3CINÉTICA DAS REAÇÕES

ENZIMÁTICAS

BIBLIOGRAFIA

MARZZOCO; A. e TORRES; B. B. “Bioquímica Básica” 2ª ed. Editora Guanabara Koogan, RJ, 360p. 1999.

STRYER, Lubert “Bioquímica” 4ª ed. Editora Guanabara Koogan, RJ, 1000p. 1996.

LEHNINGER, Albert Lester “Princípios de Bioquímica” 2ª ed. Editora Sarvier, SP, 839p. 1993.

BAILEY, J. E. e OLLIS, D. F., “Biochemical Engineering Fundamentals” 2a.

edição, Editora McGraw-Hill Chemical Engineering Series, 984p, 1986.STANBURY, P. F. & WHITAKER, A. “Principles of Fermentation Tecnology”

Pergamon Press (1984).

1 – INTRODUÇÃO

O conhecimento das propriedades cinéticas das enzimas é importante para compreender as transformações que ocorrem no interior das células que participam dos processos fermentativos e também dos reatores enzimáticos.

2 – APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

Tabela 1: Enzimas aplicadas na indústria

ENZIMA APLICAÇÃOProteases *Fabricação de aspartame

*Obtenção de insulina humana a partir de insulina suína

Amilase (Bacillus subtilis) *Indústria de fermentação alcoólica *Produção de glicose

Tripsina (pâncreas animal) Amolecimento de carnesPapaína (mamão) e Bromelina (abacaxi) *Auxiliar digestivo

*Amolecimento de carnesPepsina (estômago animal) Auxiliar digestivoRenina (estômago de bezerros) Fabricação de queijoPectinase (Aspergilus niger) Retirada de pectina na clarificação de

sucos de frutasEnzimas são proteínas (seqüência de aminoácidos) com peso

molecular muito grande, e com propriedades catalíticas. Na maioria das vezes são proteínas globulares. É mostrado na tabela 2 uma comparação entre as características das enzimas e dos catalisadores inorgânicos.

Tabela 2: Comparação entre as enzimas e os catalisadores inorgânicos.

CARACTERÍSTICA ENZIMAS CATALISADORES QUÍMICOS

1 – Especificidade ao substrato Alta Baixa2 – Natureza da estrutura Complexa Simples3 – Sensibilidade à temperatura Alta Baixa4 – Condições de reação (T, P e pH) Suaves Drásticas (geralmente)5 – Custo de obtenção (isolamento e purificação)

Alto Moderado

6 – Natureza do processo Batelada/contínuo Batelada/contínuo7 – Consumo de energia Baixo Alto8 – Formação de subprodutos Baixa Alta9 – Reutilização do catalisador Simples/cara Simples10 – Atividade catalítica (temperatura ambiente)

Alta Baixa

11- Presença de cofatores Sim Não12 – Energia de ativação Baixa Alta13 – Velocidade de reação Alta Baixa

27

A característica mais importante das enzimas é a elevada especificidade. Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos, mas outras possuem uma especificidade absoluta para um único substrato como mostrado na figura 1:

Substrato Produtos

Enzima Enzima E + S ES E + P

Figura 1: Especificidade das enzimas pelos substratos.

Como exemplo de especificidade enzimática pode ser tomado a hidrólise enzimática do amido:

-amilase atua na amilose rompendo a ligação -1,4 produzindo maltose e glicose.

-glicosidase atua na -1,6 produzindo amilose.Com a atuação das duas enzimas no amido é produzido maltose e a

glicose.Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na -1,6 e -1,4 de forma a

produzir também maltose e glicose a partir do amido.

