Slide 1

CITOMETRIA DE FLUXOProf. Ms EDGAR MATIAS BACH HICentro Universitrio Lusada - UNILUSPrincpio de FuncionamentoCitometria de FluxoAnlise multiparamtrica de partculas em suspenso, uma a uma.As partculas podem ser clulas, componentes celulares ou material no celular (Ex: protenas)Teste qualitativo e quantitativoUso de anticorpos especficos marcados com fluorocromos (de diferentes espectros de emisso)Tambm possvel a separao de clulasPrincpio do MtodoPartculas em suspenso passam, de uma forma alinhada, por um feixe de luz. Pode haver presena de partculas marcadas com fluorocromos.Feixe de luz (laser) interage com partculasA interao gera sinais e fluorescncia, detectados por detectores apropriadosCitmetro de Fluxo

Partes de um Citmetro de FluxoSuspenso de partculasFluxo laminarFonte de iluminao Cmara de FluxoFiltrao da disperso de luz e fluorescncia Captao da disperso de luz e fluorescnciaConverso dos sinais em valores analgico-digitaisAquisio, Processamento, Anlise e Armazenamento no computadorFludosptica

Eletrnica

Fludo: Sistema de FluxoFOCO DO LASERCONVERGNCIA HIDRODINMICAPresso do Filtro de Ar (Sheat)LaminarFlowSheathSheathAmostraPrincpio

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FACSMicrogotculas carregadas eletricamenteSeparadas por placas defletoras

Separao de Clulas (Cell Sorting - FACS)

Sistema pticoFonte Luz: LASER

Lentes: moldam e alinham feixe do laserColeo de espelhos direcionam a disperso do laser e a luz fluorescente.Sistema de espelhos e filtros seletivos direcionam comprimentos de onda de fluorescncia aos respectivos detectores.

CromgenosPE (488nm / 575nm)Texas Red (595nm / 615nm)PE-TR Conj. (488nm / 695nm)PI (488nm / 570nm)FITC (488nm / 525nm)600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610632488Common Laser LinesFACSCalibur

FL1 Red Diode Laser~635 nmSSCFL3FL4670LP661/16585/42488/1090/10 Beam SplitterDM 560SPFluorescenceCollection LensDM 640LPHalf Mirror488/10.488 nmBlue LaserFSC DiodeFocusingLensFL2530/30Beam CombinerFlowCellFlowCellSISTEMA TICOFiltros pticos coletar sinais de luz

Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu nmero deixado passar e menor que seu nmero refletido.Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu nmero deixado passar e acima de seu nmero refletido.Espelhos BP (bandpass) = s deixa passar o comprimento de onda especfico.SP 500LP 500BP500/30LongpassShortpassBandpass460 500 540460 500 540460 500 540FiltroDetector clula fotoeltricaNGULO DE DISPERSO FRONTAL (FSC)NGULO DE DISPERSO LATERAL (SSC)LASER16QUANDO A CLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS S EM DUAS DIREES ELA ANALISADA: A REFRAO DA LUZ NO NGULO DE 950 DENOMINADA NGULO DE DISPERSO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEDO CITOPLASMATICO. A REFLEXO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O NGULO DE DISPERSO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CLULA.

Fluorocromos e DetectoresSistema EletrnicoConverso de sinais pticos em sinais eletrnicos proporcionaisDados digitalizados em computadorConfeco do grfico de disperso das partculas analizadas (disperso do laser e fluorescncia)Parmetro: medida proveniente de cada detectorParmetrosParmetro 1 FSC (Disperso Frontal)Parmetro 2 SSC (Disperso Lateral)Parmetro 3 FL1Parmetro 4 FL2Parmetro 5 FL3FLUORESCNCIASO detector de FL-1 (Fluorescncia 1) capta luz de comprimento de onda 530 nm, que corresponde luz verde.

O detector de FL-2 (Fluorescncia 2) capta luz de comprimento de onda 570 nm, o que corresponde luz laranja.

O detector de FL-3 (Fluorescncia 3) capta luz de comprimento de onda 650 nm, o que corresponde luz vermelha.

DISPERSO

POLIMORFONUCLEARESLINFCITOSMONCITOSDEBRIS/HEMCIAS/PLAQUETAS BLASTOSVOLUME (FS)GRANULOSIDADE (SS)DISPERSO:

Side ScatterForward Light Scatter0200400600800100002004006008001000LinfcitosMoncitosNeutrfilosViso dos dados coletados

Side ScatterForward Light Scatter0200400600800100002004006008001000CD3 FITCCD4 PE

0200400600800100002004006008001000DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL225ALGUNS MARCADORESCD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timcitos.

CD4- 55% a 65% das clulas T perifricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas tambm em moncitos, macrfagos e clulas dendrticas

CD8- 25% a 35% das clulas T maduras do subtipo citotxica.

CD19- presente em mais de 95% das clulas B.

CD20- assim como o CD19 est presente em todas as clulas B maduras do tecido linfide e sangue perifrico.

CD45- expresso quase exclusivamente em clulas hematopoiticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.

CD56- marcador de NK, no est expresso em clulas B, moncitos ou granulcitos.

CD10CD2CD20CD3CD7CD19CD22CD23CD26CD5

Leucemias Linfociticas ouEnfermidade residual mnimaCD3CD7HLA DR CD 42a CD 61CD19 CD33 CD13 CD14 CD34

Leucemias mielides

CD3 CD7 CD2 CD19 CD5 CD56

Linfomas e Mielomas

LEUCEMIASPARMETROS CELULARES ANALISADOSTamanho (FSC)Complexidade (SSC)Fluorescncia relativa.(FL1, FL2, FL3) MetablitosReceptoresDNACitocinasEnzimasAntigenos celularesTamanhoComplexidadeAplicaes Avaliao de sub-populaes celulares: quadrantes CD4 e CD8.Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 1001000Log PE Fluorescence (CD4).1 1 10 100123445%2%26%27%Anlise de diviso celular.G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA contentCount2N4N

Marcador DNA dupla fitaMitose

Mitose Tumoral

Influxo de clcioTime (Seconds)03672108144180

StimulationAnlise de Reticulcitos

Marcador RNAAnlise de Reticulcitoslog Thiazole Orange.1 1000 100 10 1

RMI = 0log Thiazole Orange.1 1000 100 10 1

R1R2R3R4RMI = 34R1R2R3R4Imunofenotipagem: marcao celularCD2CD4CD # = cluster designation numberImunofenotipagemLog FITC 1000 100 10 1

.1

Imunofenotipagem de Linfcitos T e B

Principais Marcadores Imunofenotpicos MO

Obrigado