UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · mundo todo e a quarta principal causa de morte...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

KLEYTON THIAGO COSTA DE CAVALHO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA E PRÓ-APOPTÓTICA DE

CROTON BLANCHETIANUS Baill. EM LINHAGENS DE CÂNCER

CERVICAL HUMANO

Natal/RN

2016

KLEYTON THIAGO COSTA DE CARVALHO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA E PRÓ-APOPTÓTICA DE

CROTON BLANCHETIANUS Baill. EM LINHAGENS DE CÂNCER

CERVICAL HUMANO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas. Co-orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Natal/RN

2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Carvalho, Kleyton Thiago Costa de.

Avaliação da atividade citotóxica e pró-apoptótica de Croton

blanchetianus baill. em linhagens de câncer cervical humano /

Kleyton Thiago Costa de Carvalho. - Natal, 2016.

107f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em Ciências

Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal

do Rio Grande do Norte.

Orientador: Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas.

Coorientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

1. Euphorbiaceae - Dissertação. 2. Croton blanchetianus -

Dissertação. 3. Câncer cervical humano - Dissertação. 4.

Citotoxicidade - Dissertação. I. Freitas, Janaina Cristiana de

Oliveira Crispim. II. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. III.

Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 582.681.46

DEDICATÓRIA

Dedico esta obra

Aos meus pais, Maria Dalvanira e Rafael Carvalho, por todo amor, ensinamentos, apoio e dedicação

para nos deixar a maior riqueza e herança que podemos ter: os estudos. Espero estar recompensando

um pouco do que fizeram por mim. Obrigado por tudo!! Amo vocês!

À minha sobrinha Maria Sofia. Meu amor, a sua chegada no mundo foi uma das maiores bênçãos de

Deus em nossas vidas, trazendo alegria, união e luz para toda a família. Saiba que você foi força e

incentivo para que eu nunca desistisse e pudesse, um dia, servir de exemplo e orgulho. Amo-te!

Dedico esta obra

Ao meu melhor amigo, parceiro na vida, Pedro Henrique. O ser humano mais incrível que já conheci,

extremamente generoso com todos ao seu redor e com os melhores conselhos. Você é porto seguro.

Obrigado por me fazer ter mais confiança em mim mesmo e por não ter deixado que eu desanimasse

nunca durante este período. Para você, o meu abraço mais sincero!

AGRADECIMENTOS

À Deus dedico o meu agradecimento maior, pois és tudo em minha vida. “Obrigado, Senhor, pelo seu

maravilhoso amor” (Salmo 107:15);

Aos meus pais (Dalvanira e Rafael), irmão (Angelo), Cunhada (Robislene) e minha Sobrinha (Maria

Sofia) por me apoiarem e torcerem sempre por mim. Vocês são combustíveis para que eu siga em

frente;

À UFRN, à Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas e ao DACT por todo o suporte e

oportunidade de concluir esse mestrado;

À minha orientadora Profa. Dra. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim pela oportunidade oferecida,

confiança, paciência, atenção e auxílio prestados durante a pesquisa. Muito obrigado!

Ao meu co-orientdor Prof. Hugo Alexandre de O. Rocha por todo apoio prestado. Esse trabalho só foi

possível devido sua valiosa colaboração. Obrigado!

À Profa. Dra. Raquel Giordani Brandt por fornecer os extratos utilizados neste trabalho e pelas

importantes orientações prestadas. Meus sinceros agradecimentos;

À Profa. Dra. Ana Paula Lepique pela doação das linhagens HeLa e SiHa;

A todos os professores, coordenadores e secretárias (Aureliana e Fábia) do Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas;

Ao Departamento de Bioquímica da UFRN por me permitir usar as facilidades do Laboratório de

Cultura de Células;

À banca de qualificação, composta pela Profa. Dra. Silvana Zucolloto, Prof. Dr. Raimundo

Fernandes e Dra. Jailma Almeida. Obrigado pelas valiosas contribuições;

Á Doutoranda Dayanne Gomes, um dos presentes que o mestrado me deu. Pessoas atenciosas,

generosas e prestativas, como você, são raras no meio acadêmico. És um ser iluminado!!! Nunca vou

me esquecer do quão bem você me recebeu no BIOPOL na primeira vez que nos vimos. Muito

obrigado pelas suas imprescindíveis colaborações nos experimentos, nada disso seria possível sem a

sua ajuda. Minha eterna gratidão. Espero um dia poder retribuir de alguma forma;

À Dra. Ana Katarina, técnica do Laboratório de Cultura de Células do Departamento de

Bioquímica, pelo treinamento em cultura de células e todo o suporte durante todo esse tempo;

Ao Farmacêutico-bioquímico Freire Neto pela disposição na utilização do citômetro de fluxo;

À companheira de trabalho Fabíola Sephora pelas boas conversas, por dividir angústias e,

principalmente, pelo suporte nas atividades do LAPIM para que eu pudesse concluir esse curso.

Espero que fique com a gente até se aposentar;

Aos meus amigos de infância (Roseane, Leonardo, Katiúcia, Diogo e Elizângela) por, mesmo de

longe, torcerem sempre por mim. Vocês são parte da minha família e estão guardados bem aqui, do

lado esquerdo do peito;

À minha segunda família, os meus queridos amigos de trabalho do Departamento de Produtos e

Ambiente do LACEN/RN, por tornar meus dias mais leves. Durante estes dois anos, muitas vezes

estive angustiado, ansioso com os problemas que iam surgindo, mas era só chegar no DAPA e tudo

passava. Obrigado pela companhia diária!

Aos meus colegas do LAPIM (Cleine, Manu, Rhadamés, Gustavo e Luan), em especial o grupo de

cultura de células por terem me ajudado na realização dos experimentos. Passamos por tantas

dificuldades com essas células, mas juntos fomos mais fortes. Cleine, muito obrigado por ter sido tão

prestativa, você nunca hesitou em me ajudar. Conte comigo!! Gustavo, você foi fundamental para o

desfecho desse trabalho. Muito obrigado pelas suas orientações, pode ter certeza que aprendi demais

depois de sua chegada em nosso grupo de pesquisa. Espero que continue ainda um bom tempo com a

gente.

A todos qυе direta оυ indiretamente fizeram parte dа minha formação, о mеυ muito obrigado.

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas

lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que

deveria ser, mas, Graças a Deus, não sou o que era

antes”.

(Marthin Luther King)

RESUMO

Câncer cervical (CC) é o terceiro tipo de câncer mais comum em mulheres no mundo todo e a quarta principal causa de morte em mulheres nos países em desenvolvimento. Os Papilomavírus humano (HPV) de alto risco tais como HPV 16, 18, 31 e 33 são o principal fator de risco para esse tipo de câncer. Entre estes, o HPV-16 e -18 são responsáveis por quase 70% dos casos de CC. Quimioterapia com compostos à base de platina em combinação com a radioterapia ou a cirurgia é o tratamento de escolha para CC, mas sua eficácia é limitada, especialmente em estágios avançados da doença. Além disso, estes tratamentos podem facilmente levar a reações adversas e resistência às drogas. Assim, a busca por novos agentes antitumorais seletivos e de alta eficácia para o tratamento deste tipo de tumor é necessária. Croton blanchetianus (CB), popularmente conhecida como “marmeleiro preto”, é um arbusto pertencente à família Euphorbiaceae e amplamente disseminado no nordeste brasileiro. Alguns estudos têm demonstrado a atividade citotóxica de plantas do gênero Croton em linhagens tumorais humanas. Contudo, até o momento, não há nada descrito na literatura quanto ao efeito citotóxico da espécie Croton blanchetianus. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar, in vitro, os efeitos de frações obtidas das folhas e raiz de CB nas linhagens de câncer cervical humano HeLa e SiHa. As frações foram obtidas pelo método de variação do pH, a partir do qual foram obtidas duas frações ácidas, uma das folhas (CBaF) e outra da raiz (CBaR), e duas básicas, também das folhas (CBbF) e raiz (CBbR). O perfil fitoquímico das frações foi avaliado por Cromatografia em camada delgada (CCD). A atividade citotóxica e a avaliação do tipo de morte celular foram determinados pelos ensaios de MTT e Anexina V/PI, respectivamente, enquanto que para avaliação de alterações morfológicas nucleares e ensaio do ciclo celular foram utilizados, respectivamente, microscopia de fluorescência com o corante DAPI e citometria de fluxo. De acordo com os resultados, a maioria das frações apresentou terpenos, alcaloides e flavonoides. Além disso, todas as frações testadas foram capazes de diminuir significativamente a viabilidade celular de HeLa e SiHa de maneira concentração e tempo dependentes, promoveram modificações morfológicas celulares e nucleares, além de induzirem apoptose e parada do ciclo celular. Este é o primeiro estudo que demonstrou os efeitos citotóxicos e pró-apoptóticos de CB em linhagens de câncer cervical humano. Portanto, CB parece ser uma fonte natural promissora para o desenvolvimento de agentes para o tratamento do CC. No entanto, mais estudos são necessários para isolar, purificar e elucidar os possíveis mecanismos de ação dos compostos ativos. Palavras-chaves: Euphorbiaceae, Croton blanchetianus, Câncer cervical, Citotoxicidade, apoptose, Hela, SiHa

ABSTRACT

Cervical cancer (CC) is the third most common cancers in women worldwide and the fourth major cause of cancer death in the woman in developing countries. High-risk human papilloma viruses (HPVs) such as HPV 16, 18, 31 and 33 have been attributed to be the major risk factors for cervical cancer, out of which HPV-16 and -18 account for almost 70% of the cancers. Platinum-based chemotherapy in combination with radiotherapy or surgery is now mainly used to treat CC, but the efficacy is limited especially in advanced-stage disease. Furthermore, these treatments could easily lead to adverse reactions and drug resistance. Thus, it is necessary to seek antitumor drugs of high efficacy for the treatment of this kind of tumor. Croton blanchetianus (CB), known as “black marmeleiro”, belongs to the family Euphorbiaceae and it is a widely disseminated shrub found in northeast Brazil. Some studies have demonstrated cytotoxic activity of plants of this genus against human tumor cell lines. However, to date, there is nothing described in the literature as to the cytotoxic effect of the Croton blanchetianus. Therefore, the present study aimed to investigate, in vitro, the effects of leaves and root fractions from Croton blanchetianus (CB) against human cervical cancer HeLa and SiHa cells. Fractions were obtained by pH variation method, from which were obtained two acidic fractions, one of the leaves (CBaF) and root (CBaR) and two basic also obtained from leaves (CBbF) and root (CBbR). Phytochemical screening was evaluated by thin layer chromatography. Cytotoxic activity and cell death evaluation were determined with MTT and annexin V/PI assays by flow cytometry, respectively. Nuclear morphological changes were evaluated by fluorescence with DAPI stanning and flow cytometry was used to cycle assay. According to results, most of the fractions exhibited terpenoids, alkaloids and flavonoids. All fractions decreased significantly cell viability of HeLa and SiHa cells in a concentration- and time-dependent manner, promoted cellular and nuclear morphological changes and induced apoptosis and cell cycle arrest. This is the first study that demonstrated cytotoxic and pro apoptotic effects of CB on HeLa and SiHa cells. Therefore, CB appears to be a valuable natural source for the development of agents for the treatment of CC. However, more studies are needed to isolate, purify and elucidate the possible action mechanisms of the active compounds. Key words: Euphorbiaceae, Croton blanchetianus, Cervical cancer, cytotoxicity, apoptosis, HeLa, SiHa

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Incidência de câncer cervical em todo o mundo no ano de 2012 19

FIGURA 2 Mortalidade por câncer cervical em todo o mundo no ano de

2012 ..............................................................................................

20

FIGURA 3 Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais

incidentes no Brasil estimados para 2016, exceto pele não

melanoma......................................................................................

