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CINÉTICA ENZIMÁTICA
1 – INTRODUÇÃOO conhecimento das propriedades cinéticas das enzimas é importante para compreender as transformações que ocorrem no interior das células que participam dos processos fermentativos e também dos reatores enzimáticos.
2 – APLICAÇÕES INDUSTRIAISTabela 1: Enzimas aplicadas na indústria
ENZIMAAPLICAÇÃO
Proteases *Fabricação de aspartame*Obtenção de insulina humana a partir de insulina suína
Amilase (Bacillus subtilis) *Indústria de fermentação alcoólica *Produção de glicose
Tripsina (pâncreas animal) Amolecimento de carnes
Papaína (mamão) e Bromelina (abacaxi)
*Auxiliar digestivo *Amolecimento de carnes
Pepsina (estômago animal) Auxiliar digestivo
Renina (estômago de bezerros) Fabricação de queijo
Pectinase (Aspergilus niger) Retirada de pectina na clarificação de sucos de frutas
Enzimas são proteínas (seqüência de aminoácidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalíticas. Na maioria das vezes são proteínas globulares. É mostrado na tabela 2 uma comparação entre as características das enzimas e dos catalisadores inorgânicos.
Tabela 2: Comparação entre as enzimas e os catalisadores inorgânicos.
CARACTERÍSTICAENZIMAS CATALISADORES
QUÍMICOS
1 – Especificidade ao substrato Alta Baixa
2 – Natureza da estrutura Complexa Simples
3 – Sensibilidade à temperatura Alta Baixa
4 – Condições de reação (T, P e pH) Suaves Drásticas (geralmente)
5 – Custo de obtenção (isolamento e purificação) Alto Moderado
6 – Natureza do processo Batelada/contínuo
Batelada/contínuo
7 – Consumo de energia Baixo Alto
8 – Formação de subprodutos Baixa Alta
9 – Reutilização do catalisador Simples/cara Simples
10 – Atividade catalítica (temperatura ambiente) Alta Baixa
11- Presença de cofatores Sim Não
12 – Energia de ativação Baixa Alta
13 – Velocidade de reação Alta Baixa
• A característica mais importante das enzimas éa elevada especificidade. Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos, mas outras possuem uma especificidade absoluta para um único substrato como mostrado na Figura 1:
Sítio ativo
Substrato Produtos
Enzima Enzima
E + S ES E + P
• Como exemplo de especificidade enzimática pode ser tomado a hidrólise enzimática do amido:
• α-amilase atua na amilose rompendo a ligação α-1,4 produzindo maltose e glicose.
• α-glicosidase atua na α-1,6 produzindo amilose.• Com a atuação das duas enzimas no amido é
produzido maltose e a glicose.• Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na α-
1,6 e α-1,4 de forma a produzir também maltose e glicose a partir do amido.
3 – NOMENCLATURA• nome do substrato • ou + sufixo ase• reação que catalisa • protease (hidrolisa proteínas)• álcool desidrogenase (catalisa a
desidrogenação de um álcool)• outras apresentam terminações ina
(tripsina, renina, bromelina etc)
• 4 – COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO•
E + S ES E + P• Cinética da reação enzimática com
formação de um substrato• Medindo as concentrações do produto (P)
e do substrato (S) expressos na reação acima, podemos obter a figura seguinte:
[P]
e
[S]
Tempo
Produto
Substrato
5 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMA
[P][E]1[E]2
[E]1>[E]2>[E]3>[E]4
[E]3[E]4
Tempo
• 6 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO• O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar
matematicamente a influência da concentração do substrato na cinética da reação enzimática. Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversívelmente, formando um composto intermediário denominado “complexo enzima-substrato”que por sua vez decompõe ou regenera a enzima e forma os produto da reação.
