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Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico Dra. Nydia Strachman Bacal Hematologista e Patologista Clínica

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Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico

Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica

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Dra. Nydia Strachman BacalHematologista e Patologista Clínica

Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico

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Essas partículas estão suspensas em meio líquido

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CÂMERA DE FLUXOCÂMERA DE FLUXO

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Sistema que gera um fluxo contínuo laminar de partículas, que passam uma a uma frente a um feixe de laser

Orifício com Diâmetro: 50 a 250 �mOrifício com Diâmetro: 50 a 250 �m

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Freq

Fluorescence

FSC Sensor

Detector de Fluorescência(FL1,FL2, FL3 e FL4)

(tubos fotomultiplicadores)

Fotomultiplicadores

Impulsos elétricos Sinais analógicos

Sinais digitais

Distribuição por frequênciaHistogramas

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Lasers - FluorocromosFluorocromo Laser (nm) Emissão (nm)

FITC 488 525R-PE (PE) 488 575Pe-Cy5 (TC1) 488 667PerCP (BD2) 488 675PerCP/Cy5.5 (BD) 488 6957-AAD 488 655Iodeto de propidium 488 570

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660Cy5 633, 635 667

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Citometria de Fluxo Imunofenotipagem

• Análise da expressão antigênica das células através da ligação antígeno – anticorpo - fluorocromo

Anticorpos monoclonaisdesignados “CDs”Clusters of differentiationligam-se as células nos determinantes antigênicos ou epítopos em sua membrana, citoplasma e intranuclearmente.

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444321XL

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654321FACSCanto

433321FACSalibur

33321FACScan

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Alexa450Alexa405APC-Cy7APC/Cy5PE-Cy7PE-Cy5.5PE-Cy5PE-TRPEFITC

Citometros de Fluxo - Fluorocromos

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• Análise do conteúdo de DNA• Quantificação de reticulócitos• Análise da Subpopulação Linfocítica•••• Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias e Linfomas• Diagnóstico e acompanhamento de Mieloma Multiplo• Mielodisplasia / Doenças Mieloproliferativas• Diagnóstico de Hemoglobinúria Paroxística Noturna• Detecção de Anticorpos Antiplaquetários• Disfunção plaquetária• Quantificação de células progenitoras (stem cell)• Detecção de Células Neoplásicas não hematopoéticas•••• Monitoramento Quimioterapia / Doença Residual Mínima•••• Avaliação imunológico de paciente transplantado e de infusão linfocitária

Outras aplicações : Estudos da função celular, Apoptose, MDR (Múltipla Resistência à Drogas) , Procedimentos em Hemoterapia (Detecção de Anticorpo em Anemia Auto-imune, Detecção de hemorragia feto materna, Controle de Qualidade de Leucodepleção, etc...) , HLA-B27, Teste de Antígeno Leucocitário(HLA) e Cross Match.

ALGUMAS APLICAÇÕES CLÍNICAS ATUAIS

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Anti-CD3 PerCP

Anti-CD8 PE

Anti-CD4FITC

Análise da Subpopulação LinfocíticaIMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA

Anti-CD3 PerCP

Anti-CD16 /CD56PE

Anti-CD19 FITC

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Aplicações:

Monitorar Imunodeficiência Adquirida (AIDS)Imunofenotipagem de LinfomasImunofenotipagem de LeucemiasMonitorar transplantesMonitorar sistema imunológicoFunção plaquetária

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Estratégia de Gatesjanelas

1. FS x SSCtamanho x granularidade

2.CD45 x SSC

3. Gates sequenciais•CD19•CD3•CD138•CD34

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EXPRESSÃO DO CD45 em Leucemia Aguda

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Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias, Linfomas e Mieloma

• Leucemias agudas• Linfóides x Mielóides

• Leucemias Crônicas• Linfocítica, Mielomonocítica• Linfomas leucemizados• Discrasia de Células Plasmáticas

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Diferenciação Granulocítica – MO normal

Painéis de anticorpos monoclonais

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Dra.Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia -SC

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LMA M3

CD45xSS

HLA-DRxCD45

CD33xCD45

CD2xCD45

CD13xCD45

CD34xCD45

CD117xCD45

CD56xCD45

CD71xCD45

MPO(c)xCD45

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Diferenciação Linfóide B – MO Normal

Painéis de anticorpos monoclonais

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Pró B Pré-pre-BI Pré-pre-BII Pré-pre-BIII Madura Plasmáticaimatura B IV

