(“enzyme-linked immunosorbent assay”)

Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003

Aula 10

-O teste é feito em placas plásticas de microtitulação ou em tubos ( suporte sólido ), onde se coloca o Ag ou Ac em concentrações adequadas. -Utiliza-se principalmente placas de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços.

-O teste identifica e quantifica Ag ou Ac presente na amostra (soro do paciente ou outro líquido biológico), utilizando um dos dois mencionados reagentes, conjugados com enzimas.

-A reação ocorre em meio líquido. A atividade enzimática é proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra.

-A quantidade de Ag ou Ac da amostra é mensurada pela determinação da quantidade de produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro.

-O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de umasubstância indicadora).

-Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.

.Lavagem para retirada de Ag livre:

.Lavagem para retirada de Ac não fixado:

.Adição do conjugado:

.Incubação

.Incubação

.Poços de uma fileira horizontal da placa,revestidos com o mesmo Ag padronizado

.Adição de soro-teste: (1) e (2)

ELISA indireto

.Lavagem para retirada de conjugado livre

.Adição de cromógeno que é ativado pela parte enzimática do conjugado

.Positivo .Negativo

.Placa de ELISA evidenciando o resultado:

Cont. negativoCut-offCont. positivo

No diagnóstico sorológico de doençasinfecto-contagiosas, onde a detecção

de anticorpos IgG, IgA ou IgE seja signifi-cativa. A detecção de IgM por esta técnicapode levar a resultado falso-positivo, poração do fator reumatóide, autoanticorpoque quase sempre é uma IgM anti-IgG.

Exemplos onde o seu uso é intenso: diagnós-tico sorológico da Doença de Chagas e da

SIDA/AIDS

Utilização do ELISA indireto:

“Cut-off”: ponto de corte.

ELISA sanduíche

1. Placa de Elisa revestida com Ac específico

2.Adição de solução-teste contendo Ag

3. Lavagem para retirada

do Ag não capturado

4. Adição de outro Ac marcado, nova lavagem e revelação

Utilização: esta técnica é muito usada para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos, nas fezes, na urina em secreções etc. Pode detectar 10-12 a 10-14g.

Para este teste se tornar quantitativo,é necessário a construção de umacurva com os valores de densidadeótica obtidos a partir da reação comquantidades conhecidas (padrões) do antígeno a ser dosado. O valor deD.O. obtido com a amostra (teste), será então usado para interpolação na mencionado curva.

ELISA por competição

1. Placa de Elisa revestida com Ac específico

4. Quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida

3. Lavagem para retirada de excesso de Ag

2. Adição de Ag-teste:

Adição de Ag-marcado:

Competição para ligar Ac

Utilização:

Na dosagem de hormônios, marcadores tumorais e ou-tras proteínas séricas. Nodiagnóstico sorológico de algumas doenças como SIDA/AIDS

ELISA de CapturaEsta técnica é muito utilizada para dosar IgM, para se evitar a ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um autoanticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Observe agora uma ELISA de captura para pesquisa de IgM humana contra T.gondii:T.gondii:

-Poço revestido com IgG monoclonal contra IgM

humano

-Adição da amostra (contendo IgM) -Incubação-Lavagem

-Adição de Ag do T.gondiiT.gondii marcado com enzimamarcado com enzima -Incubação

-Lavagem

-Adição de cromógeno ( )/ substrato ( ) -Incubação

-Adição de reagente bloqueador (solução de parada)-Revelação: leitura em fotocolorímetro.

Utilização do ELISA captura:

É principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários etc.), em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, to-xoplasmose ou citomegalia da gestante.

Os testes “ELISA” são realizados: de modo totalmente manual, no qual até a leitura final no fotocolorímetro é feita poço a poço; parcialmente manual, no qual as lavagens e leitura final são feitas em equipamentos automáticos e, finalmente, de modo totalmente automatizado, no qual todo o procedimento é executado em “ sistemas automáticos de imunoensaios”, equipamentos “robôs”, com todas as etapas do teste guiadas por computador. Abaixo é apresentado um desses sistemas, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA:

Equipamento automático para realização de “ELISA”