1. INTRODUÇÃO - USP · minimizar os efeitos deletérios do diabetes em seus principais órgãos...

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1. INTRODUÇÃO

O Diabetes Mellitus (DM) é uma patologia que vem preocupando cada vez mais

os órgãos de saúde mundial em função do contínuo aumento da prevalência e incidência

nas últimas décadas. Atualmente, existem 285 milhões de pessoas com DM no mundo,

e a expectativa é que em 2030 sejam 438 milhões (INTERNATIONAL DIABETES

FEDERATION, 2010). Nos Estados Unidos, 18 milhões de americanos com idade

acima de 20 anos tinham DM em 2002, enquanto que em 2007, os números subiram

para 23,5 milhões (CENTER for DISEASE CONTROL and PREVENTION, 2007). No

Brasil não existem estudos comparativos recentes, entretanto, a Sociedade Brasileira de

Diabetes (SBD) estima uma população aproximada de 11 milhões de pessoas portadoras

de DM, representando 5,9% da população total (SBD, 2010). De acordo com a

American Diabetes Association (ADA, 2008), o custo anual com os cuidados

relacionados ao DM é em torno de 116 bilhões de dólares.

O DM é um distúrbio que consiste na resposta secretória deficiente ou ação

defeituosa de insulina, manifestando-se pela utilização inadequada de glicose pelos

tecidos com consequente hiperglicemia (OKOSHI, GUIMARAES, DI MUZIO,

FERNANDES & OKOSHI, 2007). O quadro crônico de hiperglicemia pode causar

complicações que envolvem doenças cardiovasculares, incluindo o desenvolvimento de

hipertensão arterial sistêmica (PETI-PETERDI, KANG & TOMA, 2008) e de

cardiomiopatia diabética (RUBERG, 2007), contribuindo significativamente para o

aumento da morbidade e mortalidade relacionada à doença (KIVELA,

SILVENNOINEN, TOUVRA, LEHTI, KAINULAINEN & VIHKO, 2 006).

No DM classificado como tipo 1, os prejuízos metabólicos são decorrentes da

falência das células ß das ilhotas endócrinas pancreáticas (POORNIMA, PARIKH &

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SHANNON, 2006), onde além da hiperglicemia, observa-se também aumento do

metabolismo energético basal e maior catabolismo protéico (HEBERT & NAIR, 2009),

poliúria, polidpsia e perda de peso corporal, apesar do aumento do apetite (HEIMANN,

2003). Alterações ocorrem também no fenótipo do músculo esquelético, tais como

redução da capacidade oxidativa e de capilarização (KRAUSE, RIDDELL, GORDON,

IMAM, CAFARELLI & HAWKE, 2009), atrofia muscular, diminuição da quantidade

de fibras musculares tipo 1 e intolerância aos exercícios físicos (ZOLL, MONASSIER,

GARNIER, N'GUESSAN, METTAUER, VEKSLER, PIQUARD, VENTURA-

CLAPIER & GENY, 2006), caracterizando, assim, o quadro de miopatia diabética

(AUGHSTEEN, KHAIR & SULEIMAN, 2006; KRAUSE et al., 2009). Observa-se

também elevados níveis de ácidos graxos livres e triglicerídeos oriundos da maior

atividade lipolítica do tecido adiposo (AN & RODRIGUES, 2006), o que coincide com

a redução considerável do tecido adiposo (GHORBANI, VAREDI, HADJZADEH &

OMRANI, 2010), perda de peso corporal (BLAAK, 2003) e prejuízo no metabolismo de

glicose (TAKADA, MACHADO, PERES, BRITO, BORGES-SILVA, COSTA,

FONSECA-ALANIZ, ANDREOTTI & LIMA, 2007).

Já no DM classificado como tipo 2, a hiperglicemia está diretamente relacionada

com prejuízos na ação da insulina. Distúrbios no metabolismo de glicose e de lipídios

são observados frequentemente e, no músculo-esquelético observa-se menor síntese de

glicogênio muscular e menor utilização da glicose como substrato energético (RABOL,

BOUSHEL, ALMDAL, HANSEN, PLOUG, HAUGAARD, PRATS, MADSBAD &

DELA, 2010; SCHRAUWEN-HINDERLING, KOOI, HESSELINK, JENESON,

BACKES, VAN ECHTELD, VAN ENGELSHOVEN, MENSINK & SCHRAUWEN,

2007), acúmulo de ácido graxo decorrente da menor taxa de oxidação associada à

disfunção mitocondrial, o que resulta em menor capacidade da musculatura esquelética

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em produzir energia em indivíduos diabéticos (ZELEZNIAK, PERS, SOARES, PATTI

& PATIL, 2010).

Os mecanismos envolvidos na progressão do diabetes que diferenciam um

indivíduo do outro até seu estágio final tornaram-se alvos de estudos para o tratamento

dessa patologia. Fatores humorais parecem interferir diretamente nas complicações

metabólicas induzidas pelo diabetes, e um exemplo que nos últimos anos vem sendo

bastante investigado é o peptídio angiotensina II (Ang II), produto final do sistema

renina angiotensina (SRA) (RIBEIRO-OLIVEIRA, NOGUEIRA, PEREIRA, BOAS,

DOS SANTOS & SIMOES E SILVA, 2008). Estudos na literatura demonstraram a

influência negativa da Ang II na progressão do diabetes até o seu desfecho final

(PERKINS, AIELLO & KROLEWSKI, 2009; SAIKI, OHIRA, ENDO, KOIDE,

OYAMA, MURANO, WATANABE, MIYASHITA & SHIRAI, 2009).

TIKELLIS; COOPER & THOMAS (2006), relataram que tanto no DM1 quanto

no DM2 pode-se observar ativação do SRA associada ao aumento do estresse oxidativo,

inflamação e aumento dos níveis de ácidos graxos livres, contribuindo diretamente para

a disfunção das células β pancreáticas. Esses dados são reforçados em estudos com

modelos experimentais de diabetes, nos quais o bloqueio do SRA via inibidor da ECA

ou bloqueador do receptor AT1 resulta em melhora na estrutura e função das ilhotas, e

na redução das complicações associadas ao diabetes (AROZAL, WATANABE,

VEERAVEEDU, MA, THANDAVARAYAN, SUZUKI, TACHIKAWA, K ODAMA &

AIZAWA, 2009; LEUNG, 2007; OLTMAN, DAVIDSON, COPPEY,

KLEINSCHMIDT, DAKE & YOREK, 2010). De fato, o uso de inibidores da ECA

(CLERK, VINCENT, BARRETT, LANKFORD & LINDNER, 2007; PERKINS,

AIELLO & KROLEWSKI, 2009) e bloqueadores do receptor AT1 (BILOUS, 2008;

DALLA VESTRA, SIMIONI & MASIERO, 2009; MAUER, ZINMAN, GARDINER,

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SUISSA, SINAIKO, STRAND, DRUMMOND, DONNELLY, GOODYER, GUBLER

& KLEIN, 2009) tem sido fortemente recomendados como estratégias terapêuticas para

minimizar os efeitos deletérios do diabetes em seus principais órgãos alvo, tais como

vasos, olhos, rins e coração.

O treinamento físico tem sido indicado para o controle do diabetes por promover

benefícios na captação de glicose, melhora da sensibilidade à ação da insulina no

músculo esquelético e no tecido adiposo (KIVELA et al., 2006). Melhoras significantes

nos níveis de insulina foram observadas em ratos diabéticos por estreptozotocina

treinados durante dez semanas (DE ANGELIS, OLIVEIRA, DALL'AGO, PEIXOTO,

GADONSKI, LACCHINI, FERNANDES & IRIGOYEN, 2000). Aumento na

expressão e atividade de enzimas oxidativas (EVANGELISTA & KRIEGER, 2006;

LEICK, HELLSTEN, FENTZ, LYNGBY, WOJTASZEWSKI, HIDALGO &

PILEGAARD, 2009), aumento de proteínas transportadoras de triglicerídeos e ácidos

graxos no músculo esquelético (LIMA-SILVA, ADAMI, NAKAMURA, DE

OLIVEIRA & GEVAERD, 2006), biogênese mitocondrial (HOOD, 2009; LJUBICIC,

JOSEPH, SALEEM, UGUCCIONI, COLLU-MARCHESE, LAI, NGUYEN & HOOD,

2009), e aumento no predomínio de fibras musculares oxidativas tipo 1

(DASTMALCHI, ALEXANDERSON, LOELL, STAHLBERG, BORG, LUNDBERG

& ESBJORNSSON, 2007) são alguns dos benefícios promovidos pelo treinamento

físico que podem auxiliar no melhor controle do diabetes.

Esses dados ressaltam a potencialidade do treinamento físico aeróbio para

promover adaptações no metabolismo energético que poderiam contribuir efetivamente

para o tratamento do diabetes. No entanto, é interessante observar que a maioria dos

estudos que investigou o potencial terapêutico do treinamento físico para o diabetes,

introduziu o treinamento físico na fase inicial da doença. Mas, ainda não está muito

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claro na literatura se os benefícios promovidos pelo treinamento físico também podem

ser obtidos quando este for iniciado somente após um período crônico de hiperglicemia.

Embora a literatura demonstre a associação do genótipo da ECA com o pior

prognóstico do diabetes e ressalte os benefícios do treinamento físico para o tratamento

do diabetes, até o presente momento pouco se sabe sobre os efeitos do treinamento

físico sobre o metabolismo energético de animais diabéticos induzidos

experimentalmente por STZ com diferentes níveis de expressão do gene da ECA. Sendo

assim, considerando a importância dos ajustes metabólicos associados ao diabetes, o

papel da Ang II na progressão da patologia e a aplicabilidade do treinamento físico

como importante tratamento não farmacológico, o presente estudo testou a hipótese de

que a expressão de ECA aumentada induz maior prejuízo metabólico no diabetes

experimental e, que o treinamento físico é capaz de atenuar essa resposta.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre as alterações do

metabolismo energético induzidas pelo diabetes em camundongos com diferentes

dosagens de ECA (1 cópia vs. 3 cópias).

2.2 Objetivos Específicos

Estudar em camundongos diabéticos com 1 e 3 cópias do gene da ECA,

sedentários e treinados:

- a evolução do peso corporal;

- a ingestão de ração e a taxa metabólica de repouso;

- a capacidade de realização de exercício físico;

- a tolerância à glicose;

- o perfil hormonal através da dosagem de leptina e insulina;

- a atividade lipolítica do tecido adiposo;

- a função lipogênica através da dosagem da enzima ácido graxo sintase no

tecido adiposo e no tecido hepático;

- a atividade máxima da enzima citrato sintase no músculo esquelético, a

tipagem de fibras musculares e capilarização.

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3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Diabetes

O DM1 é causado pela destruição das células β pancreáticas consequente de um

processo auto-imune, e geralmente provoca deficiência absoluta de insulina

(WELTMAN, SALIBA, BARRETT & WELTMAN, 2009). Alguns indivíduos com

DM1, principalmente adultos, conseguem manter o funcionamento de algumas células β

por alguns anos, entretanto, a maioria acaba se tornando dependente de insulina exógena

(ADA, 2008b). Diversos distúrbios metabólicos são evidentes no DM1, tais como

hiperglicemia, excreção de glicose na urina (glicosúria), aumento na produção de urina

(poliúria), aumento da sede (polidipsia), aumento do apetite (polifagia) e redução no

peso corporal (TAKADA, FONSECA-ALANIZ, DE CAMPOS, ANDREOTTI,

CAMPANA, OKAMOTO, BORGES-SILVA, MACHADO & LIMA, 2008).

No DM1, a hiperglicemia crônica provoca alterações importantes em toda a rede

metabólica. A indisponibilidade de glicose em quantidade suficiente para ser utilizada

como substrato energético influencia os sítios metabólicos envolvidos no fornecimento

de energia, especialmente aqueles relacionados com o metabolismo de lipídios e

proteínas (HEBERT & NAIR, 2009; VIRTUE & VIDAL-PUIG, 2010). De fato, o

aumento do catabolismo lipídico e protéico observado em portadores de DM1 contribui

ainda mais para o prejuízo metabólico e, consequentemente, para o pior prognóstico da

patologia (VAN HERPEN & SCHRAUWEN-HINDERLING, 2008).

Segundo PIGHIN, KARABATAS, PASTORALE, DASCAL, CARBONE,

CHICCO, LOMBARDO & BASABE (2005), a redução significativa da massa adiposa

e do peso corporal estão diretamente relacionados com o aumento da atividade lipolítica

do tecido adiposo. Como consequência, há uma grande disponibilidade de ácido graxo

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para ser utilizado como fonte de energia, no entanto, o ácido graxo, na forma de Acetil-

CoA no fígado, não consegue se unir ao oxalacetato e formar citrato para entrar no ciclo

de Krebs, uma vez que o oxalacetato é utilizado na gliconeogênese. Então a Acetil-CoA

acumulada na célula sofre ação das tiolases, formando corpos cetônicos que serão

liberados na corrente sanguínea, resultando em um quadro de acidose metabólica

(BARONE, RODACKI, CENCI, ZAJDENVERG, MILECH & OLIVEIRA, 2007).

Paralelo ao aumento da lipólise, a ausência ou decréscimo na quantidade de

insulina circulante associada à elevação dos hormônios contra-regulatórios, incluindo

glucagon, catecolaminas, cortisol e hormônio do crescimento (GH), resulta em aumento

da produção hepática e renal de glicose, diminuição da utilização periférica da mesma,

hiperglicemia e hiperosmolaridade. A associação entre hiperglicemia e acidose causa

diurese osmótica, com consequente desidratação e desequilíbrio eletrolítico. O estágio

mais avançado é de extrema desidratação celular, contração do volume plasmático,

hipoperfusão cerebral e alteração progressiva do estado de consciência (AXELROD &

LEVINE, 1982).

