CENTRO UNIVERSITÁRIO DE BRASÍLIA

FACULDADE DE CIÊNCIAS DA EDUCAÇÃO E SAÚDE

GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

LAURA LISIEUX DOS SANTOS MONTEIRO

ANÁLISE MOLECULAR DE MUTAÇÕES ASSOCIADAS AO GENE COL7A1 NA

EPIDERMÓLISE BOLHOSA DISTRÓFICA (EBD)

Trabalho de Conclusão de Curso,

apresentado no formato de artigo

cientifico ao UniCEUB como requisito

parcial para a conclusão do curso de

Bacharelado em Biomedicina.

Orientador: Professor Dr. Paulo

Roberto Martins Queiroz.

BRASÍLIA

2016

1

Análise molecular de mutações associadas ao gene COL7A1 na Epidermólise Bolhosa

Distrófica (EBD)

LAURA LISIEUX DOS SANTOS MONTEIRO*

PAULO ROBERTO MARTINS QUEIROZ**

Resumo

A Epidermólise Bolhosa Distrófica (EBD) é o tipo mais grave clinicamente dentre o grupo

das Epidermólises Bolhosas. É subdividida em quatro subtipos, dois dominantes (EBDD) e

dois recessivos (EBDR), todos provocados por mutações no gene COL7A1, que codifica para

o colágeno tipo VII. O objetivo deste trabalho foi associar os principais tipos de mutações

com a estrutura molecular da proteína COL7A1 relacionado aos fenótipos da EBD. Como

metodologia, foi realizado um estudo experimental em três etapas que consistiram na revisão

bibliográfica de artigos científicos sobre a EBD, processamento das informações obtidas em

programas de bioinformática e elaboração dos resultados. Os fenótipos da EBD variam de

acordo com o tipo de mutação (nonsense, minssense, deleção, inserção ou mutação indel) que

ocorreu na sequência gênica e sua localização. Mutações do tipo missense estão geralmente

relacionadas à EBDD enquanto que os outros tipos descritos associam-se aos perfis

fenotípicos da EBDR.

Palavras-chave: Epidermólise Bolhosa Distrófica, mutações, COL7A1, colágeno tipo VII,

bioinformática.

Molecular analysis of mutations associated with COL7A1 gene in the Dystrophic

Epidermolysis Bullosa (DEB)

Abstract

The Dystrophic Epidermolysis Bullosa (DEB) is the most serious type clinically from the

group of Epidermolysis Bullosa. It is subdivided in four subtypes, two dominants (DDEB)

and two recessives (RDEB), all caused by mutations in the COL7A1 gene that encoding for

collagen type VII. The objective of this study was to associate the major types of mutations

with the molecular structure of the COL7A1 protein related to phenotypes of DEB. As

methodology, an experimental study was accomplished in three stages that consisted in the

reviem of scientfic articles about the DEB, processing of the information obtained in

bioinformatics programs and preparation of the results. The phenotypes of DEB vary

according with the type of mutation (nonsense, minssense, deletion, insertion or indel

mutation) has occurred in the gene sequence and its location. Missense mutations are

generally related with DDEB while the other types described are associated with phenotypic

profiles of RDEB.

Keywords: Dystrophic Epidermolisys Bullosa, mutations, COL7A1, collagen type VII,

bioinformatic.

*Graduanda do curso de Biomedicina do Centro Universitário de Brasília - UniCEUB. lau.lisieux@gmail.com

**Biólogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília (2006). paulo.silva@uniceub.br

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1. Introdução

A Epidermólise Bolhosa (EB) constitui um grupo de enfermidades hereditárias

caracterizadas por defeitos na adesão intraepidérmica ou dermo-epidérmica que resultam no

surgimento de bolhas na pele em resposta ao menor trauma sofrido (ALMEIDA JR, 2002). As

EB’s se dispõem em quatro tipos que são classificados de acordo com a histologia e formação

das bolhas: EB Simples, EB Juncional, EB Distrófica e a Síndrome de Kindler, grupo incluído

recentemente no terceiro consenso internacional de EB (BOEIRA, 2012).

Com relação à epidemiologia da EB, vários estudos foram feitos estimando a

incidência e a prevalência da doença com diferentes técnicas realizadas, mas as pesquisas

mais importantes e tidas como referência são as derivadas do Registro Nacional de EB nos

Estados Unidos (BOEIRA, 2012). Segundo os EUA, ocorrem 50 casos de EB por um milhão

de nascidos-vivos, sendo 92% na forma EB simples, 5% na forma distrófica, 1% na forma

juncional e 2% não classificados. No Brasil não há dados epidemiológicos, pois ainda estão

sendo realizados estudos sobre o número de indivíduos afetados pela Epidermólise Bolhosa.

