Protocolo citometria de fluxo
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PROTOCOLO
CITOMETRO DE FLUXO
Prof. Enrique R. Argaaraz Lab Virologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade Universidade de Braslia
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FLUXOGRAMA
I. Iniciar Sistema
1. Ligar o aparelho na seguinte ordem: Ligar o aparelho na seguinte ordem:
Ligar estabilizador.
Ligar o Citmetro de Fluxo.
Ligar o Computador; deixar 5 a 10 (para atingir mxima potncia)
2. Checagem de Reservatrios
Vasilhame de Descarte gaveta esquerda (descartar o liquido e acrescentar 50-100 ml hipoclorito concentrado)
- Observar se est em Standby (S assim o equipamento est pronto para uso).
Vasilhame FACS FLOW Verificar presso ( puxar alavanca em direo ao operador) 1. Apertar bem a tampa 2. Encaixe do tubo Nota: No esquecer de desligar a presso ante de abrir o vasilhame
Apertar RUN e HIGH Objetivo: para que o sistema se complete com o FACS flow novo. Nota: monitorar ate ausncia de bolhas na mangueira (tirar a mangueira do
filtro e tirar as bolhas)
Se as bolhas no desaparecerem, apertar HIGH e PRIME esperar voltar a Stanby. Objetivo: tirar bolhas e a soluo velha.
3. Abrir o programa Cell Quest Pro.
Fechar a folha em branco Untitle (Dont Save).
Abrir a planilha, pode estar pronta : File Open Document Abrir a Planilha de Aquisio Open.
File Document Size Criar uma Folha.
4. Conectar o computador ao aparelho:
Acquire Connect to Cytometer (ma + B) Ao conectar, a janela do Browser aparece automaticamente (Parameter Description).
Iniciar Sistema
Controle de Qualidade
Ajustar Parmetros
Gravar Dados
Analisar Dados
Desligar Sistema
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Figura 1
Ao conectar o computador ao FACS aparecer o menu aquisio Aquisio control
Figura 2
5. Nmero e Tipos de Eventos que sero Adquiridos)
Clicar em Acquire mais uma vez;
Clicar em Aquisio and Storage aparecer menu abaixo
Figura 3
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Neste menu se podem escolher os critrios para salvar e exibir os eventos.
Aquisio Gate: quais eventos sero salvos ou rejeitados, os eventos podem compor uma dada populao (morfologica ou fenotpica)
Nota: em geral se deixa como All para ter salvos todos os eventos e excluir apenas na anlise
Collection Criteria: se define com que nmeros de eventos a aquisio ser encerrada ( seja de eventos totais ou uma dada populao);
Storage Gate: os eventos que sero salvos se aconselha deixar em All ; Resolution: selecionar o valor 256;
Parameters saved: quais parmetros sero salvos. Devem ser selecionados FSC, SSC ( morfologia, tamanho) e as fluorescncias
Figura 4
6. Identificao das Amostras ( nome e destino dos arquivos)
Ao conectar o citmetro aparecera automaticamente o menu abaixo
Figura 5
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Folder: em que pasta sero gravados os dados, ex iniciais do operador.
custom prefixmudar para simple ID
File name prefix: nome do experimento
File name suffix: se mantido enumerar de forma crescente
Figura 6
Ainda no parametr description se repete no item Sample ID: o nome do tubo ex. Mock;
Se deve colocar dos eixos dos grficos: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2; P5-FL3. Pode-se ainda se escolher outros eixos ex anti-CD3 FITC ao invez de FL1, como nome do eixo P1.
Nota: possvel s se existe um tipo de Ac conjugado a FITC. Fechar, no tem ok
7. Abrir as 4 janelas (maa 1,2,3,4) ou Cytometer abrir as seguintes janelas:
i. Detectors/Amp (ma + 1) (mudar para log FL1,2 e3) ii. Threshold (ma + 2).
iii. Compensation (ma + 3). iv. Status (ma + 4)
v. Instrument Settings Open Procurar uma Compensao
(Feita com as Beads ou CD3-CD4-CD8) Set Done.
Figura 7
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Detectors/ Amp: FSC e SSC devem ser mantidos em Linear e as fluorescncias em Log; Pode-se ligar o seh]gundo laser four color (635 nm-vermelho)
Compensation usado se houver 2 ou mais marcaes
Threshold: usado para tirar debris
8. Na pagina principal abrir Plot
Figura 8
Em Plot Source: selecionar Axquisition e em seguida parecero X e Y parameters que foram previamente selecionados parameters saved;
Escolher os eixos desejados: ex para 3 fluorescencias FSC x SSC; FL1 x FL2, FL1 x FL3 e FL2 x FL3.
Pode-se escolher No Gate ou apenas os eventos que interessam, selecionando uma regio de interesse. Nota: Mesmo que selecione um gate todos os eventos estaro sendo salvos
como determinado em Aquisio & Store
Para abrir Histogramas selcioanr plots e depois Histogram
Neste ponto poder ser adquiridas as amostras controles para ajustar os parmetros. Sempre com o item Setup selecionado Figura 2
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0 200
400
600
800
1000
0
200
400
600
800
1000
Linfcitos
Moncitos
Neutrfilos
II. Ajuste de Parmetros ( Settings)
Deve ser seguido o roteiro abaixo
A. Ajuste de morfologia
- Passar a amostra Mock e no plot de Foward / Side- Sacatter; - Mexer no Detector / Amp para distribuir a populao e distinguir as diferentes
populaes, vide exemplo
Figura 9 - Em A a voltagem SSc esta muito alta e B a de FSC esta alta, permitindo a aquisio de
debris o que diminuir os eventos plauciveis de serem analizados.
