EFEITOS EM MACROMOLÉCULAS

PROTEÍNAS

Estrutura dos 20 aminoácidos que compõe as proteínas

IMPORTÂNCIA DAS LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS

1. Ligações covalentes não podem ser as responsáveis pelas interações entre moléculas na célula, pois, por definição, numa ligação covalente os átomos unidos devem pertencer a uma mesma molécula.

2. Ligações fracas ocorrem entre átomos de uma mesma molécula ou moléculas diferentes.

3. Uma ligação química é uma força atrativa que mantém átomos juntos.

4. HbA é mantida por ligações fracas.

5. Ligações fracas são facilmente quebradas.

6. Dois H mantidos por ligação covalente H2 são separados por 0,74 A

enquanto que por Van der Waals 1,2 A

7. O máximo de ligações covalentes no de valência (oxigênio tem 2 valências)

8. No caso de ligações fracas, o fator limitante é puramente espacial

9. O ângulo entre duas ligações covalentes é sempre o mesmo. Por exemplo:

para ligações fracas o ângulo é variável

10. Quanto mais forte a ligação, maior a energia liberada por ela.

A + B AB + energia

CH

H

H

H

Todos tem 109o

11. CALORIA

Cal quantidade de energia necessária para elevar a temperatura de 1 grama de água de 14,5 para 15,5 oC.

Em geral, usa-se kcal/mol

1kcal = 26 eV

12. As ligações podem ser quebradas por calor, radiação, etc.

AB + energia A + B

13. No equilíbrio temos:

conc. AB

conc. A x conc. BKeq =

14. Energia livre é a energia capaz de realizar o trabalho (G )

G (G é negativo) reação espontânea

no equilíbrio G = 0

15. Quanto mais forte a ligação, maior a mudança na “energia livre” que acompanha a sua formação, maior o no de átomos ligados.

16. G = - R.T.lnKeq R=1,987 cal/o/mol Keq = e - G / RT T = temp. absoluta

Keq = cte equilíbrio

Keq G kcal/mol0,001 4,0890,01 2,7260,1 1,3631,0 010 -1,363100 -2,7261000 -4,089

Temperatura = 25oC (298K)

G para ligações covalentes (H, O, etc) é da ordem de -50 a -110 kcal/mol keq muito alta, portanto a concentração de átomos não ligados será muitopequena.

17. Ligações fracas têm energias que variam de 1 a 7 kcal/mol e são constantemente feitas e quebradas.

18. Moléculas polares facilitam a formação de ligações fracas.

O2-

H+

H+

0,95 A

Raio de Van der Waals p/ o oxigênio é 1,4 A

Raio de Van der Waals p/ o hidrogênio é 1,2 A

105o

19. Tipos de LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS

a) Forças de Van der Waals

b) Pontes de hidrogênio

c) Ligações iônicas

d) Ligações hidrofóbicas

20. Van der Waals

Força atrativa que se origina pela aproximação de dois átomos ou moléculas.

Energia 1 kcal/mol

Átomo Van der Waalsraio -

H 1,2N 1,5O 1,4P 1,9S 1,85CH3 2,0

A

21. Pontes de hidrogênioEnergia varia entre 3 a 7 kcal/mol. Aparece um hidrogênio ligado covalentemente com alguma carga positiva e um aceptor ligado covalentemente, porém carregado negativamente.

Átomos Distância AO – H--------O 2,70O – H--------O- 2,63O – H--------N 2,88N – H--------O 3,04N+ - H--------O 2,93NH-----------N 3,10

10 A

fraca

5 A

forte

4 A

atração e repulsão balanceadas

A soma de vários átomos ou moléculas pode chegar a 10 kcal/mol.

CR C = O

C = O

H

H

H N

C

R

Entre grupos peptídicos

C = O H O

H

H

C

H

Entre grupos OH

H O-O C = O

H O-N+

H

C = O

H

Entre COO- e OH da Tyr

Entre NH3+ e COO-

H O = CO

N

C C

H H

R

HEntre OH da Serina e um grupo peptídico

Ponte de Hidrogênio são mais fortes quando apontam diretamente para o aceptor

H O

OH

mais forte mais fraca

OHH

O

22. Ligações iônicas

Têm energia média de 5 kcal/mol

Ocorrem entre moléculas que têm uma ou mais unidades de carga positiva ou negativa líquida.

