10. Cinética enzimática

8/18/2019 10. Cinética enzimática

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CinéticaenzimáticaNELSON & COX

CAPÍTULO 6


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Cinética de las

reacciones enzimáticas Estudio de velocidad de

reacción enzimática ymodo en que cambia enrespuesta a cambiosexperimentales.

Concentración del sustrato([S]), factor clave encinética enzimática.

[S] cambia durante lareacción convirtiéndose enproducto (P)

Nelson & Cox, 2009


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Cinética de Michaelis -

Menten Estudio de cinética de

reacciones catalizadas porenzimas.

Propusieron que E se combinade forma reversible con Sformando un complejo ES(paso rápido).

Después el complejo ES sedescompone dejando E y P(paso lento).

Parámetros importantes parael estudio de la cinética deMM: [S], V max, Km, V 0


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Menten Efecto de [S] sobreV o de lareacción enzimática.

V o : cantidad de productoformado en la unidad de

tiempo a [S] determinada.Permite medir en unmomento determinado [S]o [P] formado.

V max: cantidad máxima deproducto formado a unaconcentracióndeterminada de enzima.

Nelson & Cox, 2009


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Menten Enzima existe en forma libre (E) o asociada (ES).

Enzima saturada, aumento en [S] no causa efectoen velocidad de reacción.

Velocidad global de reacción proporcional a [ES]

S S S + E E E E E E E E = ES ES ES = P P P + E E E E E E EE E E E E E E E E E E E E

S S S S S + E E = ES ES = P P E E + S S S S S = ES ES ….

S S S S S S

A baja [S] velocidad de reacción proporcional a [S]


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MentenMeseta observada(V max), efecto de

saturación de E.

Cinética de saturación.

Nelson & Cox, 2009


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MentenA bajas [S], aumento de [S]promueve aumento ≈lineal en V o.

Superado el punto mediode la cinética, aumentosde [S], provocan aumentosmenores de V o respecto aincremento de [S]. Luegose alcanza un punto endonde no se observancambios significativos enV o a pesar del incrementode [S]

K m: constante de Michaelis[S] necesaria para que V 0corresponda a ½ de V

max

.Nelson & Cox, 2009


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Menten

Interpretación de KmKm función compleja que refleja diversas constantes de velocidadimplicadas en reacción. En pocos casos refleja grado de afinidad de

enzima por sustrato. Nelson & Cox, 2009


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Constante de especificidad (Km/Kcat)

Valores de km y Kcat reflejan condiciones celulares de trabajo deenzimas.Km tiende a ser similar a la concentración celular normal del sustratoque modifica.Relación Km/kcat (constante de especificidad), es la constante develocidad para la conversión E + S en E + P.Constante de especificidad de 108 o 109, perfección catalítica.

Nelson & Cox, 2009


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Gráfica de dobles

recíprocos: Lineweaver - Burk Evalúa valores de V 0 a

diferentes [S], bajocondiciones

constantes (T, presión).

Partiendo de losvalores de V 0establecidos, permitecalcular losparámetros cinéticosKm y V max.

Nelson & Cox, 2009


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Gráfica de dobles

recíprocos: Lineweaver - Burk Transformación

algebraica deecuación MM.

Utiliza los inversos delos datos cinéticos.

Ecuación de la recta.

1 = Km 1 + 1

Vo Vmax [S] Vmax

y = m x + b

Nelson & Cox, 2009


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TransformaciónLineweaber – Burk Calcular Km y Vmax para la siguiente serie de

datos cinéticos.

S (M) Vo (mM/s)0.0012 3.10.0034 6.80.0071 10.30.0093 13.4

0.0128 15.30.0199 20.3


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Transformación

Lineweaber – Burk S (M)

Vo(mM/s)

0.0012 3.1

0.0034 6.8

0.0071 10.3

0.0093 13.4

0.0128 15.30.0199 20.3


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Transformación

Lineweaber – Burk S (M) S (mM)

Vo(mM/s)

0.0012 1.2 3.1

0.0034 3.4 6.8

0.0071 7.1 10.3

0.0093 9.3 13.4

0.0128 12.8 15.30.0199 19.9 20.3


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Transformación

Lineweaber – Burk S (M) S (mM)

Vo(mM/s) 1/S mM = X

1/Vo mM/s= Y

0.0012 1.2 3.1 0.83333333 0.32258065

0.0034 3.4 6.8 0.29411765 0.147058820.0071 7.1 10.3 0.14084507 0.09708738

0.0093 9.3 13.4 0.10752688 0.07462687

0.0128 12.8 15.3 0.078125 0.06535948

0.0199 19.9 20.3 0.05025126 0.04926108


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Transformación

Lineweaber – Burk y = 0.342x + 0.0402R² = 0.9962

0

0.050.1

0.15

0.2

0.250.3

0.35

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1

/ V o m M / s

1/S mM


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Reacciones con dos omás sustratos

Nelson & Cox, 2009


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Inhibición enzimática

Inhibidor: agente molecular que interfiere lacatálisis.

