CROMATOGRAFIA

Marilena Meira

1. HistóricoEm 1903, o botânico russoMikhail Tswett conseguiu separarpigmentos vegetais passando,através de uma coluna contendoCaCO3, uma solução depigmentos dissolvidos em umhidrocarboneto.

Obteve um registro colorido doprocesso de separaçãocromatos: cor ; grafia: registro =CROMATOGRAFIA.

2. Definição de Cromatografia:

• Fase móvel: solvente (gás ou líquido)que se move através do sistema

Método físico-químico de separação baseado namigração diferencial dos componentes de umamistura devido a diferentes graus de interaçãoentre duas fases imiscíveis, uma móvel e outra fixa.

que se move através do sistema(coluna ou placa), carregando ossolutos.

• Fase Estacionária: sólido (ou líquidoimpregnado em um sólido) quepermanece fixo no sistema (coluna ouplaca).

3. CLASSIFICAÇÃO1. PELA FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO:• CROMATOGRAFIA PLANAR• CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2. PELA FASE MÓVEL EMPREGADA:• LÍQUIDA• GASOSA• SUPERCRÍTICA

3. PELA FASE ESTACIONÁRIA UTILIZADA:• SÓLIDA• LÍQUIDA • QUIMICAMENTE LIGADA

4. PELO MODO DE SEPARAÇÃO:• ADSORÇÃO• PARTIÇÃO• TROCA IÔNICA• EXCLUSÃO

CROMATOGRAFIA

COLUNAPLANARTÉCNICA

LÍQUIDA GASOSAFASEMÓVEL

LÍQUIDA

FASEESTACIONÁRIA

LÍQUIDA LÍQUIDALÍQUIDASÓLIDA SÓLIDA SÓLIDA

CGLCP CCD CLL CLS; CE CGS

4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU LÍQUIDO-LÍQUIDO (CLL)

2. CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE)4. CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO OU

LÍQUIDO-SÓLIDO (CLS)

CL

CTI CE

CLL CLS

4.1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU LÍQUIDO-LÍQUIDO (CLL)

• A separação é baseada nosdiferentes coeficientes departição (solubilidade) doscomponentes da misturaentre dois solventesimiscíveis, um fixo (faseimiscíveis, um fixo (faseestacionária) imobilizadona superfície de umsuporte sólido e o outromóvel.

FASE MÓVEL F. ESTACIONÁRIA

EXEMPLO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO: CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP)• A celulose do papel forma pontes de hidrogênio com a água, que fica retida formando a fase estacionária.

• A separação da mistura é baseada nas diferentes solubilidades relativas dos componentes na fase relativas dos componentes na fase móvel e estacionária.

• A fase móvel sobe por ação capilar.• Os componentes mais solúveis na fase estacionária serão seletivamente retidos, tendo uma movimentação mais lenta.

FATOR DE RETENÇÃO (Rf)

Distância percorrida pela fase móvelRf = Distância percorrida pela substância

Rf = dsRf = dsdm

ds2

dmds1

SUBSTÂNCIAS SEPARADAS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL

• COMPOSTOS HIDRÓFILOS (HIDROSSOLÚVEIS) COMO ÁCIDOS ORGÂNICOS E ÍONS METÁLICOS.

4.2.CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• A fase estacionária é constituída por uma matriz com grupos funcionais ionizáveis.

• Trocadores catiônicos, têm sítios carregados

+

-

+

Trocador catiônico

têm sítios carregados negativamente adsorvendo cátions.

• Trocadores aniônicos têm sítios ativos carregados positivamente adsorvendo ânions.

+

-

-

Trocador aniônico

TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• Derivados sulfônicos de copolímeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente catiônica.

• Amina quaternária de copolímeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente aniônica.

• Resinas com o grupo ácido carboxílico. Fracamente • Resinas com o grupo ácido carboxílico. Fracamente catiônicas.

• Resina com o grupo funcional amina primária.Fracamente aniônicas.

• Derivada da celulose: por tratamento químico, emgeral sulfonação.

• Sílica-gel impregnada com trocadores iônicoslíquidos (ex: triisoctilamina)

TROCADOR CATIÔNICO: ESTIRENO-DIVINILBENZENO SULFONADO.

CH

SO3-H+

CH

2

CH

CH

CH

2

CH

2

CHCH

2

CH CH

2

CH2CH

SO3-H+

CH

2

CH

2 2

CH

2

CH

CH

CH CH

2

CH CH

2

CH

SO3-H+

SO3-H+

SO3-H+

CH

2

CH

TROCADOR ANIÔNICO: AMINA TERCIÁRIA ESTIRENO-DIVINILBENZENO.