Dra. Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia - SC

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LLA B MADURA

LINFOMA DE BURKITT

CD34xCD45

CD19xCD45 HLA-DRxCD45

CD20xCD45

CD10xCD45

CD22xCD45

TdTxCD19

KAPPA(sup)xCD19

IgM (sup)xCD19

CD45xSS

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P.O. 32a – LMA M0

ASF, 28a – LMA M0

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LLC- B: Células linfóides B com restrição de cadeia leve monoclonal para kappabaixa expressão e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ baixa expressão

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Leucemia de Células Cabeludas - Hairy cell

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Mieloma Múltiplo

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Histograma de Tamanho x Complexidade Histograma CD138 x Complexidade

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Histograma de Monoclonalidade em Kappa intracitoplasmática

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CD56 x CD138 CD19 (-) nas células CD138 (+)

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Histograma CD45 x CD138 Histograma HLA-DR x CD138

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Histograma de Conteúdo de DNA com Hiperdiploidia

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Mielodisplasia

• PAPEL DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO

• Técnica complementar / análise dentro de um contexto

• Quantificar blastos de forma exata • Discriminar Mieloblastos de Promielócitos e dos

Pró-monócitos• Estudo de mudanças fenotípicas na MDS

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M.C.DelCanizo et al Immunophenotypic analysis of myelodysplastic syndromesHaematologica/Journal of hematology vol.88(04):april 2003

Page 48: Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

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CD13

Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

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Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

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HPN - Hemácias

Ausência de expressão antigênica do CD55 em 46,5% das células identificadas por Glicoforina A

Ausência de expressão antigênica do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A

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HPN - Neutrófilos

Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.

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HPN - Neutrófilos

Controle normal: CD59 (+) = 100,0%

Ausência de expressão antigênica de CD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.

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HPN - Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99,8% Ausência de expressão do CD14 em 98,3% das células CD 64 (+)

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Pesquisa de Anticorpo Anti-plaquetas Método Direto

Total de casos 115 pacientes com plaquetopenia.

Amostra: 10 ml de sangue em EDTA.

Equipamento: Citômetro de Fluxo – EPICS XL-MCL da Beckman Coulter

Material:

- Anti-Human IgG FITC conjugate SIGMA (F-1641)

- CD41 ou CD61 PE Immunotech (PN – IM1416)

- Tampão PBS-EDTA

Método:

As Plaquetas separadas do sangue total coletada em EDTA, são lavadas e marcadas com CD41PE e IgG FITC e analisadas no Citômetro de Fluxo.

João Carlos C. Guerra, MD, Ruth H Kanayama, PhD, Sonia S.Nozawa, PhD, Márcia R. Ioshida, PhD, Irina Y Takiri, PhD, Robson J. Lazaro, PhD, Nelson Hamerschlak, MD, Luiz Gastão M. Rosenfeld, MD, Celso Carlos C. Guerra MD and Nydia S. Bacal, MD. Low Platelet Counts: Diagnosis Using Flow

Cytometry and Anti Platelet Antibody – Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2006 108: abstract 3966.

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0.114

1.47

Controle Negativo

Plaquetas – 375.000/mm³ CSMCSM, 20 anos ,masc.

Plaquetas – 65.000/mm³

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AVS, 31 anos, fem.

Plaquetas – 16.000/mm³

AVS

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O antígeno está ausente ou presente em baixa expressão em pacientes com Síndrome de Bernard-Soulier é identificado pelo anticorpo CD42b que éespecífico para a glicoproteina plaquetária GPIbEssa glicoproteina plaquetária serve como receptor para o Fator Von Willebrande tem alta afinidade ao receptor de trombina.CD42a(GPIX), CD42d(GPV) raramente utilizadas.

CD41 (GPIIb) and CD61 (GPIIIa) – TrombasteniaTrombastenia de de GlanzmannGlanzmann

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Quantificação de células progenitorasCD34 (+) - Citometria de Fluxo

Protocolo “ISHAGE”Plataforma dupla

Sangue periféricoMedula ÓsseaAféreseCordão Umbilical

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Marcação fluorescente ligada aocálcio permite o estudo deativação celular

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Imunofenotipagem – PaineisProliferativos - utilizados no HIAE

1. Leucose Aguda :• MPO, CD79a, CD3intra e/ou

• CD45 x SS

• Primeiro passo : 2 CD por linhagem

CD2-CD7 / CD10-CD19 / CD13-CD33 /CD4-CD14(My4) e CD34 / HLA-DR

• Conforme linhagem segue com outros Atc específicos :– CD20, CD22, IgM intra, Kappa e Lambda intra e/ou sup.

