TLC - Cromatografia de camada fina - uma.pt · Química Analítica / JCM TLC - Cromatografia de...

Química Analítica / JCM

TLC - Cromatografia de camada fina

� Cromatografia de camada fina� TLC - Thin Layer Chromatography

� planar / adsorção / zonal / analítica

� possibilidade de desenvolvimento bidimensional e

� de quantificação

� Fases estacionárias� Adsorventes / diferentes de absorventes

� actividade de um adsorvente é determinada pela sua área superficial, a sua natureza química e o arranjo geométrico dos átomos superficiais

� propriedades de um adsorvente:☺ não deve dissolver na fase eluente☺ não deve reagir com a fase móvel☺ não deve reagir com os solutos☺ deve dar resultados reproductíveis☺ o processo de adsorção deve ser reversível☺ o adsorvente não deve ser muito caro

distância percorrida pelo solutoRf = -----------------------------------------------------------

distância percorrida pela frente do solvente

Camada de fase estacionária : 250 µµµµmCamada de fase estacionária : 250 µµµµm


TLC - adsorventes

� Polares� vários óxidos inorgânicos ( sílica, alumina, magnésia)

☺ ordem de eluição dos solutos segue a polaridade deste s - solutos polares são fortemente retidos

� hidrocarbonetos saturados < hidrocarbonetos aromáticos < éteres < ésteres

≈ aldeídos ≈ cetonas < álcoois ≈ aminas < amidas < ácidos carboxílicos

� Não-polares� carvão activado

☺ ordem de eluição segue a polarizabilidade das molécul as� MAIS RETIDOS - compostos aromáticos, homólogos de maior peso molecular, moléculas com

átomos de halogénio ou enxofre

F o rtes M éd io s F raco s

s ilica ge l h id róxido de cá lc io ta lcoa lum ina carbona to de ca lc io am ido

carvão ac tivado m agnés ia suc rose

Ácidos : sílica (separa ácidos) Básicos: Alumina / magnésia (separa basesÁcidos : sílica (separa ácidos) Básicos: Alumina / magnésia (separa bases


TLC - adsorventes

� Sílica gel� suporte mais popular (5-10 µm)� preparada por hidrólise do silicato de sódio

seguida de condensação e polimerização

� actividade resulta da presença dos grupos Si -- OH (silanol) à superfície� controlo da actividade por aquecimento durante a preparação

☺ activação recomendada (110º / 30 - 60 min)

� Sílica gel é ligeiramente ácida☺ esteróides, amino-ácidos, álcoois, hidrocarbonetos, lípidos e vitaminas

� Preparação� 50g / 60 ml água destilada - espalhar rapidamente / secar / activar

☺ H - sem impregnante☺ G - com 13% de sulfato de cálcio☺ F254 - com indicador fluorescente

� impregnação com nitrato de prata (20%) - separação de compostos com duplas ligações (menos duplas > Rf)

OSi

OSi

O

OH OH

O O


TLC - adsorventes

� Alumina� Ainda muito comum

� Preparada por condensação do hidróxido de

alumínio hidratado

� A actividade depende quer dos átomos de oxigénio quer dos de alumínio☺ mais difícil de preparar dado que geralmente contem mais impurezas

� o conteúdo de água é muito importante para obter resultados reproductíveis☺ activação a 75 - 110 º / 30 - 60 min

� Pode ser obtida com superfície ácida, neutra ou básica (a mais comum)☺ separação de corantes, vitaminas e alcalóides

� Preparação� 30g / 40 ml de água destilada - espalhar rapidamente / secar e activar

☺ pode conter impregnantes e indicadores de fluorescên cia

Al Al Al

O O

O O O O O O


TLC - adsorventes

� Celulose� material orgânico

� diferente da cromatografia de papel☺ papel - apresenta espaços vazios onde se acumula o s olvente - a difusão leva ao alargamento

das manchas☺ celulose - são usadas partículas pequenas / distribu ição mais regular - menor difusão

� Celulose é usada para separar compostos hidrofílicos tal como açúcares, aminoácidos, iões inorgânicos solúveis e ácidos nucléicos - soluções aquosas☺ geralmente aderem muito fortemente à sílica e alumin a

� Tal como em papel o mecanismo é predominantemente de partilha

� Preparação� 400 mg amido / 10 ml água destilada + 90 ml de água a ferver + 20 g de celulose

☺ o grau de hidratação depende do tempo de agitação☺ agitação durante muito tempo leva à formação de gel

