíduos pelo peróxido de

hidrogênio depende do valor do pH da solução de pré-tratamento estar acima de 10,5 com a

máxima deslignificação ocorrendo a pH 11,5 ou mais. O pré-tratamento dos resíduos com

uma solução de peróxido de hidrogênio com pH menor que 10 apresentou baixa

digestibilidade da biomassa, sendo que 10-15% da lignina foi solubilizada a pH 6,8.

Quando tratados com peróxido a um pH 10 ou mais, a hemicelulose contida na fração

insolúvel diminuiu drasticamente. A eficiência da hidrólise enzimática na conversão da

celulose à glicose também depende do pH durante o pré-tratamento. Amostras tratadas com

pHs maiores que 10 mostraram uma maior eficiência na conversão, sendo o máximo de

aproximadamente 100% de conversão no pH 11,5.

Segundo AZZAM (1989), as condições mais importantes de estudo para o pré-

tratamento com H2O2 incluem o tempo de contato, a concentração do peróxido de

hidrogênio, e a temperatura do pré-tratamento. Resultados obtidos em seu trabalho

mostraram que aproximadamente 50% da lignina e a maior parte da hemicelulose contida

no bagaço de cana foram solubilizadas utilizando uma concentração de 2% de peróxido de

hidrogênio alcalino a 30°C em 8 horas. O conteúdo de celulose foi conseqüentemente

aumentado de 42% do bagaço não tratado para 75% após o processo de oxidação. A

sacarificação da polpa pré-tratada com celulase de Trichoderma viride a 45°C por 24 horas,

apresentou um rendimento de glicose de 95%.

AMJED et al. (1992), caracterizaram a alteração da parede celular e a

digestibilidade do bagaço de cana-de-açúcar, da medula do bagaço e da palha de trigo após

tratamento dos resíduos com 1% (w/v) de H2O2 tendo o pH 11,5 mantido com NaOH. A

reação foi agitada à temperatura ambiente (25°C) por 24 horas. Os resíduos insolúveis

foram coletados, lavados com água até os efluentes ficarem neutros e posteriormente secos

a 40°C por 7 dias. Após a caracterização química dos resíduos foi observado que a razão

hemicelulose/celulose foi diminuída, o que leva a entender que houve a degradação da

hemicelulose. A lignina de Klason também se mostrou menor após o processo de pré-

tratamento.

KRISHNA et al. (1998) analisaram três tipos de pré-tratamento para o bagaço de

cana-de-açúcar: autoclavagem por 20 min a 15 psi, tratamento alcalino (NaOH 1%) e

peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2 + NaOH, 1%). A hidrólise enzimática do bagaço



após pré-tratamento com o peróxido de hidrogênio alcalino mostrou-se superior em relação

ao bagaço pré-tratado por autoclavagem e com o hidróxido de sódio. Selecionando o

peróxido como melhor pré-tratamento, analisaram-se parâmetros tais como tempo de

reação, temperatura ótima, pH do meio e concentração de enzima durante a realização de

uma sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O melhor tempo de SSF foi de 48 h e a

temperatura ótima 50°C. O rendimento máximo de glicose foi obtido quando o bagaço pré-

tratado teve o pH ajustado para 4,5 durante o processo de hidrólise com a utilização de

40 FPU/g biomassa, de celulase.

2.5. Hidrólise

Existem basicamente três técnicas para a obtenção de açúcares fermentescíveis

provenientes de materiais lignocelulósicos: hidrólise com ácido concentrado, hidrólise com

ácidos diluídos e hidrólise enzimática.

Na hidrólise com ácido concentrado, a hemicelulose e celulose presentes na

biomassa são quebradas usando soluções aquosas de ácidos minerais fortes, tais como ácido

sulfúrico, clorídrico ou fosfórico, em baixas temperaturas (<100°C). A principal

desvantagem dessa técnica é que requer equipamentos altamente resistentes à corrosão,

aumentando assim o custo do produto. Tipicamente, a fração de hemicelulose é hidrolisada

mais rapidamente que a fração de celulose, e os monossacarídeos liberados da hemicelulose

são expostos no meio reacional por muito tempo, o que leva a degradação e perda desses

açúcares. A recuperação do ácido usado no processo é essencial por razões econômicas e

devido a problemas ambientais (SZENGYEL, 2000).

No processo com ácido diluído, parte da hemicelulose e da celulose são

hidrolisadas separadamente. A hemicelulose hidrolisada pode ser removida após o primeiro

passo da hidrólise. Desta forma, as condições de hidrólise tanto para a hemicelulose quanto

para a celulose podem ser otimizadas. Porém, devido às altas temperaturas aplicadas no

segundo passo (aproximadamente 200°C), uma quantidade considerável de açúcares e

lignina solúvel são degradadas levando a uma inibição durante o processo de fermentação

(CLARK e MACKEI, 1984, WYMAN, 1994; LARSSON et al., 1998).

No processo enzimático, a biomassa lignocelulósica é primeiramente pré-tratada



para aumentar a acessibilidade ao ataque enzimático. Durante o pré-tratamento, a

hemicelulose é hidrolisada em um processo similar ao primeiro passo da hidrólise com

ácido diluído. No segundo passo, a hidrólise propriamente dita, a celulose é quebrada

através das enzimas celulases. Devido a condições mais suaves aplicadas durante o

processo, uma menor quantidade de subprodutos é liberada, resultando em um alto

rendimento de açúcares fermentescíveis. Porém, para atingir uma alta conversão da

celulose é necessário altas concentrações da enzima, o que aumenta o custo de produção

(EKLUND et al., 1990).

As condições de cada processo e os seus desempenhos aproximados são mostrados

na Tabela 2.3.

Tabela 2.3: Comparação das condições e desempenho dos três processos de hidrólise

(HAMELINCK et al., 2005).

Consumo Temperatura

(°C) Tempo

Rendimento de

glicose

Ácido diluído <1% H2SO4 215 3 min 50-70%

Ácido concentrado 30-70% H2SO4 40 2-6 h 90%

Enzimática celulase 70 1,5 dias 75-95%

2.5.1. Hidrólise enzimática

A hidrólise enzimática da celulose é realizada pelas enzimas celulases, as quais

são altamente específicas (BÉGUIN e AUBERT, 1994). O produto da hidrólise são

usualmente açúcares redutores, incluindo a glicose. O custo da hidrólise enzimática é

muitas vezes baixo se comparado com a hidrólise ácida porque a hidrólise é usualmente

conduzida em condições suaves (pH 4,8; e temperatura 45-50°C), além de não apresentar

problemas de corrosão nos equipamentos (DUFF e MURRAY, 1996).

Ao contrário dos catalisadores comuns, as enzimas apresentam uma elevada

especificidade em relação ao substrato e sua utilização reduz a obtenção de subprodutos

indesejáveis na reação, diminuindo assim os custos de separação dos produtos, bem como

os problemas de tratamento de efluente (SEGEL, 1975). No caso da hidrólise enzimática, a



especificidade da enzima evita ainda que ocorra degradação da glicose, o que pode ocorrer

na hidrólise ácida (CONTIERO, 1992).

Ao longo dos anos, vários mecanismos diferentes foram propostos para a

conversão de celulose a glicose. PETTERSON et al. (1978) descreveram um esquema

hipotético para a degradação da celulose em 3 etapas:

ativa Celulose nativa Celulose asesendoglican →

Celobioseativa Celulose sesexoglicana →

GlicoseCelobiose eglicosidas → −β (2.6)

O rendimento da hidrólise é governado por muitos fatores, tais como: tipo de pré-

tratamento do substrato, inibição da atividade enzimática pelos produtos finais da

biodegradação, termoestabilidade das enzimas, concentração e adsorção do substrato,

tempo de duração da hidrólise, pH do meio, concentração de substrato no meio e taxa de

agitação. Conseqüentemente é necessário otimizar as condições de hidrólise para conseguir

o funcionamento satisfatório dos processos de sacarificação (VALLANDER e ERIKSSON,

1985).

Ao efetuarmos uma comparação entre os processos de hidrólise podemos perceber

que a hidrólise enzimática conduz a rendimentos mais elevados de monossacarídeos do que

a hidrólise ácida, porque as enzimas celulases catalisam somente as reações de hidrólise e

não as reações da degradação do açúcar (PARISI, 1989).

Alguns autores vêm mostrando a eficiência da hidrólise enzimática em relação à

hidrólise ácida. Segundo KRISHNA et al. (1998), aproximadamente 75 e 65% da

sacarificação foram conseguidas com 7,5% (w/w) de H2SO4 e HCI, respectivamente, a

15 psi em 45 minutos. No caso da hidrólise enzimática, o pré-tratamento do bagaço foi

essencial, mas altas pressões não foram requeridas. O hidrolisado enzimático apresentou

uma conversão de 92% do substrato quando usado no bagaço o pré-tratamento com

peróxido de hidrogênio alcalino a 2,5% (w/v). A formação dos açúcares foi conseguida a

50°C e pH 4,5, usando celulase de T. reesei com 40 FPU/g substrato em 48 h. A produção



de álcool foi mais elevada realizando a fermentação do hidrolisado enzimático do que do

hidrolisado ácido.

Embora os processos de hidrólise ácida estejam mais desenvolvidos

tecnologicamente e tenham maiores chances de se tornarem economicamente viáveis em

um futuro próximo, espera-se que os processos enzimáticos tenham seus custos bastante

reduzidos com o avanço da tecnologia envolvida e venham a ser a melhor opção no futuro.

2.5.1.1. As enzimas celulases

A celulose, dentre os materiais naturais, é o biopolímero mais abundante do

mundo (BAYER e LAMED, 1992). A degradação microbiana da celulose é total e

específica, e tem estimulado o uso dos processos de fermentações celulolíticas pelo homem

(LYNCH et al. 1981).

A hidrólise da celulose por celulases resulta na produção final de glicose. As

celulases, porém, por serem proteínas, não conseguem penetrar com facilidade a barreira da

lignina das células vegetais e, dessa forma, o difícil acesso destas enzimas às fibras de

celulose constitui o principal problema para desencadeamento desse processo de

degradação (THIEMANN et al., 1980). Logo, a necessidade do pré-tratamento antes da

etapa da hidrólise é de suma importância.

As enzimas celulases representam um fator relevante durante o processo de

hidrólise, já que estas apresentam alto custo. Dentre os vários meios de reduzir os custos da

produção das celulases, uma opção seria incluir tentativas de reciclá-las e recuperá-las do

hidrolisado da celulose (RAMOS et al., 1993a), imobilização (ROGALSKI et al., 1985;

WOODWARD, 1989) ou o uso de métodos mais eficazes de cultivo dos microrganismos

para a síntese destas enzimas, tais como culturas em batelada alimentada (PERSSON et al.,

1991) ou fermentação sólida (ROUSSOS et al., 1993).

Enzimas recicladas podem aumentar efetivamente a razão e o rendimento da

hidrólise e diminuir o custo de produção (MES-HARTREE et al., 1987). RAMOS et al.

(1993a) reportaram que misturas de enzimas comerciais Celluclast (celulase) e Novozyme

(β-glicosidase) foram sucessivamente recicladas em cinco passos consecutivos com o



passar de 48 h entre cada passo da reciclagem. A eficiência da hidrólise da celulose diminui

gradualmente com cada passo da reciclagem.

2.5.1.1.1. Degradação enzimática da celulose

Na natureza, a degradação da celulose é realizada por fungos e bactérias. Estes

produzem enzimas, celulases, que degradam especificamente a cadeia polimérica,

originando polímeros com cadeias mais curtas.

As espécies de fungos mais estudadas que produzem celulases são o Trichoderma

reesei, Penicillium pinophilum, Humicola insolens, Trichoderma koningii, Penicillium

funiculosum, Fusarium solani, Myrothecium verrucaria, Sporotrichum pulverulentum e

Aspergilo niger. Tais fungos excretam uma celulase de alta atividade no meio de cultura

(PATHAK e GHOSE, 1973; STERNBERG, 1976; LEE e FAN, 1980; CANEVASCINI e

GATTEN, 1981; LARIOS et al., 1984; FAN et al., 1987; DUFF e MURRAY, 1996). Entre

as bactérias produtoras de celulase temos a Cellulomonas fimi e Clostridium thermocellum

(BISARIA, 1991).

Os sistemas celulolíticos destes fungos e de algumas bactérias são constituídos por

enzimas que atuam nas extremidades (exoglucanases) ou que atuam no meio

(endoglucanases) das cadeias de celulose (WOOD, 1992).

A adsorção das enzimas celulases e a formação do complexo enzima/substrato são

consideradas os passos críticos na hidrólise enzimática da celulose. A adsorção de celulase

na celulose insolúvel já foi descrita como reversível, irreversível e semi-reversível, não se

tendo chegado a um consenso em relação a este ponto (GAN et al., 2003).

Segundo GAN et al. (2003), na hidrólise enzimática ocorre a transferência de

massa das moléculas de enzima através da camada estagnada de filme líquido que cerca as

partículas sólidas de celulose e depois a difusão interna das moléculas de enzima na matriz

sólida. A taxa de reação global pode ser influenciada por estas resistências à transferência

de massa. No começo da hidrólise, no caso de reação em reator batelada agitado, a taxa de

reação global é determinada pelas taxas de três eventos em seqüência: (1) a taxa de

transferência de massa da enzima, (2) a taxa de adsorção da enzima na superfície do

substrato e (3) a taxa de catálise da celulase. Com a continuação da hidrólise após a



primeira fase de reação rápida, a taxa de reação global começa a depender da maior

penetração da enzima e difusão dentro do substrato sólido. A grande maioria dos autores,

no entanto, ignoram a resistência à transferência de massa externa, que supõem

insignificante em comparação com a catálise, mais lenta.

2.5.1.1.2. Sistema celuloltico produzido pelo Trichoderma reesei

Trichoderma reesei é o fungo celulolítico melhor caracterizado e o mais utilizado

industrialmente para a produção de celulases (BEGUIN e AUBERT, 1994; SRISODSUK,

1994). Produzindo um sistema completo de glicanases, o T. reesei segrega pelo menos seis

tipos de endoglicanases (EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV e EGVI), duas celobiohidrolases

(exoglicanases) (CBHI e CBHII) e duas β-glicosidases (SALOHEIMO et al., 1997;

SALOHEIMO et al., 2002; SRISODSUK, 1994). A Tabela 2.4 mostra as propriedades e

organização estrutural das celulases de T. reesei.

A hidrólise enzimática é uma reação heterogênea catalisada pelas celulases, sendo

caracterizada por um substrato insolúvel (celulose) e um catalisador solúvel (enzimas).

Assim, as características estruturais da celulose e o modo de ação das enzimas influenciam

na taxa de reação. A susceptibilidade da celulose ao ataque enzimático é determinada pela

acessibilidade dos sítios de ligação para a celulose, o que determina a subseqüente adsorção

da enzima no substrato sólido.

A maioria das celulases dos fungos, e todas as produzidas pelo T. reesei, são

constituídas por dois domínios funcionais e estruturalmente distintos. O primeiro,

designado por domínio catalítico, constitui a maior parte da proteína, já o segundo domínio

é responsável pela ligação da enzima ao substrato designado por “Core Binding Domain”

(CBD). Os dois domínios estão ligados por uma seqüência altamente glicosídica (“linker”)

como mostra a Figura 2.14. Das celulases identificadas até hoje, apenas EGIII não possui

CBD e o “linker” (Tabela 2.4).



Tabela 2.4: Propriedades e organização estrutural das celulases produzidas pelo T. reesei

(SALOHEIMO et al., 1997; SRISODSUK, 1994).

Enzima Família Aminoácidos

Massa

molecular

(Kda)

Ponto

isoelétrico

(pI)

Organização

estrutural

EG I 7 437 50-55 4.6 368 33 36

EG II 5 397 48 5.5

36 34 327

EG III 12 218 25 7.4 218

EG IV 61 326 (37)a -

233 23 37

EG V 45 225 (23)a 2.8-3 166 23 36

EG VI * * 95-105 5.6-6.8

*

CBH I 7 497 59-68 3.5-4.2

430 31 36

CBH II 6 447 50-58 5.1-6.3 36 44 365

a – Massa molecular calculada a partir da seqüência de aminoácidos;

* - Gene não descrito;

- Domínio catalítico

- Linker

- CBD “Core Binding Domain”



Figura 2.14: Representação esquemática de uma celulase (PAULO, 1995).

2.5.1.1.3. Modo de ação das celulases: sinergismo

Apesar das discordâncias apresentadas por alguns autores, relacionadas com a

especificidade das diferentes celulases e o seu modo de ação, é geralmente reconhecida a

existência de três tipos de celulases nos sistemas completos: endoglicanases, exoglicanases

ou celobiohidrolases e β-glicosidase ou celobiase (BHAT e BHAT, 1997; MANI et al.,

2002; GAN et al., 2003).

As moléculas de celulose são lineares e associam-se umas as outras formando

feixes fibrosos. Estes feixes apresentam duas regiões bastante distintas: uma região bastante

organizada apresentando grandes quantidades de ligações de hidrogênio, chamada de região

cristalina, dificultando bastante o processo de hidrólise, e outra completamente

desorganizada, chamada de amorfa (Figura 2.15). Cada tipo de celulase acaba atacando

preferencialmente uma região específica da celulose.

Figura 2.15: Regiões específicas da celulose.

As endoglicanases (EGs, E.C. 3.2.1.4) hidrolisam preferencialmente as ligações

internas no polímero da celulose, produzindo oligossacarídeos de menor peso molecular,

chamados de celodextrinas, além de celobiose, resultando em uma rápida diminuição da



viscosidade e aumento relativamente pequeno do poder redutor (WOOD, 1989;

HEIKINHEIMO, 2002). A região catalítica da enzima é dada pela forma que permite a

ligação da enzima e a hidrólise na parte média da fibra da celulose (DIVNE et al., 1994).

Assim, as endoglicanases atacam de forma mais ou menos aleatória as ligações β-(1-4)-

glicosídicas em regiões amorfas da celulose ou na superfície das microfibrilas.

As exoglicanases ou celobiohidrolases (CBHs, E.C. 3.2.1.91) iniciam a hidrólise

nas extremidades da cadeia, e não produzem uma quantidade significativa de novas cadeias

terminais na superfície da celulose (IRWIN et al., 1993; HEIKINHEIMO, 2002). CBH I e

CBH II quebram as unidades de celobiose das extremidades redutora e não redutora do

polímero, respectivamente (VRSANSKÁ e BIELY, 1993; HEIKINHEIMO, 2002). Logo,

as exoglicanases liberam a celobiose rompendo as ligações β-(1-4)-glicosídicas.

As celobiases ou β-glicosidades (E.C. 3.2.1.21) completam a hidrólise catalisando

a hidrólise da celobiose a glicose. Portanto, as celobiases hidrolisam a celobiose e as

celodextrinas solúveis em água à glicose.

A Figura 2.16 mostra uma representação esquemática da hidrólise da celulose e a

ação das endoglicanases, exoglicanases e ß-glicosidases de Trichoderma reesei.

Figura 2.16: Representação esquemática da hidrólise da celulose e da ação do CBHs, EGs,

e ß-glicosidases (ß-gluc) de Trichoderma reesei. C define a região altamente ordenada

(região cristalina), R os grupos terminais redutores (círculos preenchidos), e NR os grupos

terminais não redutores (círculos não-preenchidos). EGs ataca as estruturas mais

desordenadas da celulose. A ação da ß-glicosidase produz a glicose. Modificado de TEERI

(1997).



DUSTERHOFT et al. (1993) mostraram que, embora a composição do complexo

enzimático influencie na extensão da solubilização, os fatores limitantes da hidrólise são: o

tipo de açúcares liberados, o local do ataque enzimático dentro do polímero e a

acessibilidade do substrato.

A celulose cristalina é altamente resistente ao ataque enzimático. A maioria das

ligações glicosídicas na microfibrila são inacessíveis às enzimas, e todas as ligações

clivadas pela ação das endoglicanases podem prontamente ser reformadas devido à

orientação estável das ligações glicosídicas. Conseqüentemente, a degradação da celulose

cristalina requer a ação sinérgica da endoglicanase e exoglicanase. O máximo sinergismo é

obtido com uma elevada quantidade de exoglicanases na mistura (REINIKAINEN, 1994) e

depende do tipo de substrato usado (NIDETZKY et al., 1993).