• k1• E + S ES• k2
• k3• ES E + P • V• onde k1 = constante de vel. de formação do complexo• k2 = constante de vel. de dissociação do complexo• k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo
formando os produtos da reação• V = velocidade de formação dos produtos
• Consideremos um caso simples, caracterizado pelas seguintes hipóteses:
• a) Complexo ES (1mol de enzima para 1 mol de substrato)
• b) O complexo formado se decompõe, sem reagir com outras substâncias existentes no sistema
• c) Fazendo X = ES logo a variação da concentração de X com o tempo (dX/dt) será:
• dX/dt = k1.E.S – k2X – k3X eq. 01• fazendo Et = E + X logo E = Et – X• fazendo St = S + X logo S = St – X• onde St = quantidade de substrato total adicionada ao
sistema• S = quantidade de substrato não associada ao
complexo ES• Et = quantidade de enzima total adicionada ao
sistema• E = quantidade de enzima não associada ao
complexo ES
• Substituindo os valores de En e de Sn na eq. 01 vem:
• eq. 02• supondo que as concentrações de substrato são
muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as do complexo, o que écomum na prática
• ES<<S>>E• Então pela eq. 02 vem:• eq. 03
XkXkXtSXtEkdtdX
32))((1 −−−−=
XkktSXtEkdtdX )32()(1 +−−=
• Supondo, ainda que boa parte da reação se desenvolve mantendo-se constante a concentração do complexo no tempo (estado estacionário) ou seja dX/dt = 0
XkkXESk tt )()( 321 +=−
32
)(1kk
XtEtSkX+
−=
mkXtStEtS
kkkXtEtSX −
=+
−=
1/)32()(
1k÷
• onde = constante de Michaelis e • Menten que pode indicar o grau de
afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato menor é o valor de km
• isolando X
132
kkk
mk +=
mktEtS
mkXtSX =+
mktEtS
mktSX =⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+1
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=
mktSmk
tEtSX1
1.
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ +=
mktSmkmk
tEtSX 1.
( )tSmkmk
mktEtSX
+= .
tSmktEtSX
+=
• fazendo St = S e Et = E vem,
SmkSEX+
= eq. 04
Sabendo que a velocidade da reação enzimática é
V = K3X eq. 05Substituindo a eq. 04 na eq. 05 vem,
SmkESkV+
= 3
Fazendo K3E = Vmax = Velocidade máxima de formação de produtos correspondente a situação em que toda enzima se encontra na forma ES vem:
SmkSVV+
= max eq. 06
Esta equação é chamada equação de Michaelis e Menten.
SmkSVV+
= max
Vmax
Vmax/2 (1)
(2) (3)
Na região (1) do gráfico a velocidade da reação é uma função crescente da concentração do substrato, até um determinado valor desta concentração (ponto 2) que a partir do qual a velocidade se mantém constante (região 3).O tipo desta curva é análogo aos fenômenos de saturação que pode ser melhor compreendido analisando o próximo gráfico.
Situação antes do Equilíbrio Situação no Equilíbrio % da Vmax
E S E + S ⇔ ES
25%
50%
75%
100%
100%
• Quando a concentração do substrato é tal que a velocidade de reação é metade da velocidade máxima teremos:
[S]K[S]
21
m +=
Km + [S] = 2[S]Km = [S]
Como se sabe o valor de Km éinversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Desta forma podemos comparar a afinidade da Enzima1 com a da Enzima2 no gráfico:
Vmax
Vmax/2
S Km1 Km2
Km2 > Km1 portanto a afinidade da enzima1 pelo
substrato S é maior que a da enzima2
Enzima1
Enzima2
• Uma forma precisa de determinar Vmax e km a partir de dados experimentais é o método chamado Lineweaver-Burk, resultado da inversão da equação 4 de Michaelis e Menten.
• eq. 07SV
mkVV
1.maxmax
11+=
• que trata-se da equação de uma reta representada pela figura a seguir.
1/v
1/vMAX
km/Vmáx
1/S
• ATIVIDADE ENZIMÁTICA• A velocidade da reação pode também ser
expressa em termos de sua atividade enzimática. Que é a quantidade de produto formado em um certo tempo pela quantidade de enzima utilizada. A atividade de uma enzima édefinida especificamente para cada caso estudado.
