Aplicações da citometria

de fluxo na pesquisa

farmacológica de plantas

medicinais

Me. Ruberlei Godinho de Oliveira Doutorando em Biotecnologia – UFMT – Bionorte

Docente na Universidade de Cuiabá-MT

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Cito metria de fluxo

Movimento Célula Medida

Utiliza dos princípios básicos da

fluorimetria.

É uma poderosa tecnologia, que possibilita a análise simultânea de

múltiplas características de uma

célula (análise multiparametrica).

Podem ser analisadas:

Qualquer partícula ou célula em

suspensão, com tamanho entre 0,2

a 50 µm.

Células de tecidos sólidos

precisam ser desagregadas e

colocadas em suspensão antes da análise.

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O que o citômetro nos diz sobre as

células?

Tamanho relativo (SSC)

Granulosidade ou complexidade (FSC)

Intensidade de fluorescência (marcação)

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Como funciona?

Combinação de 3 sistemas:

Sistema Fluido;

Sistema Óptico;

Sistema Eletrônico;

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Sistema de Fluidos

Transporta as partículas em um fluxo de fluido

em direção ao feixe de laser para

interceptação;

Posiciona e alinha o fluxo da amostra no

centro do feixe de laser, permitindo que uma

única célula ou partícula passe pela luz do

laser em um dado momento;

Sistema pressurizado.

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Laser

Fluxo

Sistema de Fluidos 6

Sistema Óptico

Excitação Emissão

Componentes de Excitação

(Lasers, prismas e lentes)

Componentes de Coleta (Lentes, espelhos, filtros e fotodetectores)

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Sistema Óptico

• Componentes de Excitação

- Lasers e lentes

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Sistema Óptico 9

Sistema Óptico

Componentes de Coleta

- Lentes coletoras: Captam a dispersão e a luz fluorescente emitida pelos fluoróforos que são excitadas pelo feixe de laser (Convergência do sinal, alinha em uma direção inicial).

- Espelhos e Filtros Ópticos: Direcionam a luz emitida, selecionando o comprimento de onda determinados

- Fotodetectores: Recebem a informação óptica que será digitalizada e armazenada em um computador

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Sistema Óptico Filtros Ópticos – coletar sinais de luz

Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu

número é deixado passar e menor que seu número é refletido.

Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu

número é deixado passar e acima de seu número é refletido.

Espelhos BP (bandpass) = deixa passar o comprimento de onda

compreendido em um intervalo especificado.

Detector – célula

fotoelétrica

SP 500 LP 500

Longpass Shortpass Bandpass

460 500 540 460 500 540 460 500 540

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Sistema Óptico 12

Sistema Eletrônico Converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos proporcionais.

Componentes: Fotodetector, amplificador, processador e computador.

“Pulso de voltagem”;

Laser

Laser

Laser

Tempo

Vo

lta

ge

m

Tempo

Vo

lta

ge

m

Tempo

Vo

lta

ge

m

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Sistema Eletrônico

Área

Altura

Largura

Dos pulsos de voltagem pode-se medir:

Dispersão ou intensidade do foton capturado

Tempo de passagem da partícula no feixe de

laser

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Width

Height

Sistema Eletrônico

Event 1

Event 2

Event 3

FSC SSC

60 120

160 65

650 160

400 800 1000 0 0 200 400 600 800

0

200

400

600

800

1000

PE

FIT

C

840

85

245 638 PE

FIT

C

0

200

400

600

800

1000

200 600

840

85

156

FITC

638

245

612

PE

1000

• Armazenamento e visualização dos dados

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18

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FSC x SSC

Detector de dispersão de luz em ângulo reto 15 a 150º

Complexidade celular

SSC (Side Scatter)

Fonte de Luz Incidente: Laser de Argônio a 488 nm

Detector de dispersão de luz frontal 0.5 a 5º

Tamanho celular

FSC (Forward Scatter)

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FSC (Forward Scatter): Tamanho

celular

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Side Scater (SSC):Complexidade:

Reflexão a 90°

22

23

Fatores que influenciam a

dispersão de luz

• Forma

• Tamanho

• Presença de grânulos

• Complexidade interna dos diversos tipos

celulares

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Visualização dos dados 25

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Detecção de Fluorescência

Detectores de Fluorescência:

FL1 FL2 FL3

Fonte de Luz Incidente: Laser de Argônio a 488 nm

FSC

SSC

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Compensação – overlap 28

FL

1-%

FL

2

29

FL

2-%

FL

1

SOBREPOSIÇÃO

Compensação – overlap

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SUBCOMPENSADO SUPERCOMPENSADO OTIMIZADO

A Fluorescência é proporcional a

quantidade de anticorpo ligada a células

PE

PE

Intensidade de Fluorescência

Nú

mero

de E

ven

tos

PE

PE

PE

PE

PE

PE

PE

PE

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Fluoróforos

Fluorescein (FITC) 512 green

Alexa 488 515 green

Phycoerythrin (PE) 565 yellow

Cyanine 3 (Cy3) 570 yellow

PE-Texas Red (ECD) 620 red

PE-Cy5 (PC5) 665 deep red

Peridin-chlorophyll (PerCP) 670 deep red

PE-Cy5.5 (PC5.5) 695 deep red

PE-Cy7 (PC7) 755 far red

488 nm excitation 633 nm

Allophycyanin APC 660

Cy5 670

APC – Cy7 770

405 nm

Alexa 405 440

Pacific Blue (PB) 440

Cascade Blue (CB) 440

Típicos fluorocromos

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Aplicações Estruturais Funcionais

Intrínsecos

Morfologia da célula

Proteínas fluorescentes

Estado Redox

Proliferação celular

Ativação celular

Apoptose

Extrínsecos Conteúdo de DNA e RNA

Taxa de DNA

Estrutura cromatínica

Proteínas totais ou básicas

Grupos químicos

Antígenos

Açúcares de superfície

Estrutura citoesqueleto

Estudos da membrana celular

Atividade enzimática Endocitose

Síntese de DNA

Receptores

Potencial de membrana

pH, cálcio, carga de superfície

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Anexina V/Iodeto de Propídeo

Determinação de apoptose

Anexina V

Membrana

Plasmática

Fosfatidilserina

PI

Núcleo

Anexina V

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Determinação da ativação de caspases 35

Ensaios de proliferação celular

Ensaio de proliferação;

5-bromo-deoxyuridina incorporado durante síntese de DNA; Análogo da timina;

Detecção: métodos enzimáticos, anticorpos fluorescentes, imuno-histoquímica;

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37 Ensaios de proliferação celular Ciclo celular

MAPK – Quinases ativadas por

mitogenos

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Marcação Aquisição Analise

dos dados

• BD CBA Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit

• Phosphorylated Human NF-κB p65 Peptide

Basal

CN

Estimulado

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40 MAPK – Quinases ativadas por mitogenos

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Detecção intracelular de

citocinas – Beads magnéticas

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Vantagens

Analise simultaneamente múltiplas citocinas (≤30) requisitos de volume reduzido da amostra;

Requer menos diluições de amostras - relevância estatística alta;

300 Beads medidos por citocina Æequivalent de 300 poços de ELISA

Reduzido hands-on tempo com análise paralela de amostras - ampla faixa dinâmica (fluorescência);

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Dosagem de citocinas

Brefeldina A

Não estimulada Brefeldina A, 100 ng/mL

1,5 horas Brefeldina A, 20 µg/mL

Dependendo da célula e o estímulo realizado a retenção de

citocinas nas células ocorre com picos de 4h (para TNF-γ),

8h (para INF- γ e IL2) e mais de 12h (para IL-12).

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Dosagem de citocinas 46

0,01 µg/mL

LPS

1 ng/mL LPS

10 µg/mL BFA

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Vantagens x Desvantagens

Vantagens:

Mede múltiplos parâmetros individuais;

Grande número de células analisadas com rapidez;

Avaliação da heterogeneidade de células;

Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;

Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;

Desvantagens:

Custo do equipamento;

Mão de obra especializada;

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