Bromatologia 2018.19 - Cromatografia

Bromatologia (FCNAUP) - Cromatografia 1josé fernandes

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

J. Oliveira Fernandes

Lab. de Bromatologia e Hidrologia

Faculdade de Farmácia U. Porto


Conjunto de técnicas afins de separação que consistem na separação dos componentes de uma mistura de substâncias por distribuição/repartição

de cada composto entre duas fases:

Fase estacionária

Constituída por uma substância sólida ou líquida aderente a um meio de suporte sólido poroso, com

grande superfície específica

Fase móvel

Constituída por um fluido (líquido ou gasoso), imiscível com a fase estacionária e que se move ao

longo desta


A separação das diversas substâncias tem como base um fenómeno de

migração diferencial, resultante da diferente afinidade de cada

composto para com as duas fases

Fase móvel

Fase estacionária

Soluto BSoluto A


A separação das diversas substâncias tem como base um fenómeno de

migração diferencial, resultante da diferente afinidade de cada

composto para com as duas fases


Fundador da Cromatografia

Usou uma coluna de carbonato de cálcio para separar pigmentos de folhas arrastando-os com um solvente e separando-os numa série de bandas coloridas (cromatografia de adsorção).

1872–1919

Mikhail Semyonovich Tsvet


Se uma solução de clorofila em éter de petróleo é passada através de uma coluna de adsorvente (p. ex. CaCO3

colocado firmemente num tubo de vidro), os pigmentos separam-se, desde o topo até à parte inferior, em

diferentes zonas coradas, de acordo com séries de adsorção, nas quais as substâncias mais fortemente adsorvidas

deslocam as menos fortemente agarradas para uma maior distância do ponto de partida. Esta separação é

praticamente completa se, após a introdução da solução, se faz passar uma corrente de solvente através da coluna

de adsorvente. Da mesma forma que os raios de luz no espectro, assim ficam os diferentes componentes da

mistura de pigmentos, separados ordenadamente na coluna de carbonato de cálcio, podendo ser assim analisados

qualitativa e quantitativamente. Designo esta preparação por cromatograma e o método correspondente por

cromatografia. É inútil afirmar que os fenómenos de adsorção não são apenas aplicáveis aos pigmentos

clorofílicos. É de esperar que todas as espécies de compostos químicos, corados ou incolores, estejam sujeitos às

mesmas leis.

1º texto sobre Cromatografia – Tswett (1903)


OUTROS NOMES IMPORTANTES

• Kuhn, Winterstein e Lederer

Separação de carotenos da cenoura e xantofilas da gema de ovo

(1931)

• A. J. P. Martin e A. T. James:

Cromatografia Gasosa

(1952)


No que respeita ao tipo de suporte, existem 2 grandes grupos de técnicas cromatográficas

►Cromatografia em coluna

A fase estacionária encontra-se confinada a um tubo estreito (coluna) e a fase móvel (líquida,

gasosa ou fluido supercrítico) passa ao longo dela por acção da gravidade ou forçada por um

bomba de propulsão

►Cromatografia planar

A fase estacionária constitui uma fina película sobre uma placa (de vidro, p. ex.) ou nos poros de

um papel. A fase móvel (líquida) move-se através da fase estacionária por capilaridade ou sob

acção da força da gravidade


Cromatografia em COLUNA

Separação dos pigmentos de folhas de uma planta por cromatografia em coluna

Fase estacionária: gel de sílica

Fase móvel (“eluente”): éter de petróleo:acetona (7:3)

Neste caso a fase móvel desloca-se apenas pela força da gravidade. Nos modernos “cromatógrafos líquidos” (slide seguinte) a fasemóvel é propulsionada por bombas de alta pressão.



As colunas (metálicas) têm um enchimento muito compacto, que causa grande resistência à passagem da

fase móvel, de modo que esta é propulsionada com recurso a bombas de alta pressão. Todo o sistema,

incluindo as colunas, deve ser capaz de suportar esta elevada pressão.

