Cinética Enzimática 1

Cinética EnzimáticaProf. Rita de Cassia Siqueira Curto ValleDepto. Engenharia QuímicaUniversidade Regional de Blumenau

Cinética enzimática• Estuda a velocidade com que ocorrem as

transformações de reações catalisadas por enzimas.

• Velocidade de transformação de substrato em produto

• Leva à determinação de parâmetros cinéticos para deduzir a atividade enzimática, a afinidade da enzima pelo substrato e os mecanismos através dos quais leva a cabo a catálise.

Cinética enzimática - objetivos• Medir as velocidades das transformações que se

processam;• Estudar a influência de condições de trabalho

naquelas velocidades:▫ pH;▫ Temperatura;▫ Concentração de reagentes e das enzimas;▫ Concentração de inibidores e de ativadores;

• Correlacionar as velocidades das transformações com algum dos fatores que as afetam;

• Colaborar com a otimização do processo;• Estabelecer critérios para o controle de processo• Projetar um reator adequado

Atividade enzimática• É a velocidade na qual a enzima catalisa a

reação

• Unidades da atividade enzimática:U: quantidade de enzima que promove a formação de 1 μmol de produto por minuto

• Deve sempre estar referenciado à uma quantidade específica de amostra

• Exemplo: 20 U/g de mamão 1 g de mamão tem uma quantidade de enzima que transforma 20 μmol de substrato por minuto

Atividade enzimática• Unidades da atividade enzimática:• Katal: quantidade de enzima que transforma

1 mol de substrato por segundo ou forma 1 mol de produto por segundo

• Deve sempre estar referenciado à uma quantidade específica de amostra• Exemplo: 45 katal/mL de amostra 1 mL da

amostra tem uma quantidade de enzima que transforma 45 moles de substrato por segundo

Fatores que influenciam a atividade enzimática• Temperatura

à medida que ↑T, ↑V da reação, até o ponto em que ↑T, vai V↓

T = temperaturaV = velocidade

Fatores que influenciam a atividade enzimática

• Temperatura▫ Estabilidade térmica

Fatores que influenciam a atividade enzimática• Temperatura

▫ Tempo de meia vida (t1/2) – tempo no qual as enzimas perdem 50% da sua atividade numa determinada temperatura

Fatores que influenciam a atividade enzimática• pH

O sítio ativo da enzima está frequantemente composto de grupos ionizáveis que devem estar na forma iônica adequada para manter a conformação, unir os substratos ou catalisar a reação.

A atividade da enzima deve ser medida no pH ótimo


à medida que ↑pH, ↑V da reação, até

o ponto em que ↑pH, vai V↓

• Fixam-se [E], [S] e a temperatura.

• Ex.: pHótimo para pepsina = 1,5 a 3


▫ Resistência ao pH

Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de enzima

Fatores que influenciam a atividade enzimática• Presença de inibidores

▫ compostos que diminuem a velocidade da reação▫ Agem de diferentes formas Inibição competitiva Inibição não-competitiva

▫ Fármacos▫ Preservativos de alimentos▫ Compostos tóxicos

Fatores que influenciam a atividade enzimática• Concentração de substrato

Elevadas concentrações de substrato podem preservar a estabilidade da enzima sob efeito da temperatura e do pH


à medida que ↑[S], ↑V da reação, até

o ponto em que ↑[S], V torna-se cte

V=Vmax

[E]; T e pH = ctes

http://wapedia.mobi/pt/Ficheiro:Michaelis-Menten_saturation_curve_of_an_enzyme_reaction.svg�


▫ Concentrações altas a velocidade será máxima. Até o ponto de saturação da enzima não afeta a velocidade.

vo

[S]

Vmax


▫ Desvios da linearidade ocorrem: Presença de inibidores na solução de enzima; Presença de substâncias tóxicas; Presença de um ativador que dissocia a enzima; Limitações impostas pelo método de análise.