20

FIGURA 4 Organização genômica do HPV 16 .............................................. 23

FIGURA 5 Ciclo de vida do HPV no epitélio .................................................. 25

FIGURA 6 Modelo prevalente de como a infecção pelo HPV pode progredir

para a malignidade .......................................................................

27

FIGURA 7 Mecanismos moleculares pelos quais as oncoproteínas do HPV

cooperam para induzir a carcinogênese cervical .........................

28

FIGURA 8 Ilustração gráfica das características morfológicas dos

mecanismos de morte celular por apoptose e necrose ................

31

FIGURA 9 Croton blanchetianus .................................................................... 38

FIGURA 10 Determinação da presença de metabólitos secundários nas

frações obtidas das folhas e raiz de Croton blanchetianus Baill...

49

FIGURA 11 Efeito das frações de Croton blanchetianus na viabilidade

celular da linhagem HeLa .............................................................

50 e 51


celular da linhagem SiHa ..............................................................

52 e 53


celular da linhagem MRC5 ...........................................................

55 e 56

FIGURA 14 Alterações morfológicas na célula HeLa após tratamento ........... 58

FIGURA 15 Alterações morfológicas na célula SiHa após tratamento ............ 59

FIGURA 16 Análise de citometria de fluxo de células HeLa tratadas com

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR ........................................................

61

FIGURA 17 Análise de citometria de fluxo de células SiHa tratadas com

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR ........................................................

62

FIGURA 18 Mudanças morfológicas em células HeLa após o tratamento

com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR por 48 h seguido de marcação

com DAPI .....................................................................................

64

FIGURA 19 Mudanças morfológicas em células SiHa após o tratamento com

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR por 48 h seguido de marcação com

DAPI .............................................................................................

65

FIGURA 20 Análises de ciclo celular de células HeLa por citometria de fluxo

após 48h de tratamento com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR .........

67

FIGURA 21 Análises de ciclo celular de células HeLa por citometria de fluxo

após 48h de tratamento com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR .........

68

LISTA DE TABELAS

Tabela I. Perfil fitoquímico das frações das folhas e raiz de Croton

blanchetianus Baill .....................................................................

48

Tabela II. Valores de IC50 das frações de Croton blanchetianus Baill em

linhagens de câncer cervical humano HeLa e SiHa ..................

54

LISTA DE ABREVIATURAS/ SIGLAS

ATCC American Type Culture Collection;

CBaF Fração ácida obtida das folhas de Croton blanchetianus

CBaR Fração ácida obtida da raiz de Croton blanchetianus

CBbF Fração básica obtida das folhas de Croton blanchetianus

CBbR Fração básica obtida da raiz de Croton blanchetianus

CO2 Gás carbônico

DMEM Eagle Modificado por Dulbecco

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

E Early genes

FITC Isotiocianato de fluoresceína

HPV Papilomavírus Humano

IC50 Concentração de um composto necessária para reduzir o

crescimento populacional de organismos, incluindo células

eucarióticas, em 50 por cento

INCA Instituto Nacional do Câncer

IP Iodeto de propídio

L Late genes

LCR Long Control Region

µg Micrograma

µL Microlitro

mL Mililitro

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenil tetrazolium bromide)

OMS Organização Mundial de Saúde

p53 Proteína supressora

PBS Tampão fostato salino

pRb Proteína Retinoblastoma

RPM Rotações por minuto

SFB Soro fetal bovino

UV Ultravioleta

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .....................................................................................

18

1.1 CÂNCER............................................................................................. 18

1.2 CÂNCER CERVICAL ......................................................................... 19

1.3 PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) .................................................. 22

1.4 HPV E CÂNCER CERVICAL ............................................................. 26

1.5 MORTE CELULAR ............................................................................. 29

1.6 CICLO CELULAR ............................................................................... 33

1.7 TERAPIAS CONVENCIONAIS PARA O TRATAMENTO DO

CÂNCER ..................................................................................................

34

1.8 IMPORTÂNCIA DA FITOTERAPIA NO CONTEXTO DO CÂNCER .. 35

1.9 O GÊNERO CROTON ....................................................................... 37

1.10 CROTON BLANCHETIANUS BAILL. ............................................... 38

2. OBJETIVOS ......................................................................................... 40

2.1 OBJETIVO GERAL............................................................................. 40

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................... 40

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 41

3.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL .................................................. 41

3.2 OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES DA CROTON BLANCHETIANUS

BAILL. .......................................................................................................

41

3.3 PERFIL FITOQUÍMICO DAS FRAÇÕES DE CROTON

BLANCHETIANUS BAILL.........................................................................

42

3.4 LINHAGENS E CULTURA DE CÉLULAS .......................................... 42

3.5 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE IN VITRO ........................................ 43

3.6 AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA CELULAR ...................................... 44

3.7 AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR ANEXINA V-FITC/

IODETO DE PROPÍDIO (IP) ....................................................................

44

3.8 AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA NUCLEAR ..................................... 45

3.9 AVALIAÇÃO DO CICLO CELULAR ................................................... 46

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................. 47

4 RESULTADOS ...................................................................................... 48

4.1 PERFIL FITOQUÍMICO DAS FRAÇÕES DAS FOLHAS E RAIZ DA

CROTON BLANCHETIANUS BAILL ........................................................ 48

4.2 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE IN VITRO ........................................ 49

4.3 EFEITOS DAS FRAÇÕES DAS FOLHAS E RAIZ DE CROTON

BLANCHETIANUS BAILL NA MORFOLOGIA CELULAR DAS

CÉLULAS HELA E SIHA...........................................................................

57

4.4 AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR ANEXINA V-FITC/

IODETO DE PROPÍDIO (IP) ....................................................................

60


BLANCHETIANUS BAILL NA MORFOLOGIA NUCLEAR DE HELA E

SIHA .........................................................................................................

63


BLANCHETIANUS BAILL NO CICLO CELULAR DE HELA E SIHA .......

66

5. DISCUSSÃO......................................................................................... 69

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................. 74

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... 75

8. ANEXO ................................................................................................. 88

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

Câncer é o termo utilizado para definir neoplasias, células que se

proliferam de maneira anormal (KING, ROBINS, 2006). Para uma neoplasia ser

considerada um câncer é necessário que suas células tenham habilidade para

invadir tecidos adjacentes (ALBERTS et al, 2008). O câncer é o resultado do

acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas que comprometem o controle

do crescimento celular normal e a diferenciação terminal, sendo que o acúmulo

de mutações no DNA é a causa subsequente ao desenvolvimento neoplásico

e, consequentemente, ao surgimento da doença (PARMIGIANI; CAMARGO,

2004; PEREIRA, 2014).

A carcinogênese pode ser compreendida como um processo complexo

de múltiplas etapas, podendo envolver muitos genes, particularmente os que

regulam a estabilidade e o reparo do DNA (quebras e perdas cromossômicas),

o crescimento celular, instabilidade genômica e mecanismos epigenéticos, a

imunidade e a quimiorresistência às drogas. Os principais grupos de genes

envolvidos nesse processo são: proto-oncogenes, que estimulam o

crescimento celular, impedem a diferenciação e a morte celular; e os genes

supressores de tumor, que limitam a proliferação das células, controlando

negativamente a proliferação e a sobrevivência celular. O desequilíbrio desse

sistema pode alterar a função de genes envolvidos, levando à proliferação

descontrolada de células e ao acúmulo de sucessivas anormalidades

genéticas, características do câncer (DANTAS et al, 2009; PEREIRA, 2014).

Com base no documento World cancer report 2014 da International

Agency for Research on Cancer (Iarc), da Organização Mundial da Saúde

(OMS), é inquestionável que o câncer é um problema de saúde pública,

especialmente entre os países em desenvolvimento, onde é esperado que, nas

próximas décadas, o impacto do câncer na população corresponda a 80% dos

mais de 20 milhões de casos novos estimados para 2025 (INCA, 2016).

A estimativa mundial, realizada em 2012, pelo projeto Globocan/Iarc,

apontou 14,1 milhões de casos novos estimados. Destes, mais de 60%

ocorreram em países em desenvolvimento. Para a mortalidade, a situação

19

agrava-se quando se constata que, dos 8 milhões de óbitos previstos para

aquele ano, 70% ocorreram nesses mesmos países (INCA, 2016).

A estimativa para o Brasil, biênio 2016-2017, aponta a ocorrência de

cerca de 600 mil casos novos de câncer. Excetuando-se o câncer de pele não

melanoma (aproximadamente 180 mil casos novos), ocorrerão cerca de 420 mil

casos novos de câncer (INCA, 2016).

1.2 Câncer cervical

O câncer cervical, também chamado de câncer de colo do útero, é

considerado uma das malignidades mais comuns entre a população feminina

em todo o mundo (FERLAY et al., 2010; FUKASAWA, 2012). Segundo as

últimas estimativas mundiais para o ano de 2012, o câncer do colo do útero é o

terceiro tipo de câncer mais comum entre as mulheres, com mais de 500 mil

casos novos, e a quarta principal causa de morte por câncer em mulheres em

todo o mundo, principalmente em regiões em desenvolvimento como América

do Sul e Caribe, África e Ásia (LEE et al, 2014; SCHOOT, BRÜNING, 2014;

CHAKRABARTY et al, 2015; ABLIZ et al, 2015; HE et al, 2016; ALSHATWI et

al, 2016;; NAYAK et al, 2016) (FIGURA 1 e FIGURA 2). Esse câncer foi

responsável pelo óbito de 265 mil mulheres em 2012 em todo o mundo e mais

de 85% desses casos e mortes ocorreram em países em desenvolvimento

(LIU, YANG, ZENG, 2015; INCA, 2016).

Figura 1. Incidência de câncer cervical em todo o mundo no ano de 2012. Fonte: Globocan 2012.

20

No Brasil, estima-se que o câncer do colo do útero seja a terceira

neoplasia maligna mais comum entre as mulheres, sendo superado apenas

pelos cânceres de mama e de cólon e reto. São esperados, para o ano de

2016, 16.340 casos novos de câncer do colo do útero, com um risco estimado

de 15,85 casos a cada 100 mil mulheres (Figura 3). Sem considerar os

tumores de pele não melanoma, o câncer do colo do útero é o primeiro mais

incidente na Região Norte (23,97/100 mil). Nas Regiões Centro-Oeste

(20,72/100 mil) e Nordeste (19,49/100 mil), ocupa a segunda posição; na

Região Sudeste (11,30/100 mil), a terceira; e, na Região Sul (15,17 /100 mil), a

quarta posição (INCA, 2016).

Figura 2. Mortalidade por câncer cervical em todo o mundo no ano de 2012. Fonte: Globocan 2012.

Figura 3. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2016, exceto pele não melanoma. Adaptado de:

INCA, 2016.

21

Estudos epidemiológicos e moleculares têm mostrado que o

Papilomavírus Humano (HPV) é o principal fator etiológico para o câncer de

colo do útero (ZUR HAUSEN, 2002; SASAGAWA, TAKAGI, MAKINODA, 2012;

GODÍNEZ et al., 2013; INCA, 2016).