CH

CH2NR

3+OH-

CH

2

CH

CH

CH

2

CH

2

CHCH

2

CH CH

2

CH2CH

CH2NR

3+OH-

CH

2

CH

H22 H

2

CH

2

CH

CH

CH CH

2

CH CH

2

CH

CH2NR

3+OH-CH

2NR

3+OH-

CH2NR

3+OH-

CH

2

CH

TIPOS DE FASES MÓVEIS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)

• Soluções tampões (pH 3,0 – 8,0):Tampão de Fosfato de pH = 8,0. Tampão de Fosfato de sódio de pH = 3,4. 3,4.

• Soluções de sal: 0,1 – 0,2 M de LiCl ou NaCl.

• Água destilada.• Qualquer solvente orgânico.

4.3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE): Cromatografia de permeação ou filtração por gel

• Baseia-se em um processo puramentemecânico. A fase estacionária é uma matriz decomposição inerte, com partículas de forma,tamanho e porosidade uniformes.

• As moléculas menores são capazes de• As moléculas menores são capazes depenetrar em todos os poros da faseestacionária, ficando mais tempo retidas,enquanto as maiores são excluídas de todosos poros, passando entre os grânulos,arrastadas pela fase móvel.

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE):

A fase estacionária mais usada é um gel dedextrano (um polissacarídeo com unidades deglicose), conhecido comercialmente comoSephadex.

4.4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO: CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO

• Baseia-se na adsorção seletiva dos

componentes da mistura pela fase

estacionária por ação de forças eletrostáticas

e nas diferentes solubilidades que estes e nas diferentes solubilidades que estes

componentes têm na fase móvel.

• São exemplos: Cromatografia em coluna

(CC) e Cromatografia em camada delgada

comparativa e preparativa (CCDC e CCDP).

Adsorção e Absorção

• Absorção: penetração de um material na

massa de outro por ação molecular ou

química. A substância absorvida infiltra-se

na substância que a absorve.na substância que a absorve.

• Adsorção: adesão das moléculas de um

material sobre a superfície de um sólido ou

líquido em que estas estão em contato.

Quanto maior a superfície do adsorventes

mais forte a adsorção.

Escolha do adsorvente e eluente na Cromatografia por Adsorção

• Pontos a considerar:1. Características da amostra2. O Adsorvente ou fase estacionária2. O Adsorvente ou fase estacionária3. O eluente ou fase móvel

Características da amostra:

1. Acidez, basicidade, caráter iônico, solubilidade, reatividade com o adsorvente e solventes,

2. Constituição química: • ligações duplas, particularmente conjugadas

aumentam adsorção.• Compostos com pontes de H intramoleculares • Compostos com pontes de H intramoleculares

são menos adsorvidos que seus isômeros.• Grupos funcionais aumentam afinidade de

adsorção. Este efeito decresce na ordem: -COOH, -CONH2, -OH, -NHCOCH3, -NH2, -OCOCH3, -COCH3, -NO2, -OCH3, -H, -Cl.

Pontes de hidrogênio intramoleculares fazem com que

o composto seja menos adsorvido que seu isômero:

OH

COOH

H

O

OH

O

COOH1 2

1 2

Com a formação das pontes de Hintramoleculares, menos moléculas docomposto orto (1), relativamente ao para(2) , estarão formando pontes de H com asílica, daí maior rapidez na eluição.

Escolha do Adsorvente

COMPOSTOS ADSORVENTES

LIPOFÍLICOS ÓXIDO DE ALUMÍNIOSÍLICA-GEL

HIDROFÍLICOSCELULOSECELULOSE COMTROCADORES DE ÍONSKIESELGURPOLIAMIDA

Principais adsorventes

• Sílica-gel: Separa bem aldeídos, cetonas, alcalóides, açúcares, fenóis, esteróides, terpenóides, ácidos graxos e aminoácidos.

• Alumina ou óxido de alumínio: Útil na separação de hidrocarbonetos policíclicos, alcalóides, aminas, vitaminas lipossolúveis e alcalóides, aminas, vitaminas lipossolúveis e algumas cetonas. Inadequado para flavonóides e cetonas insaturadas.

• Kieselgur (Terras diatomáceas ou diatomita). Ácido silícico de origem fóssil. É utilizado como suporte nas separações por partição.

Principais adsorventes

• Óxido de magnésio: Usado para compostos aromáticos e substâncias com várias ligações duplas conjugadas (Ex: carotenóides).

• Celulose e celulose modificada: Para • Celulose e celulose modificada: Para compostos hidrofílicos (aminoácidos, ácidos nucléicos, açúcares, glicosídeos.

• Poliamida: Separa flavonóides, fenóis, nitroanilinas, benzofenonas e derivados de aminoácidos.

Escolha da Fase móvel

• Sua escolha depende do adsorvente utilizado, sua atividade e da classe de compostos da amostra.

• Misturas equieluotrópicas: Misturas de • Misturas equieluotrópicas: Misturas de solventes distintas que originam iguais deslocamentos de uma mesma amostra.

Ordem crescente da capacidade eluotrópica do

solvente• Éter de petróleo• Hexano• Tetracloreto de carbono• Dissulfeto de carbono• Benzeno• Diclorometano• Clorofórmio• Clorofórmio• Éter dietílico• Acetato de etila• Éter dipropílico• Propanol• MeOH• Piridina• Água• Ácido Orgânico diluído

• Fenol

4.4.1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Aplicações:1. Para determinar o número de componentes de

uma mistura.2. Para determinar a identidade de duas

substâncias.substâncias.3. Para monitorar o progresso de uma reação4. Para determinar a eficiência de uma

purificação.5. Para determinar o melhor sistema de solvente

para uma separação em coluna cromatográfica.6. Para monitorar uma coluna cromatográfica.

CCD

UV 254 nm: detecta compostos aromáticos, compostos comduplas conjugadas e alguns compostos insaturados.

REVELADORES EM CCD

Triterpenos e esteróides Reagente de Liebermann-Burchard

Flavonóides Solução de cloreto de alumínio

Alcalóides Reagente de Dragendorff

CLASSE REVELADOR

Alcalóides Reagente de Dragendorff

Vapores de iodoCompostos insaturados

DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA DE

SOLVENTES PARA SEPARAÇÃO DE UMA MISTURA.

• Deve-se fazer uma série de placas por CCD em sistemas de diferentes polaridades com a mistura a ser separada.separada.

• O melhor sistema é aquele que dê um valor de Rf na faixa de 0,25-0,35 para o componente mais rápido na placa.

CALCULANDO O Rf

solvente 1 solvente 2 solvente3 solvente 4 solvente 5 solvente6 solvente 7

solvente 3.95 3.9 4.0 4.1 4.0 4.0 4.05

Mais lento (álcool)

0.6 0.35 0.35 0.25 0.1 0.1 0.1

Mais rápido(cetona)

1.45 1.0 1.0 0.8 0.65 0.6 0.45

Rf álcool 0.15 0.09 0.088 0.061 0.025 0.025 0.025

Rf cetona 0.37 0.26 0.25 0.20 0.16 0.15 0.11

O Rf do componente mais rápido deve estar na faixa de 0.25-0.35. Os solventes 1, 2 e 3 estão nesta faixa. Para uma melhor resolução a diferença de Rf de cada componente deve ser no mínimo 0,1: solvente 1: Rf cetone - Rf álcool = 0.37 - 0.15 = 0.22solvente 2: Rf cetone - Rf álcool = 0.26 - 0.09 = 0.17solvente 3: Rf cetone - Rf álcool = 0.25 - 0.088 = 0.16

Os sistemas 1, 2 e 3 dão diferença de Rf superior a 0,1. Escolhe-se o sistema 3 por ser o menos polar.

CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Pré-eluição

Empacotamento Carregamento

ELUIÇÃO: EXEMPLO DE MONITORAÇÃO POR CCD

• A amostra foi eluída com o sistema de solventes previamente previamente escolhido por CCD. Recolheu-se 6 frações que foram testadas por CCD.

Eluição

CCD DAS SEIS PRIMEIRA FRAÇÕES

•Frações 1 e 2 não têm nenhum componente.•Nas Frações 3, 4 e 5 saiu o primeiro componente, deve-sejuntar estas frações.•Pode-se agora aumentar a polaridade do sistema desolvente para sair o segundo componente.

CCD DAS FRAÇÕES 7 a 12

Nas frações 7, 8 e 9 saiu o segundo componenteNas frações 10 a 12 não saiu mais nadaPode-se encerrar a coluna e juntar 7, 8 e 9.

BIBLIOGRAFIA

• COLLINS, Carol H.; Braga, Gilberto L.; Bonato, Pierina S. -Introdução a Métodos Cromatográficos. 7ª ed. Editora da Unicamp. 1997.

• Degani, A. L. ; Cass, Quezia B; Vieira, P. C. Cromatografia, um breve ensaio. Química Nova na Escola, 07, 21-25, 1988.