3 – NOMENCLATURA

nome do substrato ou + sufixo asereação que catalisa

- protease (hidrolisa proteínas)- álcool desidrogenase (catalisa a desidrogenação de um álcool)- outras apresentam terminações ina (tripsina, renina, bromelina etc)

28

Sítio ativo

4 – COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO

E + S ES E + P

Cinética da reação enzimática com formação de um substrato

Medindo as concentrações do produto (P) e do substrato (S) expressos na reação acima, podemos obter a figura seguinte:

[P] e [S] Produto

Substrato

Tempo

5 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMA

[P] [E]1

[E]2

[E]1>[E]2>[E]3>[E]4

[E]3

[E]4

Tempo

6 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

29

O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar matematicamente a influência da concentração do substrato na cinética da reação enzimática. Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversívelmente, formando um composto intermediário denominado “complexo enzima-substrato” que por sua vez decompõe ou regenera a enzima e forma os produto da reação.

k1

E + S ES k2

k3

ES E + P Vonde k1 = constante de vel. de formação do complexo k2 = constante de vel. de dissociação do complexo k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo

formando os produtos da reação V = velocidade de formação dos produtos

Consideremos um caso simples, caracterizado pelas seguintes hipóteses:

a) Complexo ES (1mol de enzima para 1 mol de substrato)b) O complexo formado se decompõe, sem reagir com outras substâncias existentes no sistemac) Fazendo X = ES logo a variação da concentração de X com o tempo (dX/dt) será:

dX/dt = k1.E.S – k2X – k3X eq. 01

fazendo Et = E + X logo E = Et – Xfazendo St = S + X logo S = St – X

onde St = quantidade de substrato total adicionada ao sistema S = quantidade de substrato não associada ao complexo ES Et = quantidade de enzima total adicionada ao sistema E = quantidade de enzima não associada ao complexo ES

Substituindo os valores de En e de Sn na eq. 01 vem:

eq. 02

supondo que as concentrações de substrato são muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as do complexo, o que é comum na prática

ES<<S>>E

30

Então pela eq. 02 vem:

eq. 03

Supondo, ainda que boa parte da reação se desenvolve mantendo-se constante a concentração do complexo no tempo (estado estacionário) ou seja dX/dt = 0

onde = constante de Michaelis e Menten que pode indicar

o grau de afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato menor é o valor de km

isolando X

31

fazendo St = S e Et = E vem,

eq. 04

Sabendo que a velocidade da reação enzimática é

V = K3X eq. 05

Substituindo a eq. 04 na eq. 05 vem,

Fazendo K3E = Vmax = Velocidade máxima de formação de produtos correspondente a situação em que toda enzima se encontra na forma ES vem:

eq. 06

Esta última equação representada pela figura abaixo, é chamada equação de Michaelis e Menten.

32

Velocidade de reação

Vmax

Vmax/2

Km SNa região (1) do gráfico anterior a velocidade da reação é uma função

crescente da concentração do substrato, até um determinado valor desta concentração (ponto 2) que a partir do qual a velocidade se mantém constante (região 3). O tipo desta curva é análogo aos fenômenos de saturação que pode ser melhor compreendido analisando o esquema abaixo.

Situação antes do Equilíbrio Situação no Equilíbrio% da Vmax

E S E + S ES

25%

50%

75%

100%

100%

33

(1)

(2) (3)

Quando a concentração do substrato é tal que a velocidade de reação é metade da velocidade máxima teremos:

Km + [S] = 2[S]

Km = [S]

Como foi dito anteriormente o valor de Km é inversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Desta forma podemos comparar a afinidade da Enzima1 com a da Enzima2 no gráfico abaixo:

Velocidade de reaçãoEnzima1

Vmax

Vmax/2 Enzima2

Km1 Km2 S Uma forma precisa de determinar Vmax e km a partir de dados

experimentais é o método chamado Lineweaver-Burk, resultado da inversão da equação 4 de Michaelis e Menten.

eq. 07

que trata-se da equação de uma reta representada pela figura a seguir. 1/V

Km/Vmax

1/Vmax

-1/Km 1/S

34

Km2 > Km1 portanto a afinidade da enzima1 pelo

substrato S é maior que a da enzima2

ATIVIDADE ENZIMÁTICAA velocidade da reação pode também ser expressa em termos de sua

atividade enzimática. Que é a quantidade de produto formado em um certo tempo pela quantidade de enzima utilizada. A atividade de uma enzima é definida especificamente para cada caso estudado.