Os primeiros experimentos tentando estabelecer uma associação entre

infecção pelo HPV e o câncer cervical tiveram início no ano de 1972 com Zur

Hausen e colaboradores, quando relatos na literatura de uma rara conversão

de verrugas genitais (condiloma acuminado – lesão benigna) em carcinomas

de células escamosas levantaram a hipótese de que o câncer cervical poderia

se originar de infecções com o vírus encontrado nos condilomas acuminados

(ZUR HAUSEN, 1977; SILVA et al., 2011). Em seguida, a identificação de

alterações citopáticas nas células epiteliais (TINDLE, 2002) causadas pela

infecção por HPV, e o isolamento dos HPV 6 e 11 em verrugas genitais (KIM,

K.; KIM, Y, 1995) e papilomas laríngeos (MUÑOZ et al., 2003; GONÇALVES et

al., 2004), trouxeram novos dados que corroboravam com a participação do

HPV na transformação celular. Em 1983, Gissmann e colaboradores

detectaram o DNA do HPV 11 em apenas uma das 24 biópsias de carcinomas

cervicais. No mesmo ano, Durst e colaboradores conseguiram isolar um novo

tipo de HPV de biópsias cervicais, o HPV 16, e pouco tempo depois isolaram e

parcialmente caracterizaram o DNA do HPV 18 de biópsias cervicais assim

como de várias linhagens celulares, dentre elas as células HeLa. No ano de

1995, o trabalho de Bosch e colaboradores (1995) teve uma contribuição

fundamental para o entendimento da etiologia do câncer cervical. Avaliando

mais de mil amostras de pacientes com carcinomas cervicais invasores, os

autores verificaram a presença do HPV em mais de 95% dos tumores.

Com base em dados epidemiológicos e evidências moleculares trazidas

por esses estudos e por outros através dos anos, a agência internacional de

pesquisa do câncer (Agency for Researchon Cancer) reconheceu os HPV de

alto risco 16 e 18 como sendo carcinogênicos em humanos (FARIDI et al.,

2011).

Em 2008, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que dos 12,7

milhões de casos novos de câncer naquele ano, 610 mil estavam relacionados

com HPV, sendo 530 mil casos de carcinoma cervical (FORMAN et al., 2012).

22

Mais recentemente, um estudo que avaliou infecção por HPV em 10.575

casos de câncer invasivo histologicamente confirmados de 38 países na Ásia,

Europa, América Latina e no Caribe, América do Norte, Oceania e África

Subsaariana descobriu que 85% (N = 8.977) dos casos foram positivos para o

HPV (de SAN JOSE et al, 2010).

Os papilomavírus humano (HPV) de alto risco como o HPV 16, 18, 31 e

33 foram atribuídos serem os principais fatores de risco para o câncer do colo

do útero, dos quais os HPV-16 e -18 são os mais frequentes, sendo

responsáveis por quase 70% dos casos (ROA et al, 2009; CHOUDARI et al,

2013). O risco relativo de câncer cervical associado à infecção persistente por

tipos de HPV de alto risco é maior do que o risco de câncer de pulmão

associado com o tabagismo (GELBAND et al, 2015).

Contudo, a infecção pelo HPV, por si só, não representa uma causa

suficiente para o surgimento dessa neoplasia. A associação com outros fatores

de risco, como o tabagismo, imunossupressão (pelo vírus da imunodeficiência

humana - HIV ou outras causas), história sexual ativa, multiparidade e

contraceptivo oral, além dos fatores genéticos, influencia no surgimento desse

câncer (SONG, D. et al., 2015; INCA, 2016).

1.3 Papilomavírus humano (HPV)

O HPV, pertencente à família Papillomarividae, é um vírus pequeno (52-

55 nm), de DNA circular de fita dupla, com aproximadamente 8000 pb

(FIGURA 4), e que apresenta tropismo por células epiteliais (SILVA et al.,

2011; KOVANDA et al., 2011). O capsídeo é icosaédrico e composto de duas

proteínas estruturais (L1 e L2) que se organizam em 72 capsômeros e não é

revestido por envelope lipídico (ZUR HAUSEN, 2002; BUCK et al., 2008).

Funcionalmente, o genoma do HPV pode ser dividido em região precoce

(E - Early), região tardia (L - Late) e região reguladora (URR – upstream

regulatory region ou LCR - long control region) (ZUR HAUSEN, 2002;

STANLEY, 2010; FUKASAWA, 2012).

23

A região E codifica os genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7, os quais estão

envolvidos no processo de replicação viral e transformação celular. E1 e E2

têm relação com a replicação viral e transcrição precoce, E4 com a maturação

viral e alteração da matriz extracelular e E5, E6 e E7 estão envolvidos no

processo de imortalização, instabilidade genômica e transformação celular

(ZUR HAUSEN, 2002; ROSA et al., 2009; TOMMASINO, 2014).

A região tardia (L) codifica os genes L1 e L2 relacionados à formação e

maturação do capsídeo viral e possuem sequência gênica altamente

conservada entre todos os tipos de HPV, a qual responde por sua

antigenicidade (FARIDI et al., 2011; TOMMASINO, 2014). A proteína L1 é a

principal proteína do capsídeo e representa cerca de 80% do total de proteínas

virais; a L2 é importante no processo de empacotamento seletivo do DNA viral

e aumenta a infectividade do vírion (FEHRMANN; LAIMINS, 2003).

A região não codificadora denominada URR ou LCR está localizada

entre os genes L1 e o início da região E6. Esta região contém sequências

estimuladoras e repressoras da transcrição viral, além da sequência de origem

de replicação, reguladores da expressão e replicação gênicas e do

Figura 4. Organização genômica do HPV 16. Fonte: EGAWA, 2015

24

empacotamento de partículas virais (CHEAH; LOOI, 1998; BURD, 2003; ROSA

et al., 2009; FUKASAWA, 2012).

Baseando-se na sequência de seus nucleotídeos, cerca de 201 tipos de

HPV foram completamente sequenciados até então (KOCJAN et al, 2015).

Estes HPV são classificados em alto ou baixo risco, de acordo com o potencial

oncogênico, ou seja, conforme sua capacidade em induzir a transformação

neoplásica (MUÑOZ et al., 2003). Dentre os HPV de alto risco são encontrados

os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66, 68, sendo os tipos 16 e

18 os mais frequentes em neoplasias malignas de colo uterino (70% dos casos)

(OZSARAN et al., 1999; ALCAMI; KOSZINOWSKI, 2000; TOMMASINO, 2014).

Dentre os diferentes tipos de HPV, são considerados os de baixo risco os tipos

6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, sendo os 6 e 11 os mais prevalentes

(TOMMASINO, 2014).

O ciclo de vida do HPV está intimamente ligado ao programa de

diferenciação das células epiteliais infectadas (BODILY; LAIMINS, 2011;

FUKASAWA, 2012) e sua progressão depende ainda de outros fatores, tais

como: o tipo de HPV e a imunidade do hospedeiro (FRAZER, 2004).

A infecção se inicia quando os vírions ganham acesso às células da

camada basal do epitélio, provavelmente em decorrência da abrasão e micro-

lesões da pele ou mucosa (FIGURA 5). Quando as células basais se dividem,

uma célula filha torna-se uma nova célula basal, enquanto que as outras

migram para longe da camada basal e iniciam a diferenciação (BODILY;

LAIMINS, 2011; FUKASAWA, 2012). O genoma viral é mantido nestas células

como um epissoma estável e num baixo número de cópias. São estas células

infectadas que formam o reservatório para o desenvolvimento de verrugas

produtivas planas ou acuminadas, as quais são as principais manifestações

clínicas e que ocorrem algumas semanas após a infecção dos epitélios de

diferentes localizações anatômicas (GRM; BERGANT; BANKS, 2009; FARIDI

et al., 2011).

Na camada proliferativa, o vírus pode se replicar e expressar suas

proteínas precoces (ROSA et al., 2009). Dentre as primeiras proteínas virais

estão os fatores de replicação E1 e E2. A replicação dos genomas virais ocorre

em células diferenciadas, caracterizando a fase produtiva do ciclo celular viral e

que depende de síntese de DNA celular. Isto é assegurado pela expressão das

25

proteínas precoces E6 e E7 que, através da interferência do ciclo celular,

mantêm as células diferenciadas do epitélio em fase S, permitindo a

amplificação do genoma viral. A transcrição de outros genes virais, incluindo a

formação do capsídeo ocasionada pela transcrição dos genes tardios L1 e L2,

ocorrem nas camadas mais superiores do epitélio (KOVANDA et al., 2011).

Após atingirem sua maturação final, as partículas virais são liberadas nas

camadas mais superiores do epitélio, podendo assim, infectar outros tecidos

(MOODY; LAIMINS, 2010; FARIDI et al., 2011).

Figura 5. Ciclo de vida do HPV no epitélio. Adaptado de: Frazer, 2004).

26

1.4 HPV e Câncer cervical

A infecção persistente por um HPV de alto risco oncogênico é

necessária para o desenvolvimento de câncer cervical. A maioria das mulheres

infectadas pelo HPV, cerca de 90%, irá obter a eliminação viral

espontaneamente, através de mecanismos imunológicos (MOSCICKI et al.,

2006). Portanto, apenas uma pequena porcentagem das mulheres infectadas

pelo HPV irá permanecer persistentemente infectada, e estarão sob risco de

desenvolver o câncer cervical (ZUR HAUSEN, 2002).

A infecção pelo HPV pode progredir para a malignidade de duas formas.

Primeiro, ao HPV penetrar nas células basais do epitélio escamoso, poderá

ocorrer dois ciclos de vida: vegetativo e integrado. O vegetativo está mais

relacionado com as verrugas benignas, como discutido anteriormente. Já o

integrado ocorre com a persistência da infecção pelo HPV e está intimamente

ligado ao desenvolvimento do câncer cervical (FIGURA 6a). Quando o DNA

viral se integra ao genoma do hospedeiro, ocorre uma expressão aumentada

das oncoproteínas E6 e E7, resultando em proliferação descontrolada,

imortalização e transformação celular. Por fim, pode ocorrer completa perda do

controle da polaridade celular e, consequentemente, invasão e metástase. Este

tipo de câncer, o carcinoma cervical, está mais frequentemente associado ao

HPV16 (BANKS, PIM, THOMAS, 2012).

A segunda maneira de progressão da infecção à malignidade é através

da infecção das células cuboides embrionárias pelo HPV (FIGURA 6b). Estas

células não são permissivas à infecção viral e podem abrigar vírus por longos

períodos, permitindo a iniciação dos eventos que, finalmente, darão origem a

malignidade. Estas células ocupam a zona de transformação cervical em que a

replicação viral pode iniciar ou, alternativamente, progredir para o

desenvolvimento da malignidade. Além disso, estas células cubóides também

dão origem a células que formam a endocérvice, onde também podem surgir

tumores malignos (adenocarcinoma), e, neste caso, estes tipos de tumores são

muitas vezes associados com a infecção pelo HPV-18 (BANKS, PIM,

THOMAS, 2012).

27

O potencial oncogênico dos HPVs envolve principalmente três genes

precoces: E2, E6 e E7, sendo que o primeiro regula a transcricão dos outros

dois. As proteínas E6 e E7 de HPVs de alto risco são as principais proteínas

virais transformantes e a proteína E5 de HPVs de alto risco aumenta a

proliferação celular, podendo contribuir com a progressão do câncer (MOODY;

LAIMINS, 2010; McLAUGHLIN-DRUBIN; MUNGER, 2013). Quando ocorre a

integração do vírus no genoma humano, o gene E2 torna-se inativo, o que

determina aumento da transcrição dos genes E6 e E7. As proteínas E6 e E7

assim sintetizadas promovem a inativação de genes supressores de tumores,

respectivamente os genes p53 e pRB. A capacidade de E6 e E7 de inibir

reguladores cruciais de proliferação, apoptose, imortalização e estabilidade

genômica promove o surgimento de uma população clonal de células com uma

vantagem de crescimento e uma maior propensão para a transformação e

progressão maligna (FIGURA 7) (MOODY; LAIMINS, 2010; STANLEY, 2010).

Figura 6. Modelo prevalente de como a infecção pelo HPV pode progredir para a malignidade. a) Epitélio escamoso; b) Zona de transformação.

Adaptado de: BANKS, PIM, THOMAS, 2012.

