Practica de Cinética Enzimática

Diapositiva 1

CINETICA ENZIMATICA

OBJETIVOS:

Observar el efecto de los factores que modifican la velocidad de una reaccin enzimtica.

Calcular el porcentaje de producto formado en cada experiencia.

Elaborar la grfica: factor que modifica la velocidad de reaccin vs porcentaje de producto formado.La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y del comportamiento especfico de la enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima.

Las enzimas son protenas con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico.

% Formacin de producto (FC) = 100 (Abs tubos/Abs albmina)*100

Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos despus del incubado. Abs albmina = Absorbancia de la albmina (Abs = 0.995)Cuando la actividad enzimtica se reporta en funcin del % de formacin de producto se hace uso de la siguiente ecuacin:La actividad enzimtica se manifiesta y se mide por:Desaparicin del sustrato.Formacin del producto.Modificacin del cofactor.

Existen muchos factores que pueden modificar la actividad enzimtica como:pH, temperatura, concentracin de sustrato, concentracin de enzima, tiempo de incubacin.

PARTE EXPERIMENTALEXPERIMENTO.- Efecto del pHTUBO N12345pH1,01,56,09,511mL albmina 5,05,05,05,05,0mL HCL 1N2,00,50,00,00,0mL CO3Na20,00,00,00,52,0mL agua destilada0,01,52,01,50,0Preparar cinco tubos con:Preincubar los cinco tubos ms un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a 37C por 5 minutos. Luego aadir rpidamente 3 mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 15. Mezclar e incubar a 37C por 10 min. Observar la diferencia o leerla en fotocolormetro con filtro azul (420 nm).TUBO N12345mL albmina 5,05,05,05,05,0mL HCL 1N0,50,50,50,50,5mL agua destilada3,53,53,53,53,5TUBO N678910mL pepsina 1%1,01,01,01,01,0TUBO N1 y 62 y 73 y 84 y 9510TemperaturaO CAmb.37 C70 C37 C100 CEXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.Preparar cinco tubos con:Preparar otros cinco tubos con:Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:Agregar los respectivos tubo N 6 al N 10 a los que hay que incubar a las temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 5.

Con los resultados obtenidos confeccionar las siguientes graficas, establecer sus conclusionesTUBO N12345mL albmina 5,05,05.05,05,0mL HCL 1N0,50,50.50,50,5mL agua destilada1,52,53.54,04,5mL pepsina0,00,00.00,00,0TUBO N12345mL pepsina incubada 3,02,01,00.50,1EXPERIMENTO. -Efecto de la concentracin de la enzima

Preparar 5 tubos con:

Incubar los 5 tubos a 37C por 5 minutos y enseguida aadir:Incubar por cinco minutos a 37C. Observar al fotocolormetro a 420 nm (filtro azul), contra una lectura de agua.

TUBO N123456mL albmina 2,03,04,05,06,07,0mL HCL 1N0,50,50,50,50,50,5mL agua destilada7,06,05,04,03,02,0mL pepsina 1%0,00,00,00,00,00,0EXPERIMENTO.-Efecto de la concentracin del sustrato

Preparar 6 tubos con:

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37C. Colocar 0,5 mL de pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37C. Leer al fotocolormetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los resultados.

CUESTIONARIOSolo una pequea fraccin de la enzima se une al sustrato Qu funcin desempea el resto de la molcula de la enzima?

a) Citar tres vitaminas que formen parte de coenzimas. b) Indicar en cada caso de que coenzima forman parte. 3. Cmo influye cada uno de los siguientes factores en la velocidad de una reaccin enzimtica?a) La concentracin del enzima, b) La concentracin del sustrato, c) La temperatura, d) El pH4. Enzimas: a) Si el pH optimo de una enzima es igual a 7,3,qu ocurrir con la actividad enzimtica a pH 3,0 y a pH 9,5? b) Si la temperatura optima de una enzima es de 36C, Qu ocurrir a 80C? Justifique las respuestas. 5. a) Definir apoenzima y coenzima b) Qu factores regulan la actividad enzimtica ?6. Citar dos ejemplos de coenzimas e indicar la funcin biolgica de cada uno de ellos7. Indicar que enzima se relaciona con cada una de las siguientes enfermedades. FenilcetonuriaHemofilia, Hemofilia a , Hemofilia b,Hemofilia cMucopolidosisEnfermedad de GaucherCitrulinemiaDeficiciencia de G6pdEnfermedad de almacenamiento de glucosaEnfermedad de Tay-SachsFucosidosisGalactosemiaHiperglicerolemiaXeroderma pgmentosumAciduria metilmalonicaAlcaptomuria

8.-Explique que es un inhibidor enzimtico. De 02 ejemplos.

Grfico1102030405060708090100

% FPpH% Formacin productoExperimento: Efecto del pH

Hoja1AT10.2063.0920.4039.8130.6025.1240.8015.8551.001061.206.3171.403.984.014.525.035.546.056.567.077.588.098.5109.0119.51210.013pH% FP110220330440550660770880990101001112

Hoja10000000

Concentracin (mg/mL)Abs (540 nm)

Hoja20000000

TConcentracin (mg/mL)% T (540 nm)

Hoja30000000000000

Volumen (mL)pH

0000000000


Grfico2102030405060708090100

Temperatura (C)% Formacin productoExperimento: Efecto de la temperatura

Hoja1AT10.2063.0920.4039.8130.6025.1240.8015.8551.001061.206.3171.403.984.014.525.035.546.056.567.077.588.098.5109.0119.51210.013pH% FP110220330440550660770880990101001112 T% FP0101020203030404050506060707080809090100100

Hoja10.20.40.60.811.21.4


Hoja263.0939.8125.1215.85106.313.98


Hoja30000000000000

Volumen (mL)pH

0000000000


0000000000


Grfico1102030405060708090100

Concentracin enzima (mg/mL)% Formacin productoExperimento: Efecto de la concentracin de enzima

Hoja1AT10.2063.0920.4039.8130.6025.1240.8015.8551.001061.206.3171.403.984.014.525.035.546.056.567.077.588.098.5109.0119.51210.013pH% FP110220330440550660770880990101001112 T% FP0101020203030404050506060707080809090100100C. Enz ( )% FP11022033044055066077088099010100C. Sus ( )% FP102030405060708090100

Hoja10.20.40.60.811.21.4


Hoja263.0939.8125.1215.85106.313.98


Hoja30000000000000

Volumen (mL)pH




Grfico2102030405060708090100

Concentracin de sustrato% Formacin productoExperimento: Efecto de la concentracin de sustrato

Hoja1AT10.2063.0920.4039.8130.6025.1240.8015.8551.001061.206.3171.403.984.014.525.035.546.056.567.077.588.098.5109.0119.51210.013pH% FP110220330440550660770880990101001112 T% FP0101020203030404050506060707080809090100100C. Enz ( )% FP11022033044055066077088099010100C. Sus ( )% FP11022033044055066077088099010100

Hoja10.20.40.60.811.21.4


Hoja263.0939.8125.1215.85106.313.98


Hoja30000000000000

Volumen (mL)pH

0000000000


0000000000


0000000000


0000000000

Concentracin de sustrato% Formacin productoExperimento: Efecto de la concentracin de sustrato

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