Apesar de os tecidos metabolicamente ativos aumentarem a oxidação de ácido

graxo, ainda observa-se predomínio da produção, resultando em acúmulo de ácido

graxo e outros produtos tóxicos do seu metabolismo denominado por lipotoxicidade

(AN & RODRIGUES, 2006). No coração, essas alterações precedem a cardiomiopatia

diabética, independentemente de hipertensão ou doença coronariana prévia (RUBERG,

2007).

No músculo esquelético, o aumento do conteúdo de triglicerídeos provoca

grande prejuízo na utilização de substratos energéticos (STUMP, SHORT, BIGELOW,

SCHIMKE & NAIR, 2003) em decorrência da diminuição da atividade do complexo

piruvato desidrogenase, fundamental para o controle da oxidação de glicose, e aumento

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da piruvato desidrogenase quinase, que por fosforilação, inativa a enzima piruvato

desidrogenase provocando diminuição da oxidação de piruvato na mitocôndria e

aumento da conversão de piruvato em lactato no citosol (PIGHIN et al., 2005).

Ainda, alterações no fenótipo do músculo esquelético, tais como diminuição da

contratilidade (ANDERSEN, SCHMITZ & NIELSEN, 2005), redução da capacidade

oxidativa e capilarização (KRAUSE et al., 2009), atrofia muscular, redução de fibras

musculares tipo 1 e intolerância aos esforços físicos também são observados em

pacientes com DM1 (ZOLL et al., 2006), caracterizando o quadro de miopatia diabética

(AUGHSTEEN, KHAIR & SULEIMAN, 2006).

Entre os diversos problemas associados ao diabetes, as complicações

cardiovasculares têm aumentado significativamente as taxas de morbidade e

mortalidade (PERKINS, AIELLO & KROLEWSKI, 2009). De fato, cerca de 80% das

mortes associadas ao diabetes são devidas às complicações cardiovasculares (HAYAT,

PATEL, KHATTAR & MALIK, 2004) como obesidade, hipertensão arterial,

aterosclerose, nefropatia, isquemia coronariana, doença vascular periférica e acidente

vascular cerebral (ALVAREZ-AGUILAR, ENRIQUEZ-RAMIREZ, FIGUEROA-

NUNEZ, GOMEZ-GARCIA, RODRIGUEZ-AYALA, MORAN-MOGUEL, FARIAS-

RODRIGUEZ, MINO-LEON & LOPEZ-MEZA, 2007; BOUDINA & ABEL, 2010;

LAWN, 1992; RUBERG, 2007; VIRTUE & VIDAL-PUIG, 2010). Quanto mais longo

o tempo de diabetes, maiores são as complicações associadas à patologia e o

comprometimento dos pacientes, mesmo com intenso tratamento insulínico e controle

metabólico (NORDWALL, HYLLIENMARK & LUDVIGSSON, 2006). Desta forma,

reduzir o período de exposição à hiperglicemia pode significar reduzir os riscos de

complicações cardiovasculares no paciente diabético (KUSMINSKI, SHETTY, ORCI,

UNGER & SCHERER, 2009).

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Diferentes modelos experimentais têm sido utilizados na literatura para o estudo

do diabetes. Entre os vários agentes químicos citotóxicos para as células β do pâncreas,

a estreptozotocina (STZ), um derivado N-nitroso de glucosamina, tem sido

sistematicamente empregada para induzir diabetes nos animais (SAITO, KINOSHITA,

SATOH, SHINBORI, KONO, HANADA, UEMASU, SUZUKI, YAMADA &

SATOH, 2006). A ação da STZ é seletivamente direcionada para as células produtoras

de insulina devido à especial capacidade dessas células em reconhecer e metabolizar

glicose rapidamente, causando necrose de forma rápida e irreversível (JUNOD,

LAMBERT, ORCI, PICTET, GONET & RENOLD, 1967). Evidências de danos pela

STZ aparecem entre 30 minutos e 2 horas (SHARMA & THOMAS, 1999) e são

dependentes da dose utilizada. Doses 4 ou 5 vezes menores que a dose letal são

suficientes para gerar hipoinsulinemia, hiperglicemia, hiperfagia, polidipsia, perda de

peso corporal, aumento de lípides séricos e estresse oxidativo (OKOSHI et al., 2007;

PIGHIN et al., 2005).

Interessante observar que uma única injeção intraperitoneal ou intravenosa de

STZ induz diabetes experimental que pode ser mantido sem tratamento com insulina

por um ou dois anos (SHARMA & THOMAS, 1999). Isso porque, embora ocorra

depleção de células β pela STZ, a indução de deficiência de insulina é incompleta

quando doses abaixo de 65 mg/Kg são utilizadas, haja vista a ausência de cetose e a

persistência de pequena quantidade de insulina próxima de valores de jejum encontrada

no soro dos animais (JUNOD, LAMBERT, STAUFFACHER & RENOLD, 1969).

Dessa forma, apesar de o diabetes induzido pela STZ apresentar alterações metabólicas

que mimetizam o DM1, as particularidades observadas no modelo são suficientes para

que seja definido como diabetes experimental.

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3.2 Sistema renina angiotensina

Classicamente, o SRA é visto como um sistema hormonal que envolve uma

cascata proteolítica conectada a um sistema de transdução, onde a renina, uma enzima

proteolítica sintetizada e estocada nas células justaglomerulares da arteríola eferente

renal, cliva o angiotensinogênio, seu substrato que é produzido no fígado, na porção N-

terminal em um decapeptídeo, a angiotensina I (Ang I). Esta é convertida

subsequentemente em Ang II pela ECA primariamente na circulação pulmonar. A ECA,

uma dipeptidil-carboxipeptidade, por sua vez é predominantemente uma enzima ligada

à membrana que é responsável pela produção de Ang II a partir do precursor inativo

Ang I e também pela degradação da bradicinina em fragmentos inativos (JOHNSTON,

1990).

A interação da Ang II extracelular com receptores de membrana AT1 acoplados

à proteína G estimula primariamente o aumento de inositol fosfato e da atividade de

proteína quinase C (MORGAN & BAKER, 1991), bem como as vias de sinalização

Ras, Raf-1, MAP quinases, fosfolipase A, Jak-Stat e jun quinase (PELLIEUX,

SAUTHIER, AUBERT, BRUNNER & PEDRAZZINI, 2000; SUGDEN & CLERK,

1998; THORBURN, 1994). Apesar de a Ang II gerada através do SRA ter sido

considerada classicamente como um hormônio, outras evidências indicam a síntese de

todos os componentes do SRA, ou pelo menos parte deles em diversos órgãos e

sistemas, tais como coração, rim, pâncreas, tecido adiposo, tecido muscular, vasos,

sistema nervoso, sistema digestivo e sistema reprodutor (PAUL, POYAN MEHR &

KREUTZ, 2006).

O SRA tecidual exerce múltiplos efeitos fisiológicos em nível celular tais como

regulação do crescimento celular, diferenciação, proliferação e apoptose, geração de

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espécies reativas de oxigênio, inflamação, fibrose e secreção hormonal. No pâncreas, o

SRA influencia a regulação do fluxo sanguíneo local, secreção de enzimas digestivas,

biossíntese de pró-insulina, proliferação e diferenciação de células pancreáticas. Além

disso, pode mediar a inflamação induzida por estresse oxidativo, apoptose, fibrose e

necrose (LEUNG, 2007). Os efeitos negativos do SRA sobre o pâncreas estão

associados à disfunção das células β pancreáticas, e consequentemente, ao

desenvolvimento e pior prognóstico do DM (LEUNG, 2007). De fato, YUAN, LI, XU

& QI (2010) mostraram que o bloqueio farmacológico do SRA resultou em melhora na

função das células β pancreáticas em ratos diabéticos devido à redução do estresse

oxidativo, fibrose e apoptose.

O tecido adiposo é um importante órgão que sintetiza a Ang II independente dos

níveis circulantes, e a ação da Ang II no metabolismo das células adiposas tem sido

bastante estudada nos últimos anos. Evidências na literatura mostraram que a Ang II

pode estar envolvida na modulação da massa adiposa por influenciar a conversão de

pré-adipócito em adipócito (CASSIS, POLICE, YIANNIKOURIS & THATCHER,

2008), aumentando a síntese de lipídios e o crescimento dos adipócitos (KARLSSON,

LINDELL, OTTOSSON, SJOSTROM, CARLSSON & CARLSSON, 1998; ZORAD,

DOU, BENICKY, HUTANU, TYBITANCLOVA, ZHOU & SAAVEDRA, 2006).

Dados obtidos em nosso grupo sugeriram fortemente a participação da Ang II na

modulação da massa adiposa e do metabolismo do tecido adiposo ao confirmarem que

animais com aumento na expressão do gene da ECA (3 cópias) ganham mais massa

adiposa quando submetidos a uma dieta hiperlipídica comparados ao animais com

menor expressão de ECA (1 cópia) (EVANGELISTA, BERGAMO, FONSECA-

ALANIZ, NAKAMUTA & KRIEGER, 2008).

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A influência do SRA no controle do metabolismo e do peso corporal pode estar

ocorrendo também em nível central além do nível do tecido adiposo, no entanto, o efeito

da Ang II acontece de forma antagônica. Nesse sentido, a Ang II pode aumentar a

lipólise via estimulação da liberação de noradrenalina pelo sistema nervoso simpático,

contribuindo para a redução de peso corporal. De fato, CASSIS et. al., (2008),

observaram redução de peso corporal e da ingestão de alimentos induzidas por infusão

central crônica de Ang II.

No tecido muscular, a Ang II com seu efeito vasoconstritor é responsável pela

redução da perfusão sanguínea e aporte de nutrientes energéticos para o músculo

esquelético (ZOLL et al., 2006), redução da capilarização no diabetes (CLERK et al.,

2007), redução da eficiência da musculatura periférica no trabalho aeróbio (ZHANG,

YAN, ZHOU, HUANG, YANG, LI, LIN & ZHOU, 2008) e influência negativa sobre o

metabolismo glicêmico (MACKNIGHT, MISTRY, PASTORS, HOLMES &

RYNDERS, 2009).

O estudo da participação do SRA em mecanismos fisiopatológicos específicos

tornaram-se mais evidentes na literatura através da identificação do polimorfismo do

gene da ECA, que é definido pela presença ou ausência de uma sequência de 287 pares

de bases não codificantes inserida (I) ou deletada (D) do íntron 16 do gene da ECA, o

que confere níveis mais elevados de ECA sérica e tecidual em indivíduos homozigotos

DD (VAN BERLO & PINTO, 2003). Aumento nos níveis de ECA resulta em maior

formação de Ang II, e esta resposta está associada com aumento da suscetibilidade ao

infarto do miocárdio, aterosclerose, desenvolvimento de DM2 e maior mortalidade de

pacientes diabéticos, doenças coronárias, insuficiência cardíaca e hipertrofia cardíaca

(ALVAREZ-AGUILAR et al., 2007; BACKLUND, LAKKISTO, PALOJOKI,

GRONHOLM, SARASTE, FINCKENBERG, MERVAALA, TIKKANEN & LAINE,

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2007; BOZKURT, VERSCHUREN, VAN WIEREN-DE WIJER, KNOL, DE BOER,

GROBBEE, GEERLINGS, HEERDINK & KLUNGEL, 2008; MAUER et al., 2009;

OAK & CAI, 2007; PEDERSEN-BJERGAARD, DHAMRAIT, SETHI, FRANDSEN,

NORDESTGAARD, MONTGOMERY, PRAMMING, HOUGAARD &

THORSTEINSSON, 2008).

Experimentalmente, a criação de modelos transgênicos tem oferecido inúmeras

oportunidades para o estudo da participação de genes específicos no desenvolvimento e

evolução de doenças complexas no contexto do animal intacto. Nesse sentido,

camundongos modificados geneticamente com 1, 2, 3 e 4 cópias funcionais do gene da

ECA foram produzidos pelo Dr. John Krege no laboratório do Dr. Oliver Smithies

(University of North Carolina, Chapel Hill) através de recombinação homóloga de

células tronco embrionárias, que foram posteriormente introduzidas em zigotos. Pode-se

observar um aumento progressivo da atividade da ECA sérica e tecidual conforme

aumento do número de cópias do gene, ainda que os níveis de pressão arterial

permaneçam inalterados (KREGE, MOYER, LANGENBACH, PENG, ZHANG,

MAEDA, REDDICK & SMITHIES, 1997). Este modelo tem permitido reproduzir as

características observadas no polimorfismo da ECA presentes em humanos, onde os

níveis de ECA do genótipo II, ID e DD correlacionam-se com os níveis de ECA dos

animais com 1, 2 e 3 cópias, respectivamente.

3.3 Diabetes e Sistema Renina Angiotensina

A associação do SRA com o DM tem sido amplamente demonstrada na

literatura, especialmente em função do papel da Ang II para o desenvolvimento e

progressão do DM (TIKELLIS, COOPER & THOMAS, 2006). Ensaios clínicos

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confirmaram que a inibição do SRA resulta em proteção do músculo esquelético e

eficácia no transporte de glicose (FROSSARD, JOUKHADAR, STEFFEN, SCHMID,

EICHLER & MULLER, 2000), proteção estrutural e funcional as ilhotas pancreáticas

(YUAN et al., 2010), reduzindo significativamente a incidência de complicações

vasculares em pacientes diabéticos (OAK & CAI, 2007; PARVING & ROSSING,

2001). De fato, a utilização de inibidores da ECA (iECA) e/ou bloqueadores do receptor

AT1 da ECA têm sido benéfico para a redução da disfunção metabólica provocada pelo

DM (CLERK et al., 2007), restauração da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e da

enzima óxido nítrico sintetase (CARVALHO-PINTO, GARCIA, GOMEZ,

BALLESTEROS, ZABALLOS, FLORES, MELLADO, RODRIGUEZ-FRADE,

BALOMENOS & MARTINEZ) no endotélio (OAK & CAI, 2007), e

consequentemente, redução na disfunção endotelial.