As exoglicanases removem rapidamente as unidades de celobiose das

extremidades recentemente criadas pela ação das endoglicanases, impedindo assim a

reformação das ligações glicosídicas. As duas enzimas podem agir consecutivamente ou em

harmonia. As exo- e endoglicanases são inibidas pela celobiose, e a ação da β-glicosidade é

freqüentemente a etapa limitante na degradação da celulose (LEE, 1997).

O efeito do complexo da enzima celulase é expresso pela ação sinérgica destas três

enzimas diferentes na celulose e este sistema complexo de enzimas necessita ser mantido

estável para a atividade celulolítica elevada. Em conseqüência da ação dos primeiros dois

grupos de enzimas (endo- e exoglicanases) na celulose, a celobiose e a glicose são obtidas,

e enquanto sua concentração no meio reacional aumenta gradualmente, as atividades das

celulases respectivas são inibidas por estes produtos, tendo por resultado uma diminuição

final na taxa e no rendimento do processo de sacarificação. A celobiose apresenta um poder

de inibição maior no complexo celulolítico sendo mais expressivo que a inibição por

glicose.

O mercado atual oferece muitos complexos de celulase que contêm níveis baixos

de β-glicosidase, conduzindo a um aumento do acúmulo de celobiose nos hidrolisados

enzimáticos de celulose. Já que a celobiose apresenta um poder inibidor mais forte do que a

glicose, e sua hidrólise ocorre através da ação das enzimas β-glicosidases, é indicado que se

adicione no meio reacional uma certa quantidade desta enzima proveniente de outras fontes

de complexos enzimáticos. Desta forma há uma diminuição da concentração de celobiose



no meio reacional, ocasionando diminuição da inibição e aumento na eficiência da hidrólise

enzimática (SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996; SUN e CHENG, 2002).

A produção da β-glicosidade é altamente dependente das condições da cultura,

sendo que um relativo aumento do pH pode aumentar a produção de β-glicosidade pelos

microrganismos (JUHÁSZ et al., 2004). Alguns autores sugerem que T. reesei produz mais

de um tipo de β-glicosidade e que esta tem uma importante função indutora na formação da

endo e exoglicanase (KUBICEK e PENTTILÄ, 1998).

O padrão de inibição das enzimas celulases tem sido objeto de vários estudos.

Alguns autores sugerem que a inibição competitiva é dominante, outros que a inibição não-

competitiva é observada, enquanto outros ainda reportam uma combinação de ambas (GAN

et al., 2003).

2.6. Conversão de biomassa a álcool

O Brasil foi pioneiro no desenvolvimento da tecnologia da produção do etanol a

partir da cana-de-açúcar e também nas tecnologias de motores a álcool, a partir da década

de 80. No entanto, a incerteza no fornecimento de álcool, entre outras razões, levou ao

desmonte do Proálcool, o programa governamental para o desenvolvimento do setor

sucroalcooleiro.

Apesar disso, o país conseguiu galgar um degrau tecnológico que o colocou num

posto avançado do ponto de vista global. O Brasil é praticamente o único país do mundo

que integra totalmente a produção de açúcar e de álcool na mesma planta, reduzindo os

custos de ambos os processos. Sendo assim, integrar o processo de hidrólise do bagaço nas

usinas seria um passo fácil e muito importante.

A cana no Brasil ocupa só 2% da área agricultável, menos de 10% de toda as

culturas agrícolas, e pode portanto tranqüilamente aumentar dez vezes. Usando o bagaço, a

palha, e tecnologias novas de conversão, poderá talvez aumentar de 50 a 100% a produção

por hectare. Assim, pode-se pensar no Brasil produzindo 200 a 300 bilhões de litros de

álcool por ano, de forma sustentável e mais barato do que qualquer outra fonte energética

(CAMARGO, 2005).



Uma fonte em potencial para a produção de etanol a baixo custo é a utilização dos

materiais lignocelulósicos, sendo o bagaço de cana-de-açúcar considerado a maior fonte no

Brasil, já que existe um enorme volume desse resíduo agrícola não sendo totalmente

utilizado.

Os benefícios da tecnologia de transformação da biomassa em etanol têm sido

previamente indicados: segurança de energia aumentada, redução em emissões de gás que

causam o efeito estufa, uso de recursos renováveis, fundação de uma indústria de processos

químicos, benefícios macroeconômicos para comunidades rurais e a sociedade como um

todo. Apesar do processo encaminhar para todos esses benefícios, a comercialização e a

aplicação difundida da utilização da biomassa lignocelulósica ainda não ocorreu (KNAUF e

MONIRUZZAMAN, 2004).

Décadas de pesquisas demonstraram que as biomassas requerem processamento

extensivo para a transformação em açúcares fermentescíveis, e posteriormente uma

conversão biológica para produção de combustíveis e outros produtos químicos. A

disponibilidade da biomassa, sua posição e transporte ao local do tratamento, as estratégias

de pré-tratamento, os agentes hidrolíticos eficientes e a disponibilidade de microrganismos

fermentativos, todos impactam nos custos para a fabricação do etanol (KNAUF e

MONIRUZZAMAN, 2004).

O desenvolvimento recente de novas tecnologias mostra o potencial de remover

estes obstáculos de desempenho econômico tornando essa comercialização possível. Muitas

parcerias entre governo/universidade/indústria foram realizadas para desenvolver processos

compatíveis e para permitir uma aproximação integrada da conversão da biomassa e

conseguir uma redução de custo requerida, para que a conversão da biomassa a etanol

transforme-se em uma realidade.

Existem várias formas de converter o material celulósico a etanol. Uma delas é a

conversão direta (DMC - Direct Microbial Conversion) onde todos os estágios da produção

são interconectados: a síntese de celulase, a hidrólise enzimática e a fermentação. Este

método se baseia na utilização de culturas de microrganismos que fermentam celulose

diretamente a etanol. Em geral, a fermentação costuma ser lenta e ter baixo rendimento, o

que provavelmente está relacionado à baixa resistência dos microrganismos a altas



concentrações de etanol. Outra desvantagem é a geração de vários co-produtos, tais como

ácidos acético e lático (SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996).

A sacarificação e fermentação simultâneas (SSF- Simultaneous Saccharification

and Fermentation) combina a hidrólise enzimática e fermentação em um só reator, evitando

a inibição da celulase pela glicose resultante da hidrólise. Este processo, no entanto, não

evita a inibição causada pela celobiose, já que as leveduras industriais que fermentam

glicose não conseguem fermentar celobiose. Esta abordagem leva a rendimento mais alto,

menor tempo de fermentação e riscos menores de contaminação, devido à temperatura alta,

presença de etanol e condições anaeróbicas. Apesar destas vantagens, a SSF tem alguns

pontos negativos, entre eles as diferentes temperaturas ótimas para hidrólise (45-50ºC) e

fermentação (28-35ºC) e a inibição dos microrganismos fermentativos e da celulase pelo

etanol e por substâncias tóxicas vindas do pré-tratamento do material lignocelulósico

(SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996). Neste caso, o uso de um pré-tratamento microbiano

poderia melhorar o rendimento, já que minimiza a presença de substâncias tóxicas

(KELLER et al., 2003).

A abordagem que tem mostrado maior flexibilidade para controle das condições

operacionais é a sacarificação seguida de fermentação, na qual todos os estágios (hidrólise e

fermentação) são separados. No entanto, como os produtos da hidrólise enzimática inibem

as enzimas, há limitação da taxa de sacarificação, levando a baixos rendimentos em etanol

(SZCZODRAK e FIEDUREK, 1996).

Embora a taxa de hidrólise e a composição dos açúcares resultantes dependam do

método de pré-tratamento/hidrólise e das circunstâncias empregadas, os constituintes

principais dos hidrolisados são a glicose e xilose liberados da celulose e hemicelulose,

respectivamente. A glicose produzida da hidrólise da celulose pode facilmente ser

fermentada por microrganismos existentes como é feito atualmente. Entretanto, a hidrólise

da hemicelulose produz hexoses, facilmente fermentadas, e pentoses, conhecidos como

açúcares mal fermentescíveis. Conseqüentemente, as tecnologias de fermentação que

utilizam as pentoses necessitam ser bem desenvolvidas para realçar a eficiência total do

processo da conversão (LEE, 1997).

Microrganismos de fermentação que podem utilizar as pentoses vêm sendo

projetados através de modificações genéticas, mas os rendimentos em etanol ainda não são



suficientes para tornar o processo economicamente atrativo. Diversos produtos de

degradação, tais como o ácido fórmico, acético, furfural, hidroximetilfurfural e fenóis,

produzidos durante o pré-tratamento e a hidrólise, podem inibir o processo de fermentação

e afetar rendimentos do etanol, devendo assim ser removidos ou suavizados (PALMQVIST

e HAHN-HAGERDAL, 2000; KNAUF e MONIRUZZAMAN, 2004).

2.6.1. Microrganismos fermentativos

No processo de fermentação do hidrolisado celulósico para a produção de etanol, a

principal espécie utilizada é a Saccharomyces cerevisiae. Estas fermentam uma ampla

variedade de hexoses, tais como glicose, frutose, galactose, maltose e maltotriose, levando

a um alto rendimento de etanol. Estas leveduras têm sido tradicionalmente empregadas na

produção industrial de etanol porque são cultivadas especificamente e produzem a uma

concentração moderadamente alta de álcool.

A inibição por etanol é um dos principais fatores que restringem a taxa de

fermentação, a atividade da levedura e a concentração máxima de etanol conseguida

durante a fermentação. Com o objetivo de manter uma fermentação eficiente, substratos

com concentrações diluídas de 200 g/L ou menos são usados para obter uma concentração

final de etanol por volta de 100 g/L após 48-72 horas. Uma forma de minimizar a inibição

do etanol é remover o etanol durante a fermentação (GONG et al., 1999).

O desenvolvimento de microrganismos geneticamente modificados pode aumentar

a conversão dos açúcares redutores tais como glicose, xilose, arabinose em etanol (HO et

al., 1999). Microrganismos vêem sendo desenvolvidos através da engenharia genética.

Linhagens recombinantes das bactérias gram-negativas Escherichia coli, klebsiella oxytoca

ou Erwinia sp. têm sido desenvolvidas. Estas linhagens podem converter eficientemente

todos os açúcares da hemicelulose e celulose em etanol além do que a klebsiella oxytoca e

Erwinia sp. possuem a habilidade nativa de transportar e metabolizar a celobiose (também

celotriose, xilobiose, e xilotriose), minimizando a necessidade da adição de β-glicosidase.

Três abordagens tem sido bastante tentadas para permitir que a xilose possa ser

utilizada: (1) clonagem de genes das espécies S. cerevisiae para fermentação das pentoses

(MONIRUZZAMAN et al., 1997); (2) linhagens diferentes da cultura de Zymomonas



mobilis geneticamente modificada (MOHAGHEGHI et al., 1998); e (3) clonagem das

linhagens resistentes de Escherichia coli para utilização das pentoses (DIEN et al., 1998;

INGRAM et al., 1998).

Com o desenvolvimento da engenharia genética, ocorrerá uma melhoria na

produtividade volumétrica, aumento da tolerância a etanol, eliminação de problemas de

inibição durante a utilização de misturas ricas em glicose, e desenvolvimento de linhagens

que são inteiramente resistentes aos produtos do hidrolisado, possibilitando assim a

eliminação de todas as etapas de clean-up (INGRAM e DORAM, 1995).

2.7. Colorimetria e espectrofotometria

A colorimetria e a espectrofotometria podem ser conceituadas como um

procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas

mediante a absorção de energia radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória,

caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (λ, expressos em µm ou nm) e que

apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é

absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante

da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem. Esta absorção, em

cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de sua concentração e da

espessura da mesma que é atravessada pela luz.

A absorção de radiação visível é resultante da excitação de elétrons de ligação,

obtendo a resposta em transmitância (T) ou absorbância (A) através de um caminho óptico

(b), seguindo a lei de Lambert-Beer:



TcbA log−=⋅⋅= ε (2.7)

onde ε representa a absortividade molar; c é a concentração.

Conforme, a Lei de Lambert-Beer, a absorbância é proporcional à concentração da

espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura

atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre

absorbância ou densidade ótica e concentração, e uma relação logarítmica entre

transmitância e concentração.

A absorbância pode ser influenciada pela natureza do solvente, pH da solução,

temperatura, concentração de eletrólitos e presença de substâncias interferentes.

Segundo SKOOG et al. (2002), há algumas características importantes do método

espectrofotométrico:

1) Ampla aplicação a sistemas orgânicos e inorgânicos;

2) Seletividade moderada a alta;

3) Boa exatidão (incertezas relativas de 1 a 3% são encontrados, embora os erros

possam ser reduzidos a décimos de uma parte por cento tendo precauções);

4) Facilidade e conveniência de aquisição de dados.

Para saber a concentração do analito de interesse em uma solução, é necessário,

antes de tudo, fazer uma curva-padrão que relaciona a absorbância referente a cada

concentração do analito conhecida.

2.7.1. Métodos colorimétricos

Com alguma freqüência é necessário quantificar substâncias em misturas

complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda.

Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos. O composto a quantificar é

posto em contato com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja

intensidade é diretamente proporcional à concentração da substância na mistura original.



Para quantificar espectrofotometricamente uma substância, é necessário saber o

valor da constante de proporcionalidade ε. Para isto, é necessário preparar uma série de

soluções do composto a quantificar, de concentração conhecida, fazê-las entrar em contato

com o reagente e medir as absorbâncias no comprimento de onda adequado como mostrado

na Figura 2.17. A absorbância no comprimento de onda escolhido é diretamente

proporcional à concentração do composto na solução.

Figura 2.17: Calibração através de um método colorimétrico.

Na Figura 2.17, há uma relação linear perfeita entre a concentração da substância

(expressa em molaridade, M) e a absorbância ao comprimento de onda λ de medida. Então,

pode-se obter uma reta do tipo:

bcA +⋅= λλ ε (2.8)

onde: Aλ é a absorbância ao comprimento de onda λ de medida; c é concentração em M; λε

representa a constante de proporcionalidade e b o coeficiente linear da reta.

Sabendo esta relação, pode-se fazer corresponder uma absorbância medida a uma



concentração de substância na solução a analisar.

Muitas vezes o método só é linear até certa concentração da substância. Nesse

caso, utiliza-se a zona em que a relação é linear, diluindo a solução a medir, sempre que

necessário, de modo que a absorbância resultante esteja contida no intervalo da curva-

padrão.

2.8. Planejamento experimental

Freqüentemente, no processo de fabricação e na pesquisa e desenvolvimento de

indústrias química, alimentícia e farmacêutica, aparecem problemas em que se precisa

estudar várias propriedades ao mesmo tempo e estas, por sua vez, são afetadas por um

grande número de fatores experimentais. Para resolver tais problemas, podemos realizar um

planejamento experimental.

O planejamento experimental, de acordo com BARROS NETO et al.(2003), tem a

finalidade de ajudar na preparação e execução de experimentos e na análise dos resultados,

seja na escala laboratorial ou industrial. Esta metodologia permite obter um grande número

de informações com um número reduzido de experimentos, minimizando tempo e custo

operacionais, além de se obter uma análise mais racional dos resultados, baseada nas

probabilidades estatísticas.

Com o planejamento experimental, consegue-se descobrir como a resposta

depende dos fatores (variáveis envolvidas no sistema), ou ainda, como os fatores atuam

sobre o sistema, produzindo uma determinada resposta. Percebe se assim que o sistema

funciona como uma função desconhecida que liga os fatores (variáveis de entrada) às

respostas (variáveis de saída).

Em casos onde se queira estudar os efeitos dos fatores sobre uma ou mais

respostas, podemos utilizar um planejamento fatorial completo 2n, onde n é o número de

fatores estudados. Neste tipo de planejamento fatorial, são escolhidos dois níveis para cada

fator, de forma que sejam realizados experimentos em todas as combinações possíveis dos

níveis destes fatores. Logo, antes de qualquer coisa, em um planejamento fatorial é

necessário especificar os níveis em que cada fator deve ser estudado, isto é, os valores dos



fatores que serão utilizados para fazer os experimentos, e quais serão as respostas de

interesse.

O planejamento fatorial tem como objetivo otimizar o sistema de forma que ele

seja capaz de fornecer exatamente o tipo de informação que procuramos, maximizando ou

minimizando a resposta.

No momento em que o modelo aplicado não descreve satisfatoriamente a

superfície de resposta, é necessário ampliar o planejamento. A maneira mais comum é a

construção do planejamento composto central (também chamado de planejamento em

estrela), onde se calcula quais serão os novos valores ou pontos axiais determinados.

( ) 41

2n=α (2.9)

onde α é a distancia dos pontos axiais e n é o número de variáveis.

Para analisar a otimização de um processo, a técnica conveniente no auxílio é a

metodologia de superfície de resposta. A escolha da faixa de estudo é repetida quantas

vezes forem necessárias até atingir a região ótima de interesse da superfície investigada.

Para investigar a superfície de resposta com os valores definidos no processo, é

necessário acrescentar pontos centrais na matriz de planejamento fatorial. Eles são de

extrema importância por permitirem uma análise da reprodutibilidade do processo e

também por mostrar o que ocorre dentro da faixa estudada. Sendo assim, os cálculos para

definir a superfície de resposta são obtidos através do erro puro ao invés da soma

quadrática residual, por incluir o ponto central.



CAPÍTULO 3

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1. Materiais

3.1.1. Reagentes

Para a realização dos experimentos foi utilizada água destilada. Os demais

reagentes são apresentados na Tabela 3.1 sendo utilizados sem nenhuma purificação

adicional.

Tabela 3.1: Algumas características dos reagentes utilizados nos experimentos.

Reagentes Fórmula Molecular

Fabricante Massa Molecular (g.mol-1)

Pureza (% em massa)

Ácido cítrico monohidratado

C6H8O7.H2O Dinâmica 210,14 99,5

Ácido clorídrico

HCl Merck 36,50 37

Ácido dinitro-3,5-salicílico

C7H4N2O7 Vetec 228,12 99

Ácido Sulfúrico

H2SO4 Synth 98,08 95-98%

D-(+)-glicose

C6H12O6 Merck 180,16 ≥ 99

Fenol

C5H6OH Vetec 94,11 99



Reagentes Fórmula Molecular

Fabricante Massa Molecular (g.mol-1)

Pureza (% em massa)

Filtro de papel n° 1

- Whatman - -

Hidróxido de sódio

NaOH Merck 39,98 ≥ 96

Kit Glicose GOD-PAP

- Laborlab - -

Meta-bissulfito de sódio

Na2S2O5 Ecibra 190,10 97

Peróxido de hidrogênio

H2O2 Merck 33,98 30

Tartarato de sódio e potássio tetrahidratado

KNaC4H4O6.4H2O Synth 282,22 99

β-D-(+)-cellobiose

C12H22O11

Sigma-Aldrich

342,33 ≥ 99

3.1.2. Equipamentos

Os equipamentos utilizados para a determinação experimental foram:

• Agitador eletromagnético da marca Produtest e peneiras circulares padronizadas da

série de Taylor das marcas granuteste e bertel;

• Balança analítica da marca Bel Engineering com precisão de ± 0,001 g;

• Balança da marca Marte com precisão de ± 0,01 g;

• Banho termostatizado modelo MA-184 da marca Marconi com precisão de ± 0,01 °C;

• Centrífuga microprocessada NT 810 da marca Nova técnica;

• Espectrofotômetro 600 S da linha Fento com precisão na terceira casa decimal;

• Espectrofotômetro UV Mini-1240 Shimadzu com precisão na quarta casa decimal;

• Estufa de secagem especial modelo MA-035/2 da marca Marconi;



• Estufa para secagem de plantas da marca Blue M. Electric Company;

• Incubadora refrigerada com agitação, modelo MA-832 da marca Marconi com

precisão de ± 0,1°C;

• Medidor de pH industrial MPI 2000 da marca MS Tecnopon, com precisão de 0,01.

3.1.3. Matéria prima

Todo o bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) utilizado nos

experimentos foi proveniente de uma mesma safra e fornecido pela Usina São Luiz –

Dedini S/A agroindústria da fazenda São Luiz – Setor A, da zona rural da cidade de

Pirassununga, Estado de São Paulo.