- A voltagem de FSC deve ser mantida em E00 e como em B tem muito debris o valor de FSc deve ser diminudo ou mesmo para SSC, at ficarem satisfatrios como figura abaixo
. Figura 10
Passos da otimizao Amostras para otimizao
A. Ajustar as voltagens de FSC e SSC.
B. Ajustar threshold.
C. Seleo de populao de interesse gate.
D. Ajustar as voltagens dos PMT.
Controle No Marcado
E. Compensao.
Controle com FITC Controle com PE Controle com PerCP
-
FSC-H
0 200
400
600
800
1000
0
200
400
600
800
1000
DEBRIS
B. Ajustar o Threshold -Excluso do Debris
Existem duas formas de excluir o debris: a) Baixar a voltagem do FSC b) Aumentando o Threshold, at que o debris deixe de ser visualizada
Figura 11
C. Seleo de populao de interesse gate.
D. Ajuste de voltagens (FSC e SSC)
Fazer gate na populao de interesse e ajustar as voltagens dos PMT.
Objetivo: evitar falso positivo e falso negativo clulas no marcadas como controle
SSC-H
Em qual parmetro
usa-se o treshold?
Sem ajuste Com ajuste
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E. Compensao- Vazamento
Muitas fluorescncias apresentam superposio-vazamento para outros canais, pelo que tem que ser realizada a compensao
Sobreposio de Espectros
a) Passar os controles (+) para cada fluorescncia e compensar, ou seja aumentar as diferencias entre as fluorescencias para tirar o vazamentoi-sobreposio das fluorescencias.
Compensao do FITC ( +FITC/-PEC)
Sem ajuste Com ajuste
Relative
Intensity
500nm
550nm
600nm
650nm
700nm Wavelength (nm)
FITC
530/3
0
PE
585/42
Aumente o
valor
0.0
PERCP
670nm
-
Compensao PEC (- FITC/+ PEC)
Compensao (-FITC / - PEC) Ajustar as populaes para que a populao fique no quadrante duplo
negativo. Salvar
Aquire ---- Adquisio store: - definir R1 e o nmero de eventos Parmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo passar os controles novamente clicando no settting para que grave Onde os valores de parmetros ficam armazenados?
II. Aquisio das Amostras
c) Salvar Aquire ---- Adquisio store: - definir R1 e o nmero de eventosParmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo
Sem ajuste Com ajuste
Relative
Intensity Aumente o valor
1.2
Wavelength
(nm)
PE
585/42 PERCP
670nm
FITC
530/3
0
PE-Cy7
780/60
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Apndice I. Calibrao automtica por beads - FACS comp.
1. Preparar os seguintes tubos a) 1 ml de FACS Flow + 1 gota de beads no marcados b) 3 ml de FACS Flow + 1 gota de cada fluorescncia
2. Abrir o FACS Comp a) defenir o tipode clula: se lavada ou no b) Cdigos: colocar os cdigos de cada beads c) Se vai se gravar ou no
II. Para puxar uma calibrao anterior
a) Uma calibrao anterior Abrir Citometer---- Instrument setting---Open----Puxar a calibrao anterior
b) Calibrao do FACS Comp Abrir FACS station-----BD files---- Instrument setting----Calibration files--- ---- Open--- set----Done
III. Imprimir relatrio
Abrir FACS station-----BD files ---FACS comp files--- Pasta do dia---- cliques
OBSERVAOES IMPORTANTES
Limpeza do filtro de ar. Lavar periodicamente com detergente neutro, deixando ele secar e recolocando na grade do filtro, sempre lembrando com a proteo metlica para baixo.
Limpeza do tanque de isoton Para a retirada da sonda tomar cuidado para no rodar toda a sonda, rodar somente a parte branca que envolve a sonda, pois pode levar a quebrar o fio que leva a informao para o aparelho se o isoton esta cheio ou vazio
Nvel dos tanques A importncia de verificar o nvel dos tanques: se o isoton estiver abaixo do nvel mnimo a coluna de ar ser maior que a de lquido, levando a adquirir muito ar podendo prejudicar as amostras.
Enchendo o tanque de isoton No momento em que for encher o tanque de isoton tomar cuidado com a limpeza do funil e do Becker, que poder a levar a cair partculas de sujeira que
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acarretara no mal uso do citmetro podendo levar ate o entupimento do aparelho.
Tanque de waste O tanque de waste quando estive cheio descartar na pia, e depois colocar 100ml de hipoclorito concentrado e levar de volta ao citmetro.
Kit bsico importante ter um kit bsico na sala de citometria, que composto por um esguicho de gua bi destilada,de hipoclorito a 1% e outro de isoton, com uma observao importante, o hipoclorito no pode ficar em um frasco transparente por que s ira durar 1 dia e a gua tem que ser trocada diariamente por que pode criar alga.
Entupimento do citmetro Caso ocorra o entupimento do citmetro, temos 3 procedimentos que poderamos fazer para resolver. O 1 dando o prime no prprio aparelho com a gua no SIP, este procedimento ira provocar uma presso para o lado de fora do SIP tentando limpar o sugador. 2 passo usando uma seringa com um cano de plstico que ira ligar ao SIP que atravs da presso exercida que ser maior que a do prime para o desentupimento do SIP. 3 passo utilizando um fio muito fino que colocaremos dentro do SIP e empurrando de um lado e puxando do outro para desobstruir o SIP.