A Ang II exerce ação potencializadora para o desenvolvimento de

microalbuminúria (MAUER et al., 2009), lesão tubular, glomerular, albuminúria

(NIELSEN, SUGAYA, TARNOW, LAJER, SCHJOEDT, ASTRUP, BABA,

PARVING & ROSSING, 2009) e proteinúria (COHEN & TOWNSEND, 2009). No

DM observa-se aumento da Ang II tecidual, e nos rins, isso está diretamente associado

ao desenvolvimento de nefropatia diabética (GIACCHETTI, SECHI, RILLI & CAREY,

2005). De fato, animais diabéticos quando tratados com bloqueadores do SRA

apresentaram redução de proteinúria, demonstrando que inibir a ação do SRA é

fundamental para a proteção e prevenção da nefropatia diabética (KAMAL,

YANAKIEVA-GEORGIEVA, PIAO, MORIOKA & OITE, 2010; ZOIA &

ARGYROPOULOS, 2010; ZOJA, CORNA, GAGLIARDINI, CONTI, ARNABOLDI,

BENIGNI & REMUZZI, 2010).

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Outros estudos na literatura envolvendo modelos experimentais dão suporte à

associação entre SRA e DM. YUAN et al., (2010) observaram que animais diabéticos

por STZ quando tratados com bloqueadores do SRA, apresentavam aumento na

expressão de mRNA da insulina, redução da apoptose de ilhotas e redução do estresse

oxidativo. AROZAL et. al., (2009) demonstraram nesse mesmo modelo experimental

que o bloqueio do SRA reduziu o conteúdo de fibrose cardíaca e renal, reduziu a

proteinúria e o estresse oxidativo. Em síntese, o conjunto de achados confirma que

reduzir a ação do SRA no DM é fundamental para a proteção contra o desenvolvimento

de complicações renais e cardiovasculares associadas à patologia.

3.4 Adaptações metabólicas ao treinamento físico

A prática regular de exercícios físicos tem mostrado diminuição no risco de

desenvolvimento de DM, obesidade, hipertensão, entre outras doenças de risco

cardiovascular (FALLUCCA & POZZILLI, 2009). Estudos do nosso laboratório

mostraram que o treinamento físico aeróbio tem efeito positivo na função cardíaca

(EVANGELISTA, BRUM & KRIEGER, 2003) e no metabolismo energético

(EVANGELISTA & KRIEGER, 2006).

O treinamento físico aeróbio tem trazido muitos benefícios para indivíduos

portadores de DM e tem sido amplamente recomendado como uma estratégia não

farmacológica para o tratamento do DM (APOR, 2009; WELTMAN et al., 2009).

ERIKSEN; DAHL-PETERSEN; HAUGAARD; DELA (2007) observaram melhora na

glicemia de jejum e na tolerância à glicose em indivíduos que treinaram 3 sessões de 10

minutos por dia, com intensidade moderada a alta durante 4 semanas. SOUZA et. al.,

(2009), mostraram que oito semanas de treinamento físico aeróbio foram capazes de

17

reduzir a taxa de mortalidade em ratas diabéticas induzidas por STZ. Sabendo que a

redução do período de exposição à hiperglicemia está diretamente relacionada com a

redução do risco de complicações cardiovasculares no paciente diabético (KUSMINSKI

et al., 2009), o treinamento físico assume um papel importante no tratamento do DM.

A sensibilidade à ação da insulina é aumentada após um período de treinamento

físico através da melhora na sinalização do receptor de insulina e translocação do

GLUT4 (NAKAI, MIYAZAKI, SATO, OSHIDA, NAGASAKI, TAN AKA,

NAKASHIMA & SHIMOMURA, 2002; SHERMAN, FRIEDMAN, GAO, REED,

ELTON & DOHM, 1993). Enquanto isso, o triglicerídeo plasmático, aumentado no

DM1, diminui após o treinamento físico (LEME, GOMES, DE MELLO & LUCIANO,

2008), possivelmente associado à atividade da lipase lipoprotéica (HAMILTON,

AREIQAT, HAMILTON & BEY, 2001; KRAUSS, 2002).

Classicamente, a melhora do perfil glicêmico associado ao treinamento físico

está diretamente relacionada com as mudanças na sensibilidade da via insulínica

(HOWLETT, SAKAMOTO, HIRSHMAN, ASCHENBACH, DOW, WHITE &

GOODYEAR, 2002). No entanto, MACKNIGHT et al., (2009) observaram que a

contração muscular realizada durante o treinamento físico é capaz de aumentar o

transporte de glicose no músculo esquelético por mecanismos independentes da insulina

moduladas pela proteína quinase ativada por AMP (AMPK) e pelo cálcio (JESSEN &

GOODYEAR, 2005).

Quando fosforilada, a AMPK ativa vias que aumentam a síntese de ATP e

inativa as vias que consomem ATP (TAYLOR, ELLINGSON, LAMB, CHESSER,

COMPTON & WINDER, 2006). Durante o treinamento físico, devido à necessidade de

síntese de ATP, a AMPK atua nas vias de captação de glicose e oxidação de ácidos

graxos (MUSI, HIRSHMAN, ARAD, XING, FUJII, POMERLEAU, AHMAD,

18

BERUL, SEIDMAN, TIAN & GOODYEAR, 2005; STEPHENS, CHEN, CANNY,

MICHELL, KEMP & MCCONELL, 2002). De fato, MUSI et al., (2001), demonstraram

a relação entre o aumento da atividade da AMPK e a redução da glicemia durante o

treinamento físico em indivíduos diabéticos.

Diversas pesquisas têm procurado investigar a importância do polimorfismo do

gene da ECA na resposta ao treinamento físico. Estudos mostraram que a capacidade

máxima de esforço foi significativamente maior em indivíduos com genótipo II

comparados aos que apresentavam genótipo ID ou DD (MONTGOMERY,

CLARKSON, BARNARD, BELL, BRYNES, DOLLERY, HAJNAL, HEMINGWAY,

MERCER, JARMAN, MARSHALL, PRASAD, RAYSON, SAEED, TALMUD,

THOMAS, JUBB, WORLD & HUMPHRIES, 1999; ZHANG, WANG, DAI, LIN &

ZHANG, 2008). WILLIAMS, ANDERSON, SELIG, CAREY, FEBBRAIO, HAYES,

TOIA, HARRAP & HARE (2010) observaram que indivíduos que apresentaram

genótipo II tiveram melhor VO2 pico que seus pares homozigotos DD antes de iniciar

um período de treinamento físico, entretanto, essa diferença não se modificou após o

período de treino. Um dos possíveis mecanismos que poderia explicar essa diferença foi

a maior quantidade de fibras musculares tipo 1 e menor quantidade de fibras musculares

tipo 2 observadas em indivíduos homozigotos II (ZHANG, TANAKA, SHONO,

MIURA, KIYONAGA, SHINDO & SAKU, 2003).

Em contrapartida, EVANGELISTA & KRIEGER (2006), não encontraram

diferença nos ajustes metabólicos promovidos pelo treinamento físico de natação em

animais com 1 e 3 cópias do gene da ECA, cujos níveis diferenciais de ECA mimetizam

o polimorfismo do gene no ser humano. Esses dados demonstram as limitações que os

estudos com polimorfismo podem oferecer, tais como seleção e quantidade da amostra,

heterogeneidade genética das populações estudadas, dificuldade de controle dos fatores

19

ambientais como, por exemplo, a dieta das populações estudadas. Assim, a associação

do SRA com as respostas ao treinamento físico, especialmente no DM, ainda precisa ser

mais investigada.

3.5 O modelo experimental

A dificuldade em definir a relação entre genótipo e fenótipo de maneira

controlada tem sido um dos principais fatores limitantes nos estudos sobre a interação

gene-meio ambiente para o desenvolvimento de doenças complexas. Isso se torna

particularmente importante quando se considera que o DM é um fenótipo complexo

determinado por influências genéticas e ambientais. Supõe-se nestas condições que, a

contribuição individual de um fator genético seja modesta, impondo restrições

experimentais importantes à sua demonstração.

A possibilidade de modificar precisamente o conteúdo genético de camundongos

vem oferecendo inúmeras oportunidades para sobrepor essas limitações e possibilitar o

entendimento da participação individual de um determinado fator genético sobre

processos complexos no contexto do animal intacto (XIAO, ZHANG, CHAKIR,

AVDONIN, ZHU, BOND, BALKE, LAKATTA & CHENG, 2003).

No presente estudo, utilizamos camundongos modificados geneticamente com 1

e 3 cópias funcionais do gene da ECA, o que nos possibilitou efetivamente testar a

nossa hipótese de trabalho, já que os níveis de ECA circulante e tecidual são

significativamente superiores no animal com 3 cópias comparado ao animal com 1

cópia (EVANGELISTA & KRIEGER, 2006). Além disso, esses animais foram

submetidos à injeção de STZ para o desenvolvimento de diabetes experimental, e

posteriormente, submetidos ao treinamento físico aeróbio.

20

É importante salientar que, a utilização preferencial de camundongos para

manipulações genéticas é decorrente da disponibilidade de células tronco embrionárias

pluripotentes para esta espécie e do custo relativamente baixo para criação e

manutenção (RAO & VERKMAN, 2000). No mais, o modelo transgênico da ECA tem

sido frequentemente utilizado em estudos experimentais que visam investigar a

interação gene-meio ambiente para determinação de fenótipos complexos

(EVANGELISTA & KRIEGER, 2006; HUANG, GALLOIS, BOUBY, BRUNEVAL,

HEUDES, BELAIR, KREGE, MENETON, MARRE, SMITHIES & ALHENC-

GELAS, 2001; MESSADI, VINCENT, GRIOL-CHARHBILI, MANDET, COLUCCI,

KREGE, BRUNEVAL, BOUBY, SMITHIES, ALHENC-GELAS & RICHER, 2010)

21

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostra

Foram utilizados camundongos machos C57BL/6 modificados geneticamente,

com 1 e 3 cópias do gene da ECA, apresentando idade entre 7 e 8 semanas, com peso

inicial variando entre 15 e 25 gramas, provenientes do Biotério Central da Faculdade de

Medicina da USP. Todos os animais foram submetidos ao diabetes, e posteriormente,

distribuídos em grupos de acordo com o número de cópias do gene da ECA, sendo que

parte dos animais de cada grupo foi mantido sedentário (S) e a outra parte foi submetida

ao protocolo de treinamento físico (T), conforme demonstrado na Tabela 1. Os animais

foram mantidos em caixas com água e comida administradas ad libitum, em ambiente

com temperatura controlada entre 22ºC e 24ºC e ciclo invertido claro-escuro (7am –

7pm).

TABELA 1: Separação dos grupos de animais submetidos ao protocolo experimental.

Grupos Sub-grupos Identificação (n)

Sedentário 1S 14

1 cópia

Treinado 1T 15

Sedentário 3S 10

3 cópias

Treinado 3T 11

22

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo

(protocolo n. 2008/38).

4.2 Modelo de camundongos geneticamente modificados

O modelo de animais geneticamente modificados foi desenvolvido pelo grupo

do Dr. Oliver Smithies através da técnica de recombinação gênica (KREGE et al., 1997;

KUNJATHOOR, WILSON & LEBOEUF, 1996). Esta técnica consiste em inserir por

recombinação uma sequência de DNA no lugar do gene a ser desativado, ou inserir uma

cópia extra de um gene ao “lado” do gene existente. Os nossos animais possuem

inserido o gene que confere resistência à neomicina entre o exon 14 e o íntron 13 da

ECA (animais “knockout” – gene da ECA modificado), ou inserida uma cópia extra do

gene da ECA (animais “knockin” – gene da ECA modificado) contendo pelo menos

3Kbs de seqüência a montante (5´) e a juzante (3´) das sequências codificadoras.

4.3 Planejamento dos cruzamentos dos camundongos com 1 a 4 cópias do

gene da ECA

A produção dos camundongos transgênicos é feita seguindo um padrão

específico de acasalamentos. Animais heterozigotos para a deleção (genótipo 1/0) e

duplicação (genótipo 1/2) são acasalados com os respectivos pares de tal sorte que em

cada geração nascem em média para o acasalamento deleção 25% de animais com os

genótipos homozigoto 1/1 e 0/0 e 50% de animais com o genótipo heterozigoto 1/0. Da

mesma forma, em cada geração nascem em média para o acasalamento duplicação 25%

de animais com genótipos homozigoto 1/1 e 2/2 e 50% de animais com o genótipo

23

heterozigoto 1/2. Este esquema de acasalamento permite que o ambiente entre os vários

grupos permaneça semelhante, pois os diferentes genótipos utilizados no estudo – 1 e 3

cópias do gene da ECA - são originados de apenas 2 acasalamentos.

4.4 Identificação dos animais

Após o nascimento, os animais foram identificados com um dispositivo

eletrônico introduzido subcutaneamente no dorso durante anestesia inalatória. Cada

dispositivo contém um código com letras e números, que pode ser identificado por

telemetria através de um leitor automático. O procedimento é simples, pois não

necessita sutura e em poucos minutos o animal estava totalmente recuperado.

4.5 Genotipagem

A genotipagem dos camundongos com 1 e 3 cópias do gene da ECA foi

realizada previamente ao início do protocolo. Após a identificação dos animais, biópsias

da orelha direita foram retiradas e o DNA genômico foi extraído a partir da digestão

com proteinase K e precipitação do DNA com isopropanol. A genotipagem foi realizada

através da técnica de PCR, determinando assim o número de cópias do gene da ECA.