3.1.3.1. Preparação do bagaço de cana-de-açúcar

Antes da armazenagem, o bagaço foi seco em estufa a 45°C por 48 h e deixado à

temperatura ambiente por mais 24 h, sendo posteriormente armazenado no freezer em

bolsas hermeticamente fechadas.

Durante o processo de secagem, alíquotas do material foram coletadas e secas em

uma outra estufa a 105°C por 24 h para determinar o teor de unidade do material. As

amostras foram coletadas e analisadas em três momentos: bagaço antes de qualquer

processo de secagem e após 24 e 48 h de secagem. As análises foram realizadas em

triplicata.

Para o cálculo do teor de umidade na amostra utilizou-se a Equação 3.1.

100úmido bagaço do massa

a.s. bagaço do massa -úmido bagaço do massa% xU = (3.1)

onde U representa o teor de umidade do material e a.s. representa a massa absolutamente

seca do material.



3.1.3.2. Separação da amostra

Após o processo de secagem e armazenagem da amostra no freezer, o material foi

dividido em duas partes. Uma parte foi armazenada sem peneirar, sendo denominada de

bagaço não peneirado. A outra parte do material foi peneirada e analisada

granulometricamente. Este segundo material foi chamado de bagaço peneirado.

Além da amostra não peneirada, a amostra peneirada também foi utilizada como

substrato nos experimentos com o objetivo de analisar a influência do tamanho da partícula

nos resultados da hidrólise.

Para obter a fração peneirada foi realizada uma separação granulométrica do

bagaço passando o material por uma série de peneiras com malhas de diferentes aberturas.

Foram utilizadas peneiras de 12, 16, 24, 32, 42, 60 e 80 mesh. Inicialmente uma quantidade

do bagaço de cana previamente pesada foi colocada na parte superior da série de peneiras

que foram presas em um peneirador vibratório durante 60 minutos. Após este tempo, as

peneiras foram pesadas para determinar a massa retida em cada uma delas.

Segundo MACHADO (2000), as fibras do bagaço de cana representam o material

retido em peneiras com poros de 0,991 mm de abertura (16 mesh) e a medula, o material

retido na peneira com poros de 0,248 mm de abertura (60 mesh).

Para conseguir um material peneirado constituído de parte fibrosa e medular, foi

utilizada, para os experimentos com o bagaço peneirado, uma mistura do material das

peneiras de -12+60 mesh, representando assim um substrato de diâmetro médio igual a

0,823 mm. Este processo foi repetido inúmeras vezes até que uma quantidade de substrato

mínima para a realização dos experimentos fosse obtida (aproximadamente 200 g).

3.1.3.3. Caracterização química do material

Após divisão do bagaço em duas partes, estes foram analisados quanto ao teor de

extrativos, cinzas, lignina total, glucana, xilana e grupos acetila. Estas análises foram

realizadas pelo “Laboratório de Química de Materiais Lignocelulósicos” da Escola de

Engenharia de Lorena – EEL/USP.



O bagaço foi passado por peneiras de 0,75 mm e extraídos por 6 h em Soxhlet com

etanol 95%. O teor de cinzas foi determinado após a queima das amostras em uma mufla a

600°C por 4 h.

O teor de glucana, xilana, grupos acetila e lignina total foram determinados a partir

da hidrólise do material com H2SO4 72% (FERRAZ et al., 2000b). Cerca de 300 mg de

amostra seca ao ar foram tratados com 3 mL de H2SO4 72% (w/w) por uma hora a 30°C.

Em seguida o conteúdo do tubo de ensaio foi transferido quantitativamente para um

erlenmeyer de 250 mL com o auxílio de 79 mL de água. A mistura foi autoclavada a 121°C

por 30 minutos, resfriada e filtrada em filtros de vidro sinterizado de porosidade número 3,

previamente secos a 105°C e pesados. O material retido foi lavado com 2 porções de 5 mL

de água e seco até massa constante. Esse resíduo corresponde à lignina insolúvel em ácido

(Klason). O filtrado foi avolumado a 100 mL e analisado quanto aos teores de açúcares em

um sistema cromatográfico. A análise cromatográfica foi realizada através de cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando uma coluna BIORAD HPX-87H e H2SO4

5 mM a 0,6 mL/min como eluente e um detector de índice de refração (Shimadzu). A

concentração de açúcares foi determinada através de curvas de calibração preparadas com

padrões de grau analítico secos sob sílica e vácuo.

O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado através da leitura em 205 nm

de uma diluição (usualmente 2:10) do hidrolisado, tomando-se como padrão uma

absortividade de 105 L/g.cm neste comprimento de onda (FERRAZ et al., 2000b).

3.1.4. Enzima

Foram utilizadas as enzimas celulase de Trichoderma reesei (Sigma-Aldrich) e β-

glicosidase de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich). As atividades enzimáticas das enzimas e

o efeito do pH e da temperatura na atividade foram experimentalmente determinados.

3.2. Procedimento experimental

3.2.1. Determinação do comprimento de onda de máxima absorção da glicose

Para a quantificação dos açúcares redutores totais (ART), utilizando o método do



ácido dinitro-3,5-salicílico (DNS), e quantificação da glicose, utilizando o método

enzimático Glicose GOD-PAP, foi necessário determinar o comprimento de onda de

máxima absorção da glicose. Embora se encontre na literatura, citado por GHOSE (1987),

WOOD e BHAT (1988), ADNEY e BAKER (1996), que a glicose apresenta absorbância

máxima a 540 nm, foi necessário fazer uma varredura de uma solução padrão de glicose,

utilizando os dois métodos de quantificação dos açúcares, visto que alguns autores realizam

as leituras em outros comprimentos de onda utilizando os mesmos métodos de

quantificação.

FERRER et al (2002) determinaram a concentração dos ART do hidrolisado

utilizando o método DNS com leituras de absorbância a 584 nm. O fabricante do kit

enzimático Glicose GOD-PAP especifica que a quantificação da glicose pelo método

apresenta uma faixa de leitura de absorbância entre 500 e 550 nm. Com tudo isso,

considerou-se necessário determinar o comprimento de onda de máxima absorção da

glicose.

Para isso, preparou-se uma solução padrão de glicose e aplicou os métodos DNS e

Glicose GOD-PAP, sendo em seguida efetuada uma varredura da amostra entre 780 e

190 nm no espectrofotômetro. Após determinar o comprimento de onda máximo em cada

um dos métodos, todas as demais leituras de ART e glicose das amostras foram realizadas

no mesmo comprimento de onda em que a amostra padrão apresentou máxima absorção.

3.2.2. Determinação da concentração dos açúcares redutores totais (ART)

As concentrações de ART foram determinadas de acordo com o método do ácido

dinitro-3,5-salicílico (DNS) descrito por MILLER (1959).

Açúcares redutores são aqueles que possuem grupos carbonílico e cetônico livres,

capazes de se oxidarem na presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas (SILVA et

al., 2003).

O método DNS baseia-se na redução do ácido dinitro-3,5-salicílico a ácido 3-

amino-5-nitrossalicílico ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a



grupo carboxílico, com o desenvolvimento da coloração avermelhada sendo lida

espectrofotometricamente.

A Figura 3.1 mostra a reações ocorridas para a quantificação dos ART.

NO2

COOH

OH

NO2

CHO

AROH

-

NO2

COOH

NH2

OHCOOH

Figura 3.1: Reação para quantificação de açúcares redutores totais por DNS.

Entretanto, a equivalência entre o ácido 3-amino-5-nitrossalicílico produzido e a

quantidade do açúcar não é exata e diferentes açúcares produzem diferente intensidade na

cor desenvolvida. Isso sugere que a química da reação deva ser mais complexa que a

apresentada, podendo estar relacionada com as reações de decomposição de açúcares em

solução alcalina (MILLER, 1959).

3.2.2.1. Preparação da solução de DNS

Os ART foram determinados pelo método DNS. O reagente DNS originalmente

era constituído de uma solução contendo 1,06 g de ácido dinitro-3,5-salicílico, 1,98 g de

hidróxido de sódio, 30,6 g de tartarato de sódio e potássio, 0,76 mL de fenol (fundido),

0,83 g de bissulfito de sódio, diluídos em água até volume de 140 mL. Porém, verificou-se

que deste modo o reagente sofria degradação se estocado por algum período, mesmo

armazenado em frasco âmbar.

Assim, o reagente DNS passou a ser preparado segundo BAZÁN (1993).

Dissolveu-se 10,6 g de ácido dinitro-3,5-salicílico em 1416 mL de água. Adicionou-se a

esta mistura 7,6 mL de fenol fundido a 50°C e 8,3 g de meta-bissulfito de sódio. O reagente

foi guardado em um frasco âmbar para proteger da luz. Paralelamente, foi preparada uma

Ácido dinitro-3,5-salicílico

AR = açúcar redutor genérico

Ácido 3-amino-5-nitrossalicílico

Ácido aldônico



solução de 15,1 g/L de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado que foi guardada em

outro frasco âmbar, sendo esta solução utilizada como estabilizante da cor formada.

3.2.2.2. Quantificação dos ART

Para a quantificação dos ART, adicionou-se 0,5 mL das amostras a serem

quantificadas em cada tubo de ensaio e 0,5 mL de DNS. Os tubos foram mantidos em um

banho a 95°C por 5 minutos para desenvolvimento da coloração avermelhada. Após este

tempo reacional, as amostras foram resfriadas imediatamente pela imersão dos tubos em

um banho de gelo fundente, adicionando em seguida 3,5 mL da solução estabilizante de

tartarato de sódio e potássio tetrahidratado. Os tubos foram agitados para homogeneizar a

solução e as leituras da absorbância, efetuadas no espectrofotômetro. Para zerar o

espectrofotômetro, preparou-se um tubo onde o volume da amostra foi substituído por água

destilada, sendo chamado de tubo branco da reação.

Para determinar a concentração dos ART em cada uma das amostras analisadas,

foi necessário construir uma curva-padrão de glicose. Sempre que necessário, foram

efetuadas diluições das amostras de modo que a absorbância resultante estivesse contida no

intervalo da curva-padrão.

3.2.2.2.1. Construção da curva-padrão de glicose

Para construção de uma curva-padrão, amostras com concentrações conhecidas de

glicose foram preparadas e após aplicação do método DNS, lidas espectrofotometricamente

no comprimento de onda de máxima absorção.

Preparou-se, a partir de uma solução estoque de glicose 1,0 mg/mL, soluções de

glicose de 0 a 1,0 mg/mL, com espaçamento de 0,1 mg/mL, que após reações com DNS,

foram lidas no espectrofotômetro.

Com os dados obtidos foi possível traçar um gráfico linear da concentração de

glicose (açúcar redutor) em função da absorbância, e assim, determinar uma equação que

relaciona as duas grandezas. Ao preparar um novo reagente DNS, uma nova curva-padrão

era construída.



3.2.3. Determinação da concentração de glicose

A concentração de glicose foi determinada de acordo com o método enzimático

Glicose GOD-PAP, descrito por HENRY (1974). Trata-se de um kit enzimático contendo

um reativo mono-reagente pronto para uso, além de uma solução padrão de glicose com a

concentração de 100 mg/dL.

O método baseia-se na oxidação enzimática da glicose através da enzima glicose

oxidase (GOD) resultando em peróxido de hidrogênio, o qual é subseqüentemente usado na

geração da coloração rosada pela peroxidase (PAP).

A reação 3.2 mostra as reações enzimáticas ocorridas para a quantificação da

glicose.

22oxidase Glicose

22 OH glucônico ácidoOH O Glicose + →++

rosada) coloração( OH 4 enol OH 2 2Peroxidase

22 →+ f (3.2)

3.2.3.1. Quantificação da glicose

Para a quantificação da glicose, adicionou-se 10 µL de cada uma das amostra em

tubos de ensaio previamente identificados e 1,0 mL do mono-reagente. Os tubos foram

mantidos em um banho termostático a 37°C por 10 minutos para que houvesse o

desenvolvimento da coloração rosada. Ao término da reação, os tubos foram retirados e

adicionados a cada um deles, 3,0 mL de água destilada. Os tubos foram invertidos para

homogeneizar a solução e assim, efetuada a leitura da absorbância no espectrofotômetro.

Os tubos do branco da reação e do padrão de glicose foram feitos juntamente com

os tubos das amostras. Para o tubo branco adicionou-se 1,0 mL do reagente enzimático e

para o tubo padrão adicionou-se ao tubo 10 µL da solução padrão de glicose (100 mg/dL) e

1,0 mL do mono-reagente enzimático.

Quando necessário, diluições das amostras foram efetuadas para possibilitar a

leitura, já que a reação, segundo o fabricante, é linear até 500 mg/dL. Outra observação

relevante do fabricante é que, quando a leitura do branco apresenta absorbância acima de



0,250, o mono-reagente deve ser descartado, já que isso indica uma deterioração do reativo

de trabalho. A cor final da reação é estável por 60 minutos.

Para determinar a concentração de glicose utilizou-se a solução padrão como

calibrador e os cálculos foram realizados através da Equação 3.3.

100PadrãoA

AmostraA Glicose ×

∆

∆=dLmg (3.3)

3.2.4. Determinação da atividade das enzimas

Para determinação da atividade das enzimas foram preparadas soluções com várias

concentrações das enzimas em tampão citrato 0,05 mol/L pH 4,8.

3.2.4.1. Preparo do tampão citrato

Para o preparo do tampão citrato 0,05 mol/L pH 4,8, 10,5 g de ácido cítrico

monohidratado foram dissolvidos em 37,5 mL de água destilada. Em seguida, adicionou-se

hidróxido de sódio até que a solução atingisse o pH de 4,3 (aproximadamente 2,5 g). O

volume da solução foi completado para 50 mL e em seguida, mediu-se o pH. Quando

necessário, mais hidróxido de sódio foi adicionado à solução para que o pH atingisse 4,5 e

assim, obtivéssemos uma solução tampão de citrato pH 4,5 a 1 mol/L. Para obter a

concentração de 0,05 mol/L, a solução de 50 mL foi transferida para um balão volumétrico

de 1 L, que teve seu volume aferido com água destilada. Neste momento o pH subiu

para 4,8.

3.2.4.2. Determinação da atividade da celulase

Para a enzima celulase, a atividade foi determinada como atividade de filtro de

papel (FPA) e expressa em unidades de filtro de papel (FPU – Filter Paper Units) por

volume de enzima original, como recomendado pela IUPAC (GHOSE, 1987; WOOD e

BHAT, 1988; ADNEY e BAKER, 1996).



Durante as reações, parte da concentração da glicose pode vir da própria enzima

e/ou do substrato, uma vez que o complexo enzimático pode conter açúcares nutrientes,

assim como as extremidades da celulose podem, às vezes, ser quantificadas como glicose

antes de todo o ataque da enzima. Por esta razão, os tubos controle, que consistem (a) na

enzima sem substrato e (b) no substrato sem enzima, são incluídos durante as análises das

amostras e têm seus valores de absorbância subtraídos dos valores das absorbâncias lidas

em cada um dos tubos reacionais.

Assim, a quantificação da glicose através do método DNS envolve três categorias

de reações: tubos das amostras a serem quantificadas; tubos do branco reacional, para zerar

o espectrofotômetro; e os tubos controle da enzima e substrato.

Para a determinação da atividade enzimática, partiu-se de uma solução de celulase

de diluição de 1:20. De posse dessa solução, efetuou-se 5 novas diluições em tampão citrato

0,05 mol/L pH 4,8.

Em cada tubo de ensaio adicionou-se 1,0 mL de tampão citrato e em seguida,

50 mg de filtro de papel enrolado, tomando o devido cuidado para que este ficasse saturado

pelo tampão. Os tubos foram colocados em um banho termostático a 50°C para que a

temperatura se equilibrasse. Após 10 minutos, adicionou-se 0,5 mL de cada uma das

enzimas previamente diluídas em tampão citrato e os tubos foram encubados por

exatamente 60 minutos.

Ao final deste período, os tubos foram removidos e a reação enzimática parada

imediatamente com a adição de 1,5 mL do reagente DNS. Os tubos foram fervidos por

5 minutos a 95°C e posteriormente transferidos para um banho de gelo fundente. Ao final,

adicionou-se 10,5 mL da solução estabilizante e os tubos foram invertidos para a

homogeneização da solução. Quando a polpa de papel restante da reação de hidrólise foi

assentada, a cor formada foi medida no espectrofotômetro.

Para o preparo do tubo do branco reacional, adicionou-se 1,5 mL do tampão citrato

e após os 60 minutos de reação aplicou-se o método DNS como descrito anteriormente.

Para o preparo dos tubos controle da enzima, adicionou-se 1,0 mL do tampão citrato e

0,5 mL de cada uma das diluições da enzima, totalizando 5 tubos controle, que ao final do

tempo reacional, tiveram suas reações paradas com a adição do DNS, e então reagidos



como descrito anteriormente. O tubo controle do substrato foi preparado adicionando

1,5 mL do tampão citrato e 50 mg de filtro de papel enrolado, que ao final de 60 minutos,

também foi analisado pelo método DNS.

De posse das leituras das absorbâncias, traçou-se uma reta onde se relaciona o

logaritmo da concentração da enzima em cada uma das diluições em função da massa de

glicose liberada por 0,5 mL dessa enzima diluída, determinando assim a atividade

enzimática da celulase.

Para a celulase, uma unidade da atividade de enzima (FPU) é baseada na liberação

de exatamente 2,0 mg de glicose equivalente, isto é, 2,0/0,18016 µmol de 50 mg de filtro de

papel por 0,5 mL de enzima diluída em 60 minutos de reação. A Equação 3.4 mostra o

cálculo da atividade.

[ ]diluída enzima37,0

FPU/mL

mLminµmol) ]diluída enzima[ 60 0,5(0,18016

2,0FPU/mL 1-1-

=

⋅⋅×××

=

(3.4)

3.2.4.3. Determinação da atividade da β-glicosidase

Para a β-glicosidase, a medida da atividade foi determinada através de uma

solução de celobiose 15 mmol/L e expressa em unidades de celobiose (CBU) por volume

de enzima original, como recomendado pela IUPAC (WOOD e BHAT, 1988).

Para a determinação da atividade enzimática, partiu-se de uma solução da enzima

β-glicosidase de diluição 1:1000. De posse dessa solução, foram feitas 4 novas diluições em

tampão citrato 0,05 mol/L pH 4,8.

Para cada tubo de ensaio, adicionou-se 1,0 mL de cada uma das diluições da

enzima e estes foram colocados em um banho termostático a 50°C para que a temperatura

se equilibrasse. Após 10 minutos, foi adicionado em cada tubo, 1,0 mL da solução de

celobiose 15 mmol/L e os tubos foram encubados por 30 minutos. Ao término da reação, os



tubos foram imersos em um banho de água fervente por exatamente 5 minutos e

posteriormente transferidos para um banho de gelo.

Para a determinação da concentração de glicose liberada por cada solução de

enzima diluída, utilizou-se o método de quantificação Glicose GOD-PAP como descrito na

seção 3.2.3.1. Ao final da reação de quantificação, adicionou-se 0,2 mL de uma solução de

ácido sulfúrico 72% em cada tubo de ensaio para garantir que a reação tenha sido

terminada.

Foram preparados 4 tubos controle da enzima, onde se adicionou 1,0 mL de cada

uma das diluições da enzima e 1,0 mL do tampão citrato. Ao final do tempo reacional,

aplicou-se o método enzimático Glicose GOD-PAP. Ao tubo controle do substrato

adicionou 1,0 mL do substrato celobiose e 1,0 mL do tampão citrato que ao final de

30 minutos de reação também foi analisado pelo método enzimático Glicose GOD-PAP.

De posse das leituras das absorbâncias, traçou-se a reta onde se relaciona a

concentração da enzima em cada uma das diluições em função da massa de glicose liberada

por 1,0 mL dessa enzima diluída, determinando assim a atividade enzimática da β-

glicosidase.

Uma unidade da atividade de β-glicosidase (CBU) baseia-se na liberação de

exatamente 1,0 mg de glicose, isto é, 0,5/0,18016 µmol de celobiose convertida por 1,0 mL

de enzima diluída em 30 minutos de reação. A Equação 3.5 mostra o cálculo da atividade.

[ ]diluída enzima0926,0

CBU/mL

mLminµmol])diluída enzima[300,11816,0(

5,0CBU/mL 1-1-

=

⋅⋅×××

=

(3.5)

3.2.5. Efeito do pH na atividade enzimática

Para analisar o efeito do pH na atividade enzimática, foram preparadas soluções de

tampão citrato 0,05 mol/L em diferentes valores de pH: 1,58; 3,12; 4,10; 4,80; 5,21; 5,75;

6,14 e 6,99. A análise foi realizada com uma solução da enzima celulase de concentração



0,03 (v/v).

As reações foram realizadas com três categorias de tubo: tubos reacionais

contendo as soluções tampão em diferentes valores de pH, tubo do branco para zerar o

espectrofotômetro e os tubos controle da enzima e do substrato.

Para cada tubo reacional, adicionou-se 1,0 mL de tampão citrato 0,05 mol/L com

os diferentes valores de pH. Em seguida, adicionou-se 50 mg de filtro de papel enrolado,

tomando o devido cuidado para que este ficasse saturado pelo tampão. Os tubos foram

colocados em um banho termostático a 50°C para que a temperatura se equilibrasse. Após

10 minutos, adicionou-se 0,5 mL da enzima previamente diluída no tampão citrato e os

tubos foram misturados e encubados por exatamente 60 minutos.


imediatamente com a adição de 1,5 mL do reagente DNS. Os tubos foram fervidos por 5

minutos a 95°C e posteriormente transferidos para um banho de gelo fundente. Ao final,

adicionou-se 10,5 mL de estabilizante e os tubos foram invertidos para a homogeneização

da solução. Quando a polpa restante do papel foi assentada, as amostras foram

espectrofotometricamente lidas.

Para os tubos do branco, adicionou-se 1,5 mL de cada um das soluções tampão

citrato e após os 60 minutos de reação aplicou-se o método DNS como descrito

anteriormente. Para os tubos controle da enzima, foi adicionado em cada tubo, 1,0 mL do

tampão citrato com diferentes valores de pH e 0,5 mL da enzima diluída, onde ao final do

tempo reacional, aplicou-se o método DNS. Os tubos controle do substrato foram reagidos

com 1,5 mL do tampão citrato em diferentes pH e 50 mg de filtro de papel enrolado, que ao

final de 60 minutos também foi analisado pelo método DNS.

De posse das leituras das absorbâncias, foi traçada uma reta onde se relacionou a

atividade relativa da enzima referente à massa de glicose liberada em função dos valores de

pH da solução tampão, determinando assim, o efeito do pH na atividade enzimática.

3.2.6. Efeito da temperatura na atividade enzimática

Para analisar o efeito da temperatura na atividade enzimática, foram



providenciados banhos termostáticos e estes mantidos nas temperaturas de 9, 22, 33, 44, 50,

62 e 75°C, sendo as demais condições reacionais mantidas constantes. A análise foi

realizada com a enzima celulase a uma concentração de 0,03 (v/v).

Foram realizadas leituras com as amostras em diferentes temperaturas além dos

tubos do branco reacional e tubos controle da enzima e substrato.

Para cada tubo da amostra, foi adicionado 1,0 mL de tampão citrato 0,05 mol/L

pH 4,8 e 50 mg de filtro de papel enrolado. Os tubos foram colocados nos banhos

termostáticos em temperaturas pré-determinadas. Após 10 minutos, adicionou-se 0,5 mL da

enzima previamente diluída no tampão citrato e os tubos foram misturados e encubados por

exatamente 60 minutos.


imediatamente com a adição de 1,5 mL do reagente DNS sendo os tubos fervidos por

5 minutos a 95°C e posteriormente transferidos para um banho de gelo fundente. Ao final,

adicionou-se 10,5 mL de estabilizante e os tubos foram invertidos para a homogeneização

da solução. Quando a polpa restante assentou-se, a cor formada foi medida no

espectrofotômetro.

Para os tubos do branco reacional, adicionou-se 1,5 mL de tampão citrato sendo

cada tubo encubado nas temperaturas pré-determinadas, que após 60 minutos de reação

teve a glicose liberada quantificada pelo método DNS. Para os tubos controle da enzima,

adicionou-se a cada tubo 1,0 mL do tampão citrato e 0,5 mL da enzima diluída sendo

encubados nas diferentes temperaturas. Ao final do tempo reacional aplicou-se o método

DNS. Os tubos controle do substrato foram reagidos com 1,5 mL do tampão citrato e 50 mg

de filtro de papel enrolado, sendo encubados nas diferentes temperaturas, que ao final de

60 minutos de reação, também foi analisado pelo método DNS.

De posse das leituras das absorbâncias, foi traçada uma reta onde se relaciona a

atividade relativa da enzima referente à massa de glicose liberada em função das

temperaturas reacionais, determinando assim, o efeito da temperatura na atividade

enzimática.



3.2.7. Planejamento experimental do pré-tratamento

Para que a lignina e parte da hemicelulose fossem removidas do bagaço facilitando

o processo de hidrólise enzimática para a obtenção dos ART e da glicose, foram realizados

planejamentos experimentais para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino,

visando à otimização do mesmo, ou seja, ponto onde a concentração de glicose liberada é

máxima. Para isso, foram verificadas como algumas variáveis do processo influenciam

nesta etapa.

No planejamento fatorial experimental do H2O2 alcalino, 3 variáveis do processo

foram analisadas: tempo de contato (h), temperatura (°C) e concentração de H2O2 % (v/v).

O pH da solução com a concentração pré-determinada no planejamento foi ajustado para

11,5 com hidróxido de sódio.

3.2.7.1. Reações do pré-tratamento

Amostras de aproximadamente 4,0 g de bagaço seco não peneirado (N) e

peneirado (P) foram tratadas com 100 mL da solução contendo H2O2 alcalino a uma

concentração pré-determinada pelo planejamento e imediatamente levadas para uma

incubadora onde eram mantidos a uma rotação de 150 rpm com temperatura e tempo

reacional pré-determinados também pelo planejamento experimental.

Ao término de cada uma das reações o líquido reacional foi descartado e os

resíduos restantes lavados com água destilada e centrifugados até que toda a coloração

desaparecesse (aproximadamente 12 lavagens). As amostras foram então levadas para a

estufa, secas a uma temperatura de 110°C, pesadas em uma balança analítica e armazenadas

na geladeira em potes plásticos identificados, estando assim, prontas para etapa de hidrólise

enzimática.

Segundo GOULD (1985), a secagem da biomassa a 110°C, após o pré-tratamento

com H2O2 alcalino, não influencia muito no processo de absorção de água pela biomassa

durante a etapa de hidrólise, se comparada com uma biomassa seca à temperatura ambiente.

Ou seja, a alta temperatura não modifica as estruturas do resíduo pré-tratado, o que poderia



ocasionar em uma dificuldade de absorção de água pelo mesmo. Logo, a secagem da

biomassa foi efetuada a 110°C sem ocorrência de qualquer problema na etapa hidrólise.

3.2.7.2. Hidrólise do bagaço pré-tratado

Para verificar como cada parâmetro estudado interfere na etapa de pré-tratamento,

hidrólises foram realizadas para cada uma das amostras nas condições ótimas de

temperatura e pH da enzima, para que assim, houvesse a quantificação dos ART e da

glicose.

Após a secagem do resíduo resultante do pré-tratamento do bagaço não peneirado

e peneirado em cada uma das condições de estudo, aproximadamente 1,0 g (massa seca) de

cada ensaio foi pesado em erlenmeyers e 300 mL de água destilada foram adicionados ao

resíduo. O pH das amostras foi ajustado para o valor de pH ótimo da enzima. Este ajuste de

pH ocorreu durante vários dias até que o valor permanecesse praticamente inalterado. Os

erlenmeyers foram então fechados para que não houvesse uma alteração considerável do

volumes reacionais e encubados em um shaker com rotação mantida a 100 rpm durante

toda a hidrólise. A temperatura utilizada durante a hidrólise corresponde ao valor

encontrado para a temperatura ótima da enzima, onde sua atividade é máxima.

Para investigar as condições de pré-tratamento e verificar quais variáveis do

processo influenciam esta etapa, amostras do líquido reacional da hidrólise enzimática

(aproximadamente 2 mL) foram coletas em períodos de tempo pré-determinado, isto é, 0, 1,

3, 6, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h e então, fervidas por 15 minutos, em tubos identificados, para

inativação das enzimas.

Para a avaliação de cada pré-tratamento, utilizou-se concentrações de celulase e β-

glicosidase de 3,47 FPU/g de biomassa seca e 1,01 CBU/g de biomassa seca,

respectivamente.

Ao final das 72 h de hidrólise e após coleta do líquido reacional neste tempo, os

resíduos restantes foram lavados com água destilada e centrifugados até que todo o açúcar

fosse retirado do resíduo (aproximadamente 6 lavagens). As amostras foram levadas para a



estufa, secas a uma temperatura de 110°C, pesadas em uma balança analítica e armazenadas

na geladeira em potes plásticos previamente identificados.

3.2.7.3. Quantificação dos ART e glicose

Os ART foram quantificados através do método DNS, já as glicoses, quantificadas

através do método enzimático Glicose GOD-PAP. Os procedimentos para quantificação

dos açúcares foram descritos nas seções 3.2.2.2 e 3.2.3.1, respectivamente.

Após a quantificação dos açúcares, traçou-se o perfil da hidrólise em cada ensaio

onde a massas de ART e glicose liberadas no meio reacional foram plotadas em função do

tempo de hidrólise.

3.2.7.4. Análise dos resultados através do Statistica

Após a análise dos perfis de hidrólise para cada ensaio, foram determinados os

pontos de estabilização para cada reação, ou seja, pontos onde as massas dos ART e glicose

liberadas no meio reacional permaneceram praticamente inalterada em relação ao tempo.

As massas de ART e glicose foram então utilizadas para análise, juntamente com

os dados do planejamento experimental fatorial do pré-tratamento, utilizando o programa

computacional Statistica (Statsoft, v. 7.0).



CAPÍTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1. Cálculo do teor de umidade do bagaço de cana-de-açúcar

Antes de iniciar os experimentos, o bagaço foi seco e analisado em relação ao teor

de umidade. O teor de umidade da amostra sem nenhum processo de secagem é mostrado

na Tabela 4.1.

Tabela 4.1: Porcentagem de umidade no bagaço de cana-de-açúcar antes do processo de

secagem.

Massa de bagaço

úmido (g)

Massa de bagaço

a.s. (g) %a.s. % umidade

6,6196 2,6258 39,67 60,33

5,6710 2,2419 39,53 60,47

6,0063 2,4140 40,19 59,81

Média 39,80 60,20

Pode-se notar que o bagaço de cana-de-açúcar apresentava um teor de umidade

inicial de 60,20%. Vale ressaltar que o teor médio de umidade do bagaço de cana-de-açúcar

é de 50%.

Após 24 h de secagem do bagaço de cana a 45°C, novas amostras foram analisadas

realizando um novo cálculo da porcentagem de unidade como pode ser visto na Tabela 4.2.




Massa de bagaço

úmido (g)

Massa de bagaço


4,9817 4,6624 93,59 6,41

5,2443 4,8621 92,71 7,29

4,6123 4,2772 92,73 7,27

Média 93,01 6,99

Nota-se que após 24 h de secagem do bagaço, o teor de umidade passou de

60,20% (amostra antes da secagem) para 6,99%, havendo uma redução do teor de umidade

de 88,39%.

Todo o bagaço continuou o processo de secagem por mais 24 h, totalizando as

48 h e, tendo assim, as amostras analisadas para determinar a porcentagem de unidade

como mostra a Tabela 4.3.


Massa de Bagaço

úmido (g)

Massa de Bagaço


6,23760 5,9294 95,06 4,49

5,96766 5,6722 95,05 4,95

6,50210 6,1955 95,28 4,72

Média 95,13 4,87

Após 48 h de secagem, o teor de umidade encontrado foi de 4,87%. Se

compararmos com o teor de unidade encontrado após 24 h (6,99%) houve uma redução do

teor de umidade de 30,33%.

Após as 48 h de secagem, o bagaço permaneceu 24 h a temperatura ambiente não

havendo mudanças significativas no seu teor de umidade (5,01%). O principal objetivo para

a secagem do material é minimizar a proliferação de microrganismos que possam

degradar/fermentar o material.



4.2. Análise granulométrica

Após o processo de secagem e armazenagem do bagaço no freezer, parte do

material foi submetida a uma separação granulométrica, passando assim a ser denominado

de bagaço peneirado.

O bagaço foi adicionado a uma série de peneiras de 12, 16, 24, 32, 42, 60 e

80 mesh e teve suas frações mássica retida e acumulada, calculadas. As análises foram

realizadas em triplicata e o valor médio desses resultados mostrados na Tabela 4.4.

Tabela 4.4: Fração mássica retida e acumulada após análises em triplicata.

Peneiras dp (mm)*

Diâmetro

médio da

partícula (mm)

Média da massa

de bagaço retida

(g)

Fração

mássica

retida (%)

Fração

mássica

acumulada (%)

+12 >1,397 1,689 75,23 85,59 100,0

-12+16 0,9910 1,194 2,770 3,130 14,41

-16+24 0,7010 0,8460 2,500 2,820 11,28

-24+32 0,4950 0,5980 1,530 1,720 8,460

-32+42 0,3510 0,4230 1,600 1,770 6,740

-42+60 0,2480 0,3000 1,570 1,750 4,970

-60+80 0,1750 0,2120 1,300 1,380 3,210

-80 <0,1750 0,1500 1,730 1,830 1,830

*Valores retirados do Apêndice C-8, PERRY et al. (1997).

De posse destes valores, plotou-se o gráfico da porcentagem da fração mássica

retida em função do diâmetro médio da partícula como mostra a Figura 4.1.

Podemos observar que a maior parte do bagaço de cana utilizado em nossos

experimentos como bagaço não peneirado, cerca de 85,59 %, apresenta um diâmetro médio

superior a 1,689 mm.



0

20

40

60

80

100

1,689 1,194 0,846 0,598 0,423 0,300 0,212 0,150

dp médio (mm)

Fra

çã

o M

ás

sic

a R

eti

da

(%

)

Figura 4.1: Porcentagem da fração mássica retida em função do diâmetro médio da

partícula.

A Figura 4.2 mostra a porcentagem da fração mássica acumulada em função do

diâmetro médio da partícula.

0

20

40

60

80

100

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

dp médio (mm)

Fra

çã

o M

ás

sic

a A

cu

mu

lad

a (

%)

Figura 4.2: Porcentagem da fração mássica acumulada em função do diâmetro médio da

partícula.



A Figura 4.3 mostra a aparência do bagaço não peneirado e peneirado utilizado

nos experimentos.

Figura 4.3: Bagaço não peneirado e peneirado.

4.3. Análise da composição química do bagaço

Os resultados da análise da composição química do bagaço não peneirado e

peneirado estão dispostos na Tabela 4.5.

Tabela 4.5: Composição química do bagaço não peneirado e peneirado

Composição Bagaço

não peneirado (%)

Bagaço

peneirado (%)

Extrativos 0,6 ± 0,3 2,3 ± 0,1

Cinza 3,8 ± 0,1 5,3 ± 0,1

Lignina total 25,8 ± 0,2 29,3 ± 1,6

Glucana 39,6 ± 1,6 34,1 ± 0,9

Xilana 19,7 ± 0,6 17,7 ± 0,5

Grupos acetila 2,5 ± 0,2 2,4 ± 0,1



A extração do bagaço com etanol tem por finalidade a remoção de substâncias de

baixa polaridade, tais como terpenos, ceras, ácidos graxos, dentre outros (CARASCHI,

1997). Observa-se ao analisar a Tabela 4.5 que o bagaço peneirado possui maior quantidade

de substâncias solúveis se comparado com o bagaço não peneirado, chegando essa

diferença a quase 4 vezes mais.

O teor de cinzas fornece informações da quantidade de substâncias inorgânicas

ainda presentes no bagaço, provenientes da seiva bruta. As cinzas são constituídas

basicamente por sulfatos, oxalatos, carbonatos e silicatos, tendo como contra-íons mais

comuns cálcio, potássio, magnésio e manganês (CURVELO, 1992). Na Tabela 4.5 observa-

se que o bagaço peneirado possui um teor de cinzas maior que o bagaço não peneirado. Os

altos valores encontrados para ambas as amostras podem ser explicados devido à presença

de areia no bagaço uma vez que este material não passou por nenhum processo de lavagem

para retirada do mesmo.

Dos teores de lignina mostrados na Tabela 4.5 observa-se que o bagaço peneirado

apresenta um teor maior que o não peneirado. Quando comparados com a composição

média do bagaço de cana (Figura 2.2), percebe-se que os mesmos se encontram na faixa

dos valores expressos na literatura.

Na análise dos teores de carboidratos observa-se que a glucana (celulose) e xilana

(hemicelulose) são um pouco maiores para o bagaço não peneirado do que para o bagaço

peneirado. Quando comparados com a composição média do bagaço de cana (Figura 2.2)

observa-se que a glucana do bagaço peneirado encontra-se fora da faixa, assim como as

xilanas do bagaço não peneirado e peneirado. Os valores encontrados foram menores do

que a faixa da composição do bagaço (Figura 2.2).

Os valores encontrados para os grupos acetila são praticamente os mesmos para as

amostras de bagaço não peneirado e peneirado.

4.4. Determinação do comprimento de onda de máxima absorção da glicose

Para a determinação do comprimento de onda de máxima absorção, partiu-se de

uma solução de glicose 30 mg/mL onde foi aplicado o método DNS e Glicose GOD-PAP,



como descrito nas seções 3.2.2.2 e 3.2.3.1. A solução de 30 mg/mL de glicose apresentou

uma grande variação de absorção em função do comprimento de onda, além da escala de

absorbância ultrapassar o valor 1. Logo, a solução padrão de glicose foi diluída até que se

conseguisse uma absorbância que apresentasse um pico máximo estreito, onde os desvios

da lei de Lambert-Beer não fossem significativos, e que a escala de 0 a 1 da absorbância

não fosse ultrapassada.

Assim, aplicou-se o método DNS e Glicose GOD-PAP em várias diluições da

solução estoque de glicose 30 mg/mL, e fez-se a varredura do comprimento de onda de 780

a 190 nm, com intervalo de 5 nm de uma leitura para outra, utilizando uma célula de

quartzo com caminho óptico de 10 mm. O resultado final pode ser visto na Figura 4.4, para

a análise com DNS, e na Figura 4.5, para análise com o método Glicose GOD-PAP.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 90 180 270 360 450 540 630

Comprimento de onda (nm)

Ab

so

rbâ

nc

ia (

-)

Figura 4.4: Varredura da amostra de glicose aplicando o método DNS.



0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 90 180 270 360 450 540 630 720

Comprimento de onda (nm)

Ab

orb

ân

cia

(-)

Figura 4.5: Varredura da amostra de glicose aplicando o método Glicose GOD-PAP.

Ao analisarmos a Figura 4.4 e a Figura 4.5, podemos perceber que em ambos os

métodos, a glicose apresentou um comprimento de onda de máxima absorção a 540 nm. A

concentração de glicose que propiciou uma absorbância na faixa 0 a 1, foi de 1,0 mg/mL,

para o método DNS, e 10 mg/mL, para o método enzimático Glicose GOD-PAP.

Assim, o comprimento de onda de máxima absorção, 540 nm, passou a ser

utilizado para a leitura da absorbância nas amostras durante a quantificação dos ART e

glicoses.

4.5. Construção da curva-padrão para o método DNS

Determinado o comprimento de onda de máxima absorção (540 nm), foi

construída a curva-padrão da glicose para a utilização no método DNS, possibilitando

assim a determinação da concentração dos ART.

A Tabela 4.6 mostra a concentração das soluções de glicose e suas respectivas

absorbâncias após reação com DNS e leitura em espectrofotômetro a 540 nm.



Tabela 4.6: Absorbância da solução de glicose após reação com DNS

[Glicose] (mg/mL) [Glicose] na reação de

DNS (mg/mL) Absorbância

0,10 0,01 0,046

0,20 0,02 0,159

0,30 0,03 0,263

0,40 0,04 0,366

0,50 0,06 0,469

0,60 0,07 0,547

0,70 0,08 0,668

0,80 0,09 0,754

0,90 0,10 0,839

1,00 0,11 0,924

Com os dados da Tabela 4.6, plotou-se a curva-padrão da concentração de glicose

em função dos valores da absorbância, como mostra a Figura 4.6.

y = 0,1131x + 0,0041

R2 = 0,9986

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Absorbância a 540 nm (-)

Con

cen

traç

ão d

e gl

icos

e (m

g/m

L)

Figura 4.6: Curva-padrão de glicose (açúcar redutor).



Vale ressaltar que várias curvas-padrão de glicose foram construídas ao longo dos

experimentos, já que cada vez que uma nova solução reagente de DNS era preparada, uma

nova curva era construída. A curva mostrada na Figura 4.6 é apenas uma delas. Notou-se

que não houve mudanças significativas nos valores da absorbância a cada nova curva

construída e assim, a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2) ficaram

praticamente os mesmos.

4.6. Determinação da atividade da enzima celulase

Para a determinação da atividade da celulase partiu-se de uma solução de celulase

de diluição 1:20, ou seja, concentração de 0,05 (v/v) de enzima.

De posse dessa solução, efetuou-se 5 novas diluições em tampão citrato

0,05 mol/L pH 4,8. As concentrações das soluções de celulase são mostradas na Tabela 4.7.

Tabela 4.7: Concentração das soluções diluídas da enzima celulase.

Diluição da

enzima

Volume de

tampão (mL)

Volume enzima

diluída 1:20 (mL)

[enzima]

(v/v)

100 8,00 2,00 0,01000

133,33 8,50 1,50 0,00750

200 9,00 1,00 0,00500

400 9,50 0,50 0,00250

800 9,75 0,25 0,00125

Para determinar a concentração de glicose liberada por cada uma das diluições da

enzima, realizou-se a análise como descrita na seção 3.2.4.2. Ao término das reações e

leituras das absorbâncias, a concentração de glicose liberada foi calculada em cada um dos

tubos reacionais através da curva-padrão de glicose previamente determinada como

indicado na seção 3.2.2.2.1.



A Tabela 4.8 mostra os valores das absorbâncias das amostras, do controle da

enzima e do substrato, assim como a massa de glicose liberada utilizando 0,5 mL de cada

enzima diluída.

Tabela 4.8: Valores das absorbâncias e massa de glicose liberada em cada diluição da

enzima celulase.

Log [enzima]

(v/v)

Absorbância

amostra

Absorbância

enzima

Absorbância

substrato

Absorbância

final

Glicose

(mg/0,5 mL)

-2,000 0,4978 0,0000 0,0033 0,4945 2,230

-2,125 0,4226 0,0000 0,0033 0,4193 1,935

-2,301 0,3416 0,0000 0,0033 0,3383 1,619

-2,602 0,2328 0,0000 0,0033 0,2295 1,193

-2,903 0,1273 0,0000 0,0033 0,1240 0,7800

De posse dos dados da Tabela 4.8, traçou-se uma reta onde se relaciona o

logaritmo da concentração da enzima em cada uma das diluições em função da massa de

glicose liberada durante a reação (ADNEY e BAKER, 1996), como mostra a Figura 4.7.

A não-linearidade do método FPU é justificada por tratar-se de um procedimento

de hidrolise menos padronizado do que a análise para uma enzima específica, uma vez que

o resultado é afetado por no mínimo dois diferentes componentes ativos da enzima

(BAILEY, 1981). Além disso a turbidez da mistura reacional, devido a parcial degradação

da celulose, pode acabar ocasionando desvios de leitura (BAILEY, 1988).

Segundo GHOSE (1987), uma unidade da atividade de enzima celulase (FPU) é

baseada na liberação de exatamente 2,0 mg de glicose equivalente, isto é, 2,0/0,18016 µmol

de 50 mg de filtro de papel por 0,5 mL de enzima diluída em 60 minutos de reação. Sendo

assim, com a equação da reta obtida na Figura 4.7, foi possível determinar a concentração

de enzima necessária para liberar exatamente 2,0 mg:



0,007889[enzima]

-2,103[enzima] log

3,367-2 0,6320 [enzima] log

3,367-liberada) glicose de (massa 0,6320[enzima] log

=

=

×=

×=

y = 0,6320x - 3,367

R2 = 0,9908

(3,0)

(2,5)

(2,0)

(1,5)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Massa de glicose liberada (mg/0,5mL)

Lo

g d

a c

on

ce

ntr

aç

ão

da

en

zim

a (

-)

Figura 4.7: Gráfico do logaritmo da concentração da enzima em cada diluição em função

da massa de glicose liberada por 0,5 mL da enzima celulase diluída, nas condições

reacionais pré-determinadas.

Com o valor da concentração da enzima determinada, pode-se calcular a atividade

enzimática da celulase através da Equação 3.4.

FPU/mL 46,90007889,00,37

celulase da Atividade ==

Logo, o valor da atividade da celulase foi de 46,90 FPU/mL. Este valor de

atividade foi utilizado para calcular o volume necessário da enzima a ser adicionada ao

processo de hidrólise.



4.7. Determinação da atividade da enzima β-glicosidase

Para a determinação da atividade da β-glicosidase partiu-se de uma solução de

enzima de diluição 1:1000 (concentração de 0,001 (v/v)).

De posse dessa solução, efetuou-se 4 novas diluições em tampão citrato

0,05 mol/L pH 4,8. As concentrações das soluções diluídas de β-glicosidase são mostradas

na Tabela 4.9.

Tabela 4.9: Concentrações das soluções da enzima β-glicosidase.

Diluição da

enzima

Volume de

tampão (mL)

Volume enzima

diluída 1:1000 (mL)

[enzima]

(v/v)

2000 5,00 5,00 0,0005

3333,33 7,00 3,00 0,0003

5000 8,00 2,00 0,0002

10000 9,00 1,00 0,0001

Para determinar a concentração de glicose liberada por cada uma das diluições da

enzima, realizou-se a análise como descrita na seção 3.2.4.3. Ao término das reações e

leituras das absorbâncias, calculou-se a concentração de glicose liberada através da curva-

padrão de glicose, que foi previamente construída como indicada na seção 3.2.2.2.1 e

assim, calculou a massa de glicose liberada em cada tubo reacional. A Tabela 4.10 mostra

os valores das absorbâncias das amostras, do controle da enzima e do substrato, assim como

a massa de glicose liberada no meio reacional utilizando 1,0 mL de cada diluição da

enzima.



Tabela 4.10: Valores das absorbâncias e massas de glicose liberadas por cada diluição da

enzima β-glicosidase.

[enzima]

(v/v)

Absorbância

amostra

Absorbância

enzima

Absorbância

substrato

Absorbância

final

Glicose

(mg)

0,00050 0,005 0,000 0,000 0,005 2,50

0,00030 0,006 0,003 0,001 0,002 1,00

0,00020 0,004 0,002 0,001 0,001 0,50

0,00010 0,003 0,003 0,000 0,000 0,00

De posse dos dados da Tabela 4.10, a curva onde se relaciona a concentração da

enzima em cada diluição e a massa de glicose liberada por 1,0 mL da enzima diluída foi

traçada, como mostra a Figura 4.8.

y = 0,0002x + 0,0001

R2 = 0,9878

0,0E+00

1,0E-04

2,0E-04

3,0E-04

4,0E-04

5,0E-04

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Massa de glicose liberada (mg/mL)

Co

nc

en

tra

çã

o d

a e

nzim

a (

-)

Figura 4.8: Gráfico da concentração da enzima em cada diluição em função da massa de

glicose liberada por 1,0 mL da enzima β-glicosidase diluída, em condições reacionais pré-

determinadas.



Segundo WOOD e BHAT (1988), uma unidade da atividade de β-glicosidase

(CBU) baseia-se na liberação de exatamente 1,0 mg de glicose, isto é, 0,5/0,18016 µmol de

celobiose, convertida por 1,0 mL de enzima diluída em 30 minutos de reação. Sendo assim,

com a equação obtida na Figura 4.8, foi possível determinar a concentração de enzima

necessária para liberar exatamente 1,0 mg de glicose:

0003,0[enzima]

0,00010,10,0002[enzima]

0,0001liberada) glicose de (massa0,0002[enzima]

=

+×=

+×=

Com o valor da concentração da enzima determinada, pode-se calcular a atividade

enzimática da enzima β-glicosidase através da Equação 3.5.

Atividade da β-glicosidase = CBU/mL 308,670003,00926,0

=

O valor da atividade da enzima β-glicosidase foi de 308,67 CBU/mL. Este valor de

atividade foi utilizado para calcular o volume necessário da enzima a ser adicionado no


4.8. Efeito do pH na atividade enzimática

Para a determinação o efeito do pH na atividade enzimática, as reações foram

realizadas com uma solução de celulase de diluição 1:33,333, ou seja, concentração de

0,03 (v/v).

Para determinar a massa de glicose liberada pela enzima diluída em tampão citrato

com diferentes valores de pH, realizou-se a análise como descrita na seção 3.2.5. A Tabela

4.11 mostra os valores das absorbâncias das amostras, do tubo controle da enzima e do



substrato lidas espectrofotometricamente a 540 nm após reação com DNS, além da

absorbância final.


em diferentes valores de pH.

pH Absorbância

amostra

Absorbância

enzima

Absorbância

substrato

Absorbância

Final

1,58 0,0071 0,0011 0,0034 0,0026

3,12 0,4497 0,0071 0,0034 0,4392

4,10 0,7413 0,0111 0,0034 0,7268

4,80 0,9198 0,0112 0,0034 0,9052

5,21 0,9041 0,0126 0,0034 0,8881

5,75 0,8556 0,0144 0,0034 0,8378

6,14 0,8067 0,0138 0,0034 0,7895

6,99 0,7154 0,0140 0,0034 0,6980

Com os valores das absorbâncias finais para cada amostra, calculou-se a

concentração de glicose através da curva-padrão previamente determinada como indicada

na seção 3.2.2.2.1 e por sua vez, a massa de glicose liberada em cada reação. A Tabela 4.12

mostra os valores da massa de glicose liberada por 0,5 mL da enzima diluída, assim como a

atividade enzimática e atividade relativa.

Ao analisarmos a Tabela 4.12 percebe-se que o pH onde a enzima apresenta maior

atividade (pH ótimo) foi de 4,8. A enzima apresenta-se mais sensível em valores de

pH < 4,8 apresentando-se praticamente inativa em pH 1,58.




calculados após reação de hidrólise e quantificação por DNS em diferentes valores de pH.

pH Massa de glicose

liberada (mg)

Atividade Enzimática

(FPU) Atividade Relativa %

1,58 0,3050 1,8809 7,95

3,12 2,0133 12,4168 52,48

4,10 3,1386 19,3570 81,81

4,80 3,8367 23,6621 100,00

5,21 3,7698 23,2494 98,26

5,75 3,5729 22,0356 93,13

6,14 3,3840 20,8701 88,20

6,99 3,0259 18,6620 78,87

Com os dados da Tabela 4.12, plotou-se o gráfico da atividade relativa (%) em

função dos vários valores de pH como mostra a Figura 4.9.

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8

pH

Ati

vid

ad

e R

ela

tiv

a (

%)

Figura 4.9: Gráfico da atividade relativa em função dos valores de pHs.



Se observarmos a Figura 4.9, nota-se uma estreita faixa onde a enzima apresenta

alta atividade, aproximadamente entre valores de pH 4,8-5,0.

Assim, para os experimentos de hidrólise do bagaço de cana pré-tratado,o meio

reacional teve seu valor de pH ajustado para 4,8 uma vez que este representa o valor em

que a atividade da enzima é máxima.

4.9. Efeito da temperatura na atividade enzimática

O efeito da temperatura na atividade enzimática foi determinado com uma solução

da enzima celulase de diluição 1:33,333 (concentração de 0,03 (v/v)).

Para determinar a massa de glicose liberada pela enzima diluída, realizou-se a

análise em várias temperaturas como descrita na seção 3.2.6. A Tabela 4.13 mostra os

valores das absorbâncias das amostras, do tubo controle da enzima e do substrato lidas

espectrofotometricamente a 540 nm após reação DNS, além da absorbância final.


em cada uma das temperaturas analisadas.

Temperatura

(°C)

Absorbância

amostra

Absorbância

enzima

Absorbância

substrato

Absorbância

Final

9 0,1051 0,0070 0,0032 0,0949

22 0,1896 0,0083 0,0032 0,1781

33 0,3221 0,0062 0,0032 0,3127

44 0,4408 0,0092 0,0032 0,4284

50 0,5413 0,0087 0,0032 0,5294

62 0,5396 0,0085 0,0032 0,5279

75 0,1721 0,0101 0,0032 0,1588

Com os valores das absorbâncias finais, calculou-se a concentração de glicose

através da curva-padrão previamente determinada como indicada na seção 3.2.2.2.1 e por



sua vez, a massa de glicose liberada em cada reação. A Tabela 4.14 mostra os valores da

massa de glicose liberada, assim como a atividade enzimática e relativa.


calculados após reação de hidrólise e quantificação das amostras por DNS em diferentes

temperaturas.

Temperatura

(°C)

Massa de

glicose liberada

(mg)

Atividade Enzimática

(FPU)

Atividade Relativa

%

9 0,6661 4,1082 28,15

22 0,9917 6,1160 41,91

33 1,5183 9,3641 64,17

44 1,9710 12,1561 83,30

50 2,3662 14,5934 100,00

62 2,3604 14,5572 99,75

75 0,9162 5,6502 38,72

Com os dados da Tabela 4.14, plotou-se o gráfico da atividade relativa em função

dos vários valores de temperatura, como mostra a Figura 4.10.

Ao analisarmos a Tabela 4.14 percebe-se que a temperatura onde a enzima

apresenta maior atividade (temperatura ótima) foi de 50°C. Em condições extremas de

temperatura, a atividade enzimática cai bruscamente. Se observarmos a Figura 4.10, a

temperatura ótima apresenta-se numa faixa de aproximadamente 50-62°C.

Assim, para os experimentos de hidrólise do bagaço de cana pré-tratado, utilizou-

se a temperatura de 50°C, valor onde a enzima apresentou maior atividade enzimática.



0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperatura (°C)

Ati

vid

ad

e R

ela

tiv

a (

%)

Figura 4.10: Gráfico da atividade relativa em função da temperatura.

4.10. Planejamento fatorial 23 do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio

alcalino

Para o planejamento experimental, iniciou-se um planejamento fatorial onde foram

estudadas 3 variáveis do processo: tempo de contato (h), temperatura (°C) e concentração

de H2O2 (%). Foram realizadas análises para as amostras de bagaço não peneirado (N) e

peneirado (P). Os valores decodificados dos níveis de cada uma das variáveis nos

experimentos são apresentadas na Tabela 4.15.

Tabela 4.15: Faixa de valores estudados no planejamento experimental 23 com peróxido de

hidrogênio alcalino.

Níveis

Fatores -1 0 +1

Tempo reacional (h) 6 15 24

Temperatura (°C) 20 40 60

Concentração de H2O2 (%) 1 3 5



A metodologia experimental do pré-tratamento pode ser acompanhada na seção

3.2.7.1.

A Tabela 4.16 mostra as combinações dos níveis em cada um dos ensaios

realizados para as amostras de bagaço não peneirado (N) e peneirado (P), sendo os ensaios

9, 10 e 11, repetições do ponto central. Os ensaios foram realizados em ordem aleatória. A

Figura 4.11 mostra a massa restante de bagaço após cada ensaio do pré-tratamento

partindo-se de 4 g de bagaço peneirado ou não peneirado.

Tabela 4.16: Valores das variáveis em cada um dos ensaios.

Ensaio Substrato Tempo (h) Temperatura (°C) [H2O2] %

1 N e P 6 20 1

2 N e P 24 20 1

3 N e P 6 60 1

4 N e P 24 60 1

5 N e P 6 20 5

6 N e P 24 20 5

7 N e P 6 60 5

8 N e P 24 60 5

9 N e P 15 40 3

10 N e P 15 40 3

11 N e P 15 40 3

Ao analisarmos a Figura 4.11 podemos perceber que houve uma diminuição

bastante acentuada da massa do bagaço de cana a partir do 5º ensaio, onde as concentrações

de H2O2 são aumentadas consideravelmente (com exceção do ensaio 6 para o bagaço não

peneirado). O bagaço peneirado apresentou uma perda de massa maior que o bagaço não

peneirado em todos os ensaios. Nos ensaios onde a concentração de H2O2 é maior, a perda

de massa se deu, em alguns casos, em mais de 50%.



0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ensaios

Ma

ss

a d

a a

mo

str

a (

g/4

g d

e b

ag

aç

o)

Massa do bagaço não peneirado

Massa do bagaço peneirado

Figura 4.11: Massa de bagaço não peneirado e peneirado após cada ensaio partindo de 4 g

de bagaço peneirado e não peneirado.

Segundo GOULD e FREER (1984), o pré-tratamento H2O2 solubiliza pouco mais

da metade da lignina e a maior parte da hemicelulose, deixando o resíduo altamente

suscetível à hidrólise enzimática da celulose. Assim, o H2O2 alcalino apresenta grandes

efeitos na solubilização da lignina e na diminuição do peso seco , principalmente devido à

solubilização da hemicelulose.

Para a liberação dos ART e glicose, de acordo com o planejamento da Tabela 4.16,

efetuou-se a hidrólise com as seguintes condições reacionais fixas: 1 g de biomassa seca

pré-tratada segundo cada combinação de níveis, volume reacional de 300 mL, 3,47 FPU/g

de biomassa seca pré-tratada, 1,01 CBU/g biomassa seca pré-tratada, pH 4,8, temperatura

de 50°C e 100 rpm. A metodologia experimental para realização da hidrólise esta descrita

na seção 3.2.7.2.

A Figura 4.12 mostra a massa do resíduo restante após hidrólise por 72 h em cada

uma das condições de ensaio. Realizou-se também a hidrólise da amostra N e P sem pré-

tratamento.



0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N e P(*)

Ensaios

Ma

ss

a d

a a

mo

str

a (

g/g

bio

ma

ss

a p

ré-t

rata

da

)

Resíduo do bagaço não peneirado

Resíduo do bagaço peneirado

* As amostras N (bagaço não peneirado) e P (bagaço peneirado) não foram pré-tratadas.

Figura 4.12: Massa de bagaço não peneirado e peneirado pré-tratados restante após o


Ao analisarmos a Figura 4.12, observa-se que a maior perda de massa se deu nas

amostras peneiradas, com exceção dos ensaios 7 e 8, onde a perda de massa do bagaço não

peneirado foi maior. Observa-se ainda que a hidrólise do bagaço sem pré-tratamento foi

pouco eficiente, com apenas cerca de 21% da massa do bagaço não peneirado sendo

hidrolisada e 23% da massa do bagaço peneirado.

Em todos os ensaios foram analisadas as massas de ART e glicose liberadas em

função do tempo de hidrólise. As Figuras 4.13 a 4.23 mostram estes perfis de hidrólise para

cada um dos ensaios e para a amostra de bagaço não peneirado e peneirado sem pré-

tratamento. A metodologia experimental para a quantificação dos açúcares liberados no

meio reacional está descrita na seção 3.2.7.3.



Ensaio 1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

ma

ss

a d

e A

RT

e G

lic

os

e

(g/g

bio

ma

ss

a b

ruta

se

ca

) ART não peneirado

ART peneirado

Glicose não peneirado

Glicose peneirado

Figura 4.13: Perfil de hidrólise do ensaio 1.

Ensaio 2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa s

eca)

ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirado


Ensaio 3

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta

seca

)

ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirada


Ensaio 4

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca) ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirado


Ensaio 5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

e G

lic

ose

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta

seca)

ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirado


Ensaio 6

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca)

ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirado




Ensaio 7

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta

seca


ART peneirado


Glicose peneirado


Ensaio 8

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca)

ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirado


Ensaios 9, 10 e 11

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta

seca

)

Não peneirado - 9

Não peneirado - 10

Não peneirado - 11

Peneirado - 9

Peneirado - 10

Peneirado - 11

Figura 4.21: Perfil de hidrólise dos ensaio 9, 10

e 11 para ART.

Ensaios 9, 10 e 11

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca)

Não peneirado - 9

Não peneirado - 10

Não peneirado - 11

Peneirado - 9

Peneirado - 10

Peneirado - 11

Figura 4.22: Perfil de hidrólise dos ensaios 9, 10

e 11 para glicose.

Bagaço sem pré-tratamento

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca)

ART não peneirado

ART peneirado


Glicose peneirado

Figura 4.23: Perfil de hidrólise do bagaço N e P sem pré-tratamento.

Ao analisarmos as Figuras 4.13 a 4.23 observa-se que a massa de glicose liberada

está diretamente relacionada com a concentração de H2O2, sendo que quanto maior a

concentração, maior a massa liberada. A massa de ART mostrou-se bastante considerável.



Observamos ainda que na maioria dos ensaios, a massa de açúcares foram maiores

para as amostras de bagaço peneirado se comparado com as amostras não peneiradas. Nos

ensaios 7 e 8 (Figura 4.19 e 4.20) vemos uma inversão desse resultado onde a massa de

glicose proveniente do bagaço não peneirado é maior que do bagaço peneirado.

Na Figura 4.23 observa-se que a quantidade de glicose liberada pelo bagaço não

peneirado e peneirado sem pré-tratamento é praticamente zero, mas há a liberação de uma

pequena quantidade de ART.

Segundo estudos realizados por JUHÁSZ et al. (2005), a enzima comercial

celulase apresenta uma atividade de xilanase, mananase e β-glicosidade menor que as

enzimas não comerciais. Em contrapartida, a atividade da acetil xilana esterase é alta se

comparada com enzimas não-comerciais. As atividades das enzimas específicas e a

concentração de proteína contida no complexo enzimático podem ser visualizadas na

Tabela 4.17.

Tabela 4.17: Atividade das enzimas específicas e concentração de proteína do complexo

enzimático (JUHÁSZ et al., 2005).

Complexo celulase

Proteína (mg/mL) 125 Xilanase (FPU/mg) 100

FPA (FPU/mg) 0,55 Mananase (FPU/mg) 26,1

Endoglicanase (FPU/mg) 130 Acetil xilana esterase (FPU/mg) 14,1

EG I (FPU/mg) 4,6 α-galactosidase (FPU/mg) 0,1

CBH I (FPU/mg) 17,1 β-xilosidase (FPU/mg) 2,3

β-glicosidase (FPU/mg) 4,2 α-arabinosidase (FPU/mg) 4,3

Percebe-se ao analisar a Tabela 4.17 que a atividade das enzimas xilanase,

mananase, acetil xilana esterase e α-arabinosidase são consideráveis se comparadas com as

enzimas endoglicanase, EG I, CBH I e β-glicosidase, que são as enzimas envolvidas no

processo de hidrólise da celulose. Assim, os complexos celulolíticos comerciais conseguem

hidrolisar além da celulose, as hemiceluloses.



Nas leituras de ART estão incluídos vários açúcares redutores: glicose, celobiose,

açúcares provenientes da hemicelulose (principalmente xilose) e oligossacarídeos de alto

peso molecular, todos contendo extremidades redutoras (PALMA, 2003; LI et al., 2004;

MARTINS, 2005).

4.10.1. Determinação dos efeitos principais e de interação das variáveis

Após a análise dos perfis de hidrólise para cada ensaio, a massa de ART e glicose

usada para a análise estatística foram obtidas no tempo de reação onde não se observou

mudanças significativas na massa dos açúcares liberados.

Vale ressaltar que o ponto onde não observou mais mudanças significativas na

massa dos açúcares liberados apresentou-se em tempos diferente em cada um dos ensaios,

ficando o máximo de rendimento em um intervalo entre 48-60 h de hidrólise.

A Tabela 4.18 mostra a massa dos ART e glicose liberadas experimentalmente em

cada combinação de níveis sendo os ensaios 9, 10 e 11 repetições no ponto central. A massa

de ART e glicose são expressas como g/g biomassa bruta seca (sem pré-tratamento). São

marcados em negrito os melhores resultados obtidos nos ensaios para cada resposta

considerada.

A Figura 4.24 mostra o rendimento em glicose após hidrólise do bagaço não

peneirado e peneirado em cada um dos ensaios. Os cálculos do rendimento de glicose após

a hidrólise foram calculados através da Equação 4.1.

Rendimento de glicose = tratadanão biomassa na glucana g

1002,1802,162

glucana gglicose g

××= (4.1)

Nos cálculos foram consideradas as massas totais de glicose liberada após a

hidrólise do bagaço pré-tratado, levando em consideração as 4,0 gramas de biomassa inicial

utilizadas para o pré-tratamento, descontando o teor de umidade.

g glucana hidrolisada




liberadas em cada um dos ensaios após hidrólise.

Ensaios Tempo

(h)

Temperatura

(°C)

[H2O2]

%

Massa

ART-N

(g/g)

Massa

ART-P

(g/g)

Massa

Glicose-N

(g/g)

Massa

Glicose-P

(g/g)

1 6 20 1 0,2062 0,2590 0,0646 0,1033

2 24 20 1 0,2115 0,2535 0,0797 0,0981

3 6 60 1 0,4330 0,3424 0,2153 0,1667

4 24 60 1 0,2807 0,3403 0,1214 0,1819

5 6 20 5 0,3470 0,3680 0,2419 0,2393

6 24 20 5 0,4947 0,4521 0,3093 0,2281

7 6 60 5 0,3649 0,2889 0,2525 0,1888

8 24 60 5 0,4070 0,2855 0,2877 0,1634

9 15 40 3 0,3590 0,3094 0,2296 0,1676

10 15 40 3 0,3235 0,3465 0,2092 0,1952

11 15 40 3 0,3239 0,3071 0,2046 0,1649

Média 0,3410 0,3230 0,2014 0,1725

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ensaios

Ren

dim

en

to d

e g

lico

se (

%)

Bagaço não peneirado

Bagaço peneirado

Figura 4.24: Rendimento de glicose após hidrólise enzimática para cada um dos ensaios.



Analisando a Figura 4.24 observa-se que, para o bagaço não peneirado, o melhor

rendimento em glicose após a hidrólise foi para o ensaio 6 onde 0,694 g glicose/g celulose

foram liberadas após a hidrólise, já o pior resultado se deu no ensaio 1, onde apenas 0,145 g

glicose/g celulose foram liberadas e quantificadas. Para o bagaço peneirado, o melhor

rendimento se deu no ensaio 5, onde 0,624 g glicose/g celulose foram liberadas e o menor

rendimento se deu para o ensaio 2, onde apenas 0,256g glicose/g celulose foram liberadas e

quantificadas.

Nota-se que, de um modo geral, os melhores rendimentos foram obtidos para o

bagaço não peneirado e para os ensaios com maiores concentrações de H2O2.

A análise dos efeitos principais e de interação das variáveis foi realizada utilizando

o erro puro e o software Statistica (Statsoft, v. 7.0).

4.10.1.1. Análise da massa de ART – bagaço não peneirado

A análise dos efeitos principais e interação pode ser vista na Tabela 4.19, onde a

resposta é a massa liberada de ART nos ensaios do bagaço não peneirado. A Figura 4.25

mostra o gráfico de Pareto com os efeitos padronizados. A linha pespontada indica a

magnitude que o efeito deve ter para ser considerado significativo considerando 90% de

confiança, já que este é um valor normalmente utilizado em experimentos enzimáticos.


bagaço não peneirado.




utilizando o erro puro para a massa de ART liberada – bagaço não peneirado.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,341036 0,006145 0,323092 0,358980 0,341036

(1) Tempo (h) 0,010700 0,014412 -0,031382 0,052782 0,005350

(2) Temp. (°C) 0,056550 0,014412 0,014468 0,098632 0,028275

(3) [H2O2] (%) 0,120550 0,014412 0,078468 0,162632 0,060275

1*2 -0,065800 0,014412 -0,107882 -0,023718 -0,032900

1*3 0,084200 0,014412 0,042118 0,126282 0,042100

2*3 -0,091450 0,014412 -0,133532 -0,049368 -0,045725

1*2*3 0,013000 0,014412 -0,029082 0,055082 0,006500

Analisando a Figura 4.25 podemos perceber que nem todos as variáveis e efeitos

de interação foram significativos. O efeito da variável tempo de reação, e as interações

tempo/temperatura/concentração de peróxido (1*2*3) não se mostraram estatisticamente

significativos a 90% de confiança. Logo, estes efeitos e interações foram eliminados do

modelo e considerados erros aleatórios experimentais.

Analisando a Tabela 4.19 nota-se que os efeitos principais de tempo, temperatura e

concentração de peróxido são positivos, o que, desconsiderando as interações, sugere que

os melhores resultados deveriam ser obtidos quando os fatores são mantidos nos valores

máximos (ensaio 8). Analisando a Tabela 4.18 nota-se que o máximo ocorre no ensaio 6,

onde o tempo e a concentração estão no seus valores máximos e a temperatura encontra-se

no mínimo. Isso acontece devido ao efeito da interação 1*2 (tempo/temperatura) e 2*3

(temperatura/concentração de peróxido) serem significativos e apresentarem valores

negativos maiores que o efeito principal da temperatura.

A Tabela 4.19 mostra, ainda, que a concentração de H2O2 apresenta maior efeito

principal que a temperatura.

Com os valores dos coeficientes de regressão estatisticamente significativos

(Tabela 4.19) pode-se estimar a Equação 4.2 que representa o modelo linear. Vale ressaltar



que os valores de tempo (t), temperatura (T) e [H2O2] (C) apresentam na equação, valores

codificados.

0,045725TC- 0,042100tC0,032900tT

-0,060275C 0,028275T 0,341036 seca) bruta biomassa gg( m N ART

+

++= (4.2)

Para determinar se o modelo é estatisticamente significativo é necessário fazer

uma análise da variância (ANOVA) como mostra a Tabela 4.20.


planejamento fatorial 23, ART – bagaço não peneirado.

Fonte de Variação Soma

Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Regressão (R) 0,07500 5 0,01500 49,171

Resíduos (r) 0,001500 5 0,0003000 0,55762

Falta de ajuste (faj) 0,0006950 3 0,0002320

Erro puro (ep) 0,0008310 2 0,0004150

Total (T) 0,07655 10

% de variação

explicada (R2) 98,01

% máxima de

variação explicável 98,91

1: Teste F calculado para verificar a significância estatística da regressão

2: Teste F calculado para verificar a falta de ajuste do modelo

*F(tab.)5,5 = 3,45 no nível de 90% para a regressão

*F(tab.)3,2 = 9,16 no nível de 90% para a falta de ajuste

*Valores retirados da Tabela A.4, BARROS NETO et al (2003).

Para um modelo ser considerado estatisticamente significativo, o valor de F

calculado para verificar a significância da regressão deve ser maior do que o tabelado. Para



que o modelo possa ser usado para fins de predição, no entanto, deve apresentar um valor

de F calculado muito maior que o valor tabelado (de 5 a 10 vezes maior). O teste F

calculado para verificar a falta de ajuste do modelo deve apresentar um valor muito menor

que o valor tabelado. Se essas duas condições forem satisfeitas, o modelo é considerado

bom.

Assim, analisando a Tabela 4.20, podemos perceber que o valor do teste F

calculado para verificar a regressão foi de 49,17 sendo maior que o valor tabelado

(F(tab.)5,5 = 3,45), entendendo assim que a equação do modelo linear é significativa a 90%

por apresentar uma boa regressão. O modelo estudado não apresenta evidências de falta de

ajuste já que o teste F calculado apresentou um valor de 0,5576 que é menor que o valor

tabelado (F(tab.)3,2 = 9,16).

Como ambos os testes F foram satisfeitos, o modelo pode ser considerado

estatisticamente significativo a 90% de confiança e pode ser usado para fins preditivos.

As Figura 4.26 e 4.27 mostram as superfícies de resposta (a) e curva de nível (b)

usando o modelo da Equação 4.2 quando o tempo de pré-tratamento é mantido no menor e

maior valor, respectivamente.

(a)

b)

Figura 4.26: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.2. Tempo 6 h



(a)

(b)

Figura 4.27: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.2. Tempo 24h

Ao analisarmos a Figura 4.26 observa-se que para altas temperaturas a influência

da concentração H2O2 é pequena, sendo o máximo de ART conseguido utilizando baixas

concentrações de H2O2 e altas temperaturas, quando o tempo de reação é mantido em 6 h.

Já quando o tempo de pré-tratamento é mantido em 24 h (Figura 4.27), a

temperatura apresenta menor influência quando se utiliza altas concentrações de H2O2. O

máximo de ART para o bagaço não peneirado é conseguido para altas concentrações de

H2O2 e baixa temperatura.

Apesar de ambas as configurações de pré-tratamentos levarem a altas massas de

ART, o melhor resultado se dá quando a concentração de H2O2 e tempo reacional são

mantidos no máximo e a temperatura no mínimo, como pode ser visto comparando os

valores dos índices nas curvas de nível das Figura 4.26 e 4.26. Esse resultado é compatível

com o observado na Tabela 4.18.



4.10.1.1.1. Análise da massa de ART – bagaço peneirado

A análise dos efeitos principais e das interações na massa liberada de ART, nos

ensaios do bagaço peneirado, pode ser vista na Tabela 4.21. A Figura 4.28 mostra o gráfico

de pareto considerando 90% de confiança.


utilizando o erro puro para a massa de ART liberada – bagaço peneirado.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,322973 0,006667 0,303504 0,342442 0,322973

(1) Tempo (h) 0,018275 0,015637 -0,027384 0,063934 0,009137

(2) Temp. (°C) -0,018875 0,015637 -0,064534 0,026784 -0,009437

(3) [H2O2] (%) 0,049825 0,015637 0,004166 0,095484 0,024913

1*2 -0,021025 0,015637 -0,066684 0,024634 -0,010513

1*3 0,022075 0,015637 -0,023584 0,067734 0,011038

2*3 -0,103975 0,015637 -0,149634 -0,058316 -0,051988

1*2*3 -0,022725 0,015637 -0,068384 0,022934 -0,011362


bagaço peneirado.

Analisando a Figura 4.28 podemos perceber que os efeitos principais temperatura

e tempo, e as interações tempo/temperatura/concentração de peróxido (1*2*3),



tempo/concentração de peróxido (1*3) e tempo/temperatura (1*2), não se mostraram

estatisticamente significativos. Logo, estes efeitos e interações foram eliminados do modelo

e considerados erros aleatórios experimentais.

Analisando a Tabela 4.21 nota-se que os efeitos principais de tempo e

concentração de peróxido são positivos, já o efeito da temperatura é negativo, o que,

desconsiderando as interações, sugere que o melhor resultado deveriam ser obtido no

ensaio 6. Analisando a Tabela 4.18 nota-se que realmente o máximo ocorre no ensaio 6,

onde o tempo e a concentração estão no seus valores máximos e a temperatura encontra-se

no mínimo.

Com os valores dos coeficientes de regressão estatisticamente significativos pode-

se estimar a Equação 4.3 que representa o modelo linear. Pode-se notar que tanto o efeito

principal quanto as interações envolvendo o tempo de pré-tratamento foram eliminados do

modelo por não serem estatisticamente significativos com 90% de confiança.

0,051988TC-0,024913C0,322973 seca) bruta biomassa gg( m P ART += (4.3)

A análise da variância (ANOVA) é mostrada na Tabela 4.22 sendo assim possível

verificar a validade do modelo.

Observa-se ao analisarmos a Tabela 4.22 que o teste F calculado para verificar a

regressão do modelo apresentou um valor de 20,19 sendo este maior que o valor tabelado

(F(tab.)2,8 = 3,11), concluindo assim que a equação do modelo linear é significativa a 90%

por apresentar uma boa regressão. O modelo estudado não apresenta evidências de falta de

ajuste, uma vez que o teste F calculado para tal fim, apresentou um valor de 1,461 que é

menor que o valor tabelado (F(tab.)6,2 = 9,33).


estatisticamente significativo a 90% de confiança.




planejamento fatorial 23, ART – bagaço peneirado.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Regressão (R) 0,02660 2 0,01330 20,191

Resíduos (r) 0,005300 8 0,0007000 1,4612


Erro puro (ep) 0,0009780 2 0,0004890

Total (T) 0,03185 10

% de variação


% máxima de


1: Teste F calculado para verificar a significância estatística do modelo




*Valores retirados da Tabela A.4, BARROS NETO et al (2003).

As superfícies de resposta (a) e curvas de nível (b) para os resultados significativos

usando o modelo da Equação 4.3, podem ser visualizadas na Figura 4.29.




Ao analisarmos a Figura 4.29, vemos que, as maiores massas de ART do bagaço

peneirado são conseguidos quando a concentração de H2O2 é alta e a temperatura baixa.

Na Tabela 4.18 observa-se que a maior massa de ART para o bagaço peneirado é

conseguida quando o tempo de pré-tratamento é de 24 h sendo o segundo maior valor para

o tempo de 6 h, quando as demais condições são mantidas na maior concentração de H2O2 e

na menor temperatura (ensaio 5 e 6). Logo, para maximização da massa de ART, é

aconselhável trabalhar aumentando a concentração de H2O2 e diminuindo a temperatura,

sendo o tempo de pré-tratamento não é significativo no nível de 90% de confiança. Mesmo

a temperatura não sendo estatisticamente significativa a 90% de confiança, ela é

representada pela interação temperatura/concentração que é significativa e possui efeito

negativo.

4.10.1.1.2. Análise da massa de glicose – bagaço não peneirado

A análise dos efeitos principais e das interações na massa liberada de glicose, nos

ensaios do bagaço não peneirado, pode ser vista na Tabela 4.23. A Figura 4.30 mostra o

gráfico de Pareto considerando 90% de confiança.




utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada – bagaço não peneirado.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,201436 0,004012 0,189722 0,213151 0,201436

(1) Tempo (h) 0,005950 0,009409 -0,021524 0,033424 0,002975

(2) Temp. (°C) 0,045350 0,009409 0,017876 0,072824 0,022675

(3) [H2O2] (%) 0,152600 0,009409 0,125126 0,180074 0,076300

1*2 -0,035300 0,009409 -0,062774 -0,007826 -0,017650

1*3 0,045350 0,009409 0,017876 0,072824 0,022675

2*3 -0,050850 0,009409 -0,078324 -0,023376 -0,025425

1*2*3 0,019200 0,009409 -0,008274 0,046674 0,009600


do bagaço não peneirado.

Na Figura 4.30 nota-se que a variável tempo de reação, e a interação

tempo/temperatura/concentração de H2O2 (1*2*3), não se mostraram estatisticamente

significativos a 90% de confiança. Logo, o efeito tempo e a interação 1*2*3 foram

eliminados do modelo. Nota-se analisando a Tabela 4.23 que os efeitos principais de tempo,

temperatura e concentração de peróxido são positivos, o que, desconsiderando as

interações, sugere que os melhores resultados deveriam ser obtidos quando os fatores forem

mantidos nos valores máximos (ensaio 8).



Analisando a Tabela 4.18 nota-se que o máximo ocorre no ensaio 6, onde o tempo

e a concentração estão no seus valores máximos e a temperatura encontra-se no mínimo.

Isso acontece devido ao efeito das interações 1*2 (tempo/temperatura) e 2*3

(temperatura/concentração de peróxido) serem significativos e apresentarem valores

negativos. A interação 2*3 apresenta um efeito negativo maior que o efeito principal da

temperatura.

A determinação do modelo empírico que descreve a massa de glicose liberada pelo

bagaço não peneirado durante a hidrólise pode ser descrita pela Equação 4.4, considerando

apenas os efeitos significativos.

0,025425TC- 0,022675tC0,017650tT

-0,076300C0,0022675T0,201436 seca) bruta biomassa gg( m N glicose

+

++= (4.4)

A análise da variância (ANOVA) é mostrada na Tabela 4.24.


planejamento fatorial 23, glicose – bagaço não peneirado.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Regressão (R) 0,06250 5 0,01250 33,541

Resíduos (r) 0,001900 5 0,0004000 2,8402


Erro puro (ep) 0,0003540 2 0,0001770

Total (T) 0,06435 10

% de variação


% máxima de








*Valores retirados da Tabela A.4, BARROS NETO et al. (2003).

Analisando a Tabela 4.24 observa-se que o modelo é considerado estatisticamente

significativo, já que o valor de F calculado é 33,54, maior que o valor tabelado

(F(tab.)5,5 = 3,45). O modelo não apresenta evidência de falta de ajuste, pois o valor de F

calculado é 2,840, menor que o valor tabelado (F(tab.)3,2 = 9,16).



As superfícies de resposta (a) e curvas de nível (b) para os resultados significativos

usando o modelo da Equação 4.4, podem ser visualizadas nas Figuras 4.31 e 4.32, onde os

tempos reacionais de pré-tratamento são mantidos fixos a 6 e 24 h, respectivamente.

(a)

(b)

Figura 4.31: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.4. Tempo 6 h



(a)

(b)

Figura 4.32: Superfície de resposta (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.4. Tempo 24h

De acordo com as Figuras 4.31 e 4.32, altas massas de glicose podem ser

conseguidas em uma ampla faixa de temperatura, quando a concentração de H2O2 é alta.

Quando o tempo é fixo em 6 h e a concentração é mantida alta, massas ligeiramente

maiores são obtidas quando se trabalha com altas temperaturas, como mostra a Tabela 4.18

(ensaio 7). Quando o tempo é mantido fixo em 24h e a concentração é alta, massas

ligeiramente maiores são obtidas com baixa temperatura (ensaio 6). Uma comparação das

Figura 4.31 e 4.32 mostra que o tempo de pré-tratamento não é importante.

4.10.1.1.3. Análise da massa de glicose – bagaço peneirado

A análise dos efeitos principais e de interações das variáveis durante a análise da

massa de glicose liberada nos ensaios do bagaço peneirado podem ser visualizados na

Tabela 4.25. A Figura 4.33 mostra o gráfico de Pareto considerando 90% de confiança.




utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada – bagaço peneirado.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,172482 0,005056 0,157718 0,187245 0,172482

(1) Tempo (h) -0,006650 0,011857 -0,041273 0,027973 -0,003325

(2) Temp. (°C) 0,008000 0,011857 -0,026623 0,042623 0,004000

(3) [H2O2] (%) 0,067400 0,011857 0,032777 0,102023 0,033700

1*2 0,001550 0,011857 -0,033073 0,036173 0,000775

1*3 -0,011650 0,011857 -0,046273 0,022973 -0,005825

2*3 -0,065600 0,011857 -0,100223 -0,030977 -0,032800

1*2*3 -0,008650 0,011857 -0,043273 0,025973 -0,004325


do bagaço peneirado.

Na Figura 4.33 nota-se que o efeito da variável tempo de reação e temperatura, e

as interações tempo/concentração de H2O2 (1*3), tempo/temperatura/concentração de H2O2

(1*2*3) e tempo/temperatura (1*2), não se mostraram estatisticamente significativos a 90%

de confiança e foram eliminados do modelo. Nota-se na Tabela 4.25 que os efeitos

principais, temperatura e concentração de H2O2 são positivos e o efeito do tempo, é

negativo, o que, desconsiderando as interações, sugere que o melhor resultado deveria ser

obtido no ensaio 7.

Na Tabela 4.18 nota-se que o máximo ocorre no ensaio 5, onde as variáveis tempo

e temperatura estão no seus valores mínimos e a concentração de H2O2 alcalino no valor



máximo. Isso acontece devido ao efeito da interação 2*3 (temperatura/concentração de

H2O2) ser significativo e apresentar um valor negativo maior do que o efeito da temperatura

(positivo), que não é estatisticamente significativo.

A determinação do modelo empírico que descreve a massa de glicose liberada pelo

bagaço peneirado durante a hidrólise pode ser descrita pela Equação 4.5, que considera

apenas os efeitos significativos. Nota-se que tanto o efeito principal do tempo de pré-

tratamento quanto os efeitos de interação envolvendo este fator foram eliminados do

modelo.

0,032800TC-0,033700C0,172482 seca) bruta biomassa gg( m P glicose += (4.5)

A análise da variância (ANOVA), para a análise da glicose liberada pelo bagaço

peneirado, é mostrada na Tabela 4.26.


planejamento fatorial 23, glicose – bagaço peneirado.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Regressão (R) 0,01770 2 0,008800 56,481

Resíduos (r) 0,001300 8 0,0002000 0,4093


Erro puro (ep) 0,0005620 2 0,0002810

Total (T) 0,01894 10

% de variação


% máxima de









A validade do modelo pode ser verificada pela análise de variância (ANOVA)

apresentada na Tabela 4.26 já que o teste F calculado para verificar a regressão do modelo

apresentou um valor de 56,48, sendo este maior que o valor tabelado (F(tab.)2,8 = 3,11),

concluindo assim que a equação do modelo linear é significativa a 90% por apresentar uma

boa regressão. O modelo estudado não apresenta evidências de falta de ajuste pois o teste F

calculado apresentou um valor de 0,4093 que é menor que o valor tabelado

(F(tab.)6,2 = 9,33).



A superfície de resposta (a) e curva de nível (b) para os resultados significativos

usando o modelo da Equação 4.5, são mostrados na Figura 4.34.

(a)

(b)




De acordo com a Figura 4.34 vemos que, as maiores massas de glicose são

conseguidas quando a concentração de H2O2 é alta e a temperatura baixa.

Observa-se na Tabela 4.18 que a maior massa de glicose se dá quando o tempo de

pré-tratamento é de 6 h sendo o segundo melhor resultado para o tempo de 24 h, quando a

temperatura é mantida no ponto mínimo e a concentração no máximo (ensaios 5 e 6). Logo,

para maximização da massa de glicose no bagaço peneirado, é aconselhável trabalhar

aumentando a concentração de H2O2 e diminuindo a temperatura, que mesmo não sendo

estatisticamente significativa a 90% de confiança, apresenta a interação

temperatura/concentração significativa, sendo que o tempo de pré-tratamento não é

significativo no nível de 90% de confiança.

4.11. Otimização do pré-tratamento

O pré-tratamento com H2O2 alcalino mostrou-se efetivo para melhorar a

susceptibilidade do bagaço de cana à hidrólise enzimática, tanto para o bagaço não

peneirado quanto para o peneirado. No entanto, embora tenha sido possível propor modelos

lineares estatisticamente significativos para descrever as massas de ART e glicose liberadas

em função dos fatores considerados, para se obter o valor de ótimo global são necessários

novos experimentos, já que em todas as superfícies de resposta (Figuras 4.26, 4.27, 4.29,

4.31, 4.32 e 4.34) vemos que os maiores valores de massa de ART e glicose estão nas

extremidades.

Para determinar qual tamanho de bagaço seria selecionado para o processo de

otimização, foi levada em consideração a análise dos resultados de glicose, que são o nosso

objeto de interesse neste trabalho. Analisando as superfícies de resposta da massa de

glicose liberada pelo bagaço não peneirado (Figuras 4.31 e 4.32) e peneirado (Figura 4.34)

após pré-tratamento com H2O2, percebe-se que em ambos os estudos precisaríamos

aumentar a concentração do reagente de pré-tratamento. Logo, o reagente foi

desconsiderado na tomada de decisão do bagaço a ser otimizado.

Analisando a Tabela 4.18 podemos perceber que em condições de baixa

concentração do reagente, a massa de glicose liberada durante a hidrólise do bagaço

peneirado é, na maioria das vezes, maior que a massa liberada pelo bagaço não peneirado.



À medida que a concentração de H2O2 aumenta, os resultados se invertem, havendo uma

maior massa de glicose liberada pelo bagaço não peneirado em comparação com o

peneirado.

A hidrólise do bagaço pré-tratado levou a rendimentos de glicose bem maiores

para o bagaço não peneirado, 0,3093g/g biomassa bruta seca (ensaio 6 - 24 h, 20°C,

5% H2O2), do que para o bagaço peneirado, que apresentou como melhor resultado a

liberação de 0,2393g/g biomassa bruta seca no ensaio 5 (6 h, 20°C, 5% H2O2).

Outro fator importante é que utilizando o bagaço não peneirado conseguimos um

maior aproveitamento da matéria prima como um todo, já que grande parte do material

(85,59%) foi desprezada no estudo do bagaço peneirado. Ainda, o fato de não ser

necessário peneirar o bagaço faz com que uma operação unitária a menos seja necessária no

processo, o que diminui bastante os custos.

Diante de todos os fatos, foi selecionado para o processo de otimização o bagaço

de cana não peneirado. Para a otimização do pré-tratamento, a variável “tempo” foi

eliminada do planejamento visto que seu efeito não se mostrou estatisticamente

significativo durante os primeiros ensaios. Como o estudo havia sido realizado com tempos

de 6, 15 e 24 h de pré-tratamento, o tempo de 6 h foi fixado para todos os ensaios no

processo de otimização, variando assim, apenas a concentração de H2O2 e a temperatura,

ambos para valores maiores, como indica a superfície de resposta da Figura 4.31.

Para a otimização do pré-tratamento poderia ser usado o método da determinação

do caminho de máxima inclinação (BARROS NETO et al., 2003), mas isso levaria a

experimentos com muita variação de temperatura. Como, com o equipamento disponível

isso levaria um tempo muito grande, optamos pela execução de um planejamento fatorial 22

+ configuração estrela, que varre uma maior área de resposta, esperando encontrar o

máximo global neste novo intervalo.



4.11.1. Planejamento fatorial 22 + configuração estrela do pré-tratamento

No planejamento foram estudadas 2 variáveis do processo: temperatura (°C) e

concentração de H2O2 (%), sendo o tempo fixado em 6 h. Os valores decodificados de cada

uma das variáveis são apresentadas na Tabela 4.27.

Tabela 4.27: Faixa de valores estudados no planejamento fatorial 22 + configuração estrela

para determinação do ponto ótimo.

Níveis

Fatores -1,41 -1 0 +1 +1,41

Temperatura (°C) 50 53 60 67 70

Concentração de H2O2 (%) 4,17 5 7 9 9,83

A metodologia experimental do pré-tratamento pode ser acompanhada na seção

3.2.7.1.

A Tabela 4.28 mostra as variáveis para cada um dos ensaios realizados sendo os

ensaios 9*, 10* e 11* repetições no ponto central. Os ensaios foram realizados em ordem

aleatória. A Figura 4.35 mostra a massa restante de bagaço após cada ensaio do

planejamento fatorial 22 + configuração estrela partindo-se de 4 g de bagaço não peneirado.

Ao analisarmos a Figura 4.35 podemos perceber que em todos os ensaios houve

uma perda da massa após o pré-tratamento de mais de 50%. O ensaio 4* apresentou a maior

perda de massa durante o pré-tratamento, 59,4% do bagaço sendo solubilizado, e o ensaio

5* a menor perda, 47,5%. Isso leva a entender que houve uma perda considerável de

hemicelulose devido a essa grande diminuição de massa.



Tabela 4.28: Valores das variáveis em cada um dos ensaios do planejamento fatorial 22 +

configuração estrela.

Ensaio Substrato Temperatura (°C) [H2O2] %

1* N 53 5

2* N 53 9

3* N 67 5

4* N 67 9

5* N 50 7

6* N 70 7

7* N 60 4,17

8* N 60 9,83

9* N 60 7

10* N 60 7

11* N 60 7

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1* 2* 3* 4* 5* 6* 7* 8* 9* 10* 11*

Ensaios

Ma

ss

a d

e b

ag

aç

o (

g/4

g d

e b

ag

aç

o b

ruto

se

co

)

Figura 4.35: Massa do bagaço restante após pré-tratamento segundo o planejamento

fatorial 22 + configuração estrela, partindo-se de 4 g de bagaço não peneirado.




efetuou-se a hidrólise com as seguintes condições reacionais fixas: 1 g de biomassa pré-

tratada seca segundo cada combinação de níveis, volume reacional de 300 mL, 3,47 FPU/g



na seção 3.2.7.2.

A Figura 4.36 mostra a massa do resíduo restante após hidrólise por 72 h em cada

uma das condições de ensaio.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

1* 2* 3* 4* 5* 6* 7* 8* 9* 10* 11*

Ensaios

Massa d

e b

ag

aço

(g

/g b

iom

assa s

eca p

ré-t

rata

da)

Figura 4.36: Massa de bagaço restante após o processo de hidrólise segundo planejamento

fatorial 22 + configuração estrela.

Em relação à hidrólise, pode-se observar na análise da Figura 4.36 que a massa

restante após o processo apresentou-se menor no ensaio 4, onde ocorreu a maior hidrólise,

82,67% do bagaço pré-tratado sendo hidrolisado. Já o pior resultado foi encontrado no

ensaio 8, com hidrólise de 65,37% do bagaço pré-tratado nessas condições.

Em todos os ensaios foram analisadas a massa de ART e glicose liberada em

função do tempo de hidrólise. As Figuras 4.37 a 4.45 mostram estes perfis de hidrólise para



todos os ensaios. A metodologia experimental para a quantificação dos açúcares liberados

está descrita na seção 3.2.7.3.

Ensaio 1*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (h)

ma

ss

a d

e A

RT

e G

lic

os

e

(g/g

bio

ma

ss

a b

ruta

se

ca

)

ART não peneirado


Figura 4.37: Perfil de hidrólise do ensaio 1*.

Ensaio 2*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca)

ART não peneirado



Ensaio 3*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta

seca

)

ART não peneirado



Ensaio 4*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

ma

ss

a d

e A

RT

e G

lic

ose

(g/g

bio

mas

sa

bru

ta s

eca




Ensaio 5*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta




Ensaio 6*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta






Ensaio 7*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

mass

a d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

ma

ssa b

ruta

seca




Ensaio 8*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta




Ensaios 9*, 10* e 11*

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (h)

massa d

e A

RT

e G

lico

se

(g/g

bio

massa b

ruta

seca)

ART não peneirado - 9*



Glicose não peneirado - 9*



Figura 4.45: Perfil de hidrólise dos ensaios 9*, 10* e 11*.

Ao analisarmos as Figuras 4.37 a 4.45 observa-se que a diferença entre o perfil de

ART e glicose diminuiu se comparada com o processo de hidrólise anterior (Figuras 4.13 a

4.22), levando assim a acreditar que com o aumento da concentração de H2O2, houve uma

maior degradação da hemicelulose durante o pré-tratamento. Isto pode ser deduzido uma

vez que a concentração enzimática nestes novos ensaios foi a mesma utilizada nos ensaios

anteriores (3,47 FPU/g de biomassa seca pré-tratada, 1,01 CBU/g biomassa seca pré-

tratada) e como as enzimas são as responsáveis pela quebra das celobioses e

oligossacarídeos redutores ainda restantes no meio, essa diminuição provavelmente é

devida a diminuição das hemiceluloses no resíduo pré-tratado.



4.11.1.1. Determinação dos efeitos principais e de interação das variáveis

após planejamento fatorial 22 + configuração estrela

Após a análise dos perfis de hidrólise para cada ensaio do planejamento fatorial 22

+ configuração estrela, as massas de ART e glicose liberadas no meio reacional foram

utilizadas para a análise estatística. O ponto escolhido foi o de estabilização da reação, ou

seja, valor onde a massa dos açúcares permaneceu praticamente inalterada. O tempo de

estabilização da reação foi o mesmo para todos os ensaios, 36 h de hidrólise.

A Tabela 4.29 mostra a massa dos ART e glicose liberadas experimentalmente em

cada combinação de níveis sendo os ensaios 9*, 10* e 11* repetições no ponto central. As

massas de ART e glicose são expressas como g/g biomassa bruta seca (sem pré-

tratamento). São marcados em negrito os melhores resultados obtidos nos ensaios para cada

resposta considerada.


liberadas em cada um dos ensaios do planejamento fatorial 22 + configuração estrela.

Ensaios Temperatura

(°C) [H2O2] %

Massa

ART-N (g/g)

Massa

Glicose-N (g/g)

1* 53 5 0,3334 0,2414

2* 53 9 0,3606 0,2817

3* 67 5 0,3442 0,2759

4* 67 9 0,3255 0,2796

5* 50 7 0,4380 0,3622

6* 70 7 0,3700 0,2950

7* 60 4,17 0,3200 0,2058

8* 60 9,83 0,3249 0,2685

9* 60 7 0,3410 0,3112

10* 60 7 0,3800 0,3383

11* 60 7 0,3617 0,3244



Pode-se observar analisando a Tabela 4.29 que a massa de ART e glicose já se

aproximam bastante, levando a entender que houve maior retirada de hemicelulose e maior

a eficiência da hidrólise (diminuição de celobiose e oligossacarídeos redutores no meio)

aumentando a massa de glicose liberada.

A Figura 4.46 mostra o rendimento em glicose após hidrólise do bagaço não

peneirado em cada um dos ensaios do planejamento fatorial 22 + configuração estrela. Os

rendimento em glicose após a hidrólise foram calculados através da Equação 4.1.

0

20

40

60

80

100

1* 2* 3* 4* 5* 6* 7* 8* 9* 10* 11*

Ensaios

Re

nd

ime

nto

de

gli

co

se

(%

)

Figura 4.46: Rendimento de glicose após hidrólise enzimática para cada um dos ensaios do

planejamento fatorial 22 + configuração estrela.

Analisando a Figura 4.46 observa-se que o melhor rendimento em glicose após a

hidrólise dos bagaços pré-tratados, segundo o planejamento fatorial 22 + configuração

estrela, foi para o ensaio 5* (menor temperatura e concentração de H2O2 no ponto central),

no qual 0,8131 g glicose/g celulose foram liberadas, já o pior resultado se deu no ensaio 7*

(temperatura no ponto central e menor concentração), onde 0,4621 g glicose/g celulose

foram liberadas.



A análise dos efeitos principais e de interação das variáveis foi realizada utilizando

o erro puro e o software Statistica (Statsoft, v. 7.0).

4.11.1.1.1. Análise da massa de ART

A análise dos efeitos principais e de interação, quando a resposta é a massa

liberada de ART, pode ser vista na Tabela 4.30. A Figura 4.47 mostra o gráfico de Pareto

considerando 90% de confiança.


fatorial 22 + configuração estrela, utilizando o erro puro para a massa de ART liberada.

Efeito Desvio

padrão

Limite de

confiança -90%

Limite de

confiança +90% Coeficiente

Média 0,360762 0,011276 0,327835 0,393689 0,360762

(1) Temp. (°C) (L) -0,030044 0,013741 -0,070169 0,010080 -0,015022

Temp. (°C) (Q) 0,031754 0,016191 -0,015524 0,079031 0,015877

(2) [H2O2] (%) (L) 0,003872 0,013807 -0,036445 0,044190 0,001936

[H2O2] (%) (Q) -0,049287 0,016449 -0,097319 -0,001255 -0,024644

1*2 (L) -0,022963 0,019532 -0,079996 0,034071 -0,011481

Figura 4.47: Gráfico de Pareto para a massa de ART liberada após hidrólise enzimática das

amostras do planejamento fatorial 22 + configuração estrela.



Na análise da Figura 4.47 nota-se que o efeito linear e quadrático da temperatura, o

efeito linear da concentração de H2O2 e a interação linear dos efeitos da

temperatura/concentração de H2O2 (1*2) não se mostraram estatisticamente significativos a

90% de confiança. Logo, estes efeitos e interações foram eliminados do modelo e

considerados erros aleatórios experimentais.

Para analisar a resposta do experimento através da superfície de resposta, os

coeficientes não significativos foram eliminados e o modelo é descrito pelos coeficientes

mostrados na Tabela 4.31.

Tabela 4.31: Análise de regressão dos coeficientes das variáveis do planejamento fatorial

22 + configuração estrela, utilizando o erro puro, para a massa de ART liberada.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,375935 0,008204 0,351981 0,399890 0,375935

[H2O2] (%) (Q) -0,058930 0,015697 -0,104766 -0,013095 -0,029465


expostos na Tabela 4.31, pode-se estimar a Equação 4.6 que representa o modelo

quadrático. Vale ressaltar que o valor da [H2O2] (Q) apresenta na equação valor codificado.

2N ART 0,029465C-0,375935 seca) bruta biomassa gg( m = (4.6)



apresentada na Tabela 4.32. O teste F calculado para verificar a regressão do modelo

apresentou um valor de 7,786 que é maior que o valor tabelado (F(tab.)1,9 = 3,36). Conclui-

se que a equação do modelo quadrático é significativa a 90%, mas que o modelo não deve

ser usado para fins preditivos, já que o valor calculado é pouco maior que o tabelado. O



modelo estudado não apresenta evidências de falta de ajuste, pois o teste F calculado

apresentou um valor de 2,042 que é menor que o valor tabelado (F(tab.)7,2 = 9,35).


planejamento fatorial 22 + configuração estrela, massa de ART.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Regressão (R) 0,005377 1 0,005377 7,7861

Resíduos (r) 0,006215 9 0,0006910 2,0422


Erro puro (ep) 0,0007630 2 0,0003820

Total (T) 0,01159 10

% de variação


% máxima de







A superfície de resposta (a) e curva de nível (b), para os resultados significativos

usando o modelo da Equação 4.6, são mostrados na Figura 4.48.