Equipamento de cromatografia líquida

de alta eficiência (HPLC):


Equipamento de cromatografia gasosa (GC)


As colunas modernas correspondem a tubos abertos de sílica fundida com um revestimento exterior que lhes

proporciona uma grande maleabilidade

A fase estacionária reveste a parede interna da coluna


A fase estacionária pode ser uma película de partículas sólidas

depositada sobre uma placa de vidro ou alumínio, ou uma simples

folha de papel

A fase móvel desloca-se por capilaridade no sentido contrário à

gravidade

Cromatografia PLANAR


Tipo de

cromatografia Fase móvel Fase estacionáriaProcesso de

distribuição

AdsorçãoL

GS Adsorção

PartilhaL

GL Partilha

Troca iónica L S Reacção química reversível

Exclusão L S Crivagem molecular

TIPOS DE CROMATOGRAFIA(de acordo com o mecanismo de separação)


Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por partículas sólidas com acção adsorvente

Cromatografia de Adsorção


Adsorção

Os componentes da mistura a separar

(amostra), dissolvidos na fase móvel,

adsorvem à superfície das partículas

(sólidas) da fase estacionária

Trata-se de um fenómeno superficial, no

qual assume grande importância a

formação de pontes de hidrogénio



Cromatografia em camada fina (TLC – Thin Layer Chromatography)

Placas de vidro ou de alumínio em que se fixou uma fina camada de uma substância

adsorvente, geralmente com a ajuda de um agente ligante - sulfato de cálcio - que facilite a

adesão ao vidro.

HPTLC

Cromatografia em coluna (convencional)

Cromatografia em coluna moderna (HPLC) com fases estacionárias de sílica (fase normal)

Cromatografia gás-sólido



Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um material de suporte impregnado com um líquido

Cromatografia de Partilha


Partição (partilha)

Os componentes da mistura a

separar (amostra), dissolvidos na

fase móvel, distribuem-se entre

esta e a fase estacionária (líquido a

revestir um suporte sólido) em

função da solubilidade em cada

uma dessas fases, até se atingir um

equilíbrio. Assim, a separação faz-

se com base na diferença nos

coeficientes de distribuição ou de

partição (K) entre as duas fases.



HPLC com fases estacionárias líquidas (fase reversa)

Cromatografia gás-líquido

Cromatografia em camada fina (apenas em casos excepcionais)

Cromatografia em papel



Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um sólido com uma superfície ionizada (positiva ou negativa), capaz de atrair substâncias com carga oposta

Cromatografia de Troca iónica


Troca iónica

Usada na separação de espécies

iónicas. Os componentes da mistura

a separar com carácter iónico ligam-

se covalentemente à fase

estacionária sólida (geralmente

designada por resina de troca iónica).

Na figura, trata-se de uma resina de

troca aniónica (ou seja, tem cargas

positivas), capaz de separar os

aniões da amostra

Cromatografia de Troca iónica


Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um material de suporte inerte (gel poroso) caracterizado por apresentar poros com diferentes dimensões

Cromatografia de Exclusão molecular


• Exclusão molecular (Size exclusion), crivo molecular ou permeação em gel (Gel permeation)

Há uma separação em função do tamanho

das moléculas. Não existem interacções

entre a fase estacionária e os compostos a

separar. As pequenas moléculas penetram

nos poros da fase estacionária. As

grandes são excluídas.

Cromatografia de Exclusão molecular


CLASSIFICAÇÃO DOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS


Fase estacionária – Substância sólida com carácter adsorvente

Fase móvel – Líquido

Processo de separação – adsorção

Cromatografia em coluna convencional

Factores mais importantes para a eficiência do processo

Selectividade do adsorvente

Força do eluente


A ELUIÇÃO em cromatografia em coluna

Uma típica separação cromatográfica em coluna:

-A amostra (mistura de A e B) é colocada no topo da coluna (um tubo estreito cheio com um sólido inerte - sob a forma de partículas muito pequenas - que suporta a fase estacionária na sua superfície).

-A introdução de sucessivas porções de eluente “fresco” (fase móvel) vai provocar o deslocamento dos componentes da amostra (eluição).

-O componente B tem maior afinidade para a fase estacionária do que o componente A, pelo que se “atrasa”, saindo da coluna (parte inferior) depois dele.


