Cinética Enzimática

Prof Karine P. Naidek

Novembro/2016

UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA – DQMC BIOQUÍMICA – BIO0001

Cinética das Reações Bioquímicas

As células vivas dos organismos heterotróficos e dos

organismos autotróficos (na ausência de luz) obtêm a

energia de que necessitam a partir da oxidação dos

substratos de reserva a CO2 e água.

Esse conjunto de reações, assim como, as reações de

síntese das macromoléculas, só é possível devido à

intervenção dos catalisadores bioquímicos ⇒ as enzimas.

Todas as enzimas são proteínas globulares e catalisadores

eficientes.

Catalisadores

• Energia de ativação necessária para iniciar um processo químico pode ser fornecida pela elevação da temperatura que aumente a agitação molecular.

• Em Bioquímica, a temperatura dos sistemas não pode ultrapassar os valores compatíveis com a vida dos organismos (aquecimento ⇒ desnaturação das proteínas).

• Catalisadores bioquímicos ⇒ função de baixar a energia de ativação necessária à reação e permitir que a reação ocorra em velocidade muito mais elevada.

Centro ativo ou sítio ativo

• É constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato.

• Compreende o local de fixação: que se combina com o substrato por ligações fracas; e o centro catalítico: que atua sobre o substrato levando-o a sofrer a reação química.

• A conformação do local e fixação se modifica em consequência da ligação ao substrato ⇒ substrato induz a alteração da conformação.

• Nas enzimas que atuam através de um cofator (metal; grupo prostético ou coenzima), essa estrutura se encontra ligada na vizinhança do centro catalítico.

Velocidade da Reação enzimática

A velocidade de uma reação enzimática é, em geral, obtida pela medida da quantidade de produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo.

S = substrato; E = enzima;

P = produto

Até certo ponto da reação, a variação é linear. É vantajoso medir a velocidade no início da reação, quando pouco substrato foi transformado e a velocidade inversa é desprezível. A inclinação é então máxima, o que permite ter a velocidade inicial da reação.

Velocidade da Reação enzimática

A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima

Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática

Temperatura

A velocidade da maioria das reações químicas aumenta

quando a temperatura aumenta. Moléculas se movem

mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas

temperaturas e, portanto, muitas podem não ter energia

suficiente para promover a reação química.

Para as reações enzimáticas, entretanto, elevações além

de certa temperatura reduz drasticamente a velocidade

de reação. A temperatura ótima para a maioria das

enzimas se situa entre 35 e 40ºC.

A redução da velocidade de reação acima da temperatura

ótima é devida à desnaturação das enzimas, ou seja, a

perda de sua estrutura tridimensional característica. A

desnaturação de uma proteína envolve o rompimento de

ligações de hidrogênio e outras ligações não covalentes.

Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática

pH

A maioria das enzimas tem um pH ótimo no qual sua atividade é máxima. Acima ou abaixo deste valor de pH a atividade enzimática, e portanto a velocidade de reação, diminui.

Quando a concentração de H+ (pH) no meio é drasticamente alterada, a estrutura tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração de ácidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H+ (ou OH-) compete com o hidrogênio nas pontes de hidrogênio e ligações iônicas presentes na estrutura da enzima, resultando na sua desnaturação.

Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática

Concentração de Substrato

Existe uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação específica. Apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta taxa máxima pode ser alcançada.

Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está em saturação, isto é, seus sítios ativos estão todos ocupados por moléculas de substrato ou produto. Nesta condição, um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação porque todos os sítios ativos já estarão sendo utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não estão saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de enzima poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a velocidade de reação é influenciada pela concentração de substrato.

Fatores que Influenciam a Atividade Enzimática

Inibidores

Uma forma efetiva de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo, é controlar suas enzimas.

Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser considerada como inibidor.

Cinética Enzimática

Na reação enzimática se forma um complexo transitório entre enzima e substrato.

A reação catalisada enzimaticamente se processa em duas etapas:

* A enzima se liga reversivelmente ao substrato formando um complexo enzima-substrato (ES)

* O produto é liberado e a enzima volta à forma livre podendo, então, se ligar a outra molécula de substrato.

Cinética Enzimática

O estudo das reações enzimáticas se baseia em medidas de velocidade da reação catalisada.

Velocidade de uma reação ⇒ quantidade de produto formado em um tempo determinado.

Velocidade inicial de uma reação ⇒ medida em tempos suficientemente curtos para que no máximo 5% do substrato sejam transformados em produto.

Em uma reação enzimática típica, a 1ª fase ocorre a velocidades muito maiores do que a 2ª fase. Equações de velocidade para estas fases são:

Cinética Enzimática

A medida real da velocidade da reação, ou seja, a medida da velocidade de formação do produto é igual a v3, que é a etapa mais lenta e limitante do processo. Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, normalmente, muito menor que a concentração de substrato. Um equilíbrio entre E, S e ES (com concentrações definidas e constantes de cada espécie) se estabelece muito rapidamente. Tendo ocorrido a formação de ES, se inicia a segunda parte da reação enzimática, aquela que efetivamente forma o produto, com uma velocidade proporcional à concentração de ES. O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não provoca diminuição da sua concentração, uma vez que há excesso de substrato para se combinar com a enzima liberada quando se forma o produto. Esta situação se mantém por algum tempo (tempo inicial): contínua formação do produto e concentrações estáveis de ES e S. A pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significativa, face ao seu grande excesso.