No caso dos animais “knockout” foram utilizados três “primers”:

A (TAATTCCTTGGGAGGCAGCACT)

B (AGTGGAGGGTATTTGTCAGGGC)

C (TAAAGCGCATGCTCCAGACTGC).

Para os animais "knockin" foram utilizados dois "primers":

D11M+ (AAACAGAGATAAACCACGGGG)

24

D11M- (TGTGGAACTAACTCTCAGAAGGC)

Todos os experimentos foram realizados cegamente quanto ao genótipo dos

animais, de forma que a identificação dos grupos ocorreu somente após o término

completo das análises.

4.6 Indução do Diabetes Experimental

Na sétima semana de vida dos animais foi realizada a indução do diabetes

experimental através de injeção intraperitonial de estreptozotocina (STZ) (125 mg/kg de

peso corporal) (KUNJATHOOR, WILSON & LEBOEUF, 1996). Após sete dias da

administração de STZ, os animais foram mantidos em jejum por 6 horas e, após coleta

de sangue na cauda, a glicemia foi determinada utilizando-se fitas reativas para medida

de glicose (fitas reativas Advantage – Roche). Esse procedimento se faz necessário em

função do tempo de ação da STZ, pois apesar de causar destruição importante das

células β pacreáticas poucas horas após a injeção, a hiperglicemia resultante do

procedimento pode ser observada somente após alguns dias (JUNOD et al., 1969). O

critério de inclusão da amostra foi definido para a glicemia de jejum maior ou igual a

200mg/dl. Caso os níveis de glicose estivessem abaixo de 200mg/dl, uma dose adicional

de STZ com a mesma concentração de 125mg/kg de peso corporal seria administrada, e

novamente foram aguardados mais sete dias para a avaliação da glicemia de jejum

(KUNJATHOOR el al, 1996). De acordo com JUNOD et al. (1967), uma segunda dose

de STZ tem maior potencial para causar danos às células β pancreáticas devido ao

aumento da sensibilidade à ação da STZ provocado pela primeira dose.

25

4.7 Treinamento Físico

O início do treinamento físico aconteceu após 7 semanas de diabetes confirmado

pela verificação da glicemia de jejum acima de 200mg/dl. Buscamos com isso, avaliar o

efeito do treinamento físico iniciado em uma fase da patologia cuja hiperglicemia

estivesse cronicamente instalada. Além disso, utilizamos os dados prévios que

demonstraram aumento da mortalidade dos animais diabéticos com 3 cópias do gene da

ECA na 14ª semana após indução do diabetes por estreptozotocina para definir o curso

temporal das complicações associadas ao diabetes e seu desfecho final. Assim, sabendo

que o treinamento físico duraria 8 semanas, o início do protocolo de natação foi

programado para a 7ª semana após indução do diabetes, encerrando-se na 15ª semana de

diabetes (HEIMANN, 2003).

O treinamento físico aeróbio foi realizado com natação adaptado do estudo

realizado por EVANGELISTA et al. (2003). Após uma semana de adaptação com 10

minutos diários, iniciou-se o treinamento com duração de 20 minutos, aumentando

diariamente 10 minutos até atingir-se 90 minutos na segunda semana, uma vez ao dia,

cinco dias por semana, durante oito semanas. Os dias de descanso dos animais

ocorreram apenas às quartas-feiras e domingos.

Para minimizar a influência do efeito do estresse exercido pelo meio aquoso, os

grupos sedentários foram colocados no sistema de natação 2 vezes por semana durante 5

minutos.

4.8 Avaliação da capacidade de esforço físico

A capacidade de realização de esforço físico foi avaliada nos grupos estudados

através de um teste progressivo até a exaustão em esteira rolante (FERREIRA; ROLIM;

26

GRANÁ; BARTHOLOMEU & BRUM, 2004). O teste iniciou com velocidade de

6m/min e teve incremento de 3m/min a cada 3 minutos até a exaustão do animal. Este

teste foi realizado antes e após o período de treinamento físico, e foram quantificados o

tempo máximo de realização do teste, a velocidade atingida no pico do esforço e a

distância total percorrida. Embora o teste em esteira não seja específico ao tipo de

treinamento físico realizado no presente estudo, utilizamos esse teste apenas para

indicar a capacidade de execução de exercício físico.

4.9 Avaliações durante o protocolo experimental in vivo

4.9.1 Fatores determinantes do balanço energético

Ao longo das 15 semanas de protocolo experimental, o peso corporal foi

acompanhado semanalmente em balança digital (Gehaka, modelo BG4001), sempre no

mesmo dia e horário.

O consumo de ração foi avaliado em grupos de animais com genótipos

semelhantes mantidos na mesma gaiola ao longo de todo o período experimental,

durante períodos de 24 horas, por 3 dias consecutivos em cada semana. Foi utilizada a

média dos 3 dias avaliados para determinar o consumo de ração diário.

A taxa metabólica de repouso dos animais foi determinada através da avaliação

do consumo de oxigênio por calorimetria indireta antes e após o período de treinamento

físico. Para isso, os animais permaneceram 24 horas sem realização de exercício físico e

foram mantidos por 6 horas em jejum. O tempo de permanência dos animais dentro da

caixa metabólica foi de 30 minutos, sendo que o repouso foi considerado o menor valor

de oxigênio consumido observado. Para o cálculo de consumo de oxigênio, foi utilizada

a seguinte fórmula: VO2 = (Fi O2 -Fe O2) x 1.165 / peso corporal, onde: Fi O2 = fração

27

inspirada de oxigênio; Fe O2 = fração expirada de oxigênio; 1.165 = fluxo de ar na

bomba de ar.

4.9.2 Teste de tolerância à glicose intraperitoneal (TTGI)

A tolerância à glicose foi avaliada antes e após o período de treinamento físico,

através da determinação da curva glicêmica após administração intraperitoneal de

glicose (2 g/kg p.c.) nos animais previamente submetidos ao jejum de 6h. A glicemia foi

determinada por meio de glicosímetro (Accu-Chek Advantage Roche Diagnostics) em

amostras de sangue retiradas da cauda nos tempos 0 (basal), 15, 30, 60, 90 e 120

minutos após a administração de glicose.

4.10 Sacrifício e coleta de tecidos e sangue

Após 24 horas da última sessão de treinamento físico, os camundongos foram

anestesiados por injeção i.p. de Pentobarbital Sódico. Em seguida, foram pesados em

balança digital, e posicionados sob uma régua para a medida do comprimento naso-anal

que serviu para a determinação do Índice de Lee através da fórmula: (³√peso

corporal/comprimento naso-anal) (BERNARDIS & PATTERSON, 1968). No momento

em que o animal não mais demonstrou sinais de reflexo nas patas traseiras, a cavidade

abdominal foi exposta e a coleta de sangue foi realizada através de punção na veia cava

inferior. Em seguida, foram coletados e pesados os depósitos de gordura branca (tecido

adiposo periepididimal e retroperitoneal), os músculos esqueléticos das patas

(gastrocnêmio e sóleos) e os órgãos (coração, pulmão, rins, fígado, glândulas adrenais e

baço).

28

O sangue foi centrifugado a 40C, 12000 rpm por 10 min, e o plasma armazenado

em freezer a –800C para determinação da concentração de leptina por radioimunoensaio

(RIA) utilizando anticorpo espécie-específico (kit da Linco Research Inc.®) e da

insulina através de kit (Sensitive rat insulin RIA Kit - Linco research, Inc.). O tecido

adiposo periepididimal foi destinado para a avaliação de lipólise e medida do diâmetro

dos adipócitos, o tecido adiposo retroperitoneal e hepático foram utilizados para a

dosagem da atividade da enzima ácido graxo sintase (FAS), o músculo sóleo de uma das

patas foi retirado para a dosagem da atividade da enzima citrato sintase, além da loja

muscular da outra pata, contendo os músculos gastrocnênio, sóleo e plantar para

quantificação da tipagem de fibra muscular e razão capilar/fibra muscular.

4.11 Estudo do tecido adiposo branco

4.11.1 Extração dos adipócitos e análise morfométrica

Os adipócitos foram isolados do tecido adiposo periepididimal mediante a

técnica de digestão de tecido pela colagenase, descrita por RODBELL (1964), com

algumas modificações para adaptar o método às nossas condições laboratoriais. Em

resumo, o depósito adiposo periepididimal foi retirado, picado com tesoura em finos

fragmentos e incubado em 4,0 mL de tampão digestivo [DMEM, HEPES 25 mM, BSA

4 %, colagenase tipo II (Sigma Chemical, St. Louis, MO, Estados Unidos) 1,25 mg/mL,

pH 7,45] por cerca de 30 min a 37 oC em banho-maria com agitação orbital (150 rpm).

Em seguida, a amostra foi filtrada em peneira plástica com malha fina (que retém restos

teciduais e vasos não digeridos) e lavada por três vezes com 25 mL de tampão EHB

(sais de EARLE, HEPES 25 mM, BSA 1 %, piruvato de sódio 1 mM, sem glicose, pH

7,45) mantido a 37 ºC. Após a segunda lavagem, a suspensão celular em 25 mL de

29

tampão EHB foi deixada 30 min em repouso em estufa a 37 °C, com a finalidade de

atenuar os efeitos da insulina e de outros hormônios endógenos. Para a determinação do

lipócrito (porcentagem de adipócitos contidos na suspensão celular total), 40 µL da

suspensão celular em tampão EHB foram colocados em capilar de vidro e submetidos à

centrifugação (2000 rpm por 1 min). O volume total da suspensão corresponde a 100 %

e o volume de adipócitos obtido após a centrifugação, nos fornece o lipócrito da

amostra.

Para a análise morfométrica, alíquotas de suspensão celular foram avaliadas em

microscópio óptico com o programa Leica Quantimet 500. Em cada preparação foram

medidas 100 células. A partir do diâmetro celular médio e admitindo-se que o adipócito

isolado é esférico, o volume e o número de células foram calculados de acordo com as

seguintes fórmulas:

(a) V= [(π/6) x D3]/1000, (b) N= (lipócrito x 107)/ V

Onde:

D é o diâmetro médio de 50 adipócitos (µm), N é o número de células e V é o

volume médio (DI GIROLAMO, MENDLINGER & FERTIG, 1971). A divisão por

1000 em (a) visa expressar o volume em picolitros (pL).

4.11.2 Avaliação da atividade lipolítica frente ao estímulo com isoproterenol

As taxas de lipólise basal e estimulada pelo agonista β-adrenérgico isoproterenol

(Sigma®) foram mensuradas em adipócitos isolados do tecido adiposo periepididimal

conforme o seguinte protocolo: 40 µL de suspensão celular (em tampão EHB) foram

transferidos para microtubos (1,5 mL) e incubados durante 5 min a 37 °C em presença

30

de 20 µL de adenosina deaminase (ADA, Sigma, 0,2 U/mL em tampão EHB, pH 7,45)

para permitir a degradação da adenosina, um metabólito com ação anti-lipolítica,

liberada no meio pelos adipócitos (HONNOR, DHILLON & LONDOS, 1985). Após

este período, as células foram incubadas por 60 min a 37 °C com ou sem 10 µL de

isoproterenol (10-5 M) totalizando um volume de 200 µL. Ao final da incubação, a

mistura de reação foi bloqueada pela transferência dos tubos para o gelo seguido por

centrifugação a 12000 rpm por 10 min a 4 °C, para separar as células do meio de reação.

Após a centrifugação, alíquotas de aproximadamente 120 µL do meio de incubação

foram retiradas e armazenadas em freezer a –20 °C para posterior mensuração do

glicerol nele contido. A quantidade de glicerol liberada pelos adipócitos para o meio de

incubação foi determinada pelo método enzimático-colorimétrico (Sigma®). Os

resultados foram expressos em nmol.10-6 cels.h-1.

4.11.3 Dosagem da atividade da enzima ácido graxo sintase (FAS)

A FAS é a principal enzima envolvida no processo de lipogênese, a qual é

definida por processos metabólicos que resultam na biossíntese e incorporação de

triglicerídeos nas gotículas de gordura do adipócito (FONSECA-ALANIZ, TAKADA,

ALONSO-VALE & LIMA, 2006). Os principais locais de ação da FAS são no tecido

adiposo e no tecido hepático. Para que ocorra a reação da lipogênese, além da enzima

FAS é necessária a disponibilidade do substrato (carboidrato) e de cofatores (NADPH),

este último produzido pela via da pentose fosfato (FOUFELLE, GIRARD & FERRE,

1996). A ação catalisadora da FAS acontece na formação de acilCoA à partir do

malonil-CoA, que será utilizado para a esterificação com glicerol-3-P, completando a

31

síntese de triacilglicerol e posterior incorporação a gotícula de lipídio (FONSECA-

ALANIZ et. al., 2006).

Para dosagem da atividade da FAS, amostras do tecido adiposo RP e fígado

(aproximadamente 0,2 g) foram suspensas em tampão de extração (na proporção de 1:2

e 1:3 peso/volume, respectivamente) contendo sacarose (250 mM), EDTA (1 mM),

DTT (1 mM), leupeptina (50 µM) e aprotinina (5 µM) pH=7.4. O material mantido em

gelo foi homogeneizado em Polytron (PT 3100, Kinematica AG, Littau-Lucene, Suíça)

por 10 segundos em velocidade máxima, centrifugado (20800 g, 15 minutos, 0 °C em

Centrífuga 5417 C/R- Eppendorf) para separação dos restos celulares e lipídicos.

