cromatografia-artigo (1)

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Acromatografia é um métodofísico-químico de separação.Ela está fundamentada na mi-

gração diferencial dos componentesde uma mistura, que ocorre devido a

diferentes interações, entre duas fasesimiscíveis, a fase móvel e a faseestacionária. A grande variedade decombinações entre fases móveis eestacionárias a tornauma técnica extrema-mente versátil e degrande aplicação.

O termo cromato-grafia foi primeira-mente empregado em1906 e sua utilização éatribuída a um botâ-

nico russo ao descre-ver suas experiênciasna separação doscomponentes de ex-tratos de folhas. Nesseestudo, a passagemde éter de petróleo (fase móvel) atravésde uma coluna de vidro preenchidacom carbonato de cálcio (fase esta-cionária), à qual se adicionou o extrato,levou à separação dos componentes

em faixas coloridas. Este é provavel-mente o motivo pelo qual a técnica éconhecida como cromatografia (chrom= cor e graphie = escrita), podendolevar à errônea idéia de que o processo

seja dependente da cor. Apesar deste estudo e de outrosanteriores, que também poderiam serconsiderados precursores do uso

dessa técnica, a cro-matografia foi pratica-mente ignorada até adécada de 30, quan-do foi redescoberta. Apartir daí, diversostrabalhos na áreapossibilitaram seuaperfeiçoamento e,

em conjunto com osavanços tecnológi-cos, levaram-na a umelevado grau de sofis-ticação, o qual resul-tou no seu grande po-

tencial de aplicação em muitas áreas. A cromatografia pode ser utilizada

para a identificação de compostos, porcomparação com padrões previa-mente existentes, para a purificação de

compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura

As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critérios, sendoalguns deles listados abaixo:

1. Classificação pela forma física do

sistema cromatográficoEm relação à forma física do siste

ma, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna ecromatografia planar . Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à cromatografia por centrifugação (Chromatotron) eà cromatografia em camada delgada(CCD), são diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais serãomais bem compreendidos quando

classificados por outro critério.2. Classificação pela fase móvel empregada

Em se tratando da fase móvel, sãotrês os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica(CSC), usando-se na última um vapopressurizado, acima de sua temperatura crítica. A cromatografia líquidaapresenta uma importante subdivisãoa cromatografia líquida clássica (CLC)

na qual a fase móvel é arrastadaatravés da coluna apenas pela forçada gravidade, e a cromatografia líquidade alta eficiência (CLAE), na qual seutilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário ouso de uma bomba de alta pressãopara a eluição da fase móvel. A CLAEfoi inicialmente denominada cromatografia líquida de alta pressão, mas suaatual designação mostra-se mais

ATUALIDADES EM QUÍMICA

Ana Luiza G. DeganiQuezia B. Cass

Paulo C. Vieira

A cromatografia é ummétodo físico-químico

de separação.Ela está fundamentadana migração diferencial

dos componentes deuma mistura, que

ocorre devido a dife-

rentes interações,entre duas fasesimiscíveis, a fasefasefasefasefase

móvelmóvelmóvelmóvelmóvel e a fasefasefasefasefaseestacionáriaestacionáriaestacionáriaestacionáriaestacionária

A seção "Atualidades em química" procura apresentar assuntos que

mostrem como a química é uma ciência viva, seja com relação a

novas descobertas, seja no que diz respeito à sempre necessária

redefinição de conceitos.

Este artigo apresenta os conceitos básicos da cromatografia. Os

diferentes tipos de cromatografia são descritos e classificados

considerando-se a forma física do sistema cromatográfico

empregado, a fase móvel/estacionária utilizada ou o modo de

separação. Especial ênfase é dada à cromatografia em camadadelgada, à cromatografia líquida clássica e de alta eficiência e à

cromatografia gasosa de alta resolução.

cromatografia, sílica, fase móvel, fase estacionária

QUÍMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N° 7, MAIO 1998



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adequada. No caso de fases móveisgasosas, separações podem serobtidas por cromatografia gasosa (CG)e por cromatografia gasosa de altaresolução (CGAR). A diferença entre osdois tipos está na coluna. Enquanto naCGAR são utilizadas colunas capilares,nas quais a fase estacionária é umfilme depositado na mesma, a CG

utiliza colunas de maior diâmetroempacotadas com a fase estacionária.

3. Classificação pela faseestacionária utilizada

Quanto à fase estacionária, distin-gue-se entre fases estacionárias sóli-das, líquidas e quimicamente ligadas.No caso da fase estacionária ser cons-tituída por um líquido, este pode estarsimplesmente adsorvido sobre um su-porte sólido ou imobilizado sobre ele.