28

A principal atividade de E7 está associada à sua ligação com a proteína

do retinoblastoma (Rb), um regulador negativo do ciclo celular que

normalmente impede a progressão da fase G1 para a S por se associar ao

fator de transcrição E2F. Ao se ligar a E7, pRb é degradada liberando E2F, a

qual estimulará a transcrição de genes alvos associados a replicação do DNA,

resultando na proliferação celular desordenada (ZUR HAUSEN, 2000; SILVA et

al., 2011; FUKASAWA, 2012). Ainda, a dissociação do complexo E2F/pRb

ocasionado por E7 estimula a expressão de ciclina-E, a qual é necessária para

progressão do ciclo celular de G1 para fase S (NOYA et al., 2001).

A proteína viral E6 completa o papel de E7, prevenindo a apoptose

celular em resposta a entrada não programada na fase S induzida por E7

(DOOBAR, 2005). A associação de E6, dos tipos de HPV de alto risco, com a

proteína p53 da célula hospedeira, resulta na sua degradação, comprometendo

a interrupção do crescimento celular e a ativação da apoptose induzida por

danos no DNA genômico. A perda do controle do ciclo celular mediado por p53

favorece a instabilidade cromossômica e acúmulo de mutações na célula

infectada (ZUR HAUSEN, 1996; DOORBAR, 2005; SILVA et al., 2011;

Figura 7. Mecanismos moleculares pelos quais as oncoproteínas do HPV cooperam para induzir a carcinogênese cervical. Adaptado de: MOODY; LAIMINS, 2010.

29

FUKASAWA, 2012). Além disso, E6 estimula o crescimento celular através da

degradação das quinases da família src, favorecendo o processo de

carcinogênese (HEARD et al., 2000).

A proteína E5 de HPV de alto risco coopera com E6 e E7 na promoção

da hiperproliferação de células infectadas e isto facilita a progressão ao câncer

(DIMAIO; MATTOON, 2001). Mais ainda, as proteínas precoces E2, E6, E7 e

E5 controlam tanto os sinais intrínsicos quanto extrínsicos da apoptose

tornando a célula refratária a este importante mecanismo de eliminação viral e,

em consequência, mantendo a célula transformada e promovendo a

progressão tumoral (YUAN et al., 2012).

Assim, as proteínas codificadas pelos vírus HPV oncogênicos induzem a

transformação celular através da interação com inúmeras moléculas dentro da

célula hospedeira, inclusive alterando a expressão de genes, interferindo com

processos como controle do ciclo celular, sinalização celular, expressão gênica

e resposta apoptótica (RITCHIE et al., 2003).

1.5 Morte celular – Apoptose e Necrose

O desequilíbrio entre o crescimento e a morte celular ocasiona o

desenvolvimento do câncer, e tem se tornado evidente que as células

neoplásicas escapam da morte celular por falha nos mecanismos de apoptose

(STANLEY, 2003). As células tumorais geralmente possuem uma série de

modificações genéticas que impedem o processo de apoptose, colaborando

para o crescimento celular aberrante, o desenvolvimento da neoplasia maligna

e, posteriormente, sua capacidade de invasão (HAJRA e LIU, 2004; PINTO,

2010). Ainda, tem-se tornado claro que certos vírus possuem estratégias para

driblar a apoptose, como é o caso do HPV através de suas oncoproteínas E6 e

E7, e tendem a estar associados com a tumorogênese (LOWE e LIN, 2000;

CHOUDARI et al, 2013

A apoptose é uma forma de morte celular que ocorre durante várias

situações normais e patológicas em organismos e contribui para a substituição

de células, a remodelação do tecido e remoção das células danificadas em

condições normais (WANG; LIU; CUI, 2005; GOMES, 2012; GALLUZI et al,

2012). Porém, o bloqueio da morte celular programada (apoptose) contribui

30

para o crescimento de tumores, promove progressão neoplásica e resistência a

agentes antitumorais (BEDI et al, 1995).

As células em processo de apoptose apresentam características

morfológicas distintas das características observadas na morte celular por

necrose. Atualmente, sabe-se que a morte celular programada é caracterizada

pela fragmentação e reabsorção orquestrada da célula que inclui a degradação

de proteínas do citoesqueleto e do núcleo, a retração celular, a condensação

da cromatina, levando ao aparecimento do núcleo picnótico, fragmentação

nuclear e formação dos corpos apoptóticos, os quais são rapidamente

fagocitados pelos macrófagos e removidos sem causar processo inflamatório

(FIGURA 8) (SARASTE; PULKKI, 2000; CONRADT, 2009; GALLUZZI, 2015;

RELLO-VARONA et al., 2015). Já o processo de necrose é definido como uma

forma violenta de morte celular iniciada por estímulos ambientais que resultam

em rápida desregulação da homeostasia, ocorrendo o intumescimento celular,

rompimento de organelas, ruptura da membrana plasmática, liberação de

componentes intracelulares e, consequentemente, resposta inflamatória

intensa. Não há evidência de remodelamento de cromatina durante a necrose

(BRAS; QUEENAN; SUSIN, 2005; GIOCONDO, 2007).

São descritas duas vias clássicas de ativação do fenômeno de apoptose:

a via extrínseca (mediada pela interação ligante-receptor) e a intrínseca

(mediada pela via mitocondrial). Na via extrínseca, a interação dos receptores

de morte aos seus respectivos ligantes tais como o fator de necrose tumoral -

TNF, ligante FAS/ (CD95L) e TRAIL leva a trimerização destes receptores e

recrutamento de proteínas adaptadoras ao domínio de morte citosólico (DD).

Posteriormente, as proteínas ativam a caspase-8 e/ou 10, formando um

complexo que irá ativar as caspases efetoras, principalmente a caspase-3. Já a

via intrínseca, ou mitocondrial, é ativada por dano intracelular (Ex.: Estresse

oxidativo ou dano ao DNA) ou ativação de genes supressores de tumor. Os

sinais de morte são transmitidos para a mitocôndria através de proteínas pró-

apoptóticas da família Bcl-2 que se ligam à membrana mitocondrial, criando

poros de permeabilidade mitocondriais e, consequentemente, perda do

potencial de membrana interna (_ψ) e depleção da produção de ATP. Isso

resultará em liberação de proteínas pró-apoptóticas como o citocromo c.

Quando o citocromo c é liberado no citosol é desencadeada uma via apoptótica

31

dependente de caspase, onde o citocromo c ativa Apaf-1 e, por sua vez, liga-se

à prócaspase 9, formando o apoptossoma. Após esta associação, a caspase-9

ativa as caspases-3, -6 e -7, permitindo a fragmentação de DNA (KROEMER,

2007; YUAN; FILIPPOVA DUERKSEN-HUGHES, 2014).

Outras alterações envolvidas com a apoptose incluem modificação da

disposição das fosfatidilserinas (PS) da membrana plasmática. As

fosfatidilserinas normalmente estão dispostas no folheto interno da membrana

plasmática, porém durante o processo de apoptose estes componentes são

expostos no exterior das células. Assim, estes fosfolípides são importantes

para o processo de reconhecimento e fagocitose das células em apoptose

pelos macrófagos, precedendo a perda da integridade de membrana e

Figura 8. Ilustração gráfica das características morfológicas dos mecanismos de morte celular por apoptos e necrose. Fonte: Adaptado de

RELLO-VARONA et al., 2015.

32

alterações nucleares que definem a apoptose, sendo utilizados como

marcadores específicos em fases precoces do processo de apoptose

(SCHLEGEL; WILLIAMSON, 2001; PINTO, 2010).

A translocação da PS para a superfície da bicamada lipídica faz com que

esta fique exposta a marcadores celulares, como a anexina V, que é uma

proteína que tem alta afinidade de ligação a fosfolipídeos de membrana,

especialmente à PS, ligando-se através das suas cargas negativas na

presença de íons cálcio. A taxa de associação e dissociação sugere que a

anexina V não penetra na membrana, comportando-se como uma proteína

extrínseca. Assim, a translocação da PS e a ligação da anexina V é uma forte

evidência de apoptose inicial. Ao conjugar a anexina V ao FITC é possível

identificar e quantificar as células apoptóticas por citometria de fluxo. Isso é

possível através da avaliação dos níveis de PS expostas na membrana externa

que se associaram à anexina V, indicando fase inicial de apoptose (precoce).

Já o marcador nuclear fluorescente PI, quando associado à anexina V, pode

mensurar células com permeabilidade de membrana, o que indica células

apoptóticas tardias ou necróticas (PEC et al, 2003; MOSS; MORGAN, 2004;

BOERSMA et al., 2005; STURM et al., 2006; GARCIA, 2014).

O processo final da apoptose é caracterizado por dois fenômenos

nucleares distintos: condensação da cromatina e fragmentação do DNA. A

condensação da cromatina é um dos mais importantes critérios para

identificação do processo de apoptose (OBERHAMMER et al, 1994). Ambos os

fenômenos podem ser avaliados através de ensaio de fluorescência com 4’-6-

Diamidino-2-phenylindole (DAPI), no qual o DAPI atravessa a membrana

celular intacta e se liga ao DNA de fita dupla, formando compostos

fluorescentes que são observados em microscópio de fluorescência.

Substâncias que possam modular o fenômeno de apoptose têm

potencial de alterar a progressão natural de doenças como o câncer, infecções

virais, doenças autoimunes e doenças neurodegenerativas. A maioria das

substâncias quimioterápicas em uso clínico induz apoptose das células

malignas, sendo a avaliação desses parâmetros apoptóticos de grande

relevância para desenvolvimento de fármacos para o câncer (PINTO, 2010).

33

1.6 Ciclo celular

Outro mecanismo regulador que está associado com a evolução de

células malignas ocorre na divisão celular. Por essa razão, o entendimento do

ciclo celular e suas relações com a etiologia do câncer é de extra importância

(HAHN; WEINBERG, 2002).

As fases do ciclo celular são divididas em quatro fases principais: fase

G1, onde ocorre a preparação para a replicação do material genético; fase S,

na qual ocorre a replicação do DNA, ocupando em torno da metade do tempo

de divisão de uma célula de mamífero (10-12 horas); fase G2, com a

preparação para a citocinese e fase M (mitose), que por sua vez é subdivida

em prófase, metáfase, anáfase e telófase, resultando na divisão mitótica com a

formação de duas células-filhas (LUKAS, LUKAS e BARTEK, 2004; RABELO,

2015).

Sabe-se que durante o ciclo celular existem pontos de checagem (ou

checkpoints), que monitoram os eventos para garantir que a divisão ocorra

corretamente. Estes pontos estão localizados na fase G1 (entre a fase M e a

fase S), que verifica se os sinais externos estão favoráveis à progressão do

ciclo; na fase G2 (entre a fase S e a fase M), que checa se a replicação do

DNA está completa e se ocorreu corretamente, para que possa prosseguir; e

na fase M, também conhecido como o ponto de verificação de montagem do

fuso mitótico, que é o principal mecanismo de controle do ciclo celular na

mitose, pois garante a segregação cromossômica correta para as células-filhas

(WEAVER; CLEVELAND, 2005; RABELO, 2015).

Quando as condições externas são desfavoráveis ou quando a célula

precisa reparar algum erro, o que ocasionalmente ocorre (como danos no DNA,

alterações de bases, não disjunção mitótica, entre outras), os pontos de

checagem detectam o erro e proporcionam o tempo necessário para que a

célula o corrija e tenha condições de retornar ao processo de divisão. Caso os

danos sejam irreparáveis, a célula entra em processo apoptótico, eliminando,

assim, a chance de propagação do erro (LUKAS, LUKAS E BARTEK, 2004;

RABELO, 2015).