A CONSTANTE CATALÍTICA é definida para se estudar a eficiência da catálise enzimática.

kcat equivale ao número máximo de moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto por segundo. Como exemplo, podemos tomar a enzima catalase com kcat = 107 s-1, portanto esta enzima é capaz de originar 10 000 000 moléculas de produto por segundo.

7 – INFLUÊNCIA DA PRESENÇA DE UM INIBIDOR

A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversívelO inibidor irreversível forma um complexo estável com a enzima não

podendo ser removido para recuperar a enzima ativa.Exemplo: metais pesado (Hg), agentes complexantes de metais (CN)A inibição reversível é caracterizada por uma constante de equilíbrio ki,

que é medida pela afinidade do inibidor com a enzima.Três formas simples de inibição podem ser descritas: Pelo substrato (reversível) Competitiva (reversível) Não competitiva (irreversível)

7.1 – INIBIÇÃO PELO EXCESSO DE SUBSTRATO (reversível) k1

E + S ES k2

k3

ES + S ES2 (Complexo não reativo) k4

k5

ES E + P V

35

V

Vmax

S

eq. 08

onde ki é a constante de inibição. Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk

eq. 09

Para se obter as constantes são necessárias duas hipóteses:1 ª Hipótese: para valores de S<<ki a eq. 09 se reduz em,

1/V

Km/Vmax

1/Vmax

-1/Km 1/S

36

2 ª Hipótese: para valores de S>>km a eq. 09 se reduz em,

1/V

1/(Vmaxki)

1/Vmax

S

Obs. Os valores de Vmax determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.

7.2 – INIBIÇÃO COMPETITIVA (reversível)

Diz-se que um inibidor competitivo reage com a enzima como se fosse um outro substrato.

Indicando-se com a fórmula molecular de um inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e Menten fornece:

k1 k3

E + S ES ES E + P k2 V

k4

E + E E E + P’ k5 k6

Obs. O complexo E (Enzima-Inibidor) pode ou não formar produto, porém quando o inibidor forma o complexo E fica impedindo que o substrato S entre em contato com a enzima E.

A velocidade de formação do produto desejado será, então:

eq. 10

37

onde km = (k2+k3)/k1 = cte de Michaelis e Menten = concentração do Inibidor ki = (k5+k6)/k4

Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk

eq. 11

1/Vi

2>1

1

=0

1/Vmax

-1/Km 1/S

Fazendo a relação entre Velocidade segundo Michaelis e Menten e a Velocidade de inibição competitiva vem;

eq. 12

Esta relação trata-se de uma representação matemática da influência das concentrações de substrato e de inibidor na inibição competitiva, da seguinte forma:

38

V/Vi

S2<S1

S1

S>> 1

Ou seja, com o aumento da concentração de substrato em relação a concentração do inibidor diminui a influência do inibidor na cinética enzimática.

7.3 – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível)

Consideremos o caso em que o inibidor, presente no sistema na concentração , bloqueia irreversivelmente uma concentração de enzima. Teremos então:

k1 k3

E + S ES E + Pk2 Vi

k4

E+ E

A velocidade de formação do produto desejado será:

eq. 13

onde = Concentração do inibidor = porção de enzima bloqueada irreversivelmente

Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk vem:

eq. 14

1/Vi

39

2>1

1

=0

1/Vmax

-1/Km 1/S

8 – INFLUÊNCIA DO pH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Como as proteínas possuem muitos grupos ionizáveis, a mudança de pH afeta o sítio catalítico e a conformação das enzimas.