A EB afeta ambos os gêneros e pode ocorrer em todas as etnias (GÜRTLER; DINIZ; FILHO,

2005).

A Epidermólise Bolhosa Distrófica (EBD) é o tipo menos comum e mais grave dentre

as EB’s. Ela se subdivide em quatro subtipos principais, dois na forma autossômica

dominante e dois na forma autossômica recessiva (OLIVEIRA, et al., 2010). Os subtipos da

EBD dominante (EBDD) são: Cockayne-Touraine (EBDD-CT), que tem como características

clínicas a formação de bolhas nas extremidades do corpo, cavidade oral (mucosas e dentes) e

distrofia ou ausência de unhas; e o subtipo Pasini (EBDD-Pa), com as mesmas manifestações

clínicas que a EBDD-CT, mas de forma mais grave, com formação de bolhas mais extensas,

semelhantes à pápulas, surgindo também na região do tronco. Os subtipos de EBD recessivo

(EBDR) costumam ser mais agressivos (ALMEIDA JR, 2002). A forma recessiva não-

Hallopeau-Siemens (EBDR-nHS) é mais grave que os subtipos dominantes e também tem

como clínica o desenvolvimento de bolhas nas extremidades do corpo e perda das unhas, mas

com pouco envolvimento das mucosas. Já a forma recessiva Hallopeau-Siemens (EBDR-HS)

é a mais severa do grupo EBD. Suas manifestações clínicas compreendem a formação de

bolhas com distribuição generalizada pelo corpo; pseudosindactalia (deformidade das mãos e

pés em forma de “luva de box”), unhas e dentes extremamente afetados com perdas;

envolvimento das mucosas internas com restrições no esôfago, estenose (estreitamento) anal e

uretral; fimose; escaras na córnea; anemia ferropriva e déficit de desenvolvimento

3

ocasionados por desnutrição. Além disso, estes pacientes possuem sério risco de

desenvolvimento de câncer de pele nos locais de lesões crônicas (BARROS; RASKIN;

PEREIRA-FERRARI, 2004; BOEIRA, 2012).

Todos os subtipos de EBD, dominantes e recessivos, são provenientes de mutações em

um mesmo gene, o COL7A1. Porém, o que determina cada subtipo são a localização e o tipo

da mutação que ocorre neste gene. O COL7A1 codifica o colágeno tipo VII, importante

proteína que compõe as fibrilas de ancoragem que participam da adesão entre a lâmina densa

e a derme na pele (DANG; MURRELL, 2008).

Para a EBD já foram descritas mais de 730 mutações que levam a diferentes fenótipos

da doença. Dentre essas mutações, os tipos mais comuns são: mutações que codificam para

um aminoácido diferente (missense); mutações sem sentido, que codificam para um códon de

parada (nonsense); deleções; inserções; mutações indel, quando deleções e inserções ocorrem

concomitantemente; e as que ocorrem no splicing (DANG; MURRELL, 2008; LIN et al.,

2012).

O diagnóstico das EB’s é feito com base nos achados clínicos e laboratoriais do

paciente. Na clínica é avaliado o histórico familiar e se há consanguinidade entre os pais. No

laboratório, o diagnóstico vem por meio da técnica de microscopia eletrônica (ME), método

padrão-ouro, que consiste na análise histológica de um fragmento do tecido cutâneo. O

tratamento envolve o cuidado com as feridas e bolhas do paciente com o uso de curativos

estéreis para evitar possíveis infecções. É feito o suporte nutricional e uso de antibióticos

tópicos ou sistêmicos quando ocorrem contaminações. Evitar o surgimento de bolhas é a

finalidade principal do tratamento, pois se virarem lesões crônicas, podem desenvolver para

tumores malignos, uma das principais causas de morte em pacientes com EBD (BOEIRA,

2012).

O estudo biomolecular das Epidermólises Bolhosas, no Brasil, ainda é insuficiente

sendo necessário recorrer a estudos internacionais em outras línguas. Um trabalho mais

completo se faz necessário nesses parâmetros, pois, além de acrescer o número de pesquisas

nacionais neste campo, o estudo genético específico aliado à biologia molecular é de grande

auxílio no desenvolvimento de terapias gênicas. Segundo Cutlar, Greiser e Wang (2014), a

substituição de um gene defeituoso por uma cópia totalmente funcional é o princípio básico

da terapia gênica. O paciente passa a produzir a proteína – que antes era sintetizada de

maneira defeituosa - da forma correta, diminuindo os sintomas da doença e melhorando sua

qualidade de vida consideravelmente.

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O objetivo deste trabalho foi associar os principais tipos de mutações com a estrutura

molecular da proteína COL7A1 relacionado aos fenótipos da Epidermólise Bolhosa Distrófica

(EBD).