Dois fatores importantes que controlam negativamente a progressão do

ciclo celular são a p53 e a pRb. Enquanto aquela promove a transcrição dos

34

genes que induzem a retenção do ciclo celular (especialmente p21) ou a

apoptose em resposta a danos no DNA ou a outros estresses celulares, a pRb

se liga à E2F durante a fase G1 do ciclo celular, bloqueando a transcrição de

genes da fase S. Na infecção pelo HPV, as oncoproteínas E6 e E7 inibem,

respectivamente, p53 e pRb, levando ao desenvolvimento do câncer cervical

(WIERINGA et al, 2015).

A progressão desregulada do ciclo celular tem sido considerada como

das principais causas do aparecimento de câncer e, por isso, é relevante o

desenvolvimento de pesquisas que busquem produtos antineoplásicos que

possam atuar no ciclo celular “contornando” essa proliferação desregulada das

células.

1.7 Terapias convencionais para o tratamento do câncer

Os tratamentos disponíveis e comumente utilizados para o câncer são a

radioterapia, a quimioterapia e a remoção cirúrgica do tumor. A combinação

dessas técnicas é necessária na maioria dos casos. Os agentes

antineoplásicos mais empregados incluem os alquilantes polifuncionais como a

cisplatina; os antimetabólitos como 5-fluoruracil e o metotrexato; os antibióticos

antitumorais e os inibidores mitóticos como a vincristina, vimblastina e o

etoposídeo e outros agentes não agrupados em uma classe farmacológica

específica (CARVALHO, 2013; INCA, 2016).

Modalidades atuais de tratamento do câncer utilizam diferentes agentes

para bloquear etapas importantes envolvidas na divisão celular, assim como

etapas específicas de vias moleculares que são vitais para a sobrevivência das

células cancerosas. Entretanto, a eficácia desses agentes é limitada,

especialmente em estágios avançados da doença, e podem facilmente causar

efeitos adversos como náuseas, vômitos, alopecia, inibição da resposta

imunológica, mielossupressão, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e

cardiotoxicidade. Além disso, células neoplásicas podem adquirir resistência a

múltiplas drogas (MDR: multidrug resistance) e isso tem sido a maior causa de

falha no tratamento do câncer (NETO et al, 1975; CHOUDHARI;

SURYAVANSHI; KAUL-GHANEKAR, 2013; CARVALHO, 2013; PENG et al,

2015; YE et al, 2015; BADMUS et al, 2015; BIZZARRI et al, 2016)

35

O prognóstico dos pacientes com câncer cervical avançado/ recorrente é

particularmente pobre e sua chance de sobrevivência de 1 ano é de apenas

10%-20%. A sobrevida global mediana das pacientes recebendo cisplatina e

paclitaxel, regime quimioterápico padrão para câncer cervical em estágios

avançados, é de apenas 12,87 meses. E a eficácia da cisplatina ainda pode ser

comprometida em casos de resistência à essa droga, tanto intrínseca quanto

adquirida. Os mecanismos moleculares relacionados com a resistência à

cisplatina são complexos e geralmente associados com as seguintes

características: 1) redução da acumulação intracelular dos compostos de

platina; 2) aumento no reparo do dano ao DNA; 3) inativação da apoptose; 4) a

ativação da transição epitélio-mesenquimal (EMT); 5) alteração na metilação do

DNA, o perfil de microRNA, características das stem cells cancerígenas e a

expressão de chaperonas em resposta ao estresse (ZHU et al, 2016).

Portanto, a descoberta de novas substâncias citotóxicas e pró-

apoptóticas altamente seletivas para minimizar os efeitos adversos têm sido o

principal foco das pesquisas. (FESIK, 2005; FISCHER & SCHULZE-OSTHOFF,

2005; FERRAZ, et al, 2009; PINTO, 2010).

Neste contexto, vários estudos ao longo dos anos têm sugerido o

potencial de plantas medicinais como candidatas a drogas antitumorais,

principalmente aquelas capazes de inibir proliferação celular e induzir apoptose

(JIANG et al, 2005; ARUOMA et al, 2006; ZHANG, H. et al, 2007; PANDEY;

MADHURI, 2009).

1.8 Importância da fitoterapia no contexto do câncer

A literatura indica que muitos produtos naturais estão disponíveis como

agentes quimioterápicos contra o câncer. Desde aproximadamente 1500 a.C.,

plantas e seus extratos têm sido reconhecidos como tendo atividade

anticâncer, entretanto o estudo racional e organizado de agentes

anticancerígenos se iniciou na década de 1950, quando se associou, pela

primeira vez, a atividade antitumoral a constituintes puros originados de

plantas. Nesse período, foi feita a descoberta dos alcaloides da vinca

(vincristina, vimblastina e vindesina) a partir da planta Catharantus roseus

(Apocynaceae), os quais são utilizados até hoje no tratamento de leucemias,

36

linfomas, câncer testicular avançado, mama e pulmão (JOHNSON et al, 1963;

BALUNAS; KINGHORN, 2005; MARTINS, 2009). Como resultado, o Instituto

Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI) iniciou, em 1960, um extensivo

programa de coleção de plantas focado principalmente nas regiões

temperadas. Isso levou a descoberta de outros quimioterápicos, incluindo os

terpenos (taxanos) e camptotecinas. Dentre estes, um composto denominado

paclitaxel (Taxol®), um triterpeno poliidroxilado, foi isolado da planta Taxus

brevifolia (Taxaceae) em 1971. Este composto tornou-se um medicamento na

década de 90 e vem sendo utilizado no tratamento de câncer de mama, ovário,

pulmão e sarcoma de Kaposi (CRAGG; NEWMAN, 2005; BISCARO, 2011).

O contínuo desenvolvimento de terapias inovadoras para o tratamento

do câncer é imprescindível, devido ao restrito arsenal terapêutico, crescente

registro de novos casos e reações adversas causados pelos quimioterápicos

utilizados atualmente. Na busca por terapias, a descoberta e desenvolvimento

de medicamentos e novos protótipos de fármacos a partir de extratos vegetais

ainda são considerados pouco explorados. Atualmente, estima-se que das 300

mil espécies de plantas no mundo, apenas 15% delas tenham sido submetidas

a algum estudo científico para avaliar suas potencialidades na preparação de

novos produtos (NOGUEIRA; CERQUEIRA; SOARES, 2010).

Os produtos naturais possuem um papel altamente significativo no

descobrimento de novas entidades químicas. Especificamente no caso de

doenças infecciosas negligenciáveis e no câncer, estima-se que mais de 75 e

60%, respectivamente, dos fármacos atualmente empregados são derivados de

fontes naturais. No geral, foi estimado que mais de um terço dos fármacos

atualmente comercializados estão relacionadas a produtos naturais e os

princípios ativos provêm de uma ampla variedade de fontes naturais, incluindo:

vegetais, os produtos marinhos e microrganismos (NOGUEIRA; CERQUEIRA;

SOARES, 2010; GOMES et al, 2015).

Considerando a diversidade vegetal do Brasil e a pequena porcentagem

de espécies de plantas investigada tanto do ponto de vista fitoquímico, como

farmacológico e toxicológico, o reino vegetal apresenta um enorme reservatório

de moléculas farmacologicamente ativas a serem descobertas (POTTERAT et

al., 1995; NOGUEIRA; CERQUEIRA; SOARES, 2010). Na cobertura vegetal

das áreas do Nordeste do Brasil, a Caatinga representa cerca de 800 mil km2,

37

o que corresponde a 70% do território dessa região. A Caatinga é o único

bioma exclusivamente brasileiro, ocupa 11% do território nacional e abriga

fauna e flora únicas, onde já foram identificadas cerca de 1.500 espécies

vegetais, embora se estima que possa chegar a 3.000 espécies (PRADO,

2003; ZAPI, 2008).

Dentre as famílias vegetais de ocorrência neste bioma que possam

apresentar potencial terapêutico no contexto do câncer, se destaca a família

Euphorbiaceae, uma vez que a família produz alcaloides e terpenos,

metabólitos secundários tradicionalmente reconhecidos como agentes

citototóxicos. Dentre o cenário da biodiversidade, os produtos naturais com

atividade farmacológica como os alcaloides ocupam lugar de destaque. Ao final

do século XX, dos 119 produtos naturais bioativos utilizados como entidades

medicinais, 54 eram alcalóides (FARNSWORTH, 1985).

1.9 O gênero Croton

Croton, um dos maiores gêneros da família Euphorbiaceae, é constituído

por aproximadamente 1300 espécies distribuídas nas regiões tropicais e

subtropicais em todo o mundo. Compreendem plantas de hábitos heterogêneos

que vão desde árvores, arbustos, subarbustos, ervas e trepadeiras (WILSON;

NEUBERT; HUFFMAN, 1976; RADULOVIC et al., 2006). Com cerca de 350

espécies, o Brasil é um dos principais centros de diversidade do gênero, que

está representado nos mais variados ambientes e tipos vegetacionais (BERRY

et al., 2005; SILVA et al, 2010). Espécies desse gênero são freqüentemente

utilizadas na medicina popular (na forma de infusões, chás e emplastos) para

tratamento de câncer, aliviar dor (ABREU et al., 2001), constipação intestinal,

diarréia e outros problemas digestivos, diabetes, feridas, inflamação, febre e

hipertensão (SALATINO, SALATINO & NEGRI, 2007; LIU, C., 2014).

Estudos fitoquímicos realizados com algumas espécies de Croton de

ocorrência brasileira relatam o isolamento de 109 compostos, dentre eles

diterpenos (35,6%), alcalóides (24,8%), flavonoides (12,8%) e triterpenos

(11%), exibindo amplo espectro de atividades biológicas, tais como

antimicobacteriana (MELO et al, 2013), antifúngica (THONGTAN, 2003),

38

antiplasmódica (ATHIKOMKULCHAI et al, 2006), antiviral (LANGAT et al,

2011), anti-inflamatória (WANG, G. et al, 2012) e citotóxica (KUO et al, 2007;

LIU et al, 2014; ZHANG, X. et al, 2013).

1.10 Croton blanchetianus Baill

Dentre as espécies do gênero Croton, a Croton blanchetianus Baill

(sinônimo Croton sonderianus Müll. Arg.), conhecida como marmeleiro preto, é

um arbusto exclusivamente brasileiro e difundido largamente no nordeste do

Brasil (Alagoas, Bahia, Ceará, Minas Gerais, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio

Grande do Norte e Sergipe), ocorrendo em vegetação de cerrado e Caatinga

(GOMES, 2006). As folhas e cascas são usadas na medicina popular para o

tratamento de distúrbios gastrintestinais, reumatismo, cefaleia, inchaço,

hemorragia uterina, hemoptise, vômitos e diarréia (CHAVES; REINHARD,

2003).

Croton blanchetianus apresenta-se como um arbusto de porte variável

com até 6 m de altura, ramoso, com folhas simples, elítico-ovaladas, pilosas,

com aroma que lembra o óleo de pinho, providas de estípulas grandes,

especialmente nos ramos jovens (FIGURA 9). As flores são pequenas,

esbranquiçadas, em espigas terminais. O fruto apresenta cápsula de

deiscência explosiva, com sementes oleaginosas e brilhantes (SANTANA,

2009).

Figura 9. Croton blanchetianus. Fonte: ANGÉLICO,

2011.

39

Até o momento, as únicas atividades biológicas descritas na literatura

para a Croton blanchetianus foram o efeito antinociceptivo, anti-inflamatório,

gastroprotetor e antimicrobiano do óleo essencial obtido das folhas (SANTOS,

2005). No entanto, sabe-se que essa planta é rica em diterpenos, os quais

apresentam atividades biológicas diversificadas (McCHESNEY; CLARK;

SILVEIRA, 1991).

Vários estudos têm evidenciado a atividade citotóxica dos terpenos.