Suportes modificados são considera-dos separadamente, como fases qui-micamente ligadas, por normalmentediferirem dos outros dois em seusmecanismos de separação.

4. Classificação pelo modo de separação

Por este critério, separaçõescromatográficas se devem à adsorção,partição, troca iônica, exclusão ou mis-turas desses mecanismos.

Para se ter uma visão mais amplados diferentes tipos de cromatografia,os mesmos estão dispostos no diagra-ma da Figura 1.

Dentre os vários tipos de cromato-grafia, especial ênfase será dada àcromatografia em camada delgada(CCD), à cromatografia líquida clássicae de alta eficiência (CLAE) e à croma-

tografia gasosa de alta reso-lução (CGAR).

Cromatografia planar

A cromatografia em papel(CP) é uma técnica de partiçãolíquido–líquido, estando umdeles fixado a um suportesólido. Baseia-se na diferença

de solubilidade das substân-cias em questão entre duasfases imiscíveis, sendo geral-mente a água um dos líquidos.O solvente é saturado em águae a partição se dá devido àpresença de água em celulose(papel de filtro). Este método,embora menos eficiente que aCCD, é muito útil para a sepa-ração de compostos polares,sendo largamente usado em

bioquímica. A cromatografia em camada delga-da (CCD) é uma técnica de adsorçãolíquido–sólido. Nesse caso, a separa-ção se dá pela diferença de afinidadedos componentes de uma mistura pelafase estacionária.

A Fig. 2 mostra um cromatogramaobtido por CCD no qual se podeobservar a diferença de afinidade dassubstâncias 1 e 2 pela fase estacioná-ria, sendo a substância 1 mais retidaque a 2. Por ser um método simples,

rápido, visual e econômico, a CCD é atécnica predominantemente escolhidapara o acompanhamento de reaçõesorgânicas, sendo também muito utiliza-da para a purificação de substânciase para a identificação de frações cole-tadas em cromatografia líquida clássi-ca.

O parâmetro mais importante a serconsiderado em CCD é o fator de

retenção (Rf), o qual éa razão entre a distân-cia percorrida pela

substância em questãoe a distância percorridapela fase móvel. Osvalores ideais para Rf

estão entre 0,4 e 0,6. A CCD pode ser

usada tanto na escalaanalítica quanto na pre-parativa. Normalmenteas placas utilizadassão de vidro, com es-

pessura de 3 a 4 mm. Placas analítusualmente têm 10 cm x 2,5 cpreparativas 20 cm x 20 cm.

A sílica gel é a fase estacionmais utilizada, sendo seguida pelamina, pela terra diatomácea e celulose. Para a preparação das cas, faz-se uma suspensão do advente em água, sendo a mesma desitada sobre a placa manualmentcom o auxílio de um espalhador. Aa deposição, deixa-se a placa seca

ar. A etapa final da preparação da pé sua ativação. A sílica, por exemé ativada a 105-110 °C por 30 aminutos. A espessura da camadasílica a ser depositada é de 0,25 para placas analíticas e de 1,0 para placas preparativas. Na prepção de placas preparativas, costuse adicionar sulfato de cálcio pmelhorar a adesão à placa de vNo mercado existem placas analíte preparativas pré-fabricadas, as qapresentam a fase estacionária dep

tada sobre uma lâmina de matplástico ou de alumínio, sendo ede maior eficiência.

As amostras a serem analisapor CCD devem ser aplicadas a aximadamente 1 cm da base inferioplaca, com a ajuda de um capilar.

Após a aplicação da(s) amostsobre a placa, a mesma deveintroduzida numa cuba contendfase móvel adequada. Cubas crom

Figura 1: Representação esquemática dos diferentes tiposde cromatografia.

Figura 2: Esquematização de um cromatogrobtido por CCD.




gráficas geralmente são de vidro, comfundo chato, e devem ter suas paredeslaterais internas recobertas com papelde filtro, para facilitar sua saturaçãocom os vapores do solvente.

A escolha da fase móvel, quegeralmente é constituída por um oumais solventes, não é tarefa simples.No entanto, uma vez que as fases

estacionárias mais usadas são extre-mamente polares, não devem serutilizados solventes pouco polares, quenão removeriam os compostos doponto de aplicação, nem solventesmuito polares, capazes de arrastar oscomponentes da amostra até o topoda placa. Em vista disso, melhoresresultados são obtidos com misturasde solventes, de modo a se obter umapolaridade média em relação à polari-dade dos componentes da amostra.