2. Metodologia

Para atingir o objetivo proposto foi realizado um estudo experimental em três etapas

que consistiram na revisão bibliográfica de artigos científicos a respeito da Epidermólise

Bolhosa Distrófica, processamento das informações obtidas por programas de bioinformática

e elaboração dos resultados.

Para a revisão bibliográfica, artigos e teses científicas foram pesquisados nas bases de

dados EBSCOhost, Scielo, Medline, PubMed, Elsevier e Bireme, utilizando as palavras-chave

“epidermólise bolhosa distrófica”, “COL7A1”, “mutations and COL7A1”, “dystrophic

epidermolysis bullosa” e “mutations and dystrophic epidermolysis bullosa”, e o período da

busca foi definido entre os anos 2002 e 2016, não se excluindo trabalhos anteriores com

importância para melhor fundamentar o tema. Também foram definidos como critérios,

trabalhos escritos nos idiomas português e inglês.

2.1. Bioinformática

A bioinformática se refere ao emprego de ferramentas computacionais no estudo de

problemas e questões biológicas, abrangendo também as aplicações relacionadas à saúde

humana como o planejamento de novos fármacos (VERLI, 2014).

A bioinformática foi a parte principal do trabalho, pois com ela foram realizadas

análises sequenciais e estruturais por meio dos programas The Sequence Manipulation Suite

(http://www.bioinformatics.org/sms2/), PDB - Protein Data Bank

(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), Swiss Model (http://swissmodel.expasy.org/) e

Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index). Toda a análise do

gene COL7A1 foi feita por meio do banco de dados NCBI – National Center for

Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Primeiramente, realizou-se a pesquisa da sequência de DNA do gene COL7A1 no

banco de dados NCBI e, em seguida, analisou-se a região codante (CDS) (ID 1294) que se

refere à sequência protéica do colágeno tipo VII. Para consegui-la, buscou-se no NCBI pelo

transcrito do gene COL7A1 (mRNA) e, ao escolher a opção “Homo sapiens collagen type VII

alpha 1 (COL7A1), mRNA”, logo a baixo das referências científicas, a CDS aparece como

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opção para clique. Após clicar, a região codante é realçada para visualização. Com essa

região, iniciaram-se as tentativas de modelagem da cadeia proteica do colágeno tipo VII nos

programas Swiss Model e Phyre 2 sem êxito, pois ela não se encontrava nos bancos de dados.

Dessa forma, optou-se por se fazer uma nova busca na qual foram determinadas as regiões

que correspondiam às mutações que seriam estudadas para serem modeladas como uma única

estrutura artificial, mas os programas de modelamento não encontraram dados, ou seja, não

foi possível modelar as sequências.

Para se chegar à sequência final utilizada neste trabalho, o segmento proteico do

colágeno tipo VII foi inserido outra vez no programa Swiss Model para uma nova tentativa. A

partir das cadeias semelhantes que foram sugeridas, selecionou-se uma variante que está de

acordo com as estruturas que são descritas nos artigos científicos pesquisados que embasam

este trabalho. Em seguida, o segmento foi moldado no Swiss Model e sua estrutura

proporcionou a simulação de cadeias proteicas em condições patológicas, ou seja, com os

tipos de mutações que correspondem aos fenótipos da Epidermólise Bolhosa Distrófica.

3. Resultados e Discussão

3.1. Epidermólise Bolhosa Distrófica e o gene COL7A1

Tabela 1: Características clínicas dos subtipos da EBD.

SUBTIPOS ASPECTOS CLÍNICOS

Epidermólise Bolhosa

Distrófica Dominante

Cockayne-Touraine

(EBDD-CT)

Formação de bolhas

nas extremidades do

corpo e cavidade oral

(mucosas e dentes).

Distrofia ou ausência

de unhas.

Epidermólise Bolhosa

Distrófica Dominante

Pasini (EBDD-Pa)

Formação de bolhas

mais extensas, nas

extremidades do

corpo, tórax e

cavidade oral

(mucosas e dentes).

Distrofia ou ausência

de unhas.

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Epidermólise Bolhosa

Distrófica Recessiva

não Hallopeau-

Siemens (EBDR-nHS)

Formação de bolhas

nas extremidades do

corpo, perda das

unhas. Mais grave

que as formas

dominantes. Pouco

envolvimento das

mucosas.

Epidermólise Bolhosa

Distrófica Recessiva

Hallopeau-Siemens

(EBDR-HS)

Subtipo mais grave.

Bolhas com

distribuição

generalizada pelo

corpo;

pseudosindactalia;

perdas de unhas e

dentes; mucosas

internas

comprometidas;

Fonte: Adaptado de BOEIRA (2012).