Sousa et al (2015) isolaram um diterpeno da raiz da espécie Croton limae, o

qual apresentou efeito citotóxico contra linhagens celulares de adenocarcinoma

de colorretal e carcinoma ovariano. Um outro estudo avaliou a atividade

citotóxica de Croton caudatus var. tomentosus, a qual exibiu atividade inibitória

contra HeLa, Hep G2 (carcinoma de fígado humano), MDA-MB-231

(adenocarcinoma metastático de mama humano) e A549 (adenocarcinoma

pulmonar humano) (SONG, J. et al, 2015).

Recentemente, o grupo de pesquisa do Laboratório de Produtos

Naturais Bioativos (PNBio) do Departamento de Farmácia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), chefiado pela Profa. Dra. Raquel

Giordani Brandt, isolou alcaloides isoquinolínicos das folhas, caule e raiz da

Croton blanchetianus. A literatura que demonstra a importância dessas

moléculas como agentes citotóxicos é vasta e permanente há décadas. Por

exemplo, em 1969, Warthen, Gooden e Jacobson verificaram atividade

inibitória do crescimento de células de carcinoma humano de nasofaringe pela

liriodenina, um alcaloide isoquinolínico. Posteriormente, Sonnet e Jacobson

(1971) isolaram diversos outros alcaloides isoquinolínicos que apresentaram

atividade citotóxica e antitumoral. Mais recentemente, outros alcaloides

isoquinolínicos como coritencina e isocoreximina demonstraram atividade

citotóxica em linhagens de culturas de células tumorais (MARTINEZ-VASQUEZ

et al., 2005).

Considerando esses aspectos, torna-se relevante a investigação da

espécie C. blanchetianus quanto ao potencial citotóxico e pró-apoptótico, visto

o espaço e a importância que os produtos naturais ocupam na indústria

farmacêutica, seja pela sua própria natureza ou como fonte inspiradora de

novos padrões moleculares bioativos para o tratamento de diversas

enfermidades.

40

2 OBJETIVOS

2.1- Objetivo geral:

Avaliar as atividades citotóxica e pró-apoptótica, in vitro, da espécie

Croton blanchetianus Baill em linhagens celulares de câncer cervical humano

(HeLa e SiHa).

2.2- Objetivos específicos:

- Obter frações das folhas e raiz da Croton blanchetianus a partir do extrato

bruto, através da extração por variação de pH;

- Caracterizar fitoquimicamente as frações obtidas a partir das folhas e raiz da

CB por cromatografia em camada delgada;

- Avaliar a atividade citotóxica das frações frente às células em estudo (HeLa,

SiHa e MRC5) pelo método colorimétrico do MTT;

- Observar alterações morfológicas nas linhagens celulares de câncer cervical

humano (HeLa e SiHa) tratadas com as frações através de microscopia óptica;

- Avaliar mecanismo de morte celular das linhagens de câncer cervical (HeLa e

SiHa) frente ao tratamento com as frações através da citometria de fluxo e

microscopia de fluorescência;

- Avaliar a distribuição das células pelas diferentes fases do ciclo celular após

tratamento com as frações de Croton blanchetianus pela análise do conteúdo

de DNA por citometria de fluxo.

41

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta do material vegetal

Os espécimes de Croton blanchetianus foram coletados na Estação

Ecológica do Seridó, situada no município de Serra Negra do Norte - RN, em

abril de 2014, sob autorização emitida pelo SISBIO (Número 32749-2). Os

espécimes foram identificados pelo Mestre Alan de Araújo Roque, da UFRN, e

um material testemunho foi coletado e depositado no Herbário da própria

UFRN sob o número de referência 16077. O acesso ao patrimônio genético foi

realizado de acordo com autorização emitida pelo CNPq (Número

010142/2012-6) com anuência do CGEN (Número 010913).

3.2 Obtenção das frações de Croton blanchetianus Baill.

As frações da planta foram obtidas através da colaboração com o

Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais Bioativos (DFAR-UFRN), sob

coordenação da Professora Dra. Raquel Giordani.

Primeiramente, os extratos brutos foram obtidos por maceração,

segundo metodologia de Silva et al (2006), com modificações. As raízes e

folhas foram maceradas por 48 horas em temperatura ambiente, por três

vezes, em etanol:água (95:5, v/v) na proporção de 1 g de planta para 10 mL de

solvente. Após filtração, a solução hidroalcoólica foi rotaevaporada sob pressão

e temperatura pré-estabelecidas até evaporação completa do etanol para a

obtenção dos extratos brutos. Estes, por sua vez, foram utilizados para a

realização da partição liquido-liquido com variação de pH, segundo Stuart et al.

(1968), para obtenção de frações enriquecidas em alcaloides. Esse

procedimento apresenta-se eficiente visto que a solubilidade dos alcaloides

varia de acordo com o pH da solução. Prosseguindo com a extração, os

extratos brutos foram acidificados com solução de ácido tartárico 5% até pH 2 e

submetidos à extração com clorofórmio por três vezes, fornecendo duas

frações ácidas: uma obtida da raiz (CBaR) e outra das folhas (CBaF). Em

seguida, a solução aquosa ácida foi basificada com hidróxido de amônio 25%

42

até pH 10 e extraído com clorofórmio também por três vezes, originando mais

duas frações a partir da raiz (CBbR) e das folhas (CBbF).

3.3 Perfil fitoquímico das frações de Croton blanchetianus Baill

As frações (CBaF, CBbF, CBaR e CBbR) foram submetidos à triagem

fitoquímica preliminar por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), usando

cromatoplacas de sílica gel 60 GF 254 (Macherey-Nagel) e sistema eluente

hexano:acetato de etila (5:5, v/ v). Em seguida, as amostras foram reveladas

com vanilina sulfúrica (revelador universal, Reagente de Drangendorff

(específico para a classe dos alcaloides) e Reagente Natural A (específico para

a classe dos flavonoides) e observados em luz visível (Vanilina sulfúrica e

Reagente de Drangendorff) e luz ultravioleta no comprimento de onda de 365

nm (Reagente Natural A).

3.4 Linhagens e Cultura de células

As linhagens tumorais humanas do cólon do útero HeLa (HPV-18) e

SiHa (HPV-16) e a linhagem não-tumoral de fibroblasto pulmonar humano

(MRC5) foram cultivadas no Departamento de Bioquímica no Laboratório de

Cultura de Células (DBQ/CB-UFRN) em meio Dulbecco's Modified Eagle

Medium (DMEM) e mantidas a 37 °C em uma incubadora umidificada na

presença de 5% CO2, com os meios suplementados com 10% de soro fetal

bovino (SFB) e antibióticos (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de

estreptomicina). As células de adenocarcinoma cervical, HeLa (ATCC CCL-2),

e carcinoma cervical, SiHa (ATCC HTB-35), foram gentilmente cedidas pela

Prof.ª Dr.ª Ana Paula Lepique (Departamento de Imunologia, Universidade de

São Paulo – USP), enquanto que o fibroblasto pulmonar humano (MCR5 –

ATCC CCL-171) foi cedido pelo Prof. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha

(Departamento de Bioquímica, UFRN).

43

3.5 Ensaio de citotoxicidade in vitro

A citotoxicidade in vitro das frações foi determinada pelo ensaio

colorimétrico do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio),

segundo MOSMANN, 1983. Este método é baseado na redução do MTT à

cristais de formazan ocasionada indiretamente pela ação das enzimas

desidrogenases presentes nas células viáveis.

Inicialmente, para escolher as melhores concentrações das frações

enriquecidas a serem testadas, foi realizado um teste-piloto, no qual as

linhagens em estudo (HeLa e SiHa) foram tratadas com essas frações nas

concentrações de 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µg/mL. Essas concentrações iniciais

foram escolhidas baseando-se em um artigo científico. Os resultados desse

piloto demonstraram que as concentrações menores (6,25 e 12,5 µg/mL) não

apresentavam atividade citotóxica. Além disso, após calcular a IC50 para cada

fração, observou-se que, para a linhagem SiHa, algumas frações

apresentavam IC50 acima de 200 µg/mL. Dessa forma, as concentrações

menores foram eliminadas e se acrescentou as concentrações de 200 e 400

µg/mL, ficando, portanto, cinco concentrações para serem testadas: 25, 50,

100, 200 e 400 µg/mL.

A partir disto, o ensaio de citotoxicidade in vitro foi realizado.

Aproximadamente 5 x 103 células/ poço (HeLa, SiHa e MRC5) foram cultivadas

em placa estéril de 96 poços para um volume final de 100 μL de meio DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas na estufa à 37°C e 5%

CO2. Após 24h, o meio foi removido e as células foram carenciadas por 24h

com meio sem soro. Posteriormente, o meio foi aspirado e acrescentou-se

meio com SFB 10% para estimular as células a saírem de G0. Passado o

tempo do carenciamento, o meio foi removido mais uma vez e as células foram

tratadas com 100 µL das diferentes concentrações das frações enriquecidas

(400, 200, 100, 50 e 25 µg/mL) durante 24, 48 e 72 h. Após cada tempo de

tratamento, a solução de MTT (1 mg/mL) foi adicionado às células, as quais

foram incubadas por mais 4 horas à 37°C e 5% CO2. Depois, o meio foi

aspirado, adicionou-se 100 μL de álcool etílico P.A. para solubilizar os cristais

de formazan formados e precipitados e homogeneizou-se as placas em

agitador automático por 15 minutos ao abrigo da luz. A quantificação da

44

absorbância foi feita em leitor de placa de 96 poços (Epoch da Biotek

Instruments Inc – Winaoski, UT, USA) em comprimento de onda de 570 nm. O

valor de IC50 foi definido como sendo a concentração que inibiu 50% da

viabilidade celular quando comparado ao controle negativo e foi obtida através

da regressão logarítmica. Cada ensaio foi acompanhado de controle positivo

(Cisplatina 30 μg/mL) e controle negativo (DMSO 1%). O DMSO foi utilizado

como controle negativo por ter sido o veículo das frações. O resultado obtido é

resultante de 2 ensaios distintos e todas as concentrações foram testadas em

triplicata em cada ensaio.

O cálculo de inibição da proliferação celular foi realizado em comparação

com o controle negativo, conforme fórmula abaixo:

3.6 Avaliação da morfologia celular

As células HeLa e SiHa tratadas com as frações enriquecidas por 48h

no ensaio de citotoxicidade foram observadas em microscópio óptico invertido

(NIKON Eclipse Ti-U), antes da aplicação do MTT, para estudo de possíveis

alterações morfológicas provocadas pela ação dos tratamentos. Foram

escolhidas as concentrações de 50 e 200 μg/mL para melhor visualização da

diferença de viabilidade celular e das alterações morfológicas, uma vez que na

concentração de 400 μg/mL havia poucas células viáveis. Os critérios de

avaliação foram descolamento da monocamada, retração celular, formação de

vesículas na membrana e de corpos apoptóticos, sugerindo morte celular.

3.7 Avaliação da morte celular por Anexina V-FITC/ iodeto de propídio (IP)

Para avaliar a morte celular foi utilizado um kit para detecção de

apoptose de Anexina V-FITC/PI, de acordo com as instruções do fabricante,

com pequenas modificações (e-Bioscience, San Diego, USA). O marcador

anexina V-FITC permite detectar os estágios iniciais da apoptose por se ligar

preferencialmente a fosfolipídios negativamente carregados (fosfatidilserina)

expostos no início do processo apoptótico, enquanto o iodeto de propídio

(%) Inibição = Absorbância do Controle Negativo – Absorbância do Teste X 100

Absorbância do Controle Negativo

45

permite avaliar os momentos finais deste processo de morte celular por ser um

marcador que interage com o DNA, mas que não é capaz de atravessar a

membrana plasmática, devido ao seu elevado peso molecular. Assim, esta

marcação positiva para PI indica que há poros na membrana, fenômeno

característico de processos de necrose ou estágios finais de apoptose.