� espalhar rapidamente / secar a 110º

� pode conter indicadores de UV


Placas comerciais

� Adsorventes� Sílica; alumina

� Suportes� Vidro, alumínio ou plástico (tereftalato de polietileno)

� Espessura� 0,25 mm / 0,5 mm / 1,0 mm / 2,0 mm

� Maior amostra exige maior espessura (TLC preparativa)

� Activação� 15 minutos ao ar + 30 minutos a 110 ºC

� Nalguns casos pode elevar-se a temperatura a 200 ºC (4 horas) para maior activação

� Conservação� Após secagem / activação as placas devem ser guardadas num excicador

� As placas de sílica desactivam-se muito rapidamente☺ 50% de actividade perde-se em 3 minutos numa atmosf era com 50% de humidade


TLC – outros adsorventes

� Kieselguhr� Diatomite - terra de diatomáceas

☺ sílica com plâncton marinho (diatoms)

� elevada porosidade e área superficial - muito usada como ajudante de filtração

� muito usada como suporte de fase estacionária líquida - partilha

� Sephadex� gel dextran - hidrofílico e neutro

� habitualmente usado na filtração em gel - de acordo com os pesos moleculares

� Fase reversa / inversa� a separação de soluto de polaridade semelhante é difícil com sílica gel mesmo para

moléculas de pesos moleculares diferentes

� é possível alterar a superfície da sílica (OH reagem com silanos orgânicos)

� RP-2, RP-8 , RP-18 ☺ a fase estacionária orgânica apresenta uma retenção preferencial dos compostos não-

polares (fase reversa) e a separação depende dos pes os moleculares

� a fase móvel é polar (acetonitrilo)

� cromatografia de partilha


TLC - fase eluente

� Características - a fase móvel é o componente de mais fácil substituição� boa qualidade - a composição não deve variar de lote para lote

� não reactiva - de outro modo os resultados seriam difíceis de interpretar

� baixo ponto de ebulição - preferível para a secagem da placa

� Alta pureza (Analar) e preço razoável !!

� Escolha� a fase eluente deve ser activa ( retirar o soluto da fase estacionária) e selectiva (separar dois

solutos diferentes)

� actividade (capacidade de eluição) em relacção a sílica-gel☺ água > metanol > etanol > propanol > propanona > tric lorometano >☺ diclorometano > benzeno > metilbenzeno > tricloroetil eno > tetraclorometano >☺ ciclohexano > hexano

� Misturas de solventes☺ o mais usual - capacidade de eluição não é proporcional à composição

� amostra desconhecida☺ usar sílica gel e um solvente pouco polar (pentano)☺ acrescentar solvente polar (2, 4, 8, 16, 32%)


Separação de pigmentos


Série eluotrópica para adsorventes polares

A escala vai até cerca de 0,75 para uma placa de sílica

Tabela definida para placa de alumina


Uso de misturas de misturas de solventes (sílica)

J.C. Touchstone (Practice of TLC)


Exemplo de fases móveis


TLC - aspectos experimentais

� Preparação� preparar a mistura eluente nas proporções adequadas ao ensaio� saturar a câmara - manter fechada e à temperatura do ensaio� evitar evaporação da mistura eluente - alteração da composição� controlar o grau de humidade da placa

� Aplicação da amostra� usar micropipeta (1 -2 µl) - não danificar o suporte� colocar a amostra a cerca de 1,5 cm da base - todas a amostras na

mesma linha� a mancha deve ser de reduzidas dimensões (1,5 mm)

☺ no caso de amostras diluídas colocar por diversas v ezas, secando após cada aplicação

� evitar que a mancha toque a superfície do solvente (5 - 8 mm)

� Desenvolvimento� manter a temperatura� deixar desenvolver o cromatograma até cerca de 3 cm do topo da placa

� Revelação� usar luz UV (254 / 366 nm) ou revelador adequado (H2SO4)� determinar Rf, definir tamanho das manchas - quantificar se desejável


Placa de TLC

� Saturar a câmara / equilibrar a placa


Efeito da insaturação da placa


TLC - maus exemplos

� Polaridade� soluto muito polar é retido na origem

� Amostra em demasia / amostra mal seca� demasiada amostra cria tailing / amostra mal seca cria anéis

� Câmara mal saturada� saturação insuficiente leva a demasiada evaporação da fase eluente

� Colocação muito baixa / demasiada humidade� amostra baixa difunde-se na fase eluente / muita humidade leva a maior difusão das manchas

e também a uma separação deficiente


TLC - reveladores

� Métodos químicos / métodos físicos

� Métodos não-destructivos� radiação visível e UV (254 nm e 366 nm)� Vapor de iodo

☺ evaporação / placa sem alteração

� água

� indicadores de pH (bromocresol / bromofenol)

� Métodos destructivos� 50% H2SO4 / 110 C

� 5% dicromato de potássio ou 5% ácido nítrico em40% H2SO4 seguido de aquecimento a 110 C

� UV (vitaminas) / água (hidrólise - ésteres) / iodo (ácidos gordos poliinsaturados)

� Reagentes específicos são conhecidos para quase todas as classes de compostos

NOTA: o uso de métodos destructivos é desaconselhado sempre que a quantificação seja o objectivo da separação cromatográfica


TLC - amostras

� Classificação (energias de adsorção)� Grupo 1: moléculas neutras - hidrocarbonetos

☺ forças de Van der Waal - físicas (não há formação deligações químicas

☺ grupos metileno - não há separação por peso molecular☺ separações boas e manchas redondas

� Grupo 2: ligações polares (C - Cl / C - NO2)☺ dipolo induzido - físicas / manchas redondas

� Grupo 3: moléculas polares ( ácidos, álcoois)☺ Grupos de superfície polar - nucleofílica☺ interação com adsorvente via lig. H-H☺ forte - possibilidade de “caudas” nas manchas

� Grupo 4: ligações químicas (covalentes)☺ ligações fortes - má separação

Energias de adsorção(sílica gel)

Grupo Qi interação

R-CH3 +0.07 VdW

R-CH2- -0.05 VdW

R-Cl +1.32 dip. ind.

R-O-R +3.61 receptor H

R-CHO +4.97 receptor H

R-NO2 +5.71 dip.ind

R-CO2R +5.27 rec.H /dip.ind.

R-COR +5.27 rec.H/dip.ind.

R-OH +5.60 H-H

R-NH2 +8.00 H-H

R-CO2H +7.60 H-H

Cs

Cm

Cs

Cm

Cs

Cm

A forma das manchas depende do equilíbrio de concentrações estabelecido entre as fasesmóvel e estacionária


Casos especiais

� TLC preparativo� Colocar bandas largas de amostra e desenvolver a placa

� Retirar a sílica de cada mancha e dissolver usando um solvente adequado

� Analisar noutro equipamento (HPLC, LCMS, FTIR)

� TLC bidimensional� Colocar a amostra no lado esquerdo da placa e desenvolver

� Secar a placa e desenvolver de novo noutro eluente (colocar o lado esquerdo da placa para baixo)

� Revelar

Separação de aminoácidos

F. estacionária: sílica gel

F. Móvel 1: tolueno:2-cloroetanol:piridinaF. Móvel 2: clorofôrmio:álcool benzílico:ac. Acértico

1: ac. Aspártico, 2: ac. Glutámico, 3: serina4: alanina, 5: glicina, 6: alanina, 7: metionina,8: valina, 9: isoleucina, 10: cisteina


TLC - vantagens e desvantagens

� Vantagens� Técnica simples e versátil - aplica-se a quase todas as classes de compostos

� Pequenas quantidades de amostra – sem grande preparação

� A separação pode ser obtida com custos razoáveis - bom adsorvente e solventes puros

� As separações podem ser obtidas em tempos relativamente curtos☺ começa a não ser vantagem em relação às pequenas col unas de HPLC

� O processo de separação é “visível” e pode ser melhorado alterando suportes ou a fase eluente☺ ao contrário do GC ou HPLC e que os solutos muito re tidos podem passar despercebidos

� Desvantagens� A preparação das placas é complicada

☺ está a cair em desuso (aquisição de placas preparada s)

� A quantificação é possível mas implica um enorme custo financeiro☺ por isso o TLC é a técnica de separação cromatográfi ca tipicamente qualitativa /

semiquantitativa� Colocação de amostras em quantidades conhecidas e quantificação por comparação


Resolução = X / 0,5 (d1 + d2); x - distância entre as manchas; d1 e d2 – diâmetros das manchas

R mínimo = 1Rf = distância percorrida pelo soluto / distância percorrida pela frente do solvente

Distância percorrida pelo solvente

Distância percorrida pelo soluto A

Distância percorrida pelo soluto B

Linha de frente do solvente

Linha de colocação das amostras

TLC - Cromatografia de camada fina - uma.pt · Química Analítica / JCM TLC - Cromatografia de...

Documents

Transcript of TLC - Cromatografia de camada fina - uma.pt · Química Analítica / JCM TLC - Cromatografia de...