Seminário – Teste Elisa

1. Definição

Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de

antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e

especificidade, tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e

aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é o ELISA,

do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção

Ligado a Enzima).

O Elisa se baseia na identificação de anticorpos e ou antígenos, por

anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age

sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno (microrganismo

que produz coloração no meio onde se encontra) mude de cor. O produto

da reação, além de colorido, é insolúvel para não difundir do local da

formação. Foi inicialmente desenvolvido por Engvall & Perlman e por van

Weeman & Schuurs e, posteriormente, muito utilizado como teste

diagnóstico em varias doenças.

2. O teste

Quando o sistema imunológico do corpo encontra um antígeno específico (por exemplo, uma proteína característica na superfície de um vírus ou bactéria), os anticorpos que são específicos para o antígeno interceptam-no com uma ligação física a ele em uma "chave e fechadura", neutralizando assim o antígeno. O ELISA é uma técnica fundamental para avaliações imunológicas e bioquímicas, utilizada para detectar o antígeno ou anticorpo em uma amostra, com base em interações anticorpo-antígeno. Se um antígeno (ou da mesma forma, um anticorpo) é detectada, um sinal é produzido na forma de uma mudança mensurável. Para avaliar a presença de um antígeno específico, em uma amostra, um "teste de ELISA" pode ser realizado da seguinte maneira: Uma solução de anticorpo, que é específico (isto é, tem reconhecimento exclusivo) ao antígeno putativo, é imobilizado em uma superfície sólida em um poço de uma placa de microtitulação. É aplicado em seguida à amostra a ser analisada condições que permitam o antígeno ligar-se aos anticorpos imobilizados específicos. O material não ligado é lavado, e o antígeno ligado é reconhecida mais uma vez em condições de ligação com a adição de uma solução de um segundo anticorpo específico para o mesmo antígeno, que desta vez é acoplado ou ligados a uma enzima que catalisa a conversão de seu substrato a uma forma detectáveis e possivelmente quantificável. Esses anticorpos ligados a uma enzima que estão vinculados ao complexo antígeno-anticorpo imobilizado são resistentes a ciclos de lavagem e, finalmente, o substrato é adicionado e incubado de modo que a enzima pode catalisar a conversão do substrato para o sinal de detecção do antígeno específico . ELISAs costumam empregar qualquer um substrato cromogênico ou um fluorogênico, que produz uma cor ou

fluorescência, respectivamente, após a conversão pela enzima ligada ao segundo anticorpo. Conversão do substrato é convenientemente observada ou quantificada em um leitor de placas, por medidas de densidade óptica ou intensidade de fluorescência. Em resumo, mudar a cor ou a fluorescência sinaliza a atividade da enzima, que sinaliza a presença do segundo anticorpo, que sinaliza a presença do antígeno procurado.

3. Interpretação

A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional a

quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presente no

soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotômetro

(Leitores de Elisa), permitindo uma análise quantitativa.

4. Equipamentos

a) Placa de Elisa

Onde a reação é desenvolvida. São microplacas contendo vários

poços (wells) onde são depositados os reagentes.

b) Pipetas Automáticas

Depositar os reagentes

c) Leitor de Elisa

Permite uma análise quantitativa precisa dos resultados

(espectrofotômetro)

d) Lavador Automático de Placas

5. Enzimas

São elas que convertem um substrato sem cor em um produto de cor. A

enzima mais comumente utilizada neste teste é a peroxidase, que

catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em

H2O mais O2.

6. Tipos de Elisa

Indireto

O método indireto é utilizado para detecção de anticorpos. Neste caso o

antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida coloca-se o soro

problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage

com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de

cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem

de cor indica a ausência do anticorpo em questão.

Existem vários modelos de testes de ELISA; em sua forma mais

simples,chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um suporte sólido

(placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em

teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno. Se

houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação

antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um

segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se

busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à

peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se

conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é,

H2O2 dissolvida em uma substancia química que dá uma reação colorida

quando H2O2 é desdobrada). Os orifícios onde ocorreu a reação

antígeno-anticorpo apresentam uma coloração (variável dependendo do

substrato).

Direto ou sanduíche

O método de sanduíche, ou captura, é indicado para identificação de

antígenos, e este antígeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo

primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca. Em

seguida o antígeno na solução problema é adicionado. Depois o segundo

anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado.

Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude

de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços

que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão.

Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE. Nesse

método, o anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no

well. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é

adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente

anticorpo ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é

proporcional à quantidade de antígeno presente. Logo, permite mensurar até

pequenas quantidades de antígeno.