Para isso, as células HeLa e SiHa foram plaqueadas em uma

concentração de 2x105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24h e as

células terem aderido, o meio foi removido e as células foram carenciadas por

24h com meio sem soro. Posteriormente, o meio foi aspirado e as células foram

estimuladas a sair de G0 pelo acréscimo de meio com SFB 10% na presença

de CbaF, CBbF, CBaR e CBbR (100 µg/ mL). Após o tratamento com as

frações enriquecidas por 24 horas, as células foram lavadas duas vezes com

PBS gelado (tampão fosfato), tripsinizadas e coletadas em tubos tipo Falcon.

Em seguida, foram centrifugadas a 3200 rpm por 5 minutos em centrífuga

refrigerada (4°C). Após centrifugação, as células foram lavadas mais duas

vezes com PBS gelado, centrifugadas nas mesmas condições anteriores e

ressuspendidas em 50 μL de tampão de ligação Anexina V. Posteriormente, as

células foram transferidas para tubos de citometria de fluxo, nos quais foram

adicionados 5 μL de Anexina V-FITC e 1 μL de iodeto de propídio (IP). A

mistura foi incubada por 30 minutos no escuro. Finalmente, 300 μL do tampão

de ligação Anexina V foram adicionados às células e a suspensão celular foi

analisada por citometria de fluxo (FASCANTO II flow cytometer, BD

Biosciences). Cada ensaio foi acompanhado de controle positivo (Cisplatina 30

μg/mL) e controle negativo (DMSO 1%). A percentagem de células em

apoptose foi determinada a cada 10.000 eventos e os gráficos mostrados no

trabalho representam dados obtidos de dois experimentos separados. Para

análise dos dados foi utilizado o programa FlowJo® Analysis Software versão

9.3.2 (Junho, 2011), ©Tree Star Incorporation, OR, EUA.

3.8 Avaliação da morfologia nuclear

A avaliação de alterações na morfologia nuclear das células HeLa e

SiHa foi realizada através da microscopia de fluorescência, utilizando como

corante o 4’-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI). O DAPI é um marcador

46

fluorescente para DNA amplamente utilizado para identificação da

condensação da cromatina, encolhimento e fragmentação nuclear, permitindo a

determinação do processo de morte celular por apoptose (CANDAL, 2005).

As células HeLa e Siha foram plaqueadas na concentração de 5x104

células/ poço sobre lamínulas circulares de 12 mm colocadas em placas de 24

poços e, em seguida, mantidas por 24 h em estufa à 37°C e 5% de CO2 para

adesão das células à lamínula. Após esse tempo, o meio DMEM com soro foi

retirado e adicionou-se meio sem soro. As células foram novamente incubadas

nas mesmas condições descritas no passo anterior. Após 24 h, o meio foi

aspirado e as células foram estimuladas a sair de G0 pelo acréscimo de meio

com SFB 10% na ausência (controle negativo – DMSO 1%) e na presença de

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR nas concentrações de 100 µg/ mL para HeLa e

200 µg/ mL para SiHa. Após 48 h de tratamento com as frações enriquecidas, o

meio foi removido, as células foram lavadas com PBS gelado por duas vezes e

em seguida fixadas com paraformaldeído 4% a temperatura ambiente por 30

minutos. Após esse tempo, as células foram novamente lavadas duas vezes

com PBS e depois mantidas em solução de PBS contendo 0,1% de Triton X-

100 a temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente, fez-se novas

lavagens com PBS e, subsequentemente, as células foram incubadas com

DAPI (1µg/mL) a temperatura ambiente por 30 minutos. Por fim, as células

foram lavadas com PBS e as lâminas foram montadas utilizando Fluoromont

para serem examinadas por microscopia de fluorescência. Foram avaliados

critérios como condensação da cromatina, fragmentação nuclear, presença de

núcleos picnóticos e de corpos apoptóticos.

3.9 Avaliação do Ciclo Celular

As células HeLa e SiHa foram plaqueadas em uma concentração de

2x105 células/poço em placas de 6 poços. Após 24h, o meio foi removido e as

células foram carenciadas por 24h com meio sem soro. Posteriormente, o meio

foi aspirado e as células foram estimuladas a sair de G0 pelo acréscimo de

meio com SFB 10% na presença de CBaF, CBbF, CBaR e CBbR nas

concentrações de 100 µg/ mL para HeLa e 200 µg/ mL para SiHa. As células

foram expostas às frações enriquecidas por 48 h e então foram lavadas com

47

PBS gelado. Em seguida, foram fixadas com álcool à 70% gelado e incubadas

por 30 minutos à 4°C. Após incubação, as células foram centrifugadas à 3200

rpm por 5 minutos em centrífuga refrigerada (4°C), posteriormente lavadas com

PBS e transferidas para tubos de citometria. Em seguida, foram adicionados 90

µL de Triton-x (0,01%) e 10 µL de RNAse (4 mg/ mL) e incubadas a

temperatura de 37 °C por 1 h. Posteriormente, 2 µL de iodeto de propídio e 200

µL de PBS foram adicionadas para leitura no citômetro de fluxo FACSCANTO.

Cada ensaio foi acompanhado de controle positivo (Cisplatina 30 μg/mL) e

controle negativo (DMSO 1%). Para análise dos dados foi utilizado o programa

FlowJo® Analysis Software versão 9.3.2. A quantidade de DNA presente em

cada análise é referente a aquisição de 10.000 eventos para cada amostra.

3.10 Análise estatística

Os dados foram analisados comparativamente com média ± desvio

padrão e foi utilizada a análise de variância (ANOVA) seguido do Teste de

Bonferroni post hoc. Valores de p menores que 0,05 foram considerados

estatisticamente significativos. Foram realizados dois experimentos

independentes em triplicata para cada concentração das amostras testadas. As

concentrações das frações enriquecidas foram comparadas apenas em relação

ao controle negativo (DMSO).

48

4 RESULTADOS

4.1 Perfil fitoquímico das frações enriquecidas das folhas e raiz da Croton

blanchetianus Baill

As placas cromatográficas foram analisadas de acordo a presença (+)

ou ausência (-) dos metabólitos secundários identificados pelos reveladores em

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR, conforme mostrado na Tabela I e Figura 10. De

acordo com os resultados, a maioria das frações enriquecidas apresentam

terpenos, alcaloides e flavonoides como metabólitos secundários. A exceção foi

CBbF, que não apresentou flavonoides.

Tabela I. Perfil fitoquímico das frações das folhas e raiz de Croton blanchetianus Baill

Metabólitos

Secundários Revelador

Coloração

positiva

Resultado

CBaF CBbF CBaR CBbR

Terpenos Vanilina

sulfúrica

Violeta-Roxo + +++ + +

Alcaloides Reagente

Dragendorff

Laranja ++ ++ ++ ++

Flavonoides Natural A

reagent

Amarelo-

Verde

+ - ++ ++

(+) Fraco; (++) Moderado; (+++) Forte

49

4.2 Ensaio de Citotoxicidade in vitro

A fim de analisar o efeito das frações enriquecidas obtidas das folhas e

raiz da Croton blanchetianus Baill na viabilidade celular de linhagens de câncer

cervical humano (HeLa e SiHa), estas foram tratadas com diferentes

concentrações das frações e suas viabilidades foram determinadas usando o

ensaio colorimétrico de MTT.

De acordo com os resultados, todos as frações enriquecidas (CBaF,

CBbF, CBaR e CBbF) diminuíram sigificativamente a viabilidade celular de

HeLa e Siha de uma maneira concentração-tempo dependentes a partir da

concentração de 100 µg/ mL (Figura 11 e Figura 12).

Com relação à célula HeLa, quando tratada com o CBaF, sua viabilidade

celular variou entre 12% e 76%, sendo a concentração de 400 µg/ mL nos três

tempos (24, 48 e 72h) a que apresentou maior inibição da viabilidade celular,

sendo, inclusive, maior que a inibição promovida pela cisplatina, quimioterápico

amplamente utilizado na prática clínica (Figura 11A). Já CBbF foi a fração que

apresentou a melhor atividade citotóxica, diminuindo a viabilidade celular de

A B C

CBaF CBbF CBaR CBbR CBaF CBbF CBaR CBbR CBaF CBbF

CBaR CBbR

CBaR CBbR

Figura 10. Determinação da presença de metabólitos secundários nas frações

das folhas e raiz de Croton blanchetianus Baill. A) Terpenos, revelados com vanilina

sulfúrica. B) Alcalóides, revelados com o Reagente de Dragendorff. C) Flavonóides, revelados com

Reagente Natural A.

50

HeLa de maneira significativa para valores entre 12% e 56% (FIGURA 11B).

CBbF apresentou um efeito citotóxico maior que o da cisplatina já na

concentração de 200 µg/ mL e tempo de 24 h, quando diminuiu a viabilidade

celular da HeLa para 32%, enquanto que a cisplatina reduziu para 44%. As

frações CBaR e CBbR também mostraram boas atividades citotóxicas.

Enquanto CBaR diminuiu a viabilidade celular da HeLa para valores entre 13 e

73% (FIGURA 11C), CBbR diminuiu entre 12% e 70% (FIGURA 11D). Ambas

as frações (CBaR e CBbR), na concentração de 400 µg/ mL, foram capazes de

inibir a viabilidade celular de HeLa de maneira mais significativa que a

cisplatina.

51

Figura 11. Efeito das frações de Croton blanchetianus na viabilidade celular da linhagem celular HeLa. Células HeLa foram tratadas com diferentes

concentrações de CBaF (A), CBbF (B), CBaR (C) e CBbR (D) (25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) por 24, 48 e 72h. Células tratadas com DMSO 1% (veículo) foram usadas como controle. Os dados

são expressos em média ± desvio padrão. * Indica diferença significativa (p<0,05) entre as

diferentes concentrações das frações e o controle. CBaF = fração ácida das folhas de CB; CBbF = fração básica das folhas de CB; CBaR = fração ácida da raiz de CB; CBbR = fração básica da raiz de CB; CISP = Cisplatina

52

Quanto à linhagem celular SiHa, CBaF também foi capaz de diminuir sua

viabilidade celular, a qual variou entre 15% e 87% (FIGURA 12A). A maior

atividade citotóxica desta fração foi evidenciada na concentração de 400 µg/

mL. Assim como foi observado na linhagem HeLa, a fração CBbF também foi a

que apresentou o maior efeito citotóxico para a SiHa, diminuindo a viabilidade

celular para valores entre 14% e 66% (FIGURA 12B). Além disso, nas

concentrações de 200 e 400 µg/ mL, a inibição da viabilidade celular pela CBbF

foi semelhante a praticada pela cisplatina. Em relação à fração CBaR, esta

começou a apresentar uma melhor atividade inibitória na concentração de 200

µg/ mL, onde a viabilidade celular ficou em torno de 60% com 24h e diminuiu

para 20% com 72h. O máximo da atividade dessa fração ocorreu quando a

SiHa foi tratada por 72 h com a concentração de 400 µg/ mL, onde a viabilidade

atingiu 14% (FIGURA 12C). Assim como as demais frações, CBbR também

apresentou um melhor efeito citotóxico nas maiores concentrações (200 e 400

µg/ mL) e maior tempo (72 h), quando a viabilidade celular da SiHa ficou em

torno de 15% (FIGURA 12D). Estas duas últimas frações também

apresentaram inibição da viabilidade compatível com a da cisplatina.