– CD 3sup., CD38, CD5, CD8

– raramente TdT

– CD11b, CD14(MO2), CD15, CD41,CD64, CD71, Glicoforina A, CD117

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Imunofenotipagem – Painéis Proliferativos utilizados no HIAE

2. Doenças Linfoproliferativas B � CD19 (+) ou CD20(+) ou CD138 :

� CD5, CD10, CD11c, CD22,CD23,CD25, FMC- 7; IgM,

� Kappa e Lambda intra ou sup.,CD103, IgG,CD38,

� CD56 e HLA-DR

� 3. Doenças Linfoproliferativas T� -CD2, CD3intra e sup., CD4, CD5, CD7, CD8,

� -CD11b, CD16, CD25, CD38, CD56, CD71 e HLA-DR,

� Outros CD disponíveis:� -CD30, CD1-A, CD79b, IgG, IgD e IgA, TCRαβ/TCRγλ,

� Ti -gamma.

Page 65: Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

LEUCEMIA AGUDA

FITC PE PE-Cy5MPO c CD79a c CD3 cCD15 CD33 CD45CD2 CD7 CD45HLADR CD34 CD45CD10 CD19 CD45IgG1FITC IgG1PE CD45PE-Cy5

Painel inicial

FITC PE PE-Cy5 FITC PE PE-CY5 FITC PE PE-Cy5CD22 CD20 CD45 CD14 CD45 CD5 CD1a CD45kappa CD19 CD15 CD13 CD45 TCR g//d TCR al/b CD45Lambda CD19 CD71 glicofor. CD45 CD8 CD4 CD3IgM c CD41 CD117 CD45

CD38 CD56 CD45CD22c ? CD64 CD11b CD45

CD4 CD45

LLA-B LMA LLA T

Page 66: Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

Doenças Linfoproliferativas Crônicas

** Para suspeita de Linfoma de Hodgkin ou Linfomas agressivos de grandes células, marcar com CD30 e CD15.

FITC PE PE Cy-5HLA DR CD20 CD19CD2 CD7 CD3IgG IgG IgG

PlasmocitáriaFITC PE PE Cy-5 FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE-Cy5kappa CD19 CD8 CD4 CD3 CD138 CD117 CD19Lambda CD19 CD16 CD56 CD3 CD38 CD56 CD19CD5 CD20 CD19 CD25 CD56 CD3 CD138 CD56 CD117CD22 CD23 CD19 CD5 HLADR CD3 CD138 CD38 CD117FMC7 CD11c CD19CD79b CD38 CD19CD103* CD25* CD19* *somente p/ HCLIgMIgDIgG

CD30 CD15CD15

Painel inicial

linoproliferativa B linfoprolifertativa T

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IMUNOFENOTIPAGEM PAINEL PROLIFERATIVO NOVEMBRO/1991 A JULHO/2007

PATOLOGIAS N°DE CASOS

LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%)LMA 1084 (17,4%)LLA 854 (13,7%)L. Bifenotipica 16 (0,2%)

NEOPLASIAS DE CÉLULAS B MADURAS 1441 (23,1%)DLPC-B/LNH-B 1238 (19,9%)NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS 203 (3,2%)DLPC-T / NK 83 (1,3%)

DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS 55 (0,9%)

SMD e LMMoC 79 (1,3%)Linfoma de Hodgkin 1 (0,02%)MO SEM DOENÇAS ONCOHEMATOLOGICAS, CONTROLES 2589 (41,5%)PÓS TRATAMENTOS, MO NORMAL e OUTRAS PATOLOGIASHEMATOGONIAS 30 (0,49%)

6232 (100%)

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Imunofenotipagem de Doenças Oncohematológicas – nov/91 a julho/07

Nºtotal de casos analisados: 6 234

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OBRIGADA PELA ATENOBRIGADA PELA ATENÇÇÃO !ÃO !

Nydia S. Bacal

[email protected]

Grupo de Grupo de CitometriaCitometria de Fluxo do de Fluxo do LaboratLaboratóório Clrio Clíínico HIAE nico HIAE -- 20072007

Ana Claudia Miranda BritoAlexandra M.P. CavalcanteJoão Carlos de C. GuerraSonia Tsukasa NozawaRuth Hissae Kanayama

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Citometro de Fluxo- nova geração

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1991 - 1ªgeração Epics Profile II1994 - 2ªgeração Epics XL – MCL2007 - 3ªgeração FC – 500

Laboratórios Externos: 65%

HIAE: 35%

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Page 73: Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

Fotomultiplicadores captam a fluorescência Impulsos elétricos/Sinais analógicos

Sinais digitais

Distribuição por frequência/Histogramas

R1

Page 74: Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

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Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004

Page 75: Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

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Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica

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