Volumes de 20 µL do infranadante para o tecido adiposo RP e 15 µL do sobrenadante

para o fígado desta última centrifugação foram utilizados para a análise indireta da

atividade enzimática da FAS, como medida da oxidação (consumo) total de NADPH

(BAZIN & FERRE, 2001).

O tampão de ensaio utilizado (volume de 270 µL para tecido adiposo RP e 275

µL para fígado) consistiu de KH2PO4 (100 mM), acetilCoA (100 µM) e NADPH (200

µM), pH=6.5. A reação foi iniciada com a adição de 10 µL de malonilCoA (600 µM)

ao extrato enzimático, e acompanhada por 5 minutos (37 °C). A absorbância foi

monitorada a 340 nm, sendo o coeficiente de extinção para este comprimento de onda

igual a 6,22. As proteínas foram quantificadas pelo método de BRADFORD (1976). Os

resultados foram expressos em nmol.min-1.mg-1 de proteína presente no extrato.

4.12 Estudo do músculo esquelético

4.12.1 Dosagem da atividade máxima da enzima citrato sintase

32

A citrato sintase é uma importante enzima oxidativa, pois cataliza a primeira

reação do ciclo de Krebs, onde ocorre a condensação do Acetil coenzima A (Acetil-

CoA) com o oxalacetato para formar citrato e coenzima A (COATE & HUGGINS,

2010). É uma enzima reguladora, e em muitos tipos de células, a reação por ela

catalizada é o passo limitante na velocidade de todo o ciclo de Krebs e

consequentemente na formação de energia via metabolismo aeróbio (LEHNINGER,

1991).

Apenas uma amostra do músculo sóleo foi suspensa em tampão de extração (300

µL), contendo Tris Base (50mM), EDTA (1mM), pH 7,4. O material mantido em gelo

foi homogeneizado em Polytron (PT 3100, Kinematica AG, Littau-Lucene, Suíça) por

10 segundos, em velocidade máxima, centrifugado (3000 rpm, 15 minutos, 4 °C em

Centrífuga 5417 C/R- Eppendorf) e um volume de 15 µL do sobrenadante dessa

centrifugação foi utilizado para determinação da atividade da enzima citrato sintase

segundo ALP e cols. (1976).

A mistura de ensaio utilizada continha Tris Base (100mM), 5,5´ditio-bis– (2–

nitrobenzoic acid (DTNB, 0,2 mM), Triton 0,1%, acetil-CoA 1mg, pH 8,1 . Para análise

da cinética enzimática, foram utilizados 15 uL do homogenato das amostras e 270 uL de

mistura de ensaio. Após estabilização por 5 min, a reação foi iniciada com a adição de

15 µL de ácido oxaloacético (0,5 mM) ao extrato enzimático, e acompanhada por 10

minutos (25 °C). A absorbância foi monitorada a 412 nm, sendo o coeficiente de

extinção para este comprimento de onda igual a 13,6.

As proteínas foram quantificadas pelo método de BRADFORD (1976). Neste

33

ensaio, as proteínas da amostra são complexadas com o corante azul de coomassie

brilhante G-250. A reação foi colorimétrica e a absorbância foi medida a 595 nm. Os

resultados de absorbância obtidos foram lançados na equação da reta de uma curva

padrão de albumina sérica bovina (1 a 10 g/ml), repetida a cada determinação

enzimática. A concentração da solução padrão de albumina foi aferida antes da

preparação de cada curva, dividindo-se o valor de absorbância obtido em 280 nm por

0,66. Os resultados foram expressos em nmol.min-1.mg-1 de proteína presente no

extrato.

4.12.2 Reação histoquímica para Miosina ATPase e determinação da

tipagem de fibras musculares

Após a retirada da loja posterior composta pelos músculos gastrocnêmio, sóleo e

plantar, as amostras foram mergulhadas em isopentano durante 10 segundos (FIGURA

1A), que tem a ação crioprotetora, evitando assim artefatos nas amostras, e

posteriormente congeladas em nitrogênio líquido (FIGURA 1B), até que os cortes

fossem realizados.

FIGURA 1. Loja muscular posterior após mergulhada no isopentano (A) e

Congelamento das amostras em nitrogênio líquido (B).

34

Os cortes seriados dos músculos com espessuras de 10µm foram montados em

lâminas para as reações histoquímicas. As lâminas foram dispostas em cubetas

diferentes para os pHs 4.6 e 10.3 e nelas realizadas as reações com formol de cálcio

(CaCl e formalina 10%) seguido de tampão glicina (glicina + NaCl + CaCl . 2H2O +

NaOH 1M) para o pH 10.3 ou tampão acetato (Na-acetato + H2O destilada + Ácido

acético glacial + CaCl . 2H2O) para o pH 4.6. As lâminas das duas cubetas foram

passadas para uma única cubeta contendo solução ATP (ATP + tampão glicina, pH 9.5),

seguido de banho com cloreto de cobalto 2% (CoCl6H2O), e posteriormente solução

0,5% de sulfeto de amônio por 3 minutos. Finalmente, os cortes foram lavados em água

destilada e montados com gelatina-glicerina. A captura das imagens foi realizada

através do sistema de vídeo (LEICA QUANTIMET 500) com magnificação de 200x e

objetiva de 20x acoplado ao computador.

Os músculos sóleo e plantar foram identificados conforme descrito por

(SPURWAY, 1981). Não foram atribuídos número de campos para análise, pois a

avaliação foi realizada no músculo sóleo inteiro. A quantificação dos diferentes tipos de

fibras musculares no sóleo foi realizada por um único observador por meio do programa

Image-Pro Plus.

Para a identificação dos subtipos de fibras, em cortes seriados processados em

diferentes pHs 4,3 e 10,3, foi realizada a comparação entre as colorações obtidas nesses

ensaio segundo as observações de HAMALAINEN & PETTE (1993). A classificação

dos tipos de fibras atribuída pela coloração está exemplificada na FIGURA 2.

35

FIGURA 2. Classificação dos tipos de fibras no músculo sóleo no pH 10,3.

4.12.3 Quantificação de capilares no músculo esquelético

Por meio da reação histoquímica para miosina ATPase no pH 10,3, em uma

magnificação de 400x foi quantificado o número de capilares localizados em torno das

fibras do músculo sóleo inteiro, bem como a quantidade de fibras musculares. A

contagem dos capilares e das fibras foi realizada em sistema computadorizado (LEICA

QUANTIMET 500). Para a determinação da razão número de capilares/fibra foi

dividido o número de capilares pelo número de fibras encontrados no músculo sóleo.

36

FIGURA 3. Identificação dos capilares no músculo sóleo.

4.13 Desenho dos procedimentos experimentais

37

4.14 Análise Estatística

Os dados foram apresentados na forma de média ± erro padrão da média (EPM).

Com o propósito de avaliar o efeito do genótipo da ECA sobre os distúrbios

metabólicos associados ao diabetes, foi utilizado o Teste t de Student para dados não

pareados. Para o estudo do efeito do genótipo da ECA e do treinamento físico (fatores

independentes), foi utilizada análise de variância (ANOVA) de dois caminhos para

dados repetidos para as seguintes variáveis: evolução do peso corporal, consumo de

oxigênio e teste de esforço. As demais variáveis foram avaliadas através de análise de

variância (ANOVA) de dois caminhos (genótipo e treinamento físico como fatores

independentes). Na presença de diferenças estatísticas, foi utilizado o teste post-hoc de

Bonferroni. Em todos os casos foi adotado nível de significância de 5% (p<0,05).

38

5. RESULTADOS

5.1 Composição corporal

A FIGURA 4 demonstra a evolução do peso corporal dos quatro grupos

experimentais durante as 15 semanas totais de protocolo experimental. Foram

comparados estatisticamente apenas os dados de peso corporal dos grupos nas semanas

1, 8 e 15. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos no início do

protocolo experimental (semana 1). Após o período de diabetes, na semana de início do

treinamento físico (semana 8), apenas o grupo 1T apresentou peso corporal

significativamente maior comparado ao grupo 1S (1S= 21,97±0,6g vs. 1T=

25,69±0,4g). Essa diferença foi mantida após o período de treinamento físico, conforme

os valores observados na semana 15 (1S= 22,72±0,8g vs. 1T= 26,19±0,6g).

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Pes

o C

orp

ora

l (g

)

1S

1T

3S

3T

Início TF

**

FIGURA 4. Evolução do peso corporal dos animais durante o protocolo experimental.

1S (sedentário 1 cópia, n=14); 1T (treinado 1 cópia, n=15); 3S

(sedentário 3 cópias, n=10); 3T (treinado 3 cópias, n=11). * p<0,05 1T

vs. 1S sem8 e sem15. Dados das semanas 1, 8 e 15 comparados através

de ANOVA dois caminhos para medidas repetidas e post-hoc de

Bonferroni.

39

Ainda na FIGURA 4, pode-se observar que não houve diferença estatística no

peso corporal dos grupos no término do protocolo (semana 15) comparado aos

respectivos pesos corporais avaliados no início do protocolo (semana 1).

Também não foram observadas diferenças estatísticas no ganho de peso corporal

entre os grupos no período pré-treinamento físico, ou seja, entre a semana 1 e a semana

7, confirmando que o genótipo da ECA não influenciou as alterações de peso corporal

associadas ao diabetes. De forma semelhante, observamos que no período de realização

do treinamento físico entre a semana 8 e a semana 15 não houve diferença no ganho de

peso corporal entre os animais, independente do genótipo da ECA (FIGURA 5).

FIGURA 5. Ganho de peso corporal entre semana 1 e semana 7 (A) e entre a semana 8

e semana 15 (B). 1S (sedentário 1 cópia, n=14); 1T (treinado 1 cópia,

n=15); 3S (sedentário 3 cópias, n=10); 3T (treinado 3 cópias, n=11). Dados

comparados através de ANOVA dois caminhos e post-hoc de Bonferroni.

40

Realizamos o cálculo do ganho de peso corporal ao longo das 15 semanas de

protocolo experimental. Conforme pode ser observado na TABELA 2, não houve

diferença estatística no ganho de peso corporal entre os grupos. De forma semelhante,

não houve diferença estatística no cálculo do Índice de Lee avaliado no momento do

sacrifício dos animais.

TABELA 2. Ganho de peso corporal (PC) dos animais ao longo das 15 semanas de

protocolo e Índice de Lee. 1S (sedentário 1 cópia, n=14); 1T (treinado 1

cópia, n=15); 3S (sedentário 3 cópias, n=10); 3T (treinado 3 cópias,

n=11). * p<0,05 vs. 1S sem 15. Dados comparados através de ANOVA

dois caminhos e post-hoc de Bonferroni.

O peso do depósito de gordura branca periepididimal corrigido pelo peso

corporal dos animais obtido no momento do sacrifício não foi estatisticamente diferente

entre os grupos, entretanto, quando foi avaliada a gordura retroperitoneal, o grupo 3T

apresentou menor peso desse depósito comparado ao grupo 3S (FIGURA 6A). Ao

quantificar o diâmetro dos adipócitos extraídos do tecido adiposo periepididimal,

observamos que o grupo 3T apresentou menor diâmetro dos adipócitos comparado aos

grupos 1S, 1T e 3S (FIGURA 6B).

Grupos PC sem 1 (g) PC sem 15 (g) Ganho peso (g) Índice de Lee

1S 20,9 + 0,8 22,7 + 1,1 2,67 + 0,8 29,59 + 0,34

1T 23,4 + 0,7 26,2 + 0,6* 3,24 + 0,5 29,93 + 0,19

3S 21,8 + 1,3 25,0 + 1,0 3,23 + 1,0 30,54 + 0,24

3T 21,6 + 0,8 23,2 + 0,8 2,27 + 0,9 29,73 + 0,21

41

FIGURA 6. Peso dos depósitos de gordura branca retroperitoneal e periepididimal (A).

1S (sedentário 1 cópia, n=14); 1T (treinado 1 cópia, n=14); 3S (sedentário

3 cópias, n=10); 3T (treinado 3 cópias, n=10); Valores médios do diâmetro

de adipócitos dos animais (B). 1S (sedentário 1 cópia, n=4); 1T (treinado 1

cópia, n=5); 3S (sedentário 3 cópias, n=7); 3T (treinado 3 cópias, n=5) (B).

* p<0,05 vs 3S; # p<0,05 vs 1S, 1T e 3S. Dados comparados através de

ANOVA dois caminhos e post-hoc de Bonferroni.

A FIGURA 7 ilustra a medida do diâmetro dos adipócitos extraídos do tecido

adiposo periepididimal.

42

FIGURA 7. Imagens ilustrativas da quantificação do diâmetro dos adipócitos extraídos

do tecido adiposo periepididimal. 1S (sedentário 1 cópia); 1T (treinado 1

cópia); 3S (sedentário 3 cópias); 3T (treinado 3 cópias).

Os pesos dos órgãos corrigidos pelo peso corporal avaliado no momento do

sacrifício estão demonstrados na FIGURA 8A. Conforme pode ser observado, não

houve diferença estatística no peso dos órgãos entre os grupos, exceto para o peso dos

pulmões, onde o grupo 3S apresentou menor peso comparado aos grupos 1T e 3T. Não

foram observadas diferenças estatísticas no peso do músculo sóleo e no peso do

músculo gastrocnêmio dos animais submetidos ao protocolo experimental (FIGURA

8B).

43

FIGURA 8. Peso dos órgãos (A) e pesos dos músculos sóleo e gastrocnêmio (B) dos

animais do protocolo experimental. 1S (sedentário 1 cópia, n=14); 1T

(treinado 1 cópia, n=15); 3S (sedentário 3 cópias, n=10); 3T (treinado 3

cópias, n=11). * p<0,05 vs. 1T e 3T. Dados comparados através de


5.2 Consumo diário de ração

Conforme demonstrado na FIGURA 9A, não houve diferença estatística no

consumo diário de ração médio entre os grupos no período de diabetes, antecedente ao

treinamento físico (sem 1 à sem 7). Entretanto, durante o treinamento físico (sem 8 à

sem 15), o grupo 1S (4,72±0,18g) apresentou menor consumo diário de ração médio

44

comparado aos grupos 1T (5,77±0,24g), 3S (5,21±0,20g) e 3T (6,41±0,29g) (FIGURA

9B).