Em geral as enzimas são ativas em intervalos limitados de pH, e na maioria dos casos um pH ótimo é observado. Alguns exemplos são mostrados abaixo:

Concentração de Produto A B C D

3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH

Onde:A = invertase de levedura

B = -amilase de Bacillus sp.C = Aminoacilase de Aspergillus oryzae

D = protease alcalina de Bacillus sp.

9 – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Reações enzimáticas, como outras reações químicas são influenciadas pela temperatura.

40

Quando ocorre o aumento da temperatura a velocidade da reação aumenta. Contudo a taxa de denaturação térmica também aumenta após a temperatura ótima de reação.

A constante de catálise e denaturação pode ser representada pela equação de Arrhenius.

eq. 15

onde k = constante da reação A = constante de Arrhenius Ea = energia de ativação R = constante dos gases T = temperatura absoluta

Valores médios de energia de ativação térmica 4 a 20 kcal/gmolValores médios da energia de ativação do processo de desativação

térmica 40 a 130kcal/gmolA figura abaixo exemplifica a influência da temperatura na catálise de

algumas enzimas.

Atividade A B C

30 40 50 60 70 80 90 Temperatura oConde A = -galactosidase de leveduras B = aminoacilase de Aspergillus oryzae C = glicose isomerase de Streptomices sp.

9.1 – ESTABILIDADE TÉRMICA DAS ENZIMAS

Cinética de primeira ordem de desativação

41

integrando vem:

eq. 16

onde A = atividade enzimática kd = constante de desativação da enzima (min-1) t = tempo Ao = atividade enzimática inicial

9.2 - TEMPO DE MEIA VIDA (t1/2)

É o tempo necessário para que a atividade seja reduzida a metade da atividade inicial ou seja

logo pela equação 16 vem

eq. 17

9.3 – ENERGIA DE ATIVAÇÃO TÉRMICA

Aplicando logarítimo neperiano na equação de Arrhenius (eq. 15) vem.

eq. 18

que é uma equação de reta como mostrado no gráfico abaixo.

ln kd

42

lnA

-Ea/R

1/T

10 - EXERCÍCIOS

1) Os dados abaixo são relativos à hidrólise de sacarose por invertase livre obtidos a 40oC, onde V é a velocidade inicial da reação e S a concentração do substrato.

S (mol/L) Vx103 (mol/L.min)0,00532 0,11280,01063 0,20240,01595 0,27790,02127 0,34070,03190 0,46510,04253 0,51220,05316 0,53800,08506 0,60550,10630 0,63570,13290 0,61010,15950 0,58820,21270 0,55620,26580 0,51680,39870 0,43880,53160 0,38050,79740 0,24011,06400 0,16101,32900 0,11891,59500 0,0808

a) Verifique qual modelo cinético que melhor se ajusta aos dados experimentais.

b) Definido o modelo cinético, determine os parâmetros da equação da velocidade de reação.

Obs. Deixe claro todas as considerações e/ou siplificações adotadas.

2) Os dados da tabela abaixo são relativos à desativação térmica de invertase livre. Com base nesses dados, determine a energia de ativação do processo de desativação da enzima.

43

Temperatura oC Kd (min-1)50,0 0,00207856,0 0,00176058,0 0,00720058,5 0,01089060,5 0,02030063.0 0,175300

3) Descrever os procedimentos experimentais necessários para a obtenção do gráfico da velocidade da reação enzimática S P em função da concentração do substrato.

4) A velocidade de uma reação, utilizando-se uma concentração de substrato igual a 10-2 M e de enzima igual a 0,01mg/mL, é igual a 20 mmols de produto por min. Sabendo que o Km da enzima é 10-5M, indicar a:

a) quantidade de produto formado após 5min de reação;b) velocidade da reação, usando-se a mesma concentração da enzima

a uma concentração de substrato igual a 10-5M.

5) Indicar a porcentagem de enzima livre (em relação ao total de moléculas de enzima presente no meio) nos pontos A, B, C e D do seguinte gráfico.

44

Vel

S

40

30

20

10

A

B

C

D