Importancia en el campo farmacológico yconocimiento de mecanismos enzimáticos deacción.

Inhibición reversible e irreversible.

Moduladores moleculares:

Inhibidores Potenciadores


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Inhibición reversible


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Inhibición competitiva

Inhibidor: análogo químico del sustrato, fijación de I y S mutuamenteexcluyentes.Efecto de I disminuye por incrementos en [S].Altera únicamente Km (Km en presencia de I llamada “Km aparente”), el

valor de Vmax no se altera por presencia del inhibidor. Nelson & Cox, 2009


24/42In

h i b i c i ó n c o m

p e t i t i v a

Representación

de gráfica dedobles recíprocosde efecto deinhibidorcompetitivo.

Se altera el valorde la pendiente,pero el interceptosigue igual.

¿Efecto enparámetroscinéticos?

Nelson & Cox, 2009


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Inhibición competitiva

Vo = Vmax [S]αKm + [S]

α = 1 + [I]

KIKI =

[E] [I]

[EI]αKm = valor de la Km en presencia de inhibidor (Kmaparente), refleja la forma en que inhibidor (a través de suconstante o Ki) afecta la Km normal de la reacción.


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Inhibición acompetitiva

S e I se une a E en sitios diferentes, I se une a complejo ES, no a E libre.Efecto de I: disminuir valores de Km y Vmax de la reacción.

Incrementos en [S] no disminuyen efecto de inhibidor. Nelson & Cox, 2009


27/42In

h i b i c i ó n a c o

m p e t i t i v a

Representación de

gráfica de doblesrecíprocos de efectode inhibidoracompetitivo.

El valor de lapendiente no sealtera pero el delintercepto sí, ¿efectoen parámetroscinéticos?

¿Por qué disminuyetanto Km comoVmax si no alterapendiente?

Nelson & Cox, 2009


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Inhibición acompetitiva

Vo = Vmax [S]

Km + α’[S]

α' = 1 + [I]

K’IK’I=

[ES] [I]

[ESI]

α'Km = valor de la Km en presencia de inhibidor (Kmaparente), refleja la forma en que inhibidor (a través de suconstante o Ki) afecta la Km normal de la reacción.


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Inhibición mixta

I se une a E en sitio diferente al sitio de unión de S, pero I se puede unir a Elibre o complejo ES.

Altera tanto Km como Vmax. Nelson & Cox, 2009


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I n h i b i c i ó n m i x t a

Cinética deMichaelis – Menten

Vo = Vmax [S]

αKm + α’[S]No competitiva

clásica

α = α’

No se afectaKm solo Vmax

Nelson & Cox, 2009


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Efectos de inhibidoresreversibles sobre constantescinéticas

Nelson & Cox, 2009


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Determinando el tipo de

inhibiciónSuccinato(sustrato)

mM

Malonato (inhibidor) mM

Concentración de inhibidor

0 0.5 1.0

[S] Vo mM/s Vo mM/s Vo mM/s

0.05 0.33 0.20 0.14

0.10 0.50 0.33 0.25

0.20 0.67 0.50 0.400.40 0.80 0.67 0.57

0.50 0.83 0.71 0.63


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inhibiciónSuccinato(sustrato)

mM

Malonato (inhibidor) mM

Concentración de inhibidor

0 0.5 1.0

1 / [S] 1/Vo mM/s 1/Vo mM/s 1/Vo mM/s20 3.030 5.000 7.14210 2.000 3.030 4.0005 1.492 2.000 2.500

2.5 1.250 1.492 1.7542 1.204 1.408 1.587

Colocar todos los datos en la misma dimensional.Obtener los inversos de [S] y Vo (en presencia y ausencia

de inhibidor).


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Determinando el tipo deinhibición

y = 0.1016x + 0.9928R² = 0.9999

y = 0.2002x + 1.0043R² = 0.9999

y = 0.308x + 0.9639R² = 0.9999

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

1 / V o ( m M )

1/[S]

1/Vo no I

1/Vo I 0.5

1/Vo I 1

Notar que aunque el valor del intercepto no “exactamente igual”, enla gráfica se puede observar que la variación es tan pequeña que seconsidera despreciable. Esto se refleja en valores de V max tan cercanos

que se consideran iguales.


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inhibición En ausencia de inhibidor

Vmax 1.008 Km 0.101

Inhibidor 0.5 mM

Vmax 0.996 Km 0.199

Inhibidor 1 mM

Vmax 1.038 Km 0.319

¿Tipo de inhibición?


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Inhibición irreversible


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Inhibición irreversible

I se combinan o destruyen una porción de laenzima indispensable para su función.

Pueden formar asociaciones no covalentes muyestables o covalentes.

Permiten identificar aminoácidos con funcionescatalíticas clave en sitio de unión.

Inactivadores suicidas o basados enmecanismo.


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P e n i c i l i n a

Nelson & Cox, 2009


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P e n i c i l i n a

Nelson & Cox, 2009


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Inhibidores de proteasa

del VIH

Nelson & Cox, 2009


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Efecto del pH

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