Alumina (Al2O3)

Sílica (SiO2)

Celulose

Florisil (mistura de MgO e de sílica)

Carbonatos diversos

Talco

Amido

Carcoal

Adsorventes mais usados



Força

de a

dso

rção

crescente

Adsorção de substâncias orgânicas por grupo funcional

Hidrocarbonetos saturados

Hidrocarbonetos insaturados

Hidrocarbonetos aromáticos

Éteres

Ésteres

Aldeídos e cetonas

Alcoóis

Ácidos e aminas




Selectividade dos Solventes

Solubilidade dos diversos componentes da amostra (solutos) no solvente

Interacção entre as moléculas do solvente e a superfície sólida adsorvente

X + n Sad X ad + n S



Sílica Alumina

Ciclohexano PentanoÉter de petróleo Éter de petróleoPentano HexanoTetracloreto de carbono CiclohexanoBenzeno Tetracloreto de carbonoClorofórmio BenzenoÉter etílico Éter etílicoAcetato de etilo ClorofórmioEtanol DiclorometanoMetanol Acetato de etiloAcetona 2-propanolÁc. Acético MetanolÁgua Água

Fo

rça d

e ad

sorçã

o crescen

te

Séries Eluotrópicas


Cromatografia em camada fina ou Thin Layer Chromatography (TLC)

Placas de vidro ou de alumínio em que se fixou uma fina camada de uma

substância adsorvente, geralmente com a ajuda de um agente ligante -

sulfato de cálcio - que facilite a adesão ao vidro.

A eluição é geralmente no sentido ascendente, por capilaridade

Cromatografia em placa


Preparação da câmara de eluição

Aplicação das amostras

Desenvolvimento do processo cromatográfico

Visualização das manchas (Revelação do cromatograma)



Preparação da câmara de eluição


A câmara de eluição deve ser previamente preenchida com uma pequena quantidade de eluente (geralmente uma mistura de solventes orgânicos), de forma a ocupar cerca de 0.7-1 cm de altura, e de seguida, fechada adequadamente com a tampa de vidro

O processo de desenvolvimento da placa cromatográfica deve iniciar-se apenas alguns minutos depois, de forma a permitir a saturação da fase gasosa com a mistura eluente


Aplicação das amostras


Um pequeno volume de amostra (normalmente alguns µL),

correspondente geralmente a um extracto num solvente

volátil da amostra inicial, é colocada perto da extremidade

inferior da placa, mas de forma a ficar acima da altura de

eluente presente no interior da placa. A mancha inicial deve

ficar com um diâmetro não superior a 1-2 mm.


Desenvolvimento do processo cromatográfico


A fase móvel desloca-se através da fase estacionária por

capilaridade, movendo os componentes d amostra a

diferentes velocidades, de acordo com a sua afinidade para

a fase estacionária e a sua solubilidade no eluente. A

separação fica completa dentro de uns poucos minutos.

Quando a frente de solvente atinge as proximidades da

extremidade superior da placa, a placa é retirada da

câmara, e a “linha” de solvente imediatamente “marcada”

com a ajuda de uma espátula, antes de haver evaporação

do mesmo.



Métodos Físicos (não destrutivos)

• Iodo (revelador universal)

• Fluorescência (254 nm, 365 nm)

• Directa

• Por contraste

• Radioactividade

• Etc.

Métodos Químicos (destrutivos)

• Ác. Sulfúrico + aquecimento (revelador universal)

• Reagentes selectivos

• 2,4-dinitrofenil-hidrazina (carbonilos)

• Cloreto férrico (fenóis)

• Ninidrina (aminoácidos)

• Vanilina em HCl (aminas aromáticas)

• etc.

Revelação do cromatograma


Cromatografia em placa – Factor de Retenção


Cromatografia em placa – Resolução



Eluição bidimensional


Suporte – celulose

Fase estacionária – água

Apenas serve para separação de compostos solúveis em água

Os solventes usados para a eluição têm de formar um sistema parcial ou totalmente miscível

com a água

Podem usar-se papéis impregnados com outros solventes que não a água

Não é possível trabalhar com fins preparativos

Técnicas ascendentes, descendentes, radiais, etc.

Cromatografia em papel (partilha)



Cromatografia Preparativa

(separação das manchas e análise por outra técnica, depois de eliminação da fase estacionária)

Cromatografia Analítica

(medição da área das manchas)

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