Isomerización de la glucosa

NTRODUCCIÓN

La cinética química se encarga del estudio de la rapidez de una reacción, cómo

cambia bajo condiciones variables (concentración, temperatura, presión, etc.), así

mismo pretende encontrar ecuaciones que relacionen la rapidez de una reacción

con variables experimentales; y con ella podemos determinar el tiempo necesario

para que una reacción química llegue al equilibrio y así se determina si una

reacción es lenta o rápida al estudiar los factores que determinan la velocidad y el

mecanismo, es decir, la etapa o serie de etapas en las que ocurre el cambio.

Existen distintos tipos de cinética, en nuestro trabajo nosotros nos enfocamos a la

cinética enzimática, convirtiendo glucosa a fructosa con ayuda de la enzima

glucosa-isomerasa, por ello la orientación principal se encuentra dirigida hacía la

cinética de Michaelis-Mentel.

En el presente informe se pretende exponer los resultados de nuestra práctica. A

través de este mostramos el contraste de los resultados experimentales con los

teóricos usando los conocimientos ya adquiridos con anterioridad en clase,

nuestra hipótesis sobre la cinética en general y la cinética enzimática; se muestran

diversos métodos como el integral, el diferencial (a través de regresiones

múltiples), pero principalmente con la cinética enzimática para encontrar la

velocidad con la que se lleva a cabo la reacción; además se anexan las razones y

conclusiones a las que se llegó como equipo sobre los resultados del experimento.

3

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La cinética química tiene como función la determinación de la rapidez de una

reacción y la etapa o serie de etapas en las que ocurre el cambio. A través de la

presente práctica se pretende retomar el tema de cinética y su aplicación a los

resultados por medio del método integral y diferencial; además de retomar un

tema en específico como la cinética enzimática (debido a la utilización de la

enzima glucosa-isomerasa) y su aplicación en la ecuación de Michaelis-Mentel

para la determinación de la velocidad con la que se lleva a cabo la reacción.

Pretendemos determinar la velocidad durante el cambio al ir disminuyendo la

concentración de reactivos (glucosa en nuestro caso), y por lo tanto al aumentar la

concentración de producto (fructosa). Todo esto a través de la medición de la

concentración del sustrato de manera gradual a través del tiempo.

4

ANTECEDENTES

Antes de 1900, el gran foco de la cinética en las reacciones químicas consistía en

establecer leyes naturales acerca de la rapidez de estas. Existieron diferentes

estudios desde hace más de 200 años, cuando Wenzel en 1771 notó que la

disolución de zinc y cobre en ácido no era instantánea, sino que tomaba un tiempo

finito. Posteriormente en 1778, Priestley encontró que la cantidad de tiempo

requerido para transformar el óxido de mercurio en mercurio elemental era

dependiente la cantidad de oxigeno presente. Así se consideró que las primeras

medidas sobre las velocidades de las reacciones químicas mostraban que existía

un tiempo finito para que se llevaran a cabo, sin embargo, aún no se entendían

bien estos fenómenos.

Las primeras teorías de la rapidez de una reacción fueron propuestas entre 1889 y

1930. En 1889 Arrhenius escribió una famosa publicación –Estudios de dinámica

química- donde propuso que las reacciones eran activadas porque sólo las

moléculas “calientes” en realidad pueden reaccionar.

Actualmente, la Cinética de las Reacciones Químicas se considera una rama de la

Termodinámica, la cual investiga los estados intermedios (desequilibrios) de las

transformaciones físico-químicas desde la variable tiempo, la cual es

inherentemente dependiente del camino que siguen tales procesos. Así sobre la

base del concepto de reversibilidad en el equilibrio químico, desde un enfoque

macroscópico, es que parámetros como temperatura, presión, concentración, etc.

toman una importancia significativa, los estudios se basan en estados de equilibrio

y procesos reversibles desde un enfoque microscópico por lo que trabaja sobre

los parámetros ya mencionados.

En base a la temática central del presente proyecto, para la producción de

fructosa a partir de glucosa se somete el sustrato a un proceso de inversión, por

acción enzimática (con glucosa-isomerasa). Cabe señalar que anteriormente este

proceso se llevaba a cabo por hidrólisis ácida, actualmente se lleva a cabo por el

proceso antes mencionado ya que resulta ser más competitivo económicamente

hablando y más fácil de realizar.

5

La enzima glucosa isomerasa es una enzima que activa la reacción y permite que

se lleve a cabo la conversión de sustrato a producto; esta requiere de condiciones

específicas (pH y temperatura) para su correcto funcionamiento. El rendimiento

de la enzima disminuye con respecto al tiempo de reacción, hasta que esta queda

inactivada, alcanzando un máximo en la producción de fructosa.

El porcentaje de producción de fructosa máximo reportado en la literatura con la

utilización de la enzima trabajada es de 42 a 55%. “Natalia Lara Rodríguez”.

Cabe señalar que el jarabe de fructosa es utilizado como sustituto de la caña de

azúcar, refrescos, jugos, entre otros productos que tienen azúcar líquido. También

se utiliza en la elaboración de pasteles y galletas por ser un gran humectante y

agente texturizador.

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OBJETIVOS

Contextualizar y seguir obteniendo conocimientos sobre cinética en general

y cinética enzimática.