Figura 4.48: Superfície de tendência (a) e curva de nível (b) descrita pela Equação 4.6.

Podemos observar na Figura 4.48 uma curva de maximização onde a concentração

de H2O2 é descrita por uma ampla faixa e encontra-se na região do ponto central. Nota-se

que, na faixa estudada, a temperatura não interfere no rendimento de ART.

4.11.1.1.2. Análise da massa de glicose

A análise dos efeitos principais e de interação pode ser vista na Tabela 4.33,

quando a resposta é a massa liberada de glicose durante o processo de hidrólise. A

Figura 4.49 mostra o gráfico de Pareto considerando 90% de confiança.

Figura 4.49: Gráfico de Pareto para a massa de glicose liberada após hidrólise enzimática.




fatorial 22 + configuração estrela, utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,324523 0,007834 0,301648 0,347398 0,324523

(1) Temp. (°C) (L) -0,015699 0,009546 -0,043574 0,012176 -0,007850

Temp. (°C) (Q) -0,002425 0,011248 -0,035269 0,030419 -0,001212

(2) [H2O2] (%) (L) 0,033127 0,009592 0,005118 0,061136 0,016564

[H2O2] (%) (Q) -0,093944 0,011428 -0,127313 -0,060576 -0,046972

1*2 (L) -0,018304 0,013569 -0,057926 0,021318 -0,009152

Na análise da Figura 4.49 nota-se que o efeito linear e quadrático da temperatura e

a interação linear dos efeitos da temperatura/concentração de H2O2 (1*2) não se mostraram

estatisticamente significativos a 90% de confiança.

Para analisar a resposta do experimento através da superfície de resposta, os

coeficientes não significativos foram eliminados e o modelo é descrito pelos coeficientes

mostrados na Tabela 4.34.

Tabela 4.34: Análise de regressão dos coeficientes das variáveis do planejamento fatorial

22 + configuração estrela, utilizando o erro puro para a massa de glicose liberada.

Efeito Desvio

padrão

Intervalo de

confiança -90%

Intervalo de

confiança +90%

Coeficiente

do modelo

Média 0,323364* 0,005699 0,306722 0,340006 0,323364

[H2O2] (%) (L) 0,033127* 0,009592 0,005118 0,061136 0,016564

[H2O2] (%) (Q) -0,093208* 0,010905 -0,125051 -0,061365 -0,046604


expostos na Tabela 4.34 pode-se estimar a Equação 4.7 que representa o modelo

quadrático.



2N glicose 0,046604C-0,016564C 0,323364 seca) bruta biomassa gg( m += (4.7)



planejamento fatorial 22 + configuração estrela – massa de glicose.


Quadrática

Graus de

Liberdade

Média

Quadrática Teste F

Regressão (R) 0,01560 2 0,007800 16,341

Resíduos (r) 0,003800 8 0,0005000 3,1352


Erro puro (ep) 0,0003680 2 0,0002000

Total (T) 0,01948 10

% de variação


% máxima de








apresentada na Tabela 4.35. O teste F calculado para verificar a regressão do modelo

apresentou um valor de 16,34 que é maior que o valor tabelado (F(tab.)2,8 = 3,11),

concluindo assim que a equação do modelo quadrático é significativa a 90%. O modelo

estudado não apresenta evidências de falta de ajuste, pois o teste F calculado apresentou um

valor de 3,135 que é menor que o valor tabelado (F(tab.)6,2 = 9,33).



A superfície de resposta (a) e a curva de nível (b) para os efeitos significativos na

análise da massa de glicose liberada após o processo de hidrólise, segundo o planejamento

fatorial 22 + configuração estrela, podem ser visualizadas na Figura 4.50.


Podemos observar ao analisarmos a Figura 4.50 uma curva nítida de maximização.

Observa-se que a faixa de temperatura estudada nessas condições de hidrólise não se

apresentou com um efeito significativo.

Como se pretende maximizar a massa de glicose liberada durante a hidrólise,

deve-se trabalhar no ponto ótimo de concentração de H2O2 (descrito pela Equação 4.7) e

pode-se trabalhar com a temperatura mais baixa da faixa estudada (50°C), já que este efeito

não se mostrou significativo.

Aplicando a derivada na Equação 4.7 temos:

0,046604C 2-0,016564m N glicose xdCd =

Como dCd N glicosem no ponto máximo é igual a zero temos:



0,1777C

0,093208C-0,0165640

=

=

Assim, o valor da concentração no ponto ótimo é de 0,1777 em unidades

codificadas. Decodificando, temos:

7,355%C

00,17777-C

0179

=

−=

−

−

Logo, a concentração ótima de H2O2 foi de 7,355%. Para verificar se realmente o

tempo e a temperatura não são fatores importantes no pré-tratamento do bagaço não

peneirado utilizando a concentração de H2O2 determinada, testes foram realizados com

variação do tempo de reação e da temperatura, mantendo as demais condições fixas.

4.11.2. Estudo do tempo de pré-tratamento

Para determinar se o tempo realmente não é um fator significativo no pré-

tratamento com H2O2 a 7,355% (ponto ótimo), testes foram realizados variando o tempo de

reação do pré-tratamento.

Realizaram-se 4 experimentos com tempos de reação de 1, 15, 19 e 24 h. A

metodologia experimental do pré-tratamento pode ser acompanhada na seção 3.2.7.1.

A Tabela 4.36 apresenta os valores das variáveis para cada ensaio do bagaço não

peneirado (N).



Tabela 4.36: Valores das variáveis em cada um dos ensaios mantendo a temperatura e a

concentração fixas no ponto ótimo.


1 N 1 50 7,355

2 N 15 50 7,355

3 N 19 50 7,355

4 N 24 50 7,355

A Figura 4.51 mostra a massa restante de bagaço após cada ensaio do pré-

tratamento, em relação as variáveis da Tabela 4.36.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1 2 3 4Ensaios

Massa d

o r

esíd

uo (g/4

g b

iom

assa b

ruta

seca)


tempo do pré-tratamento.

Ao analisarmos a Figura 4.51 podemos perceber que em todos os ensaios houve

uma perda de massa após o pré-tratamento de mais de 50%, sendo bem similares nos 4

ensaios. O ensaio 3 apresentou a maior perda de massa após o pré-tratamento, tendo



58,00% do bagaço solubilizado, e o ensaio 1 a menor perda, 54,83%. Isso leva a entender

que houve uma perda considerável de hemicelulose.


efetuou-se a hidrólise com as seguintes condições reacionais fixas: 1 g de biomassa pré-

tratada seca segundo cada combinação de níveis, volume reacional de 300 mL, 3,47 FPU/g



na seção 3.2.7.2.

A Figura 4.52 mostra a massa restante do hidrolisado em cada um dos ensaios

segundo o planejamento da Tabela 4.36.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

1 2 3 4

Ensaios

Massa d

e r

esíd

uo (g/g

bio

massa s

eca p

ré-t

rata

da)


de tempo do pré-tratamento.

Em relação à hidrólise (Figura 4.52), a massa restante após o processo apresentou-

se menor no ensaio no ensaio 1, onde ocorreu a maior hidrólise, 83,15% do bagaço sendo

hidrolisado. O pior resultado foi encontrado no ensaio 4, onde 73,83% do resíduo foi

hidrolisado. Observa-se que quanto menor o tempo de pré-tratamento, menor foi a massa



do resíduo restante após hidrólise, levando a entender que houve uma hidrólise mais

eficiente.

Analisaram-se, nos 4 ensaios, a massa de ART e glicose liberada em função do

tempo de hidrólise. A Figura 4.53 mostra estes perfis de hidrólise para cada um dos ensaios.

A metodologia experimental para a quantificação dos açúcares liberados no meio reacional

está descrita na seção 3.2.7.3.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80Tempo (h)

mas

sa d

e A

RT

e G

licos

e (g

/g b

iom

assa

bru

ta s

eca)

Massa ART - 1hMassa ART - 15 hMassa ART - 19 hMassa ART - 24 hMassa Glicose - 1h

Massa Glicose - 15 hMassa Glicose - 19 hMassa Glicose - 24 h

Figura 4.53: Perfil de hidrólise para cada um dos ensaios em relação a variação do tempo

de pré-tratamento.

Ao analisarmos a Figura 4.53 podemos perceber que no tempo reacional de 24 h,

tanto os resultados de glicose quanto de ART apresentaram uma ligeira queda se

comparado com os demais. Já o tempo de 1 h mostrou resultados ligeiramente maiores que

os demais. As diferenças entre os perfis nos 4 ensaios, no entanto, são muito pequenas. Por

esta figura, podemos perceber que o tempo reacional do pré-tratamento realmente não é um

fator significativo para a liberação de ART e glicose.

Uma das explicações possíveis da não significância do tempo reacional é que,

durante o pré-tratamento com H2O2 alcalino, há uma grande liberação de O2 devido à



decomposição do peróxido (Reação 2.5). Enquanto a liberação de O2 está ocorrendo, é sinal

que ainda existe H2O2 sendo decomposto na reação. A liberação de O2 acontece por

aproximadamente 45 min, sendo que após este intervalo, o tempo reacional não apresenta

mais tanta importância.

Assim, o tempo reacional de 1 h foi escolhido para realização do pré-tratamento

ótimo.

4.11.3. Estudo da temperatura de pré-tratamento

Para determinar se a temperatura realmente não é um fator significativo no pré-

tratamento com H2O2 a 7,355% (v/v), testes foram realizados onde a temperatura de reação

foi variada.

Realizaram-se 3 experimentos com temperaturas de 25, 60 e 70°C. A metodologia

experimental do pré-tratamento pode ser acompanhada na seção 3.2.7.1.

A Tabela 4.37 mostra os valores das variáveis para cada ensaio do bagaço não

peneirado (N).

Tabela 4.37: Valores das variáveis em cada um dos ensaios mantendo o tempo e a

concentração fixas no ponto ótimo.


1 N 1 25 7,355

2 N 1 60 7,355

3 N 1 70 7,355

A Figura 4.54 mostra a massa restante de bagaço após cada ensaio do pré-

tratamento, em relação as variáveis da Tabela 4.37.



0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1 2 3

Ensaios

Massa d

o resíd

uo (g/4

g b

iom

assa b

ruta

seca)


temperatura do pré-tratamento.

Ao analisarmos a Figura 4.54 podemos observar que os ensaios 1 e 3 apresentaram

praticamente a mesma perda de massa, 58,50% e 58,15%, respectivamente. Para o ensaio 2

a perda foi um pouco menor, tendo 55,90% do bagaço sendo solubilizado.

Para a liberação dos ART e glicose, efetuou-se a hidrólise com as seguintes

condições reacionais fixas: 1 g de biomassa pré-tratada segundo cada combinação de

níveis, volume reacional de 300 mL, 3,47 FPU de celulase/g biomassa seca pré-tratada,

1,01 CBU de β-glicosidase/g biomassa seca pré-tratada, pH 4,8, temperatura de 50°C e

100 rpm. A metodologia experimental para realização da hidrólise esta descrita na seção

3.2.7.2.

A Figura 4.55 mostra a massa restante do hidrolisado em cada um dos ensaios

segundo o planejamento da Tabela 4.37



0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

1 2 3

Ensaios

Massa d

e r

esíd

uo (g/g

bio

massa s

eca p

ré-t

rata

da)


da temperatura do pré-tratamento.

Analisando a Figura 4.55 nota-se que a massa restante após o processo apresentou-

se menor nos ensaios 1 e 3, tendo 88,00% e 87,75% da massa hidrolisada, respectivamente,

enquanto no ensaio 2, a massa hidrolisada foi de 73,20%.

A Figura 4.56 mostra as massas de ART e glicose liberadas em função do tempo

de hidrólise. A metodologia experimental para a quantificação dos açúcares liberados no

meio reacional está descrita na seção 3.2.7.3.

Ao analisarmos a Figura 4.56 podemos observar que para os ensaios 1 e 3

(temperatura de 25 e 70°C) a massa de ART e glicose liberadas durante toda a hidrólise foi

praticamente a mesma. Já no ensaio 2 (temperatura de 60°C) observa-se uma ligeira queda

na liberação dos açúcares.



0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo reacional (h)

mas

sa

de

AR

T e

Glic

ose

(g

/g b

iom

ass

a b

ruta

se

ca

)

Massa ART - 25°C

Massa ART - 60°C

Massa ART - 70°C

Massa Glicose - 25°C



Figura 4.56: Perfil de hidrólise para cada um dos ensaios em relação a variação da

temperatura de pré-tratamento.

Assim, tanto para temperaturas altas (70°C) como para temperaturas baixas (25°C)

conseguimos ótimos resultados na hidrólise do bagaço pré-tratado. Logo, a temperatura

reacional de 25°C foi escolhida para realização do pré-tratamento ótimo.

4.12. Análise do pré-tratamento otimizado

Realizou-se um ensaio das condições ótimas do pré-tratamento do bagaço não

peneirado com H2O2 alcalino. O tempo de reação de 1 h, temperatura de 25°C e

concentração de peróxido de 7,355% foram selecionados como ponto ótimo.

Para a liberação dos ART e glicose, efetuou-se a hidrólise com as mesmas

condições reacionais já descritas anteriormente. A metodologia experimental para

realização da hidrólise esta descrita na seção 3.2.7.2.

A Figura 4.57 mostra o perfil de hidrólise para o ponto ótimo do pré-tratamento do

bagaço não peneirado. A metodologia experimental para a quantificação dos açúcares está

descrita na seção 3.2.7.3.



0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

massa d

e A

RT e

Glico

se (g

/g b

iom

assa b

ruta

seca)

Massa ART - ponto ótimo

Massa Glicose - ponto ótimo

Figura 4.57: Perfil de hidrólise nas condições ótimas de pré-tratamento.

Nota-se ao analisarmos a Figura 4.57 que a reação de liberação dos açúcares torna-

se praticamente estabilizada após 48 h de hidrólise, com resultados de 0,4899 g/g biomassa

bruta seca de ART e 0,3740 g/g biomassa bruta seca de glicose liberadas nas condições

ótimas. O rendimento de glicose no ponto ótimo foi de 84,07 %.

A Figura 4.58 mostra a aparência e as massas do bagaço não peneirado antes do

pré-tratamento, após o pré-tratamento e após a hidrólise nas condições ótimas.



Figura 4.58: Amostras do bagaço antes do pré-tratamento, após o pré-tratamento e após

hidrólise nas condições ótimas.

4.13. Análise da composição química do bagaço no processo otimizado

Após o pré-tratamento do bagaço nas condições ótimas foi realizada a análise da

composição química conforme metodologia descrita na seção 3.1.3.3. A Tabela 4.38 mostra

a composição química do bagaço não peneirado antes e após o processo de pré-tratamento

nas condições ótimas.

Tabela 4.38: Composição química do bagaço não peneirado antes e após pré-tratamento

nas condições ótimas.

Composição do bagaço

não peneirado

Antes do pré-

tratamento (%)

Após pré-

tratamento (%)

Extrativos 0,6 ± 0,3 -

Cinza 3,8 ± 0,1 -

Lignina total 25,8 ± 0,2 7,0 ± 0,7

Glucana 39,6 ± 1,6 77,6 ± 2,5

Xilana 19,7 ± 0,6 10,6 ± 0,5

Grupos acetila 2,5 ± 0,2 1,5 ± 0,4



Observa-se ao analisar a Tabela 4.38 que a porcentagem de glucana do bagaço

após pré-tratamento praticamente dobrou, já a xilana e grupos acetila praticamente

reduziram pela metade.



CAPÍTULO 5

CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA PRÓXIMOS TRABALHOS

Neste trabalho o desempenho do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio

alcalino para melhorar a susceptibilidade do bagaço de cana-de-açúcar à hidrólise

enzimática foi avaliado. Um planejamento fatorial 23, considerando nível de confiança de

90%, foi realizado para avaliar a influência do tempo de reação (h), temperatura (°C) e

concentração de H2O2 (%) no desempenho da hidrólise, que foi medido pela da liberação de

glicose e açúcares redutores totais (ART).

A influência de peneirar o bagaço antes do pré-tratamento no desempenho da

hidrólise foi avaliada. Testes foram realizados usando o bagaço como vem das usinas e

bagaço peneirado na faixa de -12+60 mesh (partículas entre 0.248 e 1.397 mm). Partículas

menores foram desprezadas por conterem principalmente areia. Os testes realizados

mostraram que o desempenho da hidrólise de bagaço pré-tratado com peróxido alcalino é

melhor para o bagaço não peneirado, quando o açúcar de interesse é a glicose. O uso do

bagaço não peneirado traz uma série de vantagens, como o aproveitamento integral da

matéria-prima e a redução de uma operação unitária no processo de hidrólise, o que o

simplifica e resulta em redução de custos.

Planejamentos fatoriais usando os dois tipos de bagaço mostraram que o tempo de

pré-tratamento não foi significativo a 90% de confiança. As superfícies de resposta obtidas

nestes planejamentos apresentaram pontos de máximo nas extremidades, o que levou à

realização de novos ensaios com o objetivo de encontrar o ponto ótimo. Nesta etapa,

somente o bagaço não peneirado foi usado, já que sua utilização, além de apresentar as



vantagens já descritas, levou aos melhores resultados em termos de massa de glicose

liberada após hidrólise (0,3093g/g biomassa bruta seca).

Na segunda etapa, um planejamento fatorial 22 + configuração estrela foi utilizado,

tendo como fatores a temperatura e a concentração de H2O2. O tempo de pré-tratamento foi

eliminado, já que não se mostrou significativo na etapa anterior, e permaneceu fixo no

ponto mínimo (6 h). Os resultados deste novo planejamento mostraram que, na nova faixa

estudada, a temperatura também não é significativa no nível de 90% de confiança. Um

modelo estatístico significativo foi proposto e possibilitou a determinação do valor da

concentração de H2O2 que leva à máxima liberação de glicose após hidrólise, que é de

7,355%. A conclusão nesta etapa foi que o pré-tratamento deveria ser realizado a 50ºC

(menor temperatura no planejamento), por 6 h e com concentração de peróxido de 7,355%.

Como o tempo de pré-tratamento e a temperatura não se mostraram significativos

na faixa estudada, novos estudos foram realizados para determinar se o pré-tratamento

poderia ser realizado em temperatura ambiente e qual o menor tempo necessário, além de

confirmar que estes fatores não tinham influência na liberação de açúcares após hidrólise

nestas novas faixas. Como resultado verificou-se que a máxima liberação de glicose pode

ser obtida a 25ºC, com concentração de H2O2 de 7,355% por 1 h em pH 11,5. Os resultados

de massa de ART e glicose após 48 h de hidrólise a 50ºC e pH 4,8 foram 0,4899 g/g

biomassa bruta seca e 0,3740 g/g biomassa bruta seca, respectivamente. A massa de glicose

corresponde a um rendimento de 84,07 %.

5.1. Sugestões para trabalhos futuros

Em trabalhos futuros, sugere-se o desenvolvimento e aprofundamento do

aprendizado desenvolvido com esta Dissertação de Mestrado, como explicitado a seguir:

• Realizar experimentos com o bagaço antes da secagem para visualizar se este

procedimento não altera a eficiência da hidrólise, além da quantificação de todos os

açúcares livres existentes no bagaço antes da execução da hidrólise,

• Realizar estudos mais aprofundados sobre a estrutura do bagaço como microscopia

eletrônica de varredura (MEV) e distribuição do tamanho da partícula (Mastersizer),



• Estudos para separação e análise da parte fibrosa e medular do bagaço de cana-de-

açúcar,

• Realizar estudos comparativos do pré-tratamento com H2O2 alcalino e outros tipos

de pré-tratamentos químicos que trabalhem em condições brandas de temperatura e

pressão, além da ausência de ácido, como é o caso do hidróxido de cálcio (reagente

químico já presente nas usinas),

• Realizar leituras do meio hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE) para quantificação dos açúcares e para obtermos uma visão mais específica

de quais açúcares compõem o ART,

• Experimentos para determinação da carga enzimática mínima de celulase e β-

glicosidase capazes de levar a um alto rendimento do processo e estudo da

necessidade ou não do aumento de β-glicosidase no meio reacional,

• Determinação da cinética de hidrólise enzimática,

• Fermentação dos processos otimizados para quantificação do rendimento em etanol.



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