A Epidermólise Bolhosa Distrófica (EBD) é uma condição hereditária dividida em

subtipos caracterizados pela distribuição de bolhas ao longo da pele e nas mucosas do

paciente (BARROS; RASKIN; PEREIRA-FERRARI, 2004; BOEIRA, 2012). A Tabela 1

mostra os quatro subtipos da EBD e suas características clínicas.

Figura 1: Ultraestrutura da zona de membrana basal e proteínas envolvidas na EB.

Fonte: Adaptado de BOEIRA (2012).

Fonte: GÜRTLER; DINIZ; FILHO (2005).

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Os defeitos que provocam os fenótipos da EBD encontram-se na proteína colágeno

tipo VII que forma as fibrilas de ancoragem presentes entre a lâmina densa e a sublâmina

densa na junção dermo-epidérmica, local onde as bolhas são formadas, como mostra a Figura

1 (DANG; MURRELL, 2008).

Os quatro subtipos principais descritos de EBD decorrem de mutações em um mesmo

gene, o COL7A1, que codifica o colágeno tipo VII e está presente no cromossomo 3 na

posição p21.31 (Figura 2) (WEINEL, 2008). Cada subtipo varia de acordo com o tipo da

mutação e sua localização, desde o fenótipo mais severo, a forma recessiva Hallopeau-

Siemens, até os mais brandos, as formas dominantes Cockayne-Touraine e Pasini (BOEIRA,

2012).

Figura 2: Mapeamento físico do gene COL7A1 (GenBank ID 1294) no locus 3p21.31.

Fonte: Adaptado de GENECARDS (2016).

3.2. Colágeno tipo VII

O colágeno tipo VII é produzido por queratinócitos epidérmicos e fibroblastos

dérmicos. Durante o processamento intracelular, o transcrito mRNA é traduzido em uma

cadeia polipeptídica proα1 (VII), que se une com mais duas cadeias proα1, gerando uma

estrutura de 2944 aminoácidos constituída por um domínio central triplo-helicoidal de

colágeno precedido e seguido por dois domínios não colagênicos, o NC-1 (não colagênico-1),

ampla cadeia amino-terminal, e a porção de menor tamanho NC-2 (não colagênico-2),

carboxi-terminal, como pode ser visto na representação simplificada da Figura 3 (DANG;

MURRELL, 2008).

Figura 3: Representação esquemática da molécula de colágeno tipo VII.

Fonte: Adaptado de ALMEIDA JR (2012).

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O centro de sua estrutura também possui um pequeno segmento não colagênico, o que

garante flexibilidade à proteína. A fusão de duas moléculas triplo helicoidal ocorre em nível

extracelular, pela perda do segmento NC-2 resultando, assim, em dímeros antiparalelos cuja

união destes, por sua vez, formará as fibrilas de ancoragem (Figura 4) (ALMEIDA JR, 2002;

VARKI et al., 2006).

Figura 4: Formação do colágeno tipo VII sob condições fisiológicas (lado esquerdo) e

condições patológicas (lado direito), evidenciando os subtipos da EBD.

Fonte: Adaptado de VARKI et al. (2006).

É uma proteína de extrema importância na junção dermo-epidérmica, pois é ela que

constitui firmeza e flexibilidade às fibrilas de ancoragem mantendo assim, a zona de

membrana basal (ZMB) e a derme unidas e firmes. Com o colágeno produzido de forma

defeituosa, a manutenção desta junção fica prejudicada. O resultado é que a cada atrito que a

pele sofra, por menor que seja, há formação de bolhas.

Como dito anteriormente, já foram descritas mais de 730 mutações para a EBD que

resultam em um colágeno defeituoso. As consequências variam de acordo com o tipo de

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mutação ocorrida, como a PTC (Premature Termination Codon), notado na Figura 4, a qual

geralmente está associada a mutações do tipo nonsense (codificam para um aminoácido de

parada) e deleções, frequentes no fenótipo EBDR-HS, quando presente nos dois alelos.

Mutações que codificam para um aminoácido diferente (missense), referido principalmente

como substituições do aminoácido glicina (Gly) na Epidermólise Bolhosa Distrófica, e

inserções estão comumente associadas com fenótipo EBDR-nHS e, também, com os subtipos

dominantes (EBDD-CT e EBDD-Pa), que são formas mais brandas. Essas mutações podem

ocasionar interferência na associação das cadeias de colágeno e na formação da tripla hélice

causando assim desestabilização desta molécula. As substituições do aminoácido Gly

(Glicina), também na tripla hélice do colágeno, geram interferência na formação dos dímeros

que constituem as fibrilas de ancoragem, comuns nos fenótipos da EBDD (ALMEIDA JR,

2002; VARKI et al., 2006; DANG; MURRELL, 2008).