Obtener conocimiento general sobre la cinética de la reacción. Para

determinar la variación del consumo del sustrato y de la velocidad a través

del tiempo.

Aplicar el conocimiento de la concentración de sustrato y una constante k a

través del método integral, así mismo, determinar la rapidez de la reacción

a través del mecanismo de Briggs-Halndan.

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HIPÓTESIS

La velocidad de una reacción se puede calcular a través de diversas rutas. Pero

todas ellas se ven influenciadas por la temperatura, la presión y las

concentraciones de las especies involucradas en ella. También puede depender

de la fase o fases en las que ocurre la reacción.

El análisis del consumo de glucosa para la producción de fructosa se hace de

manera gradual a través del tiempo. En esta reacción se hace en presencia de un

catalizador el cual permite la activación de la misma, se empleó glucosa-

isomerasa. Al hacer uso de un catalizador podremos observar que al paso del

tiempo la actividad de la enzima ira disminuyendo y por lo tanto la velocidad de la

reacción también.

La velocidad de reacción al ser determinada por los tres métodos mencionados

anteriormente, debe coincidir al arrojar valores aproximados.

A través del método integral obtenemos un orden de reacción (independiente a los

coeficientes estequeométricos de la reacción) nos permitirá determinar cuándo ha

llegado a su tiempo de vida media, y principalmente su velocidad.

Así mismo el método diferencial y la cinética de Michaelis-Mentel nos otorgarán

las bases para la determinación de la velocidad de manera sencilla.

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MARCO TEÓRICO

La cinética se puede subdividir en:

Cinética física:

Estudia los fenómenos físicos tales como la difusión y la viscosidad

Cinética química:

Estudia las velocidades de las reacciones químicas

Nosotros nos enfocaremos en la cinética química que estudia como ya se

mencionó la velocidad a la que ocurren las reacciones químicas en función de la

concentración de las especies que reaccionan, los factores, las leyes y teorías que

la determinan o afectan a la velocidad; este tipo de cinética es un estudio

puramente empírico y experimental.

Para que una reacción química tenga lugar no sólo es necesario que esté

favorecida termodinámicamente, sino que además, es necesario que se dé a una

velocidad determinada, a esto se le llama velocidad de reacción que es la rapidez

con que tiene lugar una reacción; durante el cambio, la concentración de los

reactantes disminuirá, mientras que la concentración de los productos aumentará.

Aquí entra también la velocidad media que es la velocidad que se mide a través

del cambio de concentración en un periodo determinado.

Existen varios factores que afectan la velocidad de una reacción química:

Naturaleza de las sustancias.

Estado físico.

Superficie de contacto o grado de pulverización (en el caso de sólidos).

Concentración de los reactivos.

Temperatura.

Presencia de catalizadores.

En nuestra práctica el factor que afecta la velocidad de la reacción es un

catalizador, específicamente una enzima.

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Una enzima son proteínas de alto peso molecular que catalizan reacciones

químicas. Cada enzima es altamente específica para la reacción que cataliza.

Esta especificidad está determinada por el centro activo de la enzima.

Los reactivos de las reacciones catalizadas por enzimas se denominan sustratos.

Debido a que son catalizadores específicos, cada enzima cataliza un solo tipo de

reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato.

Con la presencia de la enzima en la reacción, entramos a una subdivisión de la

cinética química que es la cinética enzimática.

La cinética enzimática es la disciplina que estudia la velocidad en las reacciones

químicas en las que intervienen enzimas. El estudio de esta velocidad y de la

dinámica de la enzima, nos permite conocer a fondo el mecanismo de acción de

dicha enzima, el rol que cumple en el metabolismo, y la regulación de su actividad

por inhibidores naturales.

La velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente, es directamente

proporcional a la concentración de sustrato, hasta cierto punto. Cuando la

concentración del sustrato es baja, una parte de las moléculas enzimáticas tienen

su sitio activo libre. Si aumentamos la cantidad de sustrato, estos sitios activos

libres se unirán a él, acelerando la velocidad de la reacción sustrato a productos.

Si continuamos aumentado la cantidad de sustrato, llegará un momento en donde

ya no habrá más sitios activos libres, entonces la velocidad de la reacción ya no

puede aumentar más. Cuando se llega a este punto se dice que la enzima está

saturada.

En la cinética enzimática, las dos propiedades de mayor importancia son: el

tiempo que tarda una enzima en llegar a su punto de saturación y la velocidad

máxima que puede alcanzar la reacción catalizada por dicha enzima.

La velocidad de una reacción enzimática puede ser medida en el laboratorio.

Como la enzima no se consume en el proceso de catálisis de la reacción, se suele

medir la disminución de la concentración de sustrato en el tiempo, o el aumento

10

de concentración del producto. Estas concentraciones se pueden medir por

espectrofotometría o radiometría.

La velocidad de reacción de la cinética enzimática puede ser medida por medio de

la ecuación de Michaelis-Mentel.

En este modelo la enzima se combina reversiblemente con su sustrato para formar

el complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el

producto, hecho que regenera la enzima.

v0=Vmax [S ]Km+ [S ]

En donde: v0 es la velocidad inicial de la reacción

Vmax es la velocidad máxima

Km es la constante de Michaelis y Menten= k 1+k 2k 1

S es la concentración de sustrato

Como se acaba de mencionar, aunque es imposible medir exactamente la

concentración de sustrato que da Vmax, las enzimas pueden caracterizarse

mediante la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la

mitad de la velocidad máxima.

Esta concentración de sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten

(KM).

Para enzimas que exhiben una cinética de Michaelis-Menten simple esta

constante representa la constante de disociación del complejo enzima-sustrato

(ES) (o la inversa de la afinidad entre enzima y sustrato). Valores bajos indican

que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el

sustrato reaccione para dar producto.

11

En estos casos se obtendrá una KM diferente según el sustrato específico sobre el

que actúe la enzima (como sucede en el caso de enzimas que actúan sobre

sustratos análogos) y según las condiciones de reacción en que se realicen las

mediciones.

La formulación o tratamiento de Michaelis y Menten se basa en suponer la

existencia de un equilibrio rápido para la primera etapa y en suponer que la

constante de velocidad para la segunda etapa es despreciable frente a la

constante de la reacción inversa del equilibrio.

Pero como ya mencionamos hay ciertas excepciones, en las que no se cumple la

condición Kcat <<<k2; es por eso que en 1925, Briggs y Haldane propusieron un

nuevo modelo, más general, que incluía los dos anteriores:

No requiere la restricción de rápido equilibrio.

Condición es la del estado estacionario.

E + S == ES --- E + P

En este modelo también se cumple que:

[E] = [Eo] – [ES] y d[ES]/dt = k1[E][S] – k2[ES] – k3[ES]

Briggs y Haldane proponen la existencia de un estado estacionario que es aquella

que nos dice que la variación de la concentración de cualquier especie química en

la que pueda encontrarse la enzima, con respecto al tiempo cero o dicho de otra

manera, su concentración permanece constante por tanto:

d[E]/dt = 0 y d[ES]/dt = 0

Además propusieron otra deducción basada en el estado estacionario, obteniendo

una ecuación para la velocidad de reacción:

v = Vm [S] / ( k-1+k2/k1) + [S]

Donde: k-1+ k2/k1 = Km

La velocidad de una reacción catalizada por un enzima depende de:

La concentración de moléculas de sustrato [S].

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K1

K2

K3

La temperatura.

La presencia de inhibidores.

pH del medio, que afecta a la conformación de la molécula enzimática.

Además del antes mencionado método se utilizó también el diagrama de Lineweaver-Burk que se empleó como herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima.

Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de Michaelis-Menten es fácilmente representable y que de él emanan mucha información de interés.

Donde V es la velocidad de reacción, Km  es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato.

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de -1/Km.

Inconvenientes del método

Como requiere de dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir a grandes errores.

A altas concentraciones los puntos se aglutinan al principio de la gráfica.

En la investigación cinética es necesario medir las velocidades en diversas condiciones experimentales, y determinar cómo las afectan las concentraciones de reactivos, producción de reacción y otras sustancias (inhibidores).Hay dos métodos principales para estudiar estos problemas: el método de integración y el método diferencial.En el método integral, se comienza con una ecuación de velocidad que se considere aplicable.Por ejemplo, si la reacción es de primer orden se comienza con:

-dC/dt = kCDonde C es la concentración de reactivo.

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Al efectuar la conversión mediante integración, se transforma esta expresión en una ecuación que da C en función de t. Si está bien adaptada, se pueden utilizar métodos gráficos simples para determinar el valor de la constante de velocidad.Si no está bien adaptada, es necesario utilizar otra ecuación de velocidad y llevar acabo el mismo procedimiento hasta que la adaptación resulte satisfactoria.

Es un método de prueba y error, pero de gran utilidad, sobre todo cuando no surgen complicaciones especiales.

Reacciones de orden cero:La velocidad es independiente de la concentración de los reactantes.

-dC/dt = KdC = -Kdt

∫CoC dC = -K ∫ tot dtC –C0= Kt

Vida media:Tiempo en el cual se transforma el 50% de la concentración inicial.

C = C0– KtC0– C = Kt

C0– 0.5C0= Kt1/2t1/2= 0.5C0/K

Reacciones de primer orden

La velocidad depende de la concentración de uno de los reactantes.Una reacción de primer orden puede ser del tipo:

A -------- ZdC/dt = KCdC/C = -Kdt

∫CoCdC/C = -K ∫tot dt

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lnC – ln C0= - KtlnC = ln C0– Kt

Vida media:Tiempo en el cual se transforma el 50% de la concentración inicial.lnC = lnC0– KtlnC0– lnC = KtlnC0/C = Kt1/2lnC0/ 0.5C0= Kt1/2ln 2 = Kt1/2t1/2= 0.693/K

15

   

Reacciones de segundo orden

Estas reacciones pueden considerarse de manera similar. En este caso hay dos posibilidades: la velocidad puede ser proporcional al producto de dos concentraciones iguales o al producto de dos concentraciones distintas. El primer caso ocurre cuando participa un solo reactivo, como ocurre en el proceso:

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2 A --------Z

También se observa en reacciones entre dos sustancias distintas:A + B------ Z

Siempre y cuando sus concentraciones iniciales sean iguales.

En estos casos la velocidad se puede expresar como:dx/dt = k(a0– x)2

  Donde x es la cantidad de A que ha reaccionado en un volumen unitario en el tiempo t y a0 es la cantidad inicial de A.