Ex: COO- e NH3+

23. Ligações fracas necessitam de superfícies complementares (chave - fechadura).

24. Moléculas de H2O formam pontes de hidrogênio. Moléculas orgânicas que formam pontes de hidrogênio são solúveis em água.

25. Moléculas não polares como o Benzeno, em água tendem a se unir ligações hidrofóbicas (tendência da água a excluir grupos não polares)

26. Ligações fracas participam das ligações E - S, dão flexibilidade e a forma das moléculas.

27. Algumas moléculas formam hélices e subunidades.Ferritin tem PM 480.000, porém não contém uma única cadeia de 4.000 a.a. , mas 20 polipeptídeos idênticos de cerca de 200 a.a.

28. Subunidades são econômicas e diminuem o erro de síntese

Formação de estrutura secundária das proteínas

Formação de estrutura terciária das proteínasExemplo: hemoglobina humana

Formação de estrutura quaternária das proteínasExemplo: hemoglobina humana

Deoxihemoblobina Oxihemoglobina

Interação Enzima – SubstratoEstrutura terciária da Hexokinase A

Formação de agregação de proteínas

Ação da radiação

DIRETA

INDIRETA

AÇÃO DIRETA1. Absorção de Energia

Excitação e Ionização

2. Processos de transferência de Energia

ESR (Ressonância Eletro Spin)

R S

Termoluminescência

Adição de 3H

3. Formação de moléculas danificadas estáveis

4. Características da ação direta

4.a. Relação dose-efeito

Teoria do alvo A = Ao . c

Beauragard (1985), Kempner (1986)

temperatura dependente

Swillens (1986) - considera “target” e a eficiência do “hit”

processo multievento estocástico

“Teoria do alvo – target size”1. Num organismo vivo temos um ou mais “target(s)”.

2. A interação da radiação com um organismo vivo é ao acaso

3. Um “hit” ou uma interação da radiação com o target mata, inativa ou induz um efeito radiobiológico no organismo

4. A probabilidade de produção de um hit é proporcional ao tamanho do target.

5. Para radiações de alta energia ocorre o que chamamos de ionizações primárias.

6. Uma ionização primária envolve 66 eV de energia 1500 kcal/molLigação covalente 100 kcal/molPonte de hidrogênio 7 kcal/mol

7. Como as ionizações ocorrem ao acaso, a probabilidade de ocorrer 0, 1, 2, ..., n ionizações é dada pela fórmula de Poisson

P(n) = e-x (X)n

n!Onde x é a função da exposição à radiação.

8. Como a energia é muito alta cada vez que ocorre

1 HIT INATIVAÇÃO BIOLÓGICA

9. A probabilidade de não ocorrer ionizações é

P(0) = e –x

A curva de sobrevivência ou atividade biológica medida após várias exposições decrescerá como uma simples exponencial

A= A0.e-KD

A = Atividade após a dose D de irradiação

A0 = Atividade inicial

A exposição é dada em unidades de ionização primárias por cm3

K é a constante característica de cada atividae biológica cuja uniadade é volume (cm3 )

K é chamado RADIATION TARGET ou VOLUME SENSÍVEL

Como as ionizações ocorrem ao acaso e a energia é alta: a sensibilidade é independente da FORMA e da COMPOSIÇÃO QUÍMICA do alvo

Para radiações não ionizantes, por exemplo UV, a energia absorvida depende de fatores tais como presença de ANÉIS AROMÁTICOS, PTES. DE ENXOFRE, etc.

O target size K é obtido a partir da dose 37% ou D37 que é a dose necessária para reduzir a atividade para 37% da inicial.