Determinação da velocidade de reação• Complicador - a concentração do substrato

varia ao longo da reação à medida que este vai se transformando em produto.

Velocidade de reação

•Então como medir a velocidade de uma reação enzimática?


• Limitar a velocidade em alta [S] devido à saturação dos sítios ativos da Enzima

• Determinar a velocidade inicial da reação v0 (velocidade inicial)


[P] é baixa

Variações da concentração de substrato são negligenciáveis

Cinética de Michaelis e Menten• Modelo cinético que melhor explica a influência

das concentrações iniciais de enzima e substrato na velocidade inicial da reação enzimática

(1913)Leonor Michaelis -EnzimologistaMaud Menten - Pediatra

Cinética de Michaelis e Menten• Hipóteses:

▫ O substrato e a enzima reagem reversivelmenteentre si formando um composto intermediário denominado complexo enzima-substrato.

▫ O complexo formado ou se decompõe, regenerando a enzima e formando os produtos da reação.

Cinética de Michaelis e Menten

K1 = cte de velocidade de formação do complexoK2 = cte de velocidade de dissociação do complexoK3 = cte de velocidade de decomposição do complexo, formando produtov = velocidade de formação do produtoS = concentração inicial de substratoE = concentração inicial de enzimaP = concentração de produto

v


• velocidade de catálise, ou velocidade inicial (v0) é igual ao produto da concentração de ES por k3

v0 = K3 [ES]

• A velocidade de formação de ES corresponde a k1 [E].[S]

• A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3). [ES]

• A velocidade de formação de ES será: k1 [E].[S] = (k2 + k3). [ES]

A constante de Michaelis (KM) é definida como: Reescrevendo...

Cinética de Michaelis e Menten• Considerando que a concentração da enzima livre [E] corresponde à concentração da enzima total [ET], menos a concentração da enzima ligada [ES]

Como: v0 = K3 [ES]

Fazendo as devidas substituições

Condição reacional necessáriaComo a [S] >>> [ET], a E está saturada com o [S] e a [ES] = [ET]

Nestas circunstâncias, [S] é muito maior do que KMe [S] /([S] + KM) ~ 1

Nestas condições Velocidade máxima de formação de P = Vmax

Então Equação de Michalis-Menten

Cinética de Michaelis e MentenVo = V max [S]

Km + [S]

1) Se [S] é muito maior do que KM

2) Se [S] é muito menor do que KM,

Essa equação explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas:

a velocidade da reação é máxima e independe da concentração do substrato

a velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração de substrato.


Vo = V max [S]

Km + [S]

3) Se [S] é igual a KM

Essa equação explica o comportamento da cinética de reações catalisadas por enzimas:

[S]

v

Vmax

2

v = Vmax

v = Vmax [S]Km

Km

2

1

3

Determinação de Km e Vmáx

• Método gráfico de Lineweaver-Burk

maxV1

[S]maxVmK

v1

+=

1[S]

1v

-1Km

1Vmax

KmVmax

Inclinação =

Determinação de Km e Vmáx

• Método gráfico de Eadie-Hofstee

[S]v

mK

maxVv −=

VmaxKm

v

-Km

Inclinação =

v[S]

Vmax

Determinação de Km e Vmáx• Método gráfico de Hanes-Woolf

[S]maxV1

maxVmK

v[S]

+=

[S]

[S]v

-Km

KmVmax

1Vmax

Inclinação =

Constante de afinidadeKM = K2 + K3

K1

Imaginando um caso limitante, em que k2 seja muito maior do que k3; isto significa que a dissociação do complexo ES em E mais S é mais rápida do que a formação de E mais produto (P). Portanto, quando k3 é muito menor do que k2,KM é igual à constante de dissociação de ES. Em outras

•Km alto – baixa afinidade•Km baixo – alta afinidade

•Km depende:o aspectos específicos do mecanismo de reação;o n° de passos da reação;o velocidades relativas dos passos individuais

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