Separando las variables se obtiene: dx/(a0– x)2= kdt

Y al integrar: 1/a0– x = kt + I

Donde I  es la constante de integración.La condición limitante es que x = 0 cuando t =0, entonces:I = 1/a0

Y, en consecuencia:x/a0(a0– x) = kt

La variación de x con t ya no es de tipo exponencial.

17

  De nuevo se pueden aplicar métodos gráficos para probar esta ecuación y obtener la constante de velocidad K:

18

Cuando la velocidad es proporcional a las concentraciones de dos reactivos diferentes y estas concentraciones no son iguales inicialmente, la integración se efectúa de manera distinta. Supóngase que las concentraciones iniciales son:a0 y b0 la velocidad después de que ha reaccionado una cantidad x (por volumen unitario) es :

dx/dt = k(a0 – x) (b0 - x)

El resultado de la integración, con la condición limitante x = 0, cuando t = 0, es:(1/a0 -b0  )ln {b0 (a0 – x)/ a0 (b0 – x)} = Kt 

Ésta ecuación se puede probar graficando el lado izquierdo contra t , si se obtiene una línea recta, la pendiente es k 

Vida media:t1/2= 1/a0.Kt1/2= 1/a0.KB= 1/b0.KA

   

Ecuaciones de velocidad y vidas medias

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Visto los conceptos y teorías que manejaremos en esta práctica, pasaremos a dar

generalidades a continuación de los reactivos que utilizamos:

Glucosa:

Formula C6H12O6Peso Molecular 180.16 g/mol

Es una hexosa es decir, contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es,

el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula (es un grupo aldehído). Es

una forma de azúcar que se encuentra libre en las frutas y en la miel. Su

rendimiento energético es de 3,75 kilocalorías por cada gramo en condiciones

estándar. Es un isómero de la fructosa, con diferente posición relativa de los

grupos -OH y =O.

La glucosa, libre o combinada, es el compuesto orgánico más abundante de la

naturaleza. Es la fuente primaria de síntesis de energía de las células, mediante

su oxidación catabólica, y es el componente principal de polímeros de importancia

estructural como la celulosa y de polímeros de almacenamiento energético como

el almidón y el glucógeno.

Fructosa:

Formula C6H12O6Peso Molecular 180.16 g/mol

La fructosa, o levulosa, es una forma de azúcar encontrada en los vegetales, las

frutas y la miel. Es un monosacárido con la misma fórmula empírica que la glucosa

pero con diferente estructura, es decir, es un isómero de esta. Es una hexosa al

igual que la glucosa.

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Todas las frutas naturales tienen cierta cantidad de fructosa (a menudo con

glucosa), que puede ser extraída y concentrada para hacer un azúcar alternativo.

Junto con la glucosa forman un disacárido llamado sacarosa o azúcar común.

Se utiliza en dietas que necesiten tener lo más equilibrado posible los niveles de

insulina (diabéticos, deportistas y sobre todo personas que quieren adelgazar) En

exceso, favorece el aumento de los triglicéridos plasmático, hecho que se ha de

contemplar en caso de hipertrigliceridemia. La fructosa el componente

fundamental del jarabe de maíz y se usa desde los 70’s en Estados Unidos y en la

Unión Europea para endulzar refrescos. Actualmente está presente en diferentes

cantidades en una amplia variedad de alimentos, y se ha convertido en uno de los

endulzantes más utilizados por la industria alimentaria. Se le puede encontrar en

productos de repostería, alimentos procesados, frutas y bebidas refrescantes

azucaradas, azúcar común, entre otros.

Enzima Glucosa-Isomerasa:

La glucosa-6-fosfato isomerasa es una enzima, presente en gran parte de los

seres vivos; cataliza la reacción reversible de glucosa-6-fosfato a fructosa-6-

fosfato. En el citoplasma, forma parte de las rutas metabólicas de la glucólisis y

la gluconeogénesis, y en la matriz extracelular funciona como factor

neurotrófico para cierto tipo de neuronas.

La reacción es la siguiente:

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Glucosa-6-fosfato   Fructosa-6-fosfato

La glucosa isomerasa es capaz de isomerizar D - glucosa a D - fructosa, y su uso

principal se encuentra en la elaboración de jarabe rico en alta fructosa que es

usado ampliamente como un edulcorante nutritivo en bebidas, postres,

mermeladas, etc.

Contribuye además por sus atributos funcionales y físicos en aplicaciones de

alimentos y bebidas, como potenciador de sabor, para desarrollo de color y sabor,

disminución del punto de congelación y estabilidad osmótica.

Sulfato de Magnesio:

Formula MgSO4·7H2OPeso Molecular 120.37 g/mol

El magnesio, catión principalmente intracelular, disminuye la excitabilidad neuronal

y la transmisión neuromuscular, interviene en numerosas reacciones enzimáticas y

es un elemento constitutivo; la mitad del magnesio del organismo se encuentra en

los huesos.

Sulfito de Sodio

Formula Na2SO3Peso Molecular 126.04 g/mol

Es un compuesto incoloro, producto de la reacción del ácido sulfuroso (u óxido de azufre (IV)) con hidróxido de sodio. En agua se disuelve con reacción ligeramente básica y es ligeramente higroscópico.

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El sulfito de sodio se oxida fácilmente para convertirse en sulfato de sodio (Na2SO4).

En las industrias es frecuentemente utilizado para eliminar el oxígeno disuelto en agua, que es dañino en calderas de vapor y otros tanques.

Agua desionizada

Es aquella a la cual se le han quitado los cationes, como los de sodio, calcio,

hierro, cobre y otros, y aniones como el carbonato, fluoruro, cloruro, etc. mediante

un proceso de intercambio iónico. Esto significa que al agua se le han quitado

todos los iones excepto el H+, o más rigurosamente H3O+ y el OH-, pero puede

contener pequeñas cantidades de impurezas no iónicas como compuestos

orgánicos.

Ácido sulfúrico

Formula H2SO4Peso Molecular 98.08 g/mol

Es el compuesto químico que más se produce en el mundo, por eso se utiliza

como uno de los tantos medidores de la capacidad industrial de los países. Una

gran parte se emplea en la obtención de fertilizantes. También se usa para la

síntesis de otros ácidos y sulfatos y en la industria petroquímica.

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METODO EXPERIMENTAL

Este experimento se realizó en las instalaciones de la Universidad Autónoma de

Sinaloa en el área de laboratorio de alimentos, de la Facultad de Ciencias

Químico-Biológicas.

MATERIALES Y EQUIPO:

Balanza analítica

1 Vaso de precipitado 500 mL

1 Matraz aforado de 250 mL

Plancha de calentamiento

Reactor

Bomba de agua

Micropipetas

Tubos de ensayo

Portable refracto-polarimeter

Cronómetro

Gradilla

pH metro

REACTIVOS:

Glucosa

Sulfato de magnesio (MgSo4)

Agua desionizada

Enzima Glucosa Isomerasa

Buffer pH=4 y pH=7

Sulfito de sodio (Na2SO3)

PROCEDIMIENTO:

1. Iniciamos el experimento pesando 31.5g de Glucosa en una balanza

analítica.

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2. Después en un matraz aforado de 250mL se le agregó 150mL de agua

desionizada, y añadimos la Glucosa.

3. Pesamos 0.7g de MgSo4 (este reactivo tiene la función de reaccionar con el

02 disuelto sin afectar la enzima al volverse sulfato).

4. Se agregó el MgSo4 al matraz mencionado anteriormente.

5. Posteriormente se aforó el matraz con agua desionizada.

6. Pasamos la solución a un reactor sobre la plancha para proceder a

calentamiento.

7. Lo siguiente que se realizó fue conectar con una manguera el reactor y una

bomba sumergida en agua a 68°C.

8. Una vez conectado el sistema al reactor, se tapó con aluminio para que no

se perdiera solución al momento de evaporar.

9. Tomamos la temperatura de la solución.

10.Después con ayuda del pH metro medimos el pH que fue de 8.75.

11.Posteriormente se utilizó un buffer de H2SO4 pH 4 para bajar el pH de la

solución y llegar al pH óptimo de la enzima que era 7.5.

12.Se pesó 1.25g de enzima glucosa isomerasa.

13.Medimos las temperaturas y el pH cuidando de que no cambiara.

14.Una vez cumplido con la temperatura y pH que requiere la enzima, se

agregó la glucosa isomerasa y Na2SO3(se convierte en sulfato de sodio) al

mismo tiempo; se comenzó a contar el tiempo.

15.Pasado 5min, se detuvo la agitación y el calentamiento para agarrar

muestra con micropipetas y agregar a un tubo de ensayo con ácido

previamente agregado.

16.Una vez agregada la muestra, colocamos el tubo de ensayo en una gradilla

y se procedió a calentar y agitar de nuevo.

17.Se repitió la toma de muestra para 10,20,30,40,50,60,80,100,120,150,180 y

210 minutos.

18.Una vez obtenidas las muestras se procedió a medir la concentración de

fructosa dentro de estas con ayuda del equipo portable refracto-polarimeter

25

19.Primero limpiamos el equipo con agua desionizada y posteriormente lo

calibramos.

20. Se retiró el agua desionizada con ayuda de una micropipeta y se agregó la

muestra con la misma.

21.Realizamos la medición de la concentración de fructosa en una muestra

alrededor de 15 veces cada una para obtener datos más exactos.

22.Se registraron varios valores y se sacó un promedio de cada muestra para

proceder y hacer los cálculos correspondientes.

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RESULTADOS Y DISCUSIÒN

Durante el proceso de producción de jarabe de fructosa a través de la isomerización de glucosa se obtuvieron resultados concordantes con lo ya reportado por Natalia Lara Rodríguez, lo cual indica que la máxima producción de fructosa por medio de la enzima glucosa-isomerasa es de 42 a 55%.

Nuestra producción máxima alcanzada en las réplicas del experimento se encuentra en 49.1% fue con una concentración de glucosa a 150 g/L.

De acuerdo al porcentaje de fructosa obtenido se puede evidenciar el consumo de glucosa, por lo tanto se puede apreciar como la concentración de sustrato disminuye respecto al tiempo.

Esta tendencia se observa en cada una de las réplicas del experimento realizado.