Competitivo

O método competitivo é mais usado para identificação de antígenos, mas pode

também ser empregado para a detecção de anticorpos. Neste método primeiro

se adsorve o anticorpo no poço da micro placa. Após a adsorção do anticorpo,

uma solução que possivelmente contém o antígeno é adicionada sobre os

anticorpos adsorvidos. O próximo passo é adicionar o antígeno marcado com

uma enzima. Os poços que não possuem o antígeno primário (da solução

problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poços que

possuem antígenos aderidos aos anticorpos não mudam de cor.

7. Curva Padrão

Em geral, faz-se uma CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira

com concentrações crescentes e conhecidas de antígeno. A curva serve como

padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas

soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura

de ELISA.

8. Diagnóstico por ELISA

Dermatoses bolhosas autoimunes são doenças cuja manifestação cutânea

primária e fundamental consiste em vesículas e bolhas. Classificam-se

conforme a localização da bolha, em intraepidérmica e subepidérmica. Os

pacientes produzem autoanticorpos contra estruturas específicas da pele

detectáveis por técnicas de imunofluorescência, immunobloting e Elisa. Os

recentes avanços da biologia molecular e celular têm permitido conhecer

esses autoantígenos, contra os quais os pacientes se sensibilizam e que

estão localizadosna epiderme ou na junção dermoepidérmica. São doenças

de baixa incidência, porém de elevada morbidade e por vezes letais. O

objetivo deste trabalho é revisar e descrever os progressos nos

conhecimentos de quatro doenças vésico-bolhosas autoimunes: pênfigo

foliáceo endêmico (fogo selvagem), pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso e

dermatite herpetiforme.

Fogo Selvagem

FS é uma doença autoimune de causa desconhecida, provocada por auto-

anticorpos patogênicos antiepiteliais e responsáveis pelo fenômeno da acantólise.

Os auto-anticorpos são do tipo imunoglobulina G (IgG), predominando o subtipo

IgG4. Os auto-antígenos contra o qual os anticorpos antiepiteliais reagem e a

desmogleina 1 (Dsg1), molécula, da família das caderinas, que compõe os

desmossomos, glicoproteina transmembranica com uma parte intracelular

(endodominio) e vários domínios extracelulares (ectodominio – EC). Demonstrou-

se que os auto-anticorpos do FS em pacientes com doença em atividade reagem

contra os ectodominios EC1 e EC2, que são os dominios extracelulares da Dsg1

mais afastados da membrana celular.

Elisa - Na atualidade, para o teste de Elisa, existem preparações comerciais de

desmogleinas a ser testadas com os soros dos doentes.

Pênfigo vulgar (PV)

Doença bolhosa intra-epidérmicas que afeta pele e mucosas, potencialmente fatal.

Elisa - Os anticorpos circulantes IgG no PV podem ser detectados no teste de Elisa,

usando Dsg1 e Dsg3 recombinantes.

Penfigóide bolhoso (PB)

Doença autoimune,crônica, limitada, com formação de bolhas, principalmente em

indivíduos idosos, de todas as raças. Alguns casos têm sido descritos na infância. Os

casos ocorrem esporadicamente, e não há evidênciasde que exista um componente

genético no desencadeamento da doença. Autoanticorpos da classe IgG são

identificados e dirigem-se contra antígenos designados como BP 230 Ag1 e BP 180

Ag2 . O BP 230 localiza-se na placa hemidesmossômica intracelular, e o BP 180 é

glicoproteína transmembrânica, cujo domínio extracelular ultrapassa a lâmina lúcida da

zona de membrana basal.

Elisa: Na atualidade já se dispõe comercialmente do teste de Elisa para detectar os

anticorpos circulantes do PB, contra os antígenos BP180 e BP230. Trata-se de teste

prático e de fácil execução, podendo ser útil para prever recidivas da doença após

interrupção da terapia.

Dermatite herpetiforme

Dermatite herpetiforme (DH) é doença clinicamente caracterizada por lesões

urticariformes e bolhas associada à enteropatia sensível ao glúten (doença celíaca).

Nessa doença, há presença de IgA de forma granular, grumosa, pontilhada ou fibrilar

ao longo da zona da membrana basal (ZMB).

Elisa: Anticorpos IgA contra transglutaminase tecidua atualmente são considerados

diagnóstico sorológico marcador de DH e doença celíaca. A transglutaminase

epidérmica é considerada o autoantígeno das lesões cutâneas na DH, e ocorrem

reações cruzadas entre os anticorpos que reconhecem as transglutaminases

epidérmica e intestinal.