A disposição da tripla-hélice do colágeno tipo VII, região de estudo deste trabalho, é

composta por sessões repetidas do motivo Gly-X-Y, sendo que X e Y podem ser quaisquer

aminoácidos, mas geralmente, suas posições são ocupadas por Prolina (PRO) e Hidroxiprolina

(HYP) (Figura 5) (MANKA et al., 2012).

Figura 5: Constituição da molécula de colágeno.

Fonte: PROTO-COL UK (2014).

A estrutura em hélice das cadeias-α (proα1) do colágeno garante à proteína a rigidez

necessária para manter derme e epiderme unidas. Isso acontece porque cada aminoácido dessa

repetição tem uma função precisa: a cadeia lateral da glicina que corresponde a um átomo de

hidrogênio é a única porção que pode se encaixar no centro apertado da estrutura em tripla

hélice. As pontes de hidrogênio são favorecidas pelos grupos químicos presentes na ligação

10

peptídica entre a porção NH de um resíduo de glicina com um grupo carbonilo (C=O)

segurando, assim, as três cadeias em conjunto. O ângulo fixo de C-N peptídeo-prolina ou

peptídeo-hidroxiprolina permite que a cadeia polipeptídica, ao dobrar-se em uma hélice,

constitua uma geometria na qual as cadeias polipeptídicas podem se torcer em conjunto para

formar uma cadeia triplo-helicoidal, como mostra a Figura 6. Curiosamente, apesar das

ligações rígidas peptídeo-prolina perturbarem a estrutura de aminoácidos em uma cadeia α-

hélice, elas estabilizam a estrutura final em tripla-hélice (LI; BRODSKY; BAUM, 2007;

SHOULDERS; RINES, 2009).

Figura 6: Visão geral da estrutura molecular da tripla-hélice do colágeno. Em (a), a estrutura

cristalina de alta resolução da tripla-hélice. Em (b), a tripla-hélice em três representações:

átomos inchados (space-filling), ball-and-stick (bola-e-vara) e em fita. Em (c), um segmento

ball-and-stick da tripla-hélice com destaque para as ligações de hidrogênio intercadeias. E em

(d), ligações polipeptídicas entre as cadeias-α.

Fonte: SHOULDERS; RAINES (2009).

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3.3. Fase experimental: modelamento das cadeias proteicas

A literatura não descreve mutações que ocorram de forma frequente na EBD. Logo,

não existe uma mutação principal a ser estudada. Em razão disso, preferiu-se estudar os tipos

de mutações que levam aos diferentes níveis fenotípicos da Epidermólise Bolhosa Distrófica.

Sabe-se que as cadeias proteicas de colágeno mudam de acordo com a mutação que

ocorre na sequência de aminoácidos e sua localização. Essas diferentes estruturas foram

representadas e analisadas neste trabalho, comparando-as a uma cadeia normal, ou seja, sem

alterações ou mutações.

O programa de modelagem de proteínas, Swiss Model, sugeriu a variante proteica de

ID 4AUO.2.B: um polipeptídeo de 38 aminoácidos com o motivo Gly-X-Y que aparece

repetidamente na estrutura (GPPGPPGPPGPQGLAGQRGIVGLPGQRGERGPPGPPGP) o

qual corresponde à cadeia B da tripla-hélice da proteína colágena intersticial presente nos

colágenos tipo I, II e III. Sua constituição assemelha-se bastante com a do colágeno tipo VII e,

por isso, foi utilizada para demonstração das mutações relacionadas aos fenótipos de EBD

(Figura 7) (BISIANI et al., 2014).

Figura 7: Representação da cadeia B normal da proteína colágeno intersticial.

Fonte: BIASINI et al. (2014).

Os tipos de mutações mais comuns registrados na literatura que levam à EBD são

missense, nonsense, deleções, inserções e mutações indel. Todos esses tipos terão suas

estruturas representadas nas figuras seguintes, com exceção do tipo de mutação nonsense, que

gera uma cadeia de aminoácidos insuficiente para ser modelada pelo Swiss Model. Essas

mutações provocam uma terminação prematura do códon (PTC) resultando em uma proteína

truncada não funcional e que, na maioria das vezes, relaciona-se com os fenótipos recessivos

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da EBD, sobretudo a forma mais severa: Hallopeau-Siemens. Esta pode ocorrer em

heterozigose, PTC combinada com outro tipo de mutação como, por exemplo, PTC e uma

substituição de glicina, e em homozigose, quando PTC ocorre em ambos os alelos (DANG;

MURRELL, 2008).

Mutações missense codificam para um aminoácido diferente. Na EBD, geralmente

estão associadas a substituições de glicina resultando, na maioria das vezes, nos fenótipos

dominantes (EBDD-CT e EBDD-Pa), que se caracterizam por serem mais brandos

clinicamente. Isso acontece porque essas substituições causam apenas uma pequena torção

irregular no local da mutação na sequência de aminoácidos da proteína, desestabilizando sua

estrutura e comprometendo-a, causando interferência na formação dos dímeros que

constituem as fibrilas de ancoragem (DANG; MURRELL, 2008; DENG et al., 2008; VARKI

et al., 2006). A Figura 8 evidencia essa torção anormal.

Figura 8: Representação de mutação do tipo missense circulada em vermelho: substituição de

Glicina por Valina na posição 10.

Fonte: Adaptado de BIASINI et al. (2014).

Mutações que provocam deleção estão relacionadas com os fenótipos recessivos da

EBD e, na maioria das vezes, com os casos mais graves: os de EBD recessiva Hallopeau-

Siemens. Deleções causam alterações muito problemáticas na proteína colágena,

comprometendo sua funcionalidade quase por completo. A Figura 9 representa uma deleção

do aminoácido glicina que gerou um motivo com estrutura em folha β pregueada

(representada pelo formato em seta) entre a hélice da cadeia. Sabe-se que o colágeno tem

como característica física sua rigidez, que é proporcionada pela estrutura em hélice de sua

cadeia proteica (DANG; MURRELL, 2008; VARKI et al., 2006). A folha β pregueada

compromete essa rigidez deixando o colágeno muito maleável, fazendo com que ele perca sua

real função de aderência e firmeza para a pele, deixando-a literalmente frouxa.

Aminoácido Valina

13

Figura 9: Representação de mutação do tipo deleção circulada em vermelho: deleção de

Glicina na posição 16.

Fonte: Adaptado de BIASINI et al. (2014).

Mutações de inserção e mutações do tipo indel estão relacionadas, assim como, as

deleções, na maior parte das vezes, com os fenótipos recessivos, principalmente a EBDR-HP.

A inserção de outro aminoácido na cadeia proteica gera interferência entre as repetições do

motivo Gly-X-Y, mudando a conformação da proteína levando a uma torção muito alterada

que desestabiliza toda sua estrutura. Essa anormalidade pode ser vista na Figura 10 e na

Figura 11 (B). A literatura descreve que inserções e mutações indel acarretam como

consequência PTC na cadeia polipeptídica, interferindo em toda a funcionalidade do colágeno

resultando, assim, nos fenótipos recessivos de EBD. Como dito anteriormente, a estrutura de

folha β pregueada na cadeia colagênica, vista na Figura 11 (A) provoca mudanças

significativas na funcionalidade da proteína, uma vez que sua rigidez fica extremamente

comprometida. Por esse motivo, mutações indel em ambos os alelos, quase sempre, irão se

relacionar com o fenótipo mais severo EBDR-HS (DANG; MURRELL, 2008).

Figura 10: Representação de mutação do tipo inserção circulada em vermelho: inserção de

Asparagina na posição 17.

Fonte: Adaptado de BIASINI et al. (2014).

Folha β pregueada

(deleção de Glicina)

Aminoácido Asparagina

14

Figura 11: Representação de mutação do tipo indel: em A, deleção de Glicina na posição 16 e

em B, inserção de Asparagina na posição 23.

Fonte: Adaptado de BIASINI et al. (2014).

A experimentação mostrou que as mutações do tipo missense geralmente relacionam-

se com os perfis fenotípicos autossômicos dominantes: EBDD-CT e EBDD-Pa. Na maioria

dos casos, tratam-se de substituições do aminoácido glicina e não trazem perda funcional

completa à molécula de colágeno tipo VII, ocasionando fenótipos de EBD clinicamente mais

brandos. Já os outros tipos (nonsense, deleções inserções e indel) estão mais associados aos

fenótipos autossômicos recessivos: EBDR-nHP e EBDR-HP. Mutações que provocam estes

quadros clínicos mais severos resultam em uma proteína truncada não funcional,

principalmente quando ocorrem mutações nonsense, pois provocam uma terminação

prematura do códon (PTC). Podem também trazer outras conformações à proteína, como a

folha β pregueada e torções anormais, cujas estruturas causam desestabilização do domínio

proteico prejudicando quase toda a funcionalidade do colágeno no tecido.

O estudo molecular relacionado à Epidermólise Bolhosa Distrófica se faz necessário,

sobretudo, para trazer novas perspectivas de tratamento, novos medicamentos e diagnósticos

mais rápidos e avançados para os portadores desta doença. Um bom exemplo são as terapias

gênicas que envolvem o uso de DNA’s recombinantes e que, atualmente, estão sendo

vastamente estudadas e experimentadas, com o propósito de melhorar consideravelmente a

qualidade de vida de pacientes diagnosticados com EBD (CUTLAR; GREISER; WANG,

2014). Para isso, é necessário o conhecimento prévio dos aspectos moleculares do fenótipo

que o indivíduo apresenta, como o tipo de mutação e o nível de funcionalidade do colágeno

tipo VII no tecido, bem como, mostram os estudos apresentados neste trabalho. Além dessas

terapias, é indispensável conhecer os aspectos funcionais do colágeno tipo VII. Um estudo

recente realizado na Universidade de Oxford mostrou que este tipo de colágeno está associado

15

ao desenvolvimento do carcinoma de células escamosas (CCE), pois ele suprime a sinalização

do TNFβ e a angiogênese inibindo o crescimento tumoral. O colágeno tipo VII, nestes casos,

está sendo estudado como terapia para CCE (MARTINS et al., 2016). Por esses motivos, os

estudos moleculares se mostram tão importantes, pois auxiliam pesquisadores na busca de

novas estratégias para melhorar a qualidade de vida de pacientes não só com EBD, mas outras

enfermidades genéticas sem cura.

4. Conclusão

De acordo com os estudos realizados, os fenótipos da Epidermólise Bolhosa Distrófica

se diferenciam de acordo com o tipo de mutação que ocorre na sequência gênica e, também,

sua localização. Cada um destes tipos resulta em uma cadeia proteica com características

desfavoráveis à funcionalidade do colágeno tipo VII levando a um perfil fenotípico diferente,

variando clinicamente, do brando ao mais severo. Os tipos de mutações que mais ocorrem são

missense, nonsense, mutações indel, deleções e inserções.

Conclui-se que o a mutação que traria menor acometimento clínico seriam as do tipo

missense e que a Epidermólise Bolhosa Distrófica pode apresentar vários níveis clinicamente

dependendo da mutação que ocorre no gene COL7A1 e o colágeno tipo VII pode ficar

parcialmente ou completamente não funcional.

Agradecimentos

Gostaria de agradecer, primeiramente, à minha mãe e irmãos, que me apoiaram em

toda a jornada acadêmica com muitas palavras de motivação. Minha mãe, Tânia, sempre

muito paciente, me ajudou em todos os momentos. Muito obrigada por tudo e por ser essa

linda mulher. Família é tudo e sempre será.

Ao meu orientador, professor e amigo, Paulo Roberto, por todo o auxílio, não só neste

projeto, mas também em toda a graduação. Suas palavras são preciosas e tudo que aprendi

com o senhor levarei em minha vida. Um simples obrigada não é o bastante tamanho o

sentimento de gratidão que tenho por tudo que o senhor me ensinou e espero poder, de

coração, continuar aprendendo com suas palavras.

Ao meu colega e amigo, Mateus Costa, que me indicou o tema deste trabalho e ajudou

a solucionar os vários problemas. Obrigada pela sua paciência, parceria e dedicação. Sua

ajuda foi importante para concluir este projeto e serei sempre grata por isso.

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Por fim, aos meus amigos queridos, sem vocês essa graduação não seria tão

gratificante. Obrigada por me acompanharem, por fazerem parte da minha vida, por me

ajudarem não só com este trabalho, mas com todos do curso, por me aguentarem nos

momentos de chateação, por serem essas pessoas maravilhosas. Vocês são mais que amigos

pra mim! E ao meu namorado, Marcelo Carvalho, meu melhor amigo. Você sempre me

entende quando preciso estudar, principalmente durante este trabalho, e me falou muitas

palavras de motivação para terminá-lo. Eu sempre serei grata por você ser essa pessoa tão

paciente e cuidadosa. Você é muito especial pra mim!

A todos vocês dedico este trabalho.

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5. Referências Bibliográficas

ALMEIDA JR, H. L. Molecular Genetics os Epidermolysis Bullosa. Anais Brasileiros de

Dermatologia, Rio de Janeiro, v. 77, n. 5, p. 519-532, set./out. 2002.

BARROS, I. R.; RASKIN, S.; PEREIRA-FERRARI, L. Epidermólise Bolhosa Distrófica:

Relato de um caso brasileiro. Estudos de Biologia, Curitiba, v. 26, n. 57, p. 25-30, out/dez.

2004.

BIASINI, M.; BIENERT, S.; WATERHOUSE, A.; ARNOLD, K.; STUDER, G.; SCHMIDT,

T.; KIEFER, F.; CASSARINO, T. G.; BERTONI, M.; BORDOLI, L.; SCHWEDE, T.

SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary

information. Nucleic Acids Research, London, v.42, p. W252-W258, jul. 2014.

BOEIRA, V. L. S. Y. Epidermólise Bolhosa Hereditária: Uma revisão literária. 2012. 42

f. Tese (Monografia) - Medicina, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2012.