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% de producción de fructosa[S]=100g/

L[S]=150g/

L[S]=200g/

L0 0 0

7.4 4.9 4.810.4 6.8 7.515.8 11.3 12.320.4 14.4 16.324.9 18.4 20.429.2 21.9 23.832.2 25.4 27.137.3 31.5 32.141.4 36.4 36.343.6 40.7 39.947.3 44.5 43.748.1 46.8 45.648.3 49.1 47.6

0 50 100 150 200 2500.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

Variación de la concentración respecto al tiempo

[S]=100g/L[S]=150g/L[S]=200g/L

Tiempo en (min)

[G] M

Dado que necesitábamos contrastar los datos obtenidos, se hizo una estimación de las concentraciones de sustrato de acuerdo al tiempo, mediante un modelo matemático aplicable a la reacción.

[S]=100g/LEstimación Datos Experimentales

[S]mM Velocidad Velocidad [S] mM538.590257 3.77503419 3.77503419 550

520.2096388 3.5781346 3.5781346 514.444444

502.7996958 3.38676414 3.38676414 497.777778

470.7812524 3.02061063 3.02061063 467.777778

442.3137614 2.67657367 2.67657367 442.222222

417.1760572 2.35465326 2.35465326 417.222222

395.1469744 2.05484939 2.05484939 393.333333

376.0053476 1.77716207 1.77716207 376.666667

345.4998 1.28813706 1.28813706 348.333333

323.8900906 0.88757824 0.88757824 325.555556

309.4068958 0.57548561 0.57548561 313.333333

297.1739227 0.27322075 0.27322075 292.777778

291.0231615 0.17000481 0.17000481 288.333333

28

284.9831448 0.26583779 0.26583779 287.222222

29

250 300 350 400 450 500 550 6000

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

estimación[S]

[S] en mM

velo

cidad

(μm

ol/m

L*m

in)

[S]=150g/LEstimación Datos Experimentales

[S]mM Velocidad Velocidad [S] mM817.8218056 5.40584376 833.333333 5.4058437

6791.4810825 5.13172607 783.75 5.1317260

7766.491739 4.86529192 758.75 4.8652919

2720.41352 4.35547425 714.166667 4.3554742

5679.2798067 3.87639077 680.416667 3.8763907

7642.7832573 3.42804147 643.333333 3.4280414

7610.6165301 3.01042634 612.916667 3.0104263

4582.4722832 2.6235454 584.166667 2.6235454537.0218631 1.94198606 537.5 1.9419860

6503.9732627 1.38336344 505 1.3833634

4480.8677474 0.94767754 482.5 0.9476775

4459.4742776 0.52465505 458.333333 0.5246550

5446.622368 0.37824019 442.916667 0.3782401

9434.01379 0.50843295 436.25 0.5084329

5

30

400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 9000

1

2

3

4

5

6

[S] prácticoestimación

[S] en mM

Velo

cidad

(µm

ol/m

L*m

in)

[S]=200g/LEstimación Datos Experimentales

[S]mM Velocidad Velocidad [S]mM1095.543529 6.32700538 1110 6.327005381064.632129 6.03883238 1058.3333

36.03883238

1035.142427 5.75832624 1028.33333

5.75832624

980.2747795 5.22031457 975 5.22031457930.6339111 4.71297036 930.55555

64.71297036

885.9131474 4.23629362 884.444444

4.23629362

845.8058138 3.79028435 846.666667

3.79028435

810.0052355 3.37494255 810 3.37494255750.0976465 2.63626134 755 2.63626134703.7369829 2.02024999 708.33333

32.02024999

668.4698476 1.52690852 667.777778

1.52690852

31

631.002703 1.01690231 625.555556

1.01690231

604.6956366 0.78290331 604.444444

0.78290331

581.2684323 0.82491151 582.777778

0.82491151

500 600 700 800 900 1000 1100 12000

1

2

3

4

5

6

7

[S] prácticoEstimación

[S] en mM

Velo

cidad

en

(µm

ol/m

L*m

in)

Así mismo, determinamos la velocidad de la reacción una vez conocida la concentración de sustrato (glucosa) y de acuerdo a lo planteado en la hipótesis el comportamiento de la rapidez de reacción es congruente a lo esperado.

32

0 50 100 150 200 2500

0.51

1.52

2.53

3.54

Velocidad vs Tiempo

[S]=100g/L Velocidad

Tiempo en (min)

velo

cidad

(μm

ol/m

L*m

in)

0 50 100 150 200 2500123456

Velocidad vs Tiempo

[S]=150g/L

Tiempo en (min)

velo

cidad

en

(µm

ol/m

L*m

in)

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5

6

7Velocidad vs Tiempo

[S]=200g/L

Tiempo en (min)

Velo

cidad

(μm

ol/m

L* m

in

Para determinar el orden de la reacción es necesario tener datos experimentales sobre la variación de la concentración o propiedades que den directamente con la concentración (preferentemente de los reactantes).

33

Existen diversos métodos para determinar el orden de la reacción, ya sea el integral y el diferencial. Los resultados obtenidos en este experimento los ajustamos al método integral para conocer el orden de la reacción, se graficaron los datos para orden cero, primer orden y segundo orden. Se denota gracias a los gráficos que está reacción es de segundo orden ya que este fue el que tuvo un mejor ajuste en todas las réplicas.

m=-k

34

0 50 100 150 200 2500

100

200

300

400

500

600

f(x) = − 1.21688653824964 x + 485.629664132384R² = 0.843576647009371

ORDEN CERO

Tiempo en (min)

[G] e

n m

M

ORDEN 0[G]=100g/L

[G] mM T(min)550 0

514.444444 5

497.777778 10

467.777778 20

442.222222 30

417.222222 40

393.333333 50

376.666667 60

348.333333 80

325.555556 100

313.333333 120

292.777778 150

288.333333 180

287.222222 210

m=-k

m=k

m=-k

35

0 50 100 150 200 250

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

f(x) = − 0.0031656340242165 x − 0.119054399721008R² = 0.893154487084817

PRIMER ORDENTiempo en (min)

Ln[G

]/[G

]0

PRIMER ORDEN[G]=100g/L

ln [G]/[G]0 T(min)0 0

-0.06683071 5-0.09976453 10-0.16192493 20-0.21810576 30-0.27629929 40-0.33526085 50-0.37855766 60-0.4567584 80-0.52438515 100-0.56265069 120-0.63050439 150-0.64580106 180-0.64966207 210

SEGUNDO ORDEN[G]=100g/L

1/[G] T(min)0.00181818 00.00194384 50.00200893 100.00213777 200.00226131 300.0023968 400.00254237 500.00265487 600.00287081 800.00307167 1000.00319149 1200.00341556 1500.00346821 1800.00348162 210

0 50 100 150 200 2500

100200300400500600700800900

f(x) = − 1.84115655457724 x + 743.982392743737R² = 0.864094423587532

ORDEN CERO

Tiempo en (min)

[G]

36

ORDEN CERO[G]=150 g/L

[G] mM T(min)833.3333333 0

783.75 5758.75 10

714.1666667 20680.4166667 30643.3333333 40612.9166667 50584.1666667 60

537.5 80505 100

482.5 120458.3333333 150442.9166667 180

436.25 210

m=-k

37

0 50 100 150 200 250

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

f(x) = − 0.00313185584656833 x − 0.10658614756165R² = 0.911591352689435

PRIMER ORDENTiempo en min

Ln[G

]/[G

]

PRIMER ORDEN[G]=150g/L

ln[G]/[G]0 T(min)

0 0-0.06134363 5-0.09376138 10-0.15431736 20

-0.202728367 30-0.258770729 40-0.307204739 50-0.355247392 60-0.438504962 80-0.500875293 100-0.546452801 120-0.597837001 150-0.632052081 180-0.647218249 210

m=k

m=-k

38

0 50 100 150 200 2500

200

400

600

800

1000

1200

f(x) = − 2.48350044909229 x + 1014.88759336612R² = 0.903314547810572

ORDEN CERO

tiempo(min)

[G] m

M

SEGUNDO ORDEN[G]=150g/L

1/[G] T(min)0.0012 0

0.001275917 5

0.001317957 10

0.001400233 20

0.001469688 30

0.001554404 40

0.001631543 50

0.00171184 600.00186046

5 800.00198019

8 1000.00207253

9 1200.00218181

8 1500.00225776

1 1800.00229226

4 210

ORDEN CERO[G]=200g/L

[G] mM T(min)1111.1111

10

1058.33333

5

1028.33333

10

975 20930.55555

630

884.444444

40

846.666667

50

810 60755 80

708.333333

100

667.777778

120

625.555556

150

604.444444

180

582.777778

210

m=-k

m=k

Determinado el orden de la reacción, se calcula la vida media de esta que se define como el tiempo necesario para que haya reaccionado la mitad de su concentración

inicial. Suele representarse como t1/2 y se calcula mediante la fórmula T1/2=1/k*[A]o

39

0 50 100 150 200 250

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

f(x) = − 0.00312197873081093 x − 0.0807720275841388R² = 0.945216021430883

PRIMER ORDEN

tiempo(min)

ln[G

]/[G

]0

0 50 100 150 200 2500

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.001

0.0012

0.0014

0.0016

0.0018

0.002

f(x) = 4.02220681500328E-06 x + 0.00095879823949704R² = 0.974922848230704

SEGUNDO ORDEN

tiempo(min)

1/[G

]

PRIMER ORDEN[G]=200g/L

ln[G]/[G]0 T(min)0 0

-0.04866517 5-0.07742115 10-0.13067832 20-0.17733402 30-0.22815609 40-0.27180872 50-0.31608155 60-0.38639805 80

-0.450201 100-0.50916034 120-0.57447565 150-0.60880603 180-0.64530985 210

SEGUNDO ORDEN[G]=200g/L

1/[G] tiempo(min)

0.0009 00.000944

885

0.00097245

10

0.00102564

20

0.00107463

30

0.00113065

40

0.0011811

50

0.00123457

60

0.0013245

80

0.00141176

100

0.0014975

120

0.00159858

150

0.00165441

180

0.00171592

210

Concentración Vida media

100g/L 212 Min

150g/L 218 Min

200g/L 225 Min

Dado que esta cinética es enzimática del gráfico que mejor describe a esta reacción es lineweaver-Burk el cual se ajusta perfectamente a la reacción y es posible hacer cálculos de velocidad máxima de la reacción y Km.

40

0.0008 0.001 0.0012 0.0014 0.0016 0.0018 0.0020

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

f(x) = 114.662008649884 x + 0.0509288186995253R² = 0.9968040279273

Gráfico de Lineweaver-Burk

Series2Linear (Series2)

1/[G]

1/Vo

1/[G] 1/Vo0.0018567

0.26489826

0.0012 0.184985

0.00091279

0.15805266

b=1/Vmax

m=km/Vmax

41

km en mM

vmax (μmol/mL*min)

2252.65226

19.64636542

CONCLUSIÒN

En esta práctica experimental pudimos contextualizar los conocimientos de cinética química profundizando en cinética enzimática. Todo nuestro entorno material sufre cambios, es decir van reaccionando químicamente con otras sustancias o compuestos formando nuevos y con propiedades físicas y químicas diferentes.La cinética química estudia los cambios que sufre un sistema químico en el transcurso de cierto periodo de tiempo, en cinética química, como anteriormente se mostró, se nos presentan importantes conceptos como la velocidad de reacción, orden de la reacción, la molecularidad y de igual importancia mencionamos el tiempo de vida medio.Al enfocarnos en la temática de cinética enzimática podemos recapitular que, estas reacciones son de suma importancia debido a que se producen procesos esenciales para los organismos vivos que, sin éstos catalizadores, tomaría periodos muy largos de tiempo en ocurrir la reacción o los niveles de pH y temperatura tendrían que ser extremos.Para poder llevar a la comprensión los conocimientos adquiridos en horas clase de la materia de Fisicoquímica Biológica realizamos la presente práctica experimental, la cual consiste en la transformación de glucosa en fructosa mediante la actividad catalítica de la enzima glucosa isomerasa y a partir de ella poder determinar a partir de la concentración y en función de los intervalos de tiempo la velocidad de la reacción y el orden según el método integral aprendido en clase y el método diferencial aprendido en laboratorio. Además, llevamos la reacción obtenida, al mecanismo de las reacciones catalizadas por enzimas de cinética de Michaelis-Menten y posteriormente transformarlo en la ecuación de Lineweaver-Burk.El modelo de Lineaweaver-Burk fue utilizado debido a que puede resultar complicado encontrar el valor de Vmax a altas concentraciones de sustrato, es mediante este gráfico que podemos obtener el valor de Km y la velocidad máxima.La práctica experimental que se llevó a cabo que fue de 100 g/L, 150 g/L y 200 g/L de sustrato y con una enzima de concentración 5 g/L , al sacar velocidad máxima, orden de la reacción y el gráfico de Lineweaver-Burk, pudimos comparar con otras corridas enzimáticas de la misma reacción que nuestros datos en comparación con la corridas de 100 g/L y 200 g/L son equivalentes, el orden de la reacción que se ajusta de mejor manera y nos da una R2 más próxima a 1 es la de segundo orden. En la reacción, al irse consumiendo la glucosa y aumentando el porcentaje de fructosa se concluye que la concentración de sustrato disminuye respecto al tiempo.En esta corrida enzimática la velocidad máxima obtenida fue de 19.6463 μmol/mL*min y el Km fue de 2252.65226 mM.

42

El porciento de fructosa puede llegar en esta reacción hasta 50% debido a que la k es 1 y el tiempo se hace infinito.Se concluye que la corrida más eficiente es la de concentración de 200 g/L, debido a que a mayor concentración de sustrato es mayor la formación de complejos enzima-sustrato hasta llegar al punto de la velocidad máxima y a partir de ahí permanecer constante. La velocidad máxima de esta concentración fue la más alta en comparación con las otras dos concentraciones.Como un punto importante a mencionar para la finalización de este reporte experimental, podemos decir algunas aplicaciones que tienen las enzimas en la industria alimentaria, que es el campo de acción en la que entra nuestra reacción enzimática realizada.Las enzimas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, principalmente en la alimenticia. En algunos casos, como la obtención de yogurth, o la producción de cerveza o de vino, el proceso de fermentación se debe a las enzimas presentes en los microorganismos que intervienen en el proceso de producción. Los principales alimentos en los que se utiliza como endulzante el jarabe de alta fructosa songaseosas, en conservas de frutas y en el área de la repostería. Estos alimentos se endulzan con jarabes de fructosa y también glucosa, que antiguamente se obtenían por la ruptura del almidón de maíz al tratarlo con ácido. Los beneficios de la obtención del jarabe por medio por la acción enzimática es que permite obtener un jarabe de glucosa de mayor calidad y a menor costo. Los enzimas utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa obtenida puede transformarse luego en fructosa, otro azúcar más dulce, utilizando la enzima glucosa-isomerasa.

43

FUENTES ELECTRONICAS

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CINETICAQUIMICAACTUALIZADO_19881.pdf

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo01&note=54

http://matematicasfisicaymas.blogspot.mx/2012/11/cinetica-enzimatica-lineweaver-burk.html

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm

http://www.ecured.cu/index.php/Cinetica_enzim%C3%A1tica

http://fisicanet.com.ar/quimica/bioquimica/ap05_enzimas.php

http://www.mat.uson.mx/eduardo/calculo2/metodos.pdf

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/modelo.htm

http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/ecuacion%20de%20michaelis1.html

http://apuntesbiotecnologiageneral.blogspot.mx/2014/09/uso-de-las-enzimas-en-la-produccion-

de.html

http://identidad.queretaro.itesm.mx/2011/03/procesos-enzimaticos-en-la-produccion-de-alta-

fructosa-2/

http://www.cyclopaedia.es/wiki/Diagrama-de-Lineweaver-Burke

44

ANEXOS

45

46

47