• A CONSTANTE CATALÍTICA é definida para se estudar a eficiência da catálise enzimática.
[E]Vk max
cat =
• kcat equivale ao número máximo de moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto por segundo. Como exemplo, podemos tomar a enzima catalase com kcat = 107 s-1, portanto esta enzima é capaz de originar 10 000 000moléculas de produto por segundo.
• 7 – INFLUÊNCIA DA PRESENÇA DE UM INIBIDOR• A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível• O inibidor irreversível forma um complexo estável com a
enzima não podendo ser removido para recuperar a enzima ativa.
• Exemplo: metais pesado (Hg), agentes complexantes de metais (CN)
• A inibição reversível é caracterizada por uma constante de equilíbrio ki, que é medida pela afinidade do inibidor com a enzima.
• Três formas simples de inibição podem ser descritas:• Pelo substrato (reversível)• Competitiva (reversível)• Não competitiva (irreversível)
• 7.1 – INIBIÇÃO PELO EXCESSO DE SUBSTRATO (reversível)• k1• E + S ES• k2
• k3• ES + S ES2 (Complexo não reativo)• k4• k5• ES E + P• V•
S
Vmax
V
ikSSmk
SVV 2max
++
=
eq. 08
onde ki é a constante de inibição; Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk
SiKVSV
mkVV max
11.maxmax
11++=
Km/vmax
1/S-1/km
1/V
Eq. 9
1ª Hipótese:para valores de S<<ki a eq. 09 se reduz em,
SVmk
VV1.
maxmax
11+=
SiKVSV
mkVV max
11.maxmax
11++=
1/vmaxKi
S
1/Vmax
1/V
Eq. 9
2ª Hipótese:para valores de S>>km a eq. 09 se reduz em,
SiKVVV max
1
max
11+=
Os valores de Vmax determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.
• Diz-se que um inibidor competitivo reage com a enzima como se fosse um outro substrato.
• Indicando-se com Ι a fórmula molecular de um inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e Menten fornece:
• k1 k3• E + S ES ES E + P• k2 V• k4• E + Ι EΙ EΙ E + P’• k5 k6
• O complexo EΙ (Enzima-Inibidor) pode ou não formar produto, porém quando o inibidor forma o complexo EΙ fica impedindo que o substrato S entre em contato com a enzima E.
• A velocidade de formação do produto desejado será, então:
• eq. 10 Sikmk
SVVi+Ι+
=)/1(max
onde km = (k2+k3)/k1 = cte de Michaelis e MentenΙ = concentração do Inibidorki = (k5+k6)/k4
Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk
SVikmk
ViV1.
max
)/1(
max
11 Ι++= Eq.11
)/1(1
ikmk Ι+−
-1/km 1/S
1/V
1/Vmax
I2>I1 I1I=0
• Fazendo a relação entre Velocidade segundo Michaelis e Menten e a Velocidade de inibição competitiva vem;
iKSmkmk
iVV
)(1
+Ι
+= Eq.12
• Esta relação trata-se de uma representação matemática da influência das concentrações de substrato e de inibidor na inibição competitiva, da seguinte forma:
S>>i
S1
S2<S1
I
V/VI
1
Ou seja, com o aumento da concentração de substrato em relação a concentração do inibidor diminui a influência do inibidor na cinética enzimática.
• INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível)• Consideremos o caso em que o inibidor,
presente no sistema na concentração Ι, bloqueia irreversivelmente uma concentração αΙde enzima. Teremos então:
k1 k3
• E + S ES E + P• k2 Vi• k4• E+Ι EΙ
SmKSkViV+
Ια−= )3max(
A velocidade de formação do produto desejado será:
onde Ι = Concentração do inibidorαΙ = porção de enzima bloqueada irreversivelmente
eq. 13
Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burkvem:
SkVkViV.
3max3max Ια−+
Ια−= eq. 14mk 111
Ια− 3max
1kV
I=0
I1
I2>I11/Vi
1/S-1/km