53

Figura 12. Efeito das frações de Croton blanchetianus na viabilidade celular da linhagem celular SiHa. Células SiHa foram tratadas com diferentes

concentrações de CBaF (A), CBbF (B), CBaR (C) e CBbR (D) (25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) por 24, 48 e 72h. Células tratadas com DMSO 1% (veículo) foram usadas como controle. Os

dados são expressos em média ± desvio padrão. * Indica diferença significativa (p<0,05)

entre as diferentes concentrações das frações e o controle. CBaF = fração ácida das folhas de CB; CBbF = fração básica das folhas de CB; CBaR = fração ácida da raiz de CB; CBbR = fração básica da raiz de CB; CISP = Cisplatina.

54

Com base nos resultados do ensaio de citotoxicidade, calculou-se a IC50

de todas as frações enriquecidas testadas para ambas as células em estudo

(TABELA 2). De acordo com a IC50, pode-se observar que a célula HeLa foi

mais sensível aos tratamentos do que a célula SiHa, uma vez que

concentrações menores das frações foram capazes de inibir a viabilidade

daquela célula em 50%, enquanto que para a SiHa foram necessárias

concentrações maiores para se obter o mesmo efeito citotóxico. Outra

informação que se pode extrair a partir da IC50 é que CBbF foi o mais potente

em ambas as células, apresentando os menores valores de IC50.

Tabela II. Valores de IC50 das frações de Croton blanchetianus em linhagens de câncer cervical humano HeLa e SiHa.

Como as frações enriquecidas testadas apresentaram atividade inibitória

contra as células tumorais HeLa e SiHa, resolveu-se avaliar o efeito dessas

frações frente uma linhagem de células não-tumorais, no caso fibroblastos de

pulmão humano (MRC5). Conforme se pode observar na FIGURA 13A-D, a

maioria das frações enriquecidas apresentou uma ação citotóxica menor que a

cisplatina quando se analisa até a concentração de 200 µg/ mL.

Valores de IC50 (µg/ mL)

Frações

HeLa SiHa

24h 48h 72h 24h 48h 72h

CBaF 265,8 156,5 158,2 343,7 203,9 143,7

CBbF 147,7 118,1 106,9 207,3 185,0 104,1

CBaR 249,3 125,9 124,5 274,9 193,3 140,8

CBbR 267,8 98,8 113,8 249,7 169,4 125,5

56

Figura 13. Efeito das frações de Croton blanchetianus na viabilidade celular da linhagem celular MRC5. Células MCR5 foram tratadas com diferentes

concentrações de CBaF (A), CBbF (B), CBaR (C) e CBbR (D) (25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) por 24 e 48. Células tratadas com DMSO 1% (veículo) foram usadas como controle. Os dados são expressos em média ± desvio padrão. CBaF = fração ácida das folhas de CB; CBbF = fração básica das folhas de CB; CBaR = fração ácida da raiz de CB; CBbR = fração básica da raiz de CB; CISP = Cisplatina.

57

4.3 Efeitos das frações enriquecidas de Croton blanchetianus Baill na

morfologia celular de HeLa e SiHa

Análises de microscopia de luz foram realizadas para se observar as

alterações morfológicas induzidas nas linhagens celulares HeLa e SiHa pelo

tratamento com as frações enriquecidas. Como se pode observar nas

FIGURAS 14 e 15, células HeLa e SiHa não tratadas, respectivamente, exibem

um padrão típico de morfologia normal, evidenciado pelo aspecto celular

fusiforme, com uma distribuição homogênea em relação ao tamanho, além de

apresentarem projeções de membrana, as quais são características de

motilidade celular.

Por outro lado, células tratadas com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR

mostraram uma clara mudança morfológica que pode ser caracterizada pela

retração celular, o que culmina com a redução do contato célula-célula, e

presença de vesículas na membrana. Além disso, a freqüência de células

redondas (provavelmente células mortas) aumentou com o aumento da

concentração das frações. Essas alterações morfológicas foram observadas

tanto na HeLa (FIGURA 14) como na SiHa (FIGURA 15). Entre as frações

testadas, CBbF e CBbR foram os que promoveram maiores alterações

morfológicas nas linhagens estudadas.

58

Figura 14. Alterações morfológicas na célula HeLa após tratamento. A Hela foi

tratada com CBaF, CBbF, CBaRe CBbR por 24 h nas concentrações de 50 e 200 µg/ mL. Após incubação, as células foram examinadas em microscópio de luz. Ampliação, x 100. As setas indicam a presença de células redondas (mortas) e retração celular.

Controle

CBaF 50 µg/ mL CBaF 200 µg/ mL

CBbF 50 µg/ mL

CBaR 50 µg/ mL

CBbR 50 µg/

mL

CBbF 200 µg/ mL

CBaR 200 µg/ mL

CBbR 200 µg/ mL

59

Figura 15. Alterações morfológicas na célula SiHa após tratamento. A SiHa foi

tratada com CBaF, CBbF, CBaRe CBbR por 24 h nas concentrações de 50 e 200 µg/ mL. Após incubação, as células foram examinadas em microscópio de luz. Ampliação, x 100. As setas indicam a presença de células redondas (mortas) e retração celular.

Controle

CBaF 50 µg/ mL CBaF 200 µg/ mL

CBbF 50 µg/ mL CBbF 200 µg/ mL

CBaR 50 µg/ mL CBaR 200 µg/ mL

CBbR 50 µg/ mL CBbR 200 µg/ mL

60

4.4 Avaliação da morte celular por Anexina V-FITC/ iodeto de propídio (IP)

Anexina V e iodeto de propídeo (PI) são dois marcadores muito

utilizados para se diferenciar células em apoptose e em necrose. Geralmente,

células marcadas com anexina V (Anexina V+/ PI-) são indicativas de apoptose

inicial, células marcadas com PI (Anexina V-/ PI+) indicativas de necrose e

células positivas tanto para anexina V como para PI são indicativas de

apoptose tardia.

Para avaliar o mecanismo de morte induzido pelas frações enriquecidas

testadas, as células HeLa e SiHa foram incubadas com CBaF, CBbF, CBaR e

CBbR (100 µg/ mL) por 24 h e, posteriormente, foram marcadas com anexina V

e PI. Os dados obtidos são visualizados nas FIGURAS 16 e 17. Todos as

frações testadas diminuíram o número de células viáveis em comparação com

o controle. Com relação à linhagem HeLa, pode-se observar também que, com

exceção de CBaF, as demais frações aumentaram significativamente a

percentagem de células positivas para anexina (anexina V-FITC + / PI-) em

relação ao controle, enquanto que a porcentagem de células positivas para PI

(anexina V-FITC-/PI +) continuou baixa, sugerindo uma apoptose inicial. Dentre

todas as frações, CBbF foi a que mais induziu apoptose inicial em HeLa,

aumentando a porcentagem de células positivas para anexina (anexina V-FITC

+ / PI-) de 19,5% para 45,8%. Quando comparadas com o controle, todas as

frações promoveram um aumento na porcentagem de células positivas para

anexina e PI (anexina V-FITC + / PI +), o que indica apoptose tardia.

Já em relação à linhagem SiHa, com exceção da fração CBbF, que

provocou um aumento apenas na porcentagem de células positivas para

anexina e PI (19,2%) (anexina V-FITC +/ PI +), sugerindo a presença de

células em apoptose tardia, todas as demais frações promoveram um aumento

tanto na porcentagem de células positivas para anexina e PI (anexina V-FITC +

/ PI+) como, em menor grau, na de células positivas apenas para PI (anexina

V-FITC-/PI +), indicando a presença de um maior número de células em

apoptose tardia do que em necrose.

61

Figura 16. Análise de citometria de fluxo de células HeLa tratadas com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR. Os gráficos de pontos (histogramas) exibem a morte de

células HeLa tratadas com 100 µg/mL das frações por 24h. Anexina-/PI- (Q4), células viáveis; Anexina+/PI- (Q3), células em apoptose; Anexina+/PI+ (Q1), células em estágio final de apoptose; Anexina+/PI+ (Q2), células em necrose.

Anexina V

PI

Controle

CBaF

CBaR

CBbF

CBbR

62

Figura 17. Análise de citometria de fluxo de células SiHa tratadas com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR. Os gráficos de pontos (histogramas) exibem a

morte de células SiHa tratadas com 100 µg/mL das frações por 24h. Anexina-/PI- (Q4), células viáveis; Anexina+/PI- (Q3), células em apoptose; Anexina+/PI+ (Q1), células em estágio final de apoptose; Anexina+/PI+ (Q2), células em necrose.

Anexina V

PI

Controle

CBaF

CBaR

CBbF

CBbR

63

4.5 Efeitos das frações enriquecidas de Croton blanchetianus Baill na

morfologia nuclear de HeLa e SiHa

As células HeLa e SiHa foram tratadas com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR

nas concentrações de 100 e 200 µg/mL, respectivamente, por 48 h, e a

morfologia nuclear foi observada após coloração com DAPI. Nas FIGURAS 18

e 19 pode-se observar, respectivamente, células HeLa e SiHa apresentando

núcleos picnóticos, condensação da cromatina e fragmentação nuclear. Estas

alterações morfológicas nucleares são características típicas de células em

processo de apoptose, o que fortalece a hipótese de que a atividade citotóxica

das frações testadas está relacionada com a indução de apoptose nas células

HeLa e SiHa. Vale salientar que estas modificações morfológicas foram

observadas com maior freqüência quando CBbF foi utilizado.

64

E

Figura 18. Mudanças morfológicas nucleares em células HeLa após o tratamento com

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR por 48 h seguido de marcação com DAPI. (A) Fotografias de

microscopia de fluorescência de células HeLa não tratadas, (B) células tratadas com 100 µg/mL de CBaF, (C)

células tratadas com 100 µg/mL de CBbF, (D) células tratadas com 100 µg/mL de CBaR, (E) células tratadas

com 100 µg/mL de CBbR. Setas indicam condensação de cromatina e fragmentação nuclear. Amplificação, ×

200.

A

C B

D E

A

65

A

B C

D E

Figura 19. Mudanças morfológicas nucleares em células SiHa após o tratamento com

CBaF, CBbF, CBaR e CBbR por 48 h seguido de marcação com DAPI. (A) Fotografias de

microscopia de fluorescência de células SiHa não tratadas, (B) células tratadas com 200 µg/mL de CBaF, (C)

células tratadas com 200 µg/mL de CBbF, (D) células tratadas com 200 µg/mL de CBaR, (E) células tratadas

com 200 µg/mL de CBbR. Setas indicam condensação de cromatina, fragmentação nuclear e núcleos picnóticos.

Amplificação, × 200.

C B

D E

A

66

4.6 Efeito das frações enriquecidas de Croton blanchetianus Baill no ciclo

das células HeLa e SiHa

Para determinar se as frações, após tratamento por 48 h, promoveríam

alteração na progressão do ciclo celular das linhagens HeLa e SiHa, o

conteúdo de DNA das células em cada fase do ciclo celular foi avaliado. Blots

representativos são mostrados nas FIGURAS 20 e 21.

As análises do ciclo celular por citometria de fluxo mostraram que, após

o tratamento das células HeLa e SiHa com as frações, houve uma mudança no

perfil de distribuição das células pelas diferentes fases do ciclo celular.

Em relação às células HeLa, todos as frações provocaram uma

diminuição na quantidade de células na fase G1, principalmente CBbF e CBbR,

as quais diminuíram para 38,4% e 56,8%, respectivamente. Em relação à fase

S, não houve mudança significativa no número de células, enquanto que para a

fase G2-M, apenas CBbF induziu um aumento considerável no número de

células (27,6%). O tratamento com as frações também provocou um aumento

nas marcações positivas em sub G1, em especial CBbF (28,8%) e CBbR

(21%), o que é mais um indício de que estas frações possuem atividade

antiproliferativa por induzirem apoptose.

Já nas células SiHