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Técnicas em Biologia Molecular

No final da década de 50 os cientistas aprenderam a caracterizar, manipular e isolar os componentes moleculares (DNA, RNA, proteínas) de células e microorganismos.

Técnicas em Biologia Molecular

•Clonagem•ELISA •PCR•Probind and Blotting (Western blotting)•Arrays•Oligonucleotídeos específicos

Técnicas em Biologia Molecular

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

ELISAELISA

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

ELISA é um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos/antígenos específicos no plasma sanguíneo. Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças que induzem a produção de imunoglobulinas.

ELISAELISA

APLICAÇÕES

• Doenças infecciosas (HIV...)• Detectar alergia a alimentos (leite, ovo...)•Identificação de antígenos (hormônio da gravides, alergia a drogas...)• Doenças auto-imunes•Concentração sérica de anticorpos

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura.2Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades mínimas de uma substância em particular e com grande confiabilidade.3Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados.

Componentes

•Anticorpo ou Ag ligado•Enzima ativa•Substrato•Produtos solúveis

2 Enzyme-linked Ab

Serum Ab

Antigen

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.2É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.

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CARACTERÍSTICAS BÁSICAS1Elementos necessários para a realização:2Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)3Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)4Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos5Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos6Amostras a serem testadas7Placa de poliestireno8Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes9Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima10 Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor11 Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO)

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CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

•Vantagens•Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.•Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos.•Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.•Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

•Desvantagens•Necessidade de mão de obra especializada.•Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas.•Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.

PRINCIPAIS TIPOS

•INDIRETO: detecta principalmente Ac•DIRETO: detecta principalmente Ag•COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes)•CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide)

1. ELISA INDIRETO

1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços

2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços

3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags

4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags

5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs

6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre

7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor

ELISA INDIRETO1Interpretação dos resultados:2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da amostra pesquisada.3Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio. Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os negativos.O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.

www.labimuno.org.br

ELISA INDIRETO1Aplicações na medicina humana e veterinária:2Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.3Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS.4Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite Caseosa e da Leishmaniose.5OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator reumatóide.

www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html

ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE1Interpretação dos resultados:2A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ag da amostra pesquisada.3Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.

ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE

•Aplicações na medicina humana e veterinária:•Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.•Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).•Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos alimentos).

www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html

HIV Terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato.

Quarta geração já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV (a proteína p24), fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.

Um resultado reagente num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por outros testes específicos, como é o caso do Western blot, que detecta proteínas deste vírus, e do PCR, que detecta os seus ácidos nucleicos virais.

Gerações do ELISA

Os exames de anticorpos são relatados como positivos ou

negativos. O desempenho destes exames é descrito em termos de:

■sensibilidade — a percentagem dos resultados que serão

positivos quando o HIV estiver presente.

■especificidade — a percentagem dos resultados que serão

negativos quando o HIV não estiver presente.

Todos os exames de diagnóstico têm limitações, e, algumas vezes,

o seu uso pode produzir resultados errôneos ou questionáveis.

■falso positivo — os resultados indicam que o HIV está presente,

quando, na verdade, não está.

■falso negativo — os resultados não identificam o HIV, que está

presente.

www.youtube.com/watch?v=elisaUb4vmt0