CUTLAR, L.; GREISER, U.; WANG, W. Gene therapy: pursuing restoration of dermal

adhesion in recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Experimental Dermatology,

Sydney, v. 23, n. 1, p. 1-6, jan. 2014.

DANG, N.; MURRELL, D. F. Mutation analysis and characterization of COL7A1 mutations

in dystrophic epidermolysis bullosa. Experimental Dermatology, Sydney, v. 17, n. 7, p. 553-

568, jul. 2008.

DENG, W.; CHEN, S.; LU, C.; ZHOU, X.; CHEN, M.; LAI, W.; WANG, Y. A novel

p.Gly1700Aspmutation in COL7A1 responsible for dominant dystrophic epidermolysis

bullosa: More severe phenotype in female members of a Chinese Family. Journal of

Dermatological Science, Singapore, v.49, n. 2, p. 166-169, fev. 2008.

GENECARDS. COL7A1 Gene (Protein Coding). Rehovot, 2016. Disponível em:

<http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=COL7A1>. Acesso em: 22 jun 2016.

GÜRTLER, T. G. R.; DINIZ, L. M.; FILHO, J. B. S. Epidermólise bolhosa distrófica

recessiva mitis - Relato de caso clínico. Anais Brasileiros de Dermatologia, Rio de Janeiro,

v. 80, n. 5, p. 503-508, set/out. 2005.

LI, Y.; BRODSKY, B.; BAUM, J.; NMR Shows Hydrophobic Interactions Replace Glycine

Packing in the Triple Helix at a Natural Break in the (GLY-X-Y) Repeat. The Journal of

Biologica Chemistry, Rockville, v. 282, n. 31, p. 22699-22706, ago. 2007.

LIN, Y.; CHEN, X. J.; LIU, W.; GONG, B.; XIE, J.; XIONG, J. H.; CHENG, J.; DUAN, X.

L.; LIN, Z. C.; HUANG, L. L.; WAN, H. Y.; LIU, X. Q.; SONG, L. H.; YANG, Z. L. Two

Novel Mutations on Exon 8 and Intron 65 of COL7A1 Gene in Two Chinese Brothers Result

in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa. Journal Plos One, Columbus, v. 7, n. 11, p.

e50579, nov. 2012.

MANKA, S. W.; CARAFOLI, F.; VISSE, R.; BIHAN, D.; RAYNAL, N.; FARNDALE, R.

W.; MURPHY, G.; ENGHILD, J. J.; HOHENESTER, E.; NAGASE, H. Structural insights

into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. PNAS Early Edition.

Washington.DC, v. 109, n. 31, p. 12461-12466, jul. 2012.

MARTINS, V. L.; CALEY, M. P.; MOORE, K.; SZENTPETERY, Z.; MARSH, S. T.;

MURREL, D. F.; KIM, M. H.; AVARI, M.; MCGRATH, J. A.; CERIO, R.; KIVISAARI, A.;

KÄHÄRI, V. M.; HODIVALA-DILKE, K.; BRENNAN, C. H.; CHEN, M.; MARSHAL, J.

18

F.; O’TOOLE, E. A. Suppression of TGFβ and Angiogenesis by Type VII Collagen in

Cutaneous SCC. Journal of the National Cancer Institute, London, v. 108, n. 1, p. 1-11,

jan. 2016.

MEDICINAPERTUTTI. Membrana basale. Borgorose, 2015. Disponível em:

<http://medicinapertutti.altervista.org/argomento/membrana-basale/>. Acesso em: 19 mai

2016.

OLIVEIRA, Z. N. P.; PÉRIGO, A. M.; FUKUMORI, Lígia M. I.; AOKI, V.

Imunomapeamento nas epidermólises bolhosas hereditárias. Anais Brasileiros de

Dermatologia, Rio de Janeiro, v. 85, n. 6, p. 856-861, nov/dez. 2010.

PROTO-COL UK. What is collagen?. Londres, 2014. Disponível em: <http://www.proto-

col.com/blog/2014/07/collagen/>. Acesso em: 19 jun 2016.

SHOULDERS, M. D.; RAINES, R. T.; Collagen structure and stability. Annual Reviews of

Biochemistry, Palo Alto, v. 78, n. 1, p. 929-958, mar. 2009.

VARKI, R.; SADOWSKI, S.; UITTO, J.; PFENDNER, E. Epidermolysis bullosa. II. Type

VII collagen mutations and phenotype–genotype correlations in the dystrophic subtypes.

Journal of Medical Genetics, Londres, vol. 44, n. 3, p. 181-192, mar/abr. 2006.

VERLI, H. Bioinformática: da Biologia à Flexibilidade Molecular. São Paulo: SBBq,

2014.