A placa é deixada na cuba, onde osolvente irá subir por capilaridade, atéque ele esteja a aproximadamente 2cm da extremidade superior. Ao ascen-der, o solvente irá arrastar mais os com-postos menos adsorvidos na faseestacionária, separando-os dos maisadsorvidos.

A linha de chegada da fase móveldeve ser marcada e a placa deve estarseca. Como a maioria dos compostosorgânicos é incolor, faz-se necessáriaa utilização de um processo de revela-

ção para que se possa analisar oresultado.Para a revelação de placas de CCD,

existem processos destrutivos e nãodestrutivos. Os métodos não destruti-vos mais utilizados são a utilização de1) placas onde a fase estacionária éfluorescente ou 2) iodo. O primeirobaseia-se na utilização de substânciasfluorescentes misturadas à sílicaquando da preparação das placas,possibilitando a revelação dos com-postos em câmaras de luz ultravioleta.

O segundo vale-se do fato de que oiodo complexa-se com compostosinsaturados, de modo que placas queos contenham, ao serem colocadasem uma câmara contendo cristais deiodo, apresentarão pontos amarron-zados.

Os processos destrutivos consis-tem na oxidação dos compostos sobrea placa, pulverizando-os com soluçãoaquosa de um oxidante orgânico e/ou

um ácido mineral, submetendo-se aplaca a altas temperaturas (~110 °C)por alguns minutos. Os compostosorgânicos oxidados serão revelados naforma de pontos escuros.

Cromatografia em coluna

Cromatografia líquida clássica

Esta técnica é muito utilizada paraisolamento de produtos naturais epurificação de produtos de reaçõesquímicas. As fases estacionárias maisutilizadas são sílica e alumina, entre-tanto estes adsorventes podem servirsimplesmente como suporte para umafase estacionária líquida. Fases esta-cionárias sólidas levam à separaçãopor adsorção e fases estacionáriaslíquidas por partição. Suportes quimi-camente modificados também têm

sido usados, sendo o processo de se-paração misto neste caso.Esses suportes são acondicio-

nados em tubos cilíndricos geralmentede vidro, de diâmetros variados, osquais possuem uma torneira em suaextremidade inferior. A Fig. 3 é umailustração de uma coluna cromato-gráfica empacotada com sílica, sendomostrados seus demais constituintes.

Os adsorventes possuem partí-culas na faixa de 60-230 mesh, demodo a possibilitar um fluxo razoável

do solvente através da coluna.O uso de sílica de partícula menor(230-400 mesh) como adsorvente paraessas colunas requer a utilização deum sistema de bombeamento para o

empacotamento e eluição, sendoconhecido como Cromatografia Flash

A principal etapa ao se utilizar essatécnica é o empacotamento, o qualentre outros fatores, definirá a eficiência da separação. Enquanto a aluminaé empacotada em sua forma originala sílica deve sê-lo na forma de suspensão.

À coluna adiciona-se uma pequenaquantidade de solvente e deposita-sena sua extremidade inferior um chumaço de algodão com espessura deaproximadamente 0,5 cm para impedia passagem de partículas da faseestacionária. A adição de sílica deveser feita com a torneira semi-abertaO adsorvente é adicionado lentamenteà coluna fixada na posição verticalbatendo-se continuamente ao longoda mesma para que todo o ar seja

expulso, de modo a se obter umacompactação uniforme. A existênciade ar entre as partículas leva à formação de canais na coluna, os quaisalargam as bandas eluídas.

Nunca se deve permitir que o nívedo solvente desça abaixo do nível doadsorvente, o que poderia acarretarachaduras, comprometendo a eficiência da coluna.

Após o empacotamento, é conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a três vezes o

volume da coluna) a ser utilizadoatravés da coluna antes da introduçãoda amostra. Esta é adicionada àcoluna com o auxílio de uma pipetano momento em que o nível do eluenteesteja o mais próximo possível doadsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas aserem eluídas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente é entãoadicionado cuidadosa e continuamente.

A escolha do eluente segue o

princípios discutidos em CCD, masneste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatográfico. Sepor exemplo, a amostra é constituídapor duas substâncias, uma apolar eoutra polar, utiliza-se primeiramenteum eluente apolar e em seguida umeluente polar.

O volume das frações a seremrecolhidas é função da quantidade deamostra e do grau de dificuldade da

Figura 3: Ilustração de uma coluna croma-tográfica.




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separação. Para análise das mesmas,recorre-se a alguma técnica auxiliar,usualmente CCD.

Em vista de que geralmente algu-mas partículas da amostra perma-necem irreversivelmente adsorvidas àfase estacionária, a cada separação énecessário um tratamento para a recu-

peração do adsorvente.Cromatografia líquida de altaeficiência (CLAE)

O grande avanço na cromatografiaem coluna foi o desenvolvimento e autilização de suportes com partículasdiminutas responsáveis pela altaeficiência, as quais tornam necessárioo uso de bombas de alta pressão paraa eluição da fase móvel, devido a suabaixa permeabilidade. A Fig. 4 mostraum equipamento típico de CLAE.

As fases móveis utilizadas em CLAEdevem possuir alto grau de pureza eestar livres de oxigênio ou outros gasesdissolvidos, sendo filtradas e desga-seificadas antes do uso.

A bomba deve proporcionar aosistema vazão contínua sem pulsoscom alta reprodutibilidade, possibilitan-do a eluição da fase móvel a um fluxoadequado.

As válvulas de injeção usadaspossuem uma alça de amostragem

para a introdução da amostra com umaseringa e duas posições, uma para o

preenchimento da alça e outra parasua liberação para a coluna. Existemalças de diversos volumes, sendoutilizadas geralmente alças na faixa de5-50 µL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para preparativas.

As colunas utilizadas em CLAE sãogeralmente de aço inoxidável, com

diâmetro interno de cerca de 0,45 cmpara separações analíticas e na faixade 2,2 cm para preparativas. O com-primento é variável, sendo comunscolunas analíticas de 10-25 cm e pre-parativas em torno de 25-30 cm. Essascolunas são reaproveitáveis, sendoempacotadas com suportes de altaresolução, não sendo necessária suaregeneração após cada separação.

O detector mais utilizado paraseparações por CLAE é o detector deultravioleta, sendo também empregadosdetectores de fluorescência, de indícede refração, e eletroquímicos, entreoutros. Detectores de polarimetria paraCLAE, recentemente desenvolvidos,diferenciam compostos quirais, atravésda rotação de seus estereoisômerosfrente à luz plano-polarizada.

O registro de dados pode ser feitoatravés de um registrador, um integra-dor ou um microcomputador.

A Fig. 5 ilustra uma separaçãoenantiomérica por CLAE.

A versatilidade desta técnica resideno grande número de fases estacio-

nárias existentes, as quais possibilanálises e separações de uma amgama de compostos com alta efic

cia. Tem sido utilizada em várias áda ciência, no acompanhamentosínteses, em análises de pesticiferomônios, no isolamento de prodnaturais e sintéticos e na produçãcontrole de qualidade de medmentos, dentre tantas outras acações.

As separações em CLAE podemdar por adsorção, partição ou amO suporte mais comumente utilizé a sílica. O uso de fases estacioná

líquidas adsorvidas a um suporte tem grande aplicação devido à pede fase estacionária, mas o usosuportes modificados, os quais fodesenvolvidos como conseqüênciproblema acima, possibilita a proção de uma imensa variedade de cnas com diferentes propriedadetipos de seletividade. As fases asobtidas são chamadas de quimmente ligadas.

Essas fases, dependendo da mficação feita ao suporte, podem ano modo normal, reverso ou amNa cromatografia em fase normfase estacionária é mais polar qufase móvel, e em fase reversa, a móvel é mais polar.

Separações analíticas são preminantemente realizadas em freversa, sendo a fase C18 (octadsílica) a mais usada, ao passo que preferidas fases que atuem no m

Figura 4: Equipamento básico de CLAE. a) reservatório da fase móvel; b) bomba de altapressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.

Figura 5: Cromatograma mostrandseparação dos enantiômeros do tetramprincípio ativo de vários medicameusados para ascaridíase.




Para saber mais

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BO-NATO, P.S. Introdução a métodos croma-tográficos. 5ª ed. Campinas: Editora daUnicamp, 1993.

LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Per-formance liquid chromatography: fun-damental principles and practice. Blackie

Academic and Professional, 1995.CHAVES, M.H.; Análise de extratos de

plantas por CCD: uma metodologia apli-

cada à disciplina “Química Orgânica”.Química Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562,1997.

ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LO-PES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M.e BRANDÃO, A.M. Determinação de cafeí-na em bebidas através de cromatografialíquida de alta eficiência (CLAE). QuímicaNova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.

NETO, F.R.A.; CGAR em análise deresíduos. Química Nova, v. 18, n. 1, p.65-67, 1995.

normal para fins preparativos, em vistade que separações no modo reversoutilizam fases móveis aquosas.

Entre as fases quimicamente liga-das, merecido destaque deve ser dadoàs fases estacionárias quirais, as quaispossibilitam a separação direta deenantiômeros. Para tanto, é necessáriaa presença de um seletor quiral comoparte integrante da fase estacionária.

Cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR)

Em contraste à CLAE, o principalmecanismo de separação da cromato-grafia gasosa está baseado na parti-ção dos componentes de uma amostraentre a fase móvel gasosa e a faseestacionária líquida. A utilização de fa-ses estacionárias sólidas, as quaislevariam à separação por adsorção,

apresenta poucas aplicações. A cromatografia gasosa é uma das

técnicas analíticas mais utilizadas. Além de possuir um alto poder deresolução, é muito atrativa devido àpossibilidade de detecção em escalade nano a picogramas (10–9-10-12 g). Agrande limitação deste método é anecessidade de que a amostra sejavolátil ou estável termicamente, embo-ra amostras não voláteis ou instáveispossam ser derivadas quimicamente.

Pode ser utilizada para separaçõespreparativas apenas na faixa demicrogramas a miligramas, não sendomuito empregada para esse fim. A Fig.

6 mostra os componentes básicos deum cromatógrafo gasoso.

Como dito anteriormente, a diferen-ça entre CG e CGAR está na coluna.Colunas de CGAR são maiores emcomprimento, menores em diâmetro,possuem a fase líquida como um filmeaplicado diretamente

às paredes do tubo dacoluna e são mais efi-cientes.

Essas colunas sãotubos longos de me-tais como aço ou co-bre, vidro ou teflon.Colunas de CG têmdiâmetro de cerca de3 mm e comprimentoem torno de 3 m, aopasso que colunas de CGAR têmdiâmetro na faixa de 0,15-0,75 mm ecomprimentos variados, usualmenteentre 10 m e 100 m.

Os gases utilizados como fasemóvel devem ter alta pureza e serinertes em relação à fase estacionária.Hidrogênio, nitrogênio e hélio são osmais usados.

A injeção da amostra é feita atravésde microsseringas ou válvulas seme-lhantes às utilizadas em CLAE.

Os detectores de maior aplicaçãosão o detector por ionização em

chama e o detector de condutividadetérmica. Os dados podem ser obtidosatravés de um registrador po-tenciométrico, um integrador ou um mi-

crocomputador, sen-do as amostrasidentificadas por seustempos de retenção.

Nesses equipa-mentos é necessárioo controle da tempe-ratura do injetor, da

coluna e do detector,as quais são man-tidas por termostatos.Como a temperaturaé um fator extrema-mente importante,grande parte dasanálises por croma-tografia gasosa é feitacom programação detemperatura, obten-

Figura 6: Componentes básicos de um cromatógrafo gasoso.a) cilindro do gás de arraste mantido sob alta pressão; b) injetor;c) coluna; d) detector e e) registrador.

do-se melhor separação com picomais simétricos em menor tempo.

Para o empacotamento de colunade CG, geralmente empregam-seterras diatomáceas como suporte. Aescolha da fase estacionária é de fundamental importância, sendo ela o

componente crítico da

coluna. As fases estacionárias podem sepolares, apolares oquirais. Fases polaresão baseadas em polietileno glicol puro omodificado e apolareem metilsiloxano puroou modificado. As fases quirais mais comuns são composta

de ciclodextrinas. Atualmente, espectrômetros d

massa têm sido acoplados a equipamentos de cromatografia gasosapossibilitando a identificação imediatadas substâncias presentes na amostra

Ana Luiza G. Degani, mestre em químic

orgânica, é doutoranda na UFSCar. Quezia BQuezia BQuezia BQuezia BQuezia B

CassCassCassCassCass, bacharel em farmácia pela UFPE e Ph.D. em

química pela City University, Londres, é docente d

Departamento de Química da UFSCar, em São Carlo

– SP. PPPPPaulo C. Vaulo C. Vaulo C. Vaulo C. Vaulo C. Vieiraieiraieiraieiraieira, licenciado pelo DQ-FFC

USP, em Ribeirão Preto, doutor em ciências (químic

orgânica) pela USP, é docente do Departamento d

Química da UFSCar, em São Carlos – SP.


A cromatografiagasosa é uma dastécnicas analíticas

mais utilizadas. Alémde possuir um alto

poder de resolução, émuito atrativa devido à

possibilidade dedetecção em escala de

nano a picogramas

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