FIGURA 9. Consumo diário de ração por animal avaliado durante a sem 1 à sem 7 (A) e

a sem 8 à sem 15 (B). 1S (sedentário 1 cópia, n=8); 1T (treinado 1 cópia,

n=8); 3S (sedentário 3 cópias, n=8); 3T (treinado 3 cópias, n=8). * p<0,05

vs 1S. Dados comparados através de ANOVA dois caminhos e post-hoc de

Bonferroni.

5.3 Metabolismo energético de repouso

A FIGURA 10 apresenta a avaliação do consumo de oxigênio de repouso no

momento pré-treinamento físico e no momento pós-treinamento físico. Pode-se

observar que o grupo 3S no período pós-treinamento físico apresentou maior consumo

de oxigênio de repouso quando comparado aos grupos 1T e 3T pós-treinamento físico

45

(3S=29,25±2,5 vs. 1T=18,98±0,8 e 3T=19,35±1,2 ml/kg/min) e aos grupos 1S e 3S pré-

treinamento físico (3S=29,25±2,5 vs 1S=19,53±0,5 e 3S=18,70±1,0 ml/kg/min).

FIGURA 10. Consumo de oxigênio (VO2) de repouso dos animais submetidos ao

protocolo experimental pré e pós treinamento físico. 1S (sedentário 1

cópia, n=5); 1T (treinado 1 cópia, n=5); 3S (sedentário 3 cópias, n=5);

3T (treinado 3 cópias, n=6). * p<0,05 vs. 1T e 3T pós-treino; # p<0,05

vs. 1S e 3S pré-treino. Dados comparados através de ANOVA dois

caminhos para medidas repetidas e post-hoc de Bonferroni.

5.4 Capacidade de realização de exercício físico

Como pode ser visto na FIGURA 11, antes do protocolo de treinamento físico

com natação, o desempenho dos animais no teste de esforço na esteira foi semelhante

tanto na variável distância (FIGURA 11A) quanto na variável tempo (FIGURA 11B).

No entanto, após o período de treinamento físico, observou-se melhor desempenho nas

variáveis distância e tempo no teste de esforço físico na esteira apenas no grupo 1T

comparado aos grupos 1S e 3S.

46

FIGURA 11. Distância (A) e Tempo (B) avaliados no teste de esforço progressivo em

esteira até exaustão realizado pré e pós-treinamento físico. 1S (sedentário 1


3T (treinado 3 cópias, n=10). *p<0,05 vs. 1S e 3S pós-treino. Dados

comparados através de ANOVA dois caminhos para medidas repetidas e

post-hoc de Bonferroni.

5.5 Avaliações bioquímicas

5.5.1 Glicemia de Jejum

Com o intuito de avaliar o efeito do genótipo da ECA na progressão do diabetes,

comparamos através de teste T os valores de glicemia de jejum apresentados por todos

animais com 1 cópia versus todos animais com 3 cópias da ECA, nas semanas 1 e 7.

Observamos na semana 1 que, a glicemia de jejum dos animais com 3 cópias foi

47

significativamente maior que dos animais com 1 cópia (313,4±21,2 vs. 263,2±14,4

mg/dl, p=0,04). Já na semana 7, antecedente ao início do treinamento físico, não

observamos diferença estatística na glicemia de jejum entre os animais com 1

(366,8±21,6 mg/dl) e 3 cópias (387±21,1 mg/dl) (p=0,512).

A FIGURA 12 representa a glicemia de jejum dos grupos experimentais obtida

após o período de treinamento físico. Foi observado menor nível glicêmico nos animais

1T comparado aos animais 1S e 3S (1T=305±34 vs 1S=479±47 e 3S=496±49 mg/dl).

FIGURA 12. Glicemia de jejum avaliada após o treinamento físico. 1S (sedentário 1


3T (treinado 3 cópias, n=10). *p<0,05 vs. 1S e 3S. Dados comparados

através de ANOVA dois caminhos e post-hoc de Bonferroni.

5.5.2 Teste de tolerância à glicose intraperitoneal

A FIGURA 13 mostra os valores da glicemia no teste de tolerância à glicose

intraperitoneal e a área sob a curva nos momentos pré-treinamento físico (A) e pós-

treinamento físico (B). Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos

independentemente do genótipo da ECA e do treinamento físico.

48

FIGURA 13. Glicemia avaliada no teste de tolerância à glicose e área sob a curva

(AUC) pré-treino (A) e pós-treino (B). 1S (sedentário 1 cópia, n=14); 1T


cópias, n=11). Dados comparados através de ANOVA dois caminhos e

post-hoc de Bonferroni.

Quando foi calculada a diferença entre a área sob a curva pós-treino e a área sob

a curva pré-treino, observamos um decréscimo de 6,71% no grupo 1S, aumento de

6,05% no 1T, o grupo 3S não apresentou alteração e o grupo 3T obteve aumento de

4,98%.

49

Com o intuito de avaliar o efeito do genótipo da ECA na progressão do diabetes,

comparamos através de teste T os valores de área sob a curva apresentados por todos os

animais com 1 cópia versus todos os animais com 3 cópias da ECA na semana 7. Não

foram observadas diferenças estatísticas entre os animais (p= 0,357).

5.5.3 Insulina

Embora a utilização de STZ promova destruição das células β pancreáticas,

pode-se observar que todos os grupos ainda apresentaram pequenas quantidades de

insulina sérica. No entanto, não foi observada diferença estatística na quantidade de

insulina avaliada após o período de treinamento físico entre os grupos, independente do

genótipo da ECA (FIGURA 14).

FIGURA 14. Concentração de insulina sérica após o período de treinamento físico. 1S

(sedentário 1 cópia, n=14); 1T (treinado 1 cópia, n=15); 3S (sedentário 3

cópias, n=10); 3T (treinado 3 cópias, n=11). Dados comparados através

de ANOVA dois caminhos e post-hoc de Bonferroni.

50

5.5.4 Leptina

Como pode ser observado na FIGURA 15, apenas o grupo 1T apresentou maior

quantidade de leptina sérica quando comparado ao grupo 1S (1T=5,65±0,33 vs

1S=4,07±0,43 ng/ml).

FIGURA 15. Concentração de leptina sérica após o período de treinamento físico. 1S


cópias, n=10); 3T (treinado 3 cópias, n=11). * p<0,05 vs 1S. Dados

comparados através de ANOVA dois caminhos e post-hoc de

Bonferroni.

5.6 Atividade lipolítica

A atividade lipolítica frente ao estímulo com isoproterenol (agonista β-

adrenérgico) foi determinada através da produção de glicerol. Nos adipócitos extraídos

do tecido adiposo periepididimal, o valor obtido para a taxa de lipólise basal no grupo

3T foi estatisticamente menor comparado ao 1S (3T=162±65 vs. 1S=556±21 nmol/106

céls). Porém, quando estimulada por isoproterenol, não houve diferença estatística entre

os grupos (FIGURA 16A). Entretanto, quando calculada a diferença na produção de

glicerol estímulada por Isoproterenol e Basal (FIGURA 16B), observamos que o grupo

51

1T apresenta valor maior que os grupos 1S, 3S e 3T (1T=288±50 nmol/106 céls vs.

1S=79±37, 3S=123±37 e 3T=50±20 nmol/106 céls).

FIGURA 16. Atividade lipolítica (A) e diferença entre as taxas de glicerol na presença

(Iso) e na ausência (Basal) de isoproterenol (B) em adipócitos de animais

submetidos ao protocolo experimental. 1S (sedentário 1 cópia, n=5); 1T


cópias, n=5). *p<0,05 vs. 1S; # p<0,05 vs. 1S, 3S e 3T. Dados

comparado através de ANOVA dois caminhos e post-hoc de Bonferroni.

5.7 Atividade lipogênica

A atividade da enzima lipogênica FAS foi avaliada no tecido adiposo

retroperitoneal e no tecido hepático. Não foram observadas diferenças estatísticas na

atividade da FAS nos animais dos grupos sedentários e treinados, independente do

52

genótipo da ECA, tanto no tecido adiposo retroperitoneal (FIGURA 17) quanto no

tecido hepático (FIGURA 18). No entanto, é importante ressaltar que houve uma

tendência ao aumento da FAS no tecido hepático dos animais 3S (p= 0,06).

FIGURA 17. Atividade da enzima lipogênica ácido graxo sintase (FAS) no tecido

adiposo retroperitoneal. 1S (sedentário 1 cópia, n=11); 1T (treinado 1

cópia, n=9); 3S (sedentário 3 cópias, n=6); 3T (treinado 3 cópias, n=4).

Dados comparados através de ANOVA dois caminhos e post-hoc de

Bonferroni.

FIGURA 18. Atividade da enzima lipogênica ácido graxo sintase (FAS) no tecido

hepático. 1S (sedentário 1 cópia, n=4); 1T (treinado 1 cópia, n=6); 3S

(sedentário 3 cópias, n=6); 3T (treinado 3 cópias, n=7). Dados


Bonferroni.

53

5.8 Avaliações músculo-esqueléticas

A atividade máxima da enzima citrato sintase foi avaliada nos animais treinados

e sedentários com 1 e 3 ECA. Conforme pode ser observado na FIGURA 19, não foram

encontradas diferenças estatísticas entre os grupos de animais (1S= 137±11; 1T= 137±9;

3S= 183±20; 3T= 191±17 nmol/min/mg proteína).

FIGURA 19. Atividade máxima da enzima citrato sintase no músculo sóleo. 1S


cópias, n=8); 3T (treinado 3 cópias, n=10). Dados comparados através de


A FIGURA 20 apresenta o percentual de fibras musculares avaliado no músculo

sóleo para as fibras tipo I, Intermediárias e tipo IIA. Não foram observadas diferenças

estatísticas entre os grupos experimentais para nenhum dos tipos de fibra muscular

avaliado.

54

FIGURA 20. Percentual de fibras musculares tipo I (A), Intermediárias (B) e tipo IIA

(C) no músculo sóleo. 1S (sedentário 1 cópia, n=5); 1T (treinado 1 cópia,

n=5); 3S (sedentário 3 cópias, n=5); 3T (treinado 3 cópias, n=5). Dados


Bonferroni.

Realizamos a quantificação do número de fibras musculares no músculo sóleo

dos animais, e conforme pode ser observado na FIGURA 21, não houve diferença

estatística na densidade de fibras musculares entre os grupos. De forma semelhante, não

55

foram observadas diferenças estatísticas na razão capilar por fibra muscular (FIGURA

22).

FIGURA 21. Densidade de fibras no músculo sóleo inteiro. 1S (sedentário 1 cópia,

n=5); 1T (treinado 1 cópia, n=5); 3S (sedentário 3 cópias, n=5); 3T

(treinado 3 cópias, n=5). Dados comparados através de ANOVA dois

caminhos e post-hoc de Bonferroni.

FIGURA 22. Razão número de capilares por número de fibras no músculo sóleo inteiro.

1S (sedentário 1 cópia, n=5); 1T (treinado 1 cópia, n=5); 3S (sedentário 3

cópias, n=5); 3T (treinado 3 cópias, n=5). Dados comparados através de


56

6. DISCUSSÃO

6.1 Influência do genótipo da ECA no desenvolvimento do diabetes

experimental

A proposta inicial do presente estudo previa a investigação da relação do

genótipo da ECA com as respostas metabólicas induzidas pelo diabetes experimental.

Para isso, a indução do diabetes experimental foi realizada entre a 7ª e 8ª semana de

vida dos animais, e diferente da maioria dos estudos sobre o tema na literatura,

planejamos introduzir o treinamento físico somente após um período de estabelecimento

da hiperglicemia. Utilizamos como referência para a definição do momento de

introdução do treinamento físico o estudo prévio de (HEIMANN, 2003), no qual foi

demonstrado que a taxa de mortalidade dos animais diabéticos com 3 cópias do gene da

ECA aumentava significativamente na 14ª semana após indução do diabetes por

estreptozotocina, definindo o curso temporal para o agravamento das complicações

associadas ao diabetes e seu desfecho final. Assim, sabendo que o treinamento físico

duraria 8 semanas, o início do protocolo de natação foi programado para a 7ª semana

após indução do diabetes, encerrando-se na 15ª semana de diabetes.

Considerando que o SRA exerce grande influência no desenvolvimento e

progressão do diabetes (AROZAL et al., 2009; LEUNG, 2010; OLTMAN et al., 2010),

avaliamos durante as sete semanas de desenvolvimento do diabetes se a presença de

mais ou menos ECA poderia interferir em algumas variáveis metabólicas. Nossos

principais achados demonstraram que na fase inicial do desenvolvimento do diabetes

(sete semanas), o nível diferencial de expressão gênica da ECA não refletiu em

alterações no ganho de peso corporal, no consumo de ração diário, no consumo de

57

oxigênio em repouso, na capacidade de realização de exercício físico e na tolerância à

glicose. Quanto à glicemia de jejum, observamos que o nível glicêmico dos animais 3

cópias avaliados após a indução do diabetes foi superior ao nível glicêmico dos animais

com 1 cópia do gene da ECA, porém após sete semanas de desenvolvimento do

diabetes, essa diferença já não foi mais observada.

Evidências na literatura demonstraram que a influência do SRA no controle de

peso corporal é bastante complexa, haja vista os diferentes resultados encontrados.