A = 0,37 A0

0,37 A0 = A0. e-KD37

ln 0,37 = -1 = -KD37

K = 1 D37

Cálculo do Peso MolecularConsiderando:

1. RAD é a deposição de 100 ERGs de energia por cm3 de material.

2. Densidade da proteína.

3. O número de Avogadro.

4. Uma série de dados obtidos por radiação.

Chegou-se a uma equação empírica

Peso molecular = 6,4 x 1011

D37 D37 em RADs

1. Se tivermos mais de uma molécula, teremos soma de exponenciais

2. Só é válido para efeito direto da radiação (irradiação a seco)

Exemplos da literaturaEnzima PM x 10-3 Target size Radiação

Malato desidrogenase

74 73 e-

Catalase 232 230 RX

Lisozima 14 15 e-

ATPase 284 280 e-

Glutamato desidrogenase

320 300 e-

Fosforilase de amido

215 210

Enzima PM x 10-3

No. de cadeias

PM x 10-3

Target size

Radiação

Álcool Desidrogenase

141 4 35 37

Xantina Oxidase

300 2 150 125

Glucose e Fosfatase

130 2 63 70

Peroxidase 40 14

Amilase 96 2 48 46

Fosfatase Alcalina

140 2 69 70 e-

Crotoxina1. É a toxina mais potente do veneno de cascavel brasileira2. PM por várias técnicas: 23. 0003. Cristalizável4. Contém duas subunidades

CROTAPOTIN = PM 8 000

FOSFOLIPASE A2 = PM 13 000TOXICIDADE

Crotoxina: LD50 = 0,05 mg/kg camundongo

Fosfolipase A2 : LD50 = 0,55 mg/kg camundongo

Crotapotin: LD50 100 mg/kg camundongo

A interação das duas proteínas aumenta a toxicidade 10 vezes (não covalente)

Importância da fosfolipase A2

C

O = P

R

O

O

C H2C

O

C = O C = O

O

HH

H

xxxx

xxxx

1 2 3

1,2 diacilfosfoglicerídeos

R = colina

Fosfolipase A2

POLAR

APOLAR

- CH2 - CH2 - N+ - CH3

CH3

CH3Leticina

A dor é provocada pelo estímulo do receptor da dor, que é chamado nociceptor.

PEI2 e PGE2 agem na membrana destes receptores alterando a atividade elétrica, produzindo estímulos de dor levados pelos nervos sensitivos ao sistema nervoso central.

Bactérias Pirogênio exógeno Macrófagos Pirogênio endógeno Circulação C.N.C. PGE2 Altera o centro regulador do hipotálamo Temp. 37oC do sangue como fria Ordena vaso constrição periférica Evita perda de calor. Ao mesmo tempo Tremores gera calor.

Isto tudo leva à febre.Aspirina age no mesmo ponto.

Mecanismo de açãoJ.R. Vane (Nobel, 1982)Sérgio H. Ferreira - Med. Rib. Preto década de 70

COOH

Fosfolipídeos da membrana

Fosfolipase A2

O

O

HO

O

COOH

COOH

Ácido aracdônico

Ciclo oxigenase

Endoperóxidos cíclicos

Prostaglandinas clássicas

OHOH

OO

COOH

ASPIRINA

Prostaciclina

PGE2

PGI2

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

1. Irradiação de Fosfolipase A2 e Crotoxina 1mg/mL - Liofilizada - em placas de Petri, elétrons acelerados com doses de 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 Mrad.

2. Dissolução das amostras em solução fisiológica.

3. Determinação da atividade enzimática usando gema de ovo como substrato e glóbulos vermelhos de rato.

DoseMrad

% Ativid. DoseMrad

% Ativid.

0 100 0 1005 70 5 56,4

10 23 10 49,315 18 15 4020 17 20 24,225 15 25 24,230 12 30 19,2

FOSFOLIPASE A2 CROTOXINA

D37 = 8 MradPM = 80 000Agregação ?

Em gráfico semi logD37 = 19 MradPM = 33 000

4.b. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas

b.1 Temperatura

0

100

30 60Dose Mrad

Ati

v. E

nz.

310 K

195 K

77 K

Inativação da Ribonuclease por 60Co () no vácuo

b.2. Presença de O2

0

3

720Mm Hg

Rad

ioss

.

2

1

Radiosensibilidade da Tripsina seca, irradiada com 60Co

D37 oxigênio

D37 no vácuo

b.3. Presença da segunda molécula

Radiosensibilidade relativa de enzimas no estado sólido irradiadas na presença de diferentes aditivos

Aditivo Invertase Ribonuclease UreaseNenhum 1,0 1,0 1,0Cisteína 0,5 - 0,5 – 0,7Glutationa 0,5 0,52 0,10 -Extrato de lev. 0,45 0,52 10 0,8Tampão acetato 1,4 – 1,6 4,8 1,4 -Sacarose - 2,6 0,5 -NaCl 1,5 – 3,5 0,98 0,21 -

D37 nenhum / D37 aditivo

b.4. Conteúdo de água

6

12

14 28% água

Dos

e 37

x 1

0 6

Arilesterase

Colinesterase

b.5. Efeito do pH

2

10

3,5 8,5pH

Dos

e 37

x 1

0 6

6,5

Deoxiribonuclease dissolvida em tampão fosfato pH 3,5 - 8,5, liofilizado e inativado com 60 Co

AÇÃO INDIRETAReação entre as moléculas do soluto e as espécies reativas do solvente, formadas pela ação direta da radiação

1. Espécies reativas da água

H2O H + OH + e-aq + H2 + H2O2 + H3O+

Valores de G a pH neutro

Produto Ge-

aq 2,6H 0,6OH 2,6H2 0,45H2O2 0,75

2. Algumas reações dos produtos da radiólise com o soluto

2.a. Abstração de átomos de H

R H + H R H2

2.b. Reações dissociativas

R NH3+ + e-

aq R +NH3

2.c. Reação de adição

C=C CCOH

OH

HH H

RR

+ R

R

2.d. Dimerização e adição

NH2 CH2 COOH

NH2 CH2 COOH

NH2 CH2 COOH

CH2 COOH

H e- aq

Glicina

NH2 CH COOH

CH2 COOHÁcido aspártico

2.e. Reações de desprotonação

2 CH3 CH2 OH 2 CH3 CH OH

CH3 COH

CH3 CH2 OHálcool

álcool

acetaldeído

2.f. Hidrólise

RCO NH CH R2 RCO NH CH R2

RCOR

RCO NH2 + H2O

OH

0

1

5 X 10-1

G

0,1

0,01

DNA ase

G de inativação

0

1,0

1,0 100

Conc. DNA (%)

0,1 10

G 0,5

G da formação de grupos monofosfatos (quebras simples da cadeia)

2.h. Transferência de H

2.g. Adição de oxigênio

RO2O2 RO2HR +

CH2OH CH3OHRSH+ RS+

3. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas frente à radiação indireta

3.a. Concentração do soluto (‘efeito da diluição’)Geralmente o efeito da diluição está entre 0,1 e 10%

para macromoléculas e para moléculas pequenas, como a glicina, entre 10-3 a 10-1 M.

0

2

1,0

1Fra

ção

rel

ativ

a

Conc. Carboxi Peptidase

conc x concdose

3.b. Presença do segundo solutoTipo de reação competitiva (Scavengers)

3.c. Efeito do oxigênioEm algumas moléculas o O2 pode aumentar o dano de 2 ou 3 vezes. Embora isto não seja observado em algumas enzimas e no DNA.

3.d. Efeito do pHO pH altera a distribuição de cargas na superfície molecular além da conformação molecular.

3.e. Efeito do tipo de radiação LET é menos efetivo em soluções diluídas

Mudanças na estrutura primária1. Destruição de aminoácidos entre proteínas

2. Gly e Ala

3. Cys, His, Met, Phe, Tyr, Trp estão entre os mais radiosensíveis

4. Formação de grupos carbonilas a partir de quebras da ligação C - N

5. Formação de fragmentos de PM formação de agregadosPor exemplo: crosslink s poli ala

poli phe

Mudanças na estrutura secundária1. Desestabilização das pontes de H2. Agregação

Por exemplo:

10

10 50

% a

min

o gr

upos

de

Lys

ñ n

ativ

os

20

30

40 globulina

BSA

Dose x 10-6 radelétrons de Z MeV

1. Estrutura quaternária2. Dissociação de subunidade

Ocorre, em seguida, uma reação em cadeia que pode ser interrompida de duas maneiras

H + H2O2 OH + H2O

OH + H2 H + H2O

Que termina

OH + H H2O

ou

OH + H2O2 HO2 + H2O

HO2 + H H2O2

Do ponto de vista de rendimento, quando a radiação atinge moléculas de água, temos:

28% de ionização

26% de excitação

47% de superexitação

H2O H2O H + OH

H2O H2O+ + e-

H+ + OH

+ H2O H2O- H + OH-

e- + H+ H

+H2O e-aq

H2O + H2O H2O- H + OH-

exitação

ionização

EFEITO DA RADIAÇÃO

ULTRAVIOLETA - UV

Efeito da radiação UV

A) Absorção

UV causa como efeio biológico excitação de parte das macromoléculas. O primeiro passo é a absorção de QUANTA - um processo que ocorre ao acaso

QUANTA: São pulsos de energia que para uma dada frequência de luz que tem a mesma energia definida como

E = hh = cte. de Plank = 6,63 x 10-34 J. seg

1 eV = 1,6 x 10-19 Jaule

A absorção ocorre ao acaso e segue a equação:

I/I0 = e-nsl

I = Intensidade transmitida

I0 = Intensidade incidente

n = número de partículas absorventes/cm3

l = comprimento do trajeto da amostra em cm

s = cte. que depende da natureza das partículas e comprimento de onda da radiação

B) Rendimento quântico

A probabilidade da UV provocar uma alteração mensurável é pequena porque a energia pode ser dissipada como fluorescência ou calor.

Esta probabilidade é chamada rendimento quântico , que é o número de partículas danificadas pelo número QUANTA absorvido.

é da ordem de 10-2 ou menos para macromoléculas biológicas

C) Radiação Monocromática

Usando-se prismas que filtram a luz UV, obtém-se bandas da ordem de 20 A com intensidade suficiente para produzir efeitos biológicos.

D) Curva Dose-Efeito

A inativação de enzimas obedece a equação:

N/N0 = e- D

Onde: D = dose em QUANTA/cm2

= é a sensitividade que varia com o comprimento de onda

Se D = 1 N/N0 = 1/2 = 37%

Dose = 37%

CURVAS DE INATIVAÇÃO

% s

obre

vida

QUANTA / cm2 x 10-21

% s

obre

vida

QUANTA / cm2 x 10-21

% s

obre

vida

QUANTA / cm2 x 10-21

% s

obre

vida

QUANTA / cm2 x 10-21

30 60

10

100

1 1

11

10

10

10

100 100

100

2967 A

2967 A

2650 A

2805 A

0,01 0,02 0,03

2650 A 2537 A

2375 A

4 8

2400 A

2650 A

10 20

3023 A2303 A 2652 A

C) Inativação de DNA de haemophilus influenzae

A) Inativação de gramicidin (11 a a )

B) Inativação de Bacteriófago T2

D) Inativação de Hema glutinina de vírus influenzae

AÇÃO EM PEOTEÍNAS E SEUS CONSTITUINTES

Pode ocorrer- Rompimento de ponte C - C- Desaminação- Oxidação para formar carboxil ou ceto grupos- Transferência de amino grupos

Phe, Tyr, Trp e cistina são os mais sensíveis. Deles, cistina é o mais sensível

para produzir cisteína é 0,2; para formar NH3, H2S é 0,04 e 0,02 respectivamente

para produzir NH3 a partir de Phe, Tyr e Trp é 0,002

para destruição de cistina é 0,13; 10 vezes maior que para os aa aromáticos

INATIVAÇÃO DE ENZIMAS E A.A.Os QUANTA absorvidos pela cistina são os maiores responsáveis pela inativação por causa do rompimento das pontes S - S.

% 1/2 cistina

0,01

0,03

0,02

T

CHT

CHTDD

PAC

L R

I

I - insulinaR - RNAaseL - lisizimaCH - quimiotripsinaP - pepsinaTD - triposfato desidrogenaseA - aldolaseD - DNAaseC - catalaseG - gramicidinCHT - quimiotripsinogênio

medido em água ou com proteína seca dá resultados semelhantes solvente parece não ser importante.

RNAase dá mesmo para 95% etanol ou 100% H2O.

Comprimento de onda é importante para algumas enzimas.

pH: não parece ser importante - lisozima tem mesmo a pH 3-12.

T menor sensibilidade das proteínas

O2 não afeta

Conc. da proteína não afeta