Cinética Enzimática

À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as velocidades de formação do produto se tornarão cada vez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa existirá cada vez mais complexo ES. Nestas condições haverá a maior concentração possível do complexo ES; a reação será processada na máxima velocidade possível.

Existirá uma determinada concentração de substrato que provocará a formação de uma concentração de ES igual à metade da máxima possível. Nestas condições, a velocidade será, naturalmente, a metade da maior velocidade possível.

Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou Km.

Teoria de Michaelis-Menten

Propostas

• A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato (ES)

• A fase mais lenta é a formação de produto (P)

• Há excesso de substrato (S)

• Todas as determinações de produto (P) são feitas no início da reação quando a velocidade de formação do complexo enzima-substrato (ES) a partir de enzima (E) + produto (P) é muito pequena e pode ser desprezada ⇒ velocidades iniciais

Teoria de Michaelis-Menten

Cinética de Michaelis–Menten

Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato e a velocidade de reação;

As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato.

Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala de concentrações de substrato [S]);

a velocidade de reação (v), aumenta com o acréscimo de [S].

A medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax.

Teoria de Michaelis-Menten

A saturação acontece porque, à medida que é aumentada a concentração de substrato, aumenta também a quantidade de enzima presente sob a forma de complexo enzima-substrato (ES).

À velocidade máxima, Vmax, todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato e a concentração de complexo ES é igual à concentração de enzima.

Teoria de Michaelis-Menten

A atividade de uma enzima é geralmente descrita através de Vmax e também da constante de Michaelis-Menten (KM), que representa a concentração de substrato à qual se detecta uma velocidade de reação igual a metade de Vmax;

Cada enzima possui um KM característico (kcat) para um dado substrato; este parâmetro é muitas vezes usado para demonstrar a força de ligação de um substrato à enzima.

É também usada outra constante cinética, kcat, para descrever o comportamento de uma enzima, representando o número de moléculas de substrato que podem ser catalisadas por centro ativo por segundo.

Teoria de Michaelis-Menten

No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reação com um substrato existe uma reação bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reação unimolecular ES → E + P possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k2.

v = k2[ES]

k2 também é o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas por segundo.

Teoria de Michaelis-Menten

Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E], mudando o equilíbrio para o lado direito.

Uma vez que a velocidade de reação depende da concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S];

Altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES.

Nestas condições, a velocidade (v≈k2[E]tot=Vmax) é insensível a pequenas alterações de [S]; assim, [E]tot é a concentração total enzimática

[E]tot = [E] + [ES]

que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação

Teoria de Michaelis-Menten

A equação de Michaelis–Menten descreve como a velocidade de reação v depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis e Menten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-se a seguinte equação: A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.

Teoria de Michaelis-Menten

A situação mais normal dá-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cinética de Briggs-Haldane. A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação ao estado estacionário. Durante o período inicial, a velocidade de reação v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante:

A concentração de [ES] é dada por:

em que a constante de Michaelis Km é definida por

Por que determinar Km ?

Km estabelece o valor aproximado para o nível de substrato intracelular.

[S]intracelular << Km ⇒ v seria muito sensível a variações de S (1ª ordem) e o poder catalítico da enzima seria desperdiçado, pois v << Vmax.

[S]intracelular >> Km ⇒ não há sentido fisiológico pois v não pode exceder Vmax. Quando [S] >> Km; v se torna insensível a variações de S.

Km é específico para uma dada enzima.

Serve de meio de comparação entre enzimas extraídas de diferentes fontes, mas que catalisam a mesma reação.

Pode-se determinar se duas enzimas são idênticas ou se são proteínas diferentes que catalisam a mesma reação.

Por que determinar Km ?

Variação no valor de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade de uma enzima.

Se Km determinada “in vitro” for diferente da determinada em condições fisiológicas, isto pode indicar a falta de um efetor. Vários efetores podem ser testados para a identificação de quais atuam como inibidores ou ativadores.

Conhecendo-se o valor de Km pode-se determinar Vmax que é função da [E]total

Utilizando [S] >> Km determina-se Vmax.

Km indica a adequacidade relativa de substratos a uma enzima.

Quando mais baixo o valor de Km maior a afinidade do substrato com a enzima.

Método gráfico

Inibição Enzimática

Inibição Enzimática

Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade das enzimas.

Podem encontrar-se dois tipos:

Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática;

classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas Km e Vmax.

Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo

enzima-substrato ES ou a ambos.

Irreversíveis: quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima.

Geralmente produzem modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima.

Estas reações decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis.

Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao inibidor.