Enquanto alguns autores confirmaram que o aumento dos componentes do SRA,

especialmente a Ang II, associa-se ao maior ganho de peso corporal (GIACCHETTI,

FALOIA, MARINIELLO, SARDU, GATTI, CAMILLONI, GUERRIERI &

MANTERO, 2002), outros autores observaram que a atividade do SRA era

inversamente associada ao ganho de peso corporal (CASSIS, ENGLISH,

BHARADWAJ & BOUSTANY, 2004).

Para avaliar a evolução do peso corporal dos animais nas sete primeiras semanas

de protocolo, realizamos inicialmente a comparação dos dados dos animais com 1 cópia

versus animais como 3 cópias. Observamos que não havia diferença estatística entre os

grupos. No entanto, quando separamos os animais nos respectivos grupos sedentários e

treinados, observamos que o grupo 1T apresentava peso corporal superior ao grupo 1S

após sete semanas de diabetes. Essa resposta parece ser muito mais conseqüente da

distribuição dos animais nos grupos do que propriamente do genótipo da ECA, pois

embora não tenham sido estatisticamente diferentes, os valores iniciais de peso corporal

do 1S foi de 20,9 + 0,8g e do 1T foi de 23,4 + 0,7g. Além disso, quando avaliamos o

ganho de peso corporal nessa etapa, não encontramos diferença estatística entre os

grupos.

58

Apesar de os estudos na literatura demonstrarem que o animal diabético por STZ

reduz o peso corporal (TAKADA et al 2007; PINGHIN, 2005). HEIMANN et al.

(2005) utilizando o modelo animal geneticamente modificado com 1, 2 e 3 cópias do

gene da ECA alimentados com dieta padrão, não apresentaram diferença no peso

corporal avaliado durante 30 semanas. HUANG et al. (2001) estudaram animais com 1,

2 e 3 cópias do gene da ECA diabéticos por STZ e não observaram diferença no peso

corporal após 12 semanas de diabetes. Esses dados dão suporte ao nosso estudo, que

embora na presença de diabetes, o padrão de resposta de peso corporal dos animais é

mantido, mostrando que na fase inicial de desenvolvimento do diabetes, o genótipo da

ECA não influencia o peso corporal.

Embora o diabetes tenha como característica marcante o aumento do consumo

alimentar (OKOSHI et al., 2007), e que a infusão central crônica de Ang II em ratos

provoca diminuição no consumo alimentar (PORTER, ANDERSON, ROBISON &

PHILLIPS, 2003), no presente trabalho não foi encontrada diferença estatística na

média de consumo de ração diário entre os grupos com 1 e 3 cópias de ECA durante as

7 semanas de diabetes que antecederam o início do treinamento físico. Esses dados

demonstram que o modelo experimental e o procedimento metodológico influenciam

diretamente os resultados observados, e devem ser considerado quando a proposta de

estudo se volta para o entendimento da interação gene-meio ambiente para definição de

fenótipos complexos.

Os dados de metabolismo energético de repouso observados nas 7 primeiras

semanas de protocolo (avaliação pré-treino) foram relativamente inesperados, já que o

aumento da Ang II resulta em potente efeito estimulador do sistema nervoso simpático,

o que poderia contribuir diretamente para o aumento do metabolismo energético de

repouso (ENGLISH & CASSIS, 1999). No entanto, observamos que na fase inicial do

59

diabetes, não houve diferença no consumo energético de repouso dos animais associado

ao genótipo da ECA.

Considerando que a determinação do peso corporal está intimamente relacionada

com o balanço energético (MULLER, BOSY-WESTPHAL, LATER, HAAS &

HELLER, 2009), os dados de consumo de ração e de metabolismo energético de

repouso apontam para um balanço energético neutro, refletindo em inalteração no ganho

do peso corporal associado ao genótipo da ECA. Isso porque, os animais ingeriram

exatamente a mesma ração, estavam submetidos ao mesmo confinamento em caixa e

não realizavam treinamento físico, nos permitindo considerar que os principais fatores

determinantes do balanço energético foram o consumo de ração e o gasto energético de

repouso.

Considerando que o pior prognóstico do diabetes está associado ao maior

conteúdo de Ang II (TIKELLIS, COOPER & THOMAS, 2006; WEIR, 2007),

esperávamos que logo após as 7 semanas de diabetes, os animais com 3 cópias

apresentassem maiores prejuízos na glicemia de jejum e na tolerância à glicose. No

entanto, o que vimos foi apenas uma maior hiperglicemia do 3 cópias no início do

protocolo, e que depois de sete semanas foi equiparada à hiperglicemia dos animais com

1 cópia.

A literatura oferece inúmeras evidências dos prejuízos causados pelo SRA na

progressão do diabetes, no entanto, quando olhamos para os estudos experimentais, a

associação do SRA com o diabetes normalmente tem sido demonstrada através do uso

farmacológico de bloqueadores do SRA (KAMAL et al., 2010; VAISHYA, SINGH &

LAL, 2009; ZOJA et al., 2010). Por outro lado, no nosso estudo observamos que a

presença de mais ou menos ECA em níveis fisiológicos não interfere na magnitude de

60

resposta da glicemia e da tolerância à glicose na fase inicial da doença. Esses dados

fortalecem a idéia de que a modulação do SRA no diabetes parece ser não só

dependente do modelo estudado, mas também do tempo necessário para que o excesso

de Ang II reflita em complicações metabólicas associadas ao diabetes.

Um dado interessante foi a diferença estatística na glicemia de jejum entre os

animais com 1 e 3 cópias logo após a indução do diabetes, revelando que o efeito da

STZ sob as células ß pancreáticas é mais acentuado nos animais com maior conteúdo de

ECA. No entanto, esse efeito parece ser mais agudo, pois não observamos mais

diferença estatística entre os grupos após 7 semanas de diabetes. Nossos dados

corroboram o estudo de HUANG et al. (2001) no qual foi demonstrado que a glicemia

de jejum não diferiu entre os animais com 1 a 3 cópias do gene da ECA diabéticos por

STZ. Embora os mecanismos não estejam claros na literatura, uma possível explicação

para essa resposta seria a resposta compensatória de algum dos componentes do SRA

em função do elevado conteúdo de Ang II. De fato, MONOSIKOVA, ZEMAN,

VESELA & HERICHOVA (2009) observaram redução na expressão gênica do receptor

da angiotensina AT1 no pâncreas de ratos diabéticos induzido por STZ durante os

estágios iniciais do desenvolvimento do diabetes.

As adaptações encontradas no diabetes podem refletir diretamente na redução da

tolerância ao esforço físico, especialmente em função das complicações metabólicas e

de distúrbios no músculo esquelético (STUMP et al., 2003; KRAUSE et al., 2009). No

entanto, observamos que após 7 semanas de diabetes, o desempenho físico dos animais

no teste de esforço em esteira até a exaustão não foi diferente entre os genótipos da

ECA.

61

6.2 Efeitos metabólicos do treinamento físico no diabetes experimental

Após o período de 7 semanas de desenvolvimento do diabetes, os animais foram

submetidos ao treinamento físico com natação por 8 semanas ou mantidos sedentários.

Nessa etapa, avaliamos se os distúrbios metabólicos associados ao diabetes seriam

diferenciados nos animais com 1 e 3 cópias do gene da ECA, e se o treinamento físico

iria interferir nessa resposta.

Após o período de treinamento físico, observamos que o grupo 1T apresentou

peso corporal significativamente maior comparado ao grupo 1S. Essa diferença parece

ser conseqüente do diferencial de peso corporal entre esses grupos já observado no

início do treinamento físico, já que o ganho de peso corporal durante o treinamento

físico não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Esses dados repetem

exatamente aquilo que foi observado nas 7 semanas iniciais de protocolo experimental.

No presente estudo, esperávamos redução significativa do peso corporal dos

animais treinados, especialmente com 3 cópias da ECA, pois reuníamos dois

importantes fatores determinantes para essa resposta, o diabetes por STZ (LEHTI et al.,

2007) e a maior oxidação de substratos energéticos promovida pelo treinamento físico

(LIMA-SILVA et al., 2006). No entanto, não foram observadas diferenças estatísticas

no peso corporal dos animais quando considerado o genótipo (1S vs. 3S) e o

treinamento físico (3S vs. 3T).

Apesar de o diabetes por STZ induzir respostas metabólicas mais condizentes

com o diabetes tipo 1 (OKOSHI et al., 2007), esse modelo apresenta características

peculiares, como por exemplo, pequena quantidade de insulina ainda remanescente

(JUNOD et al., 1969), que acabam refletindo diretamente no comportamento

metabólico observado. De fato, quando avaliamos a concentração de insulina nos nossos

62

animais, observamos que os quatro grupos apresentavam pequena quantidade de

insulina plasmática, porém sem diferença estatística entre eles.

Quanto ao treinamento físico, apesar de alguns estudos demonstrarem redução

de peso corporal (SNIJDERS, VERDIJK, HANSEN, DENDALE & VAN LOON,

2010) ou aumento de forma mais lenta em animais treinados (TATCHUM-TALOM,

SCHULZ, MCNEILL & KHADOUR, 2000), nossos dados corroboram os estudos que

observaram que o treinamento físico não influenciou o ganho de peso corporal de

animais. De forma semelhante ao realizado para as sete semanas iniciais de protocolo

experimental, estudamos duas possíveis variáveis determinantes da resposta de peso

corporal dos animais durante o período de treinamento físico, o consumo de ração e o

metabolismo energético de repouso.

Considerando apenas o genótipo da ECA, observamos que durante o período de

8 semanas de treinamento físico, o grupo 3S apresentou maior consumo diário de ração

comparado ao grupo 1S, porém o grupo 3S no período pós-treinamento físico

apresentou maior consumo de oxigênio comparado aos grupos 1S e 3S pré-treinamento

físico. De acordo com esses dados, o peso corporal de ambos os grupos sedentários não

diferiu porque no grupo 1S não há diferença no metabolismo energético de repouso e

também no consumo de ração, porém no grupo 3S a maior ativação metabólica em

repouso foi ajustada com o aumento no consumo de ração, garantindo assim,

manutenção do peso corporal.

Quando consideramos o treinamento físico, observamos que o grupo 1T

consumiu mais ração que o grupo 1S, porém não diferiu no metabolismo energético de

repouso. De acordo com STEVENSON, BOX, FELEKI & BEATON (1966), os animais

podem ajustar o consumo de ração equivalente ao gasto energético quando submetidos

63

ao treinamento físico regular, o que em última instância garante a manutenção do peso

corporal. Interessante observar que o consumo de ração não diferiu entre os animais 3S

e 3T, no entanto, o metabolismo energético de repouso é menor no 3T comparado ao

3S, sinalizando que a manutenção do peso corporal no grupo 3T foi decorrente do ajuste

entre o gasto energético promovido pelo treinamento físico e o gasto energético

resultante do metabolismo de repouso.

Ainda em relação à avaliação do metabolismo energético de repouso,

observamos que o grupo 3S apresentou maior consumo de oxigênio em repouso na

semana quinze (pós-treinamento físico) comparado ao seu respectivo valor obtido na

semana oito (pré-treinamento físico) e também comparado ao grupo 3T (pós-

treinamento físico). Esses dados sinalizam que o metabolismo energético de repouso

aumentou durante a progressão do diabetes e que foi genótipo-dependente, ou seja, o

maior nível de ECA resultou em maior gasto energético de repouso, e que o treinamento

físico foi capaz de atenuar essa resposta. Embora o comportamento do metabolismo

energético de repouso não tenha refletido em alteração no ganho de peso corporal

desses animais, isso pode ter sido apenas por uma questão temporal do diabetes.

Com os dados reportados até o presente momento, podemos afirmar que o

treinamento físico promoveu manutenção do peso corporal e que o genótipo da ECA

influenciou apenas os meios pelos quais essa resposta foi obtida. Na tentativa de

entender um pouco mais sobre os fatores determinantes do balanço energético,

realizamos a dosagem da concentração de leptina plasmática. Considerando que a

leptina secretada pelas células adiposas aumenta o gasto energético de repouso e reduz o

apetite (MERINO, CANO, GUZMAN, SOMOZA & RUIZ-GAYO, 2008) e a possível

influencia da Ang II na regulação da secreção de leptina (CASSIS et al., 2004),

esperávamos que os animais com 3 cópias de ECA apresentassem maior concentração

64

de leptina. No entanto, observamos que apenas o grupo 1T apresentou aumento

significante comparado ao 1S.

O aumento da secreção de leptina pelo grupo 1T parece ser mais condizente ao

efeito agudo da última sessão de treino do que propriamente uma adaptação crônica

provocada pelo treinamento físico, já que a literatura tem demonstrado que o

treinamento físico promove redução ou manutenção da concentração de leptina

(BALDUCCI, ZANUSO, NICOLUCCI, FERNANDO, CAVALLO, CARDELLI,

FALLUCCA, ALESSI, LETIZIA, JIMENEZ, FALLUCCA & PUGLIESE, 2009;

BOUASSIDA, CHAMARI, ZAOUALI, FEKI, ZBIDI & TABKA, 2 008; POLAK,

KLIMCAKOVA, MORO, VIGUERIE, BERLAN, HEJNOVA, RICHTEROVA,

KRAUS, LANGIN & STICH, 2006). Isso porque, conforme mostrado por ESSIG,

ALDERSON, FERGUSON, BARTOLI & DURSTINE (2000), a redução da

concentração de leptina foi observada apenas 48hs após a última sessão de treino,

sugerindo que o treinamento físico pode induzir mudanças na concentração de leptina,

mas que não são observadas nas primeiras horas de recuperação. De fato, a coleta de

sangue dos animais foi realizada 24 horas após a última sessão de treinamento físico.

Além disso, a inabilidade da ação periférica da leptina em alterar o metabolismo

energético de repouso e inibir o apetite dos animais 1T, reforçam ainda mais a hipótese

de que a elevação da concentração de leptina no nesse grupo tenha sido um efeito agudo

da última sessão de treinamento.

Um possível mecanismo que justifica o aumento agudo da leptina associado ao

treinamento físico é o sinergismo desta proteína com o cortisol, cuja secreção está

diretamente relacionada à intensidade do exercício. Embora não tenha sido dosada a

cortisona nos animais, possivelmente a intensidade do exercício realizado bem como o

estresse provocado pela natação seria suficiente para exacerbar a resposta da cortisona

65

e, paralelamente, elevar a concentração de leptina. De fato, foi observado aumento na

concentração de leptina durante 41 minutos de ciclismo associado ao aumento

significativo do cortisol e adrenalina (FISHER, VAN PELT, ZINDER, LANDT &

KOHRT, 2001).

O efeito agudo da última sessão de exercício também deveria ter promovido

aumento na secreção de leptina no grupo 3T, porém não visualizamos diferença

comparada ao grupo 3S. Essa resposta pode ser justificada pela redução significativa da

massa adiposa retroperitoneal e menor diâmetro de célula adiposa periepididimal

apresentada por esses animais. De acordo com GUO, HALO, LEIBEL & ZHANG

(2004), a secreção de leptina é diretamente proporcional ao conteúdo de massa adiposa

e, de fato, quando há redução na massa adiposa a secreção de leptina também é reduzida

(KONDO, KOBAYASHI & MURAKAMI, 2006). Por isso a resposta de leptina no

grupo 3T não ter sido semelhante à resposta observada no 1T.

A indisponibilidade de glicose suficiente para o fornecimento de energia causada

pelo diabetes influencia diretamente o tecido adiposo e o metabolismo de lipídios

(VIRTUE & VITAL-PUIG, 2010). Embora a combinação de diabetes, ativação do SRA

e treinamento físico não tenha refletido em alteração do peso corporal, observamos que

o grupo 3T apresentou menor peso do depósito de gordura retroperitoneal comparado ao

grupo 3S e menor diâmetro dos adipócitos comparado aos grupos 1S, 1T e 3S. Em

função das diferenças encontradas no tecido adiposo e a importância metabólica desse

tecido no diabetes, estudamos a lipólise em células adiposas estimuladas por

isoproterenol e também dosamos a enzima lipogênica FAS no tecido adiposo e também

hepático.

66

Os componentes do SRA, como angiotensinogênio, renina, ECA, Ang II e

receptor AT1 foram demonstrados no tecido adiposo (SARZANI, SALVI, DESSI-

FULGHERI & RAPPELLI, 2008). E, apesar de a Ang II aumentar a lipólise via

estimulação da liberação de noradrenalina pelo sistema nervoso simpático (BLAAK,

2003), não foram observadas diferenças estatísticas nos dados de lipólise entre os

grupos. Ainda, quando calculada a diferença na produção de glicerol estimulada por

isoproterenol e basal, observamos apenas que o 1T apresentou maior valor que os

grupos 1S, 3S e 3T. Esses dados nos revelam que o genótipo da ECA por si só não

influenciou a lipólise, pois não encontramos diferença estatística entre os grupos

sedentários. Além disso, confirma dados anteriores publicados na literatura sobre o

aumento da taxa lipolítica induzida pelo treinamento físico (ENEVOLDSEN,

STALLKNECHT, LANGFORT, PETERSEN, HOLM, PLOUG & GALBO, 2001;

SHEPHERD, NOBLE, KLUG & GOLLNICK, 1981), conforme observado no grupo

1T. Nesse sentido, era de se esperar que os animais 3T apresentassem respostas

parecidas dos animais 1T, entretanto, isso não foi observado possivelmente em função

da diferença no conteúdo de tecido adiposo periepididimal desses dois grupos, que

apesar de não ter sido estatisticamente significante, pode ter influenciado no conteúdo

de células extraídas e estimuladas. Obviamente, a quantificação do lipócrito realizada

visa normalizar o conteúdo de células adiposas estimuladas, porém não exclui

totalmente essa interferência.

O processo lipogênico, avaliado através da enzima FAS no tecido adiposo e no

tecido hepático, não foi estatisticamente diferente entre os grupos estudados, embora

tenha havido uma tendência ao aumento no tecido hepático dos animais 3S. Estudos na

literatura demonstraram que a Ang II estimula a expressão de genes lipogênicos como o

da enzima FAS e da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), resultando em

67

aumento no conteúdo de ácidos graxos e estoque de triglicerídeos (JONES,

STANDRIDGE & MOUSTAID, 1997; KIM, DUGAIL, STANDRIDGE,

CLAYCOMBE, CHUN & MOUSTAID-MOUSSA, 2001). No entanto, na presença do

diabetes e do treinamento físico, o diferencial de expressão da ECA não interferiu na

resposta enzimática.

O treinamento físico tem sido fortemente recomendado para o tratamento do

diabetes, especialmente por melhorar os mecanismos envolvidos na captação de glicose

e exercer um potente efeito hipoglicemiante (MACKNIGHT et al., 2009; WELTMAN

et al., 2009). Um dos principais resultados encontrados no nosso estudo foi a redução do

nível glicêmico demonstrado pelo grupo 1T comparado aos grupos 1S e 3S,

confirmando a eficácia do treinamento físico para atenuar a hiperglicemia induzida pelo

diabetes apenas nos animais com 1 cópia do gene da ECA. Entretanto, no grupo 3T essa

resposta não foi observada. Se considerarmos que a quantidade de insulina não diferiu

entre os grupos, e que no teste de tolerância à glicose também não observamos diferença

alguma, independente do genótipo e do treinamento físico, a melhora glicêmica pode

estar associada às adaptações intracelulares responsáveis pela captação de glicose,

principalmente no músculo esquelético e no tecido adiposo.

A associação entre o SRA e a resistência à insulina tem sido demonstrada na

literatura (MATAYOSHI, KAMIDE, TAKIUCHI, HORIO, YOSHIHARA,

NAKAMURA, NAKAHAMA & KAWANO, 2007). A maior concentração de Ang II

influencia negativamente no metabolismo glicêmico (MACKNIGHT et al., 2009; XU,

ZHANG, COHEN & DIPETRILLO, 2010), onde a infusão de Ang II induz resistência à

insulina (RICHEY, ADER, MOORE & BERGMAN, 1999) e a utilização de

bloqueadores do SRA melhora a sensibilidade à insulina (FURUHASHI, URA,

TAKIZAWA, YOSHIDA, MONIWA, MURAKAMI, HIGASHIURA &

68

SHIMAMOTO, 2004). Isso ocorre porque a Ang II pode modular negativamente as

ações da insulina através da inibição da fosforilação do receptor IRS 1 no resíduo de

tirosina e também da inibição da sinalização intracelular via IP-3 (SHINSHI,

HIGASHIURA, YOSHIDA, TOGASHI, YOSHIDA, MIYAZAKI, URA &

SHIMAMOTO, 2007). Esses achados podem contribuir para justificar o efeito do

treinamento físico sobre a glicemia observado apenas no grupo 1T, pois embora os

valores de insulina sejam semelhantes, possivelmente a presença de maior quantidade

de ECA no grupo 3T pode ter contribuído para reduzir a ação da insulina ainda existente

nesses animais. Sendo assim, a capacidade do treinamento físico em atenuar a resposta

de hiperglicemia foi genótipo-dependente, ou seja, apenas os animais com menor

expressão de ECA foram beneficiados por essa resposta.

Embora não tenhamos estudado, é sabido que durante o exercício físico, devido

à necessidade de síntese de ATP, a proteína ativada por AMP (AMPK) atua nas vias de

captação de glicose e oxidação de ácidos graxos (MUSI et al., 2005; STEPHENS et al.,

2002). Por acionar um mecanismo independente da insulina para a captação de glicose,

a ação da AMPK tem sido bastante investigada em estudos que mostram o efeito

terapêutico do treinamento físico sobre o diabetes. De fato, PÁDUA, PÁDUA, PAULI,

DE SOUZA, DA SILVA, ROPELLE, CARVALHEIRA & ROPELLE (2009),

observaram que camundongos diabéticos ob/ob submetidos à sessão aguda de exercício

físico aumentaram a atividade da AMPK em 229,4%, e os diabéticos db/db aumentaram

a atividade em 288,5%, quando comparados aos seus respectivos grupos sem exercício

físico.

Sabendo disso, uma hipótese alternativa que poderia justificar a melhora

glicêmica no grupo 1T seria a resposta mais eficaz da AMPK ao treinamento físico

associada à menor expressão de ECA. Em um elegante estudo da ação da Ang II sobre a

69

atividade da AMPK e captação de glicose, SHINSHI et al., (2007) confirmaram o efeito

inibitório que a Ang II, através do receptor AT1, exerce sobre a captação de glicose via

prejuízo da AMPK. Embora essa via não tenha sido estudada em modelo de diabetes

por STZ, os dados obtidos por SHINSHI et al., (2007) fortalecem nossa justificativa

para melhora da glicemia apenas no grupo 1T.

A melhor resposta glicêmica observada no grupo 1T corrobora o melhor

desempenho físico apresentado por esse grupo no teste de capacidade de realização de

exercício físico em esteira quando comparado com os grupos 1S e 3S. Por outro lado, o

treinamento físico não foi capaz de promover essa resposta nos animais com 3 cópias do

gene da ECA (3T).

É sabido que as alterações metabólicas encontradas no diabetes podem refletir

diretamente na redução da capacidade de realização de exercício físico, tanto em função

dos prejuízos cardiovasculares (WICHI, MALFITANO, ROSA, DE SOUZA, SALEMI,

MOSTARDA, DE ANGELIS & IRIGOYEN, 2007), quanto de alterações morfológicas

e funcionais no músculo esquelético (STUMP et al., 2003; KRAUSE et al., 2009). De

acordo com KRAUSE et al., (2009), a redução da capacidade oxidativa muscular, a

alteração de tipagem de fibras e redução da capilarização estão entre os principais

mecanismos responsáveis pela redução da capacidade de realização de exercício físico

associado ao diabetes.

Conhecendo a importância do músculo esquelético para as respostas metabólicas

ao diabetes e ao treinamento físico e, considerando os estudos na literatura que

mostraram que indivíduos com genótipo II, que dispõem de menor quantidade de ECA

local e circulante, apresentam maior capacidade máxima de realização de exercício

físico comparados com genótipos ID e DD (MONTGOMERY et al., 1999; ZANG et al.,

70

2008 e WILLIAMS et al., 2010), investigamos algumas possíveis adaptações no

músculo esquelético que pudessem esclarecer o porquê de apenas o grupo 1T melhorar

a capacidade de realização de exercício físico.

Para nossa surpresa, independente do genótipo e do treinamento físico, não

foram encontradas diferenças estatísticas no peso dos músculos sóleo e gastrocnêmio

corrigidos pelo peso corporal, na tipagem de fibras musculares, na densidade de fibras

musculares, na razão capilar por fibra muscular e, finalmente, na atividade máxima da

enzima oxidativa citrato sintase. Nossos dados obtidos em animais diabéticos não

corroboraram os achados da literatura que mostraram melhora na atividade de enzimas

oxidativas, mudanças na tipagem de fibras e aumento na capilarização associados ao

treinamento físico aeróbio (DASTMALCHI et al., 2007; EVANGELISTA et al., 2003;

EVANGELISTA & KRIEGER, 2006; LEICK et al., 2009).

Um dos possíveis fatores que poderia justificar os resultados de músculo-

esquelético do nosso estudo foi o estágio da patologia no momento em que o

treinamento físico foi iniciado. Quando buscamos na literatura informações sobre os

benefícios musculares proporcionados pelo treinamento físico que auxiliam no

tratamento de doenças metabólicas, observamos que os efeitos significativos

normalmente aconteciam quando o treinamento físico era introduzido no estágio inicial

da doença. Por outro lado, SNIJDERS et al. (2010), quando avaliaram o efeito de 6

meses de treinamento físico em pacientes obesos e com diabetes tipo 2 há mais de 12

meses, não observaram diferenças na quantidade de massa muscular na perna e nas

características das fibras musculares, fortalecendo a idéia de que quanto mais precoce a

introdução do treinamento físico para auxiliar no tratamento de doenças metabólicas,

maiores serão os benefícios gerados por ele. No entanto, uma questão que não poderá ser

respondida através do nosso estudo é se o treinamento físico introduzido precocemente

71

seria eficaz para oferecer benefícios metabólicos no músculo esquelético dos animais

diabéticos e se isso estaria relacionado ao genótipo da ECA.

Assim, os dados obtidos no presente estudo apenas sugerem que após um

período crônico de hiperglicemia, observa-se redução do potencial do treinamento físico

para promover adaptações metabólicas musculares que poderiam contribuir para atenuar

a progressão do diabetes no modelo experimental investigado. Em decorrência disso,

parece que a melhora na capacidade de realização de exercício físico apresentada pelo

grupo 1T está mais associada à melhora no metabolismo glicêmico do que propriamente

aos efeitos do treinamento físico sobre as variáveis músculo-esqueléticas estudadas.

7. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos no presente estudo nos permitem afirmar que as respostas

metabólicas provocadas pelo diabetes não foram associadas ao aumento da expressão de

ECA e, que o treinamento físico foi capaz de atenuar parcialmente os prejuízos

metabólicos induzidos pelo diabetes apenas nos animais com 1 cópia do gene da ECA.

72

8. REFERÊNCIAS

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1. INTRODUÇÃO - USP · minimizar os efeitos deletérios do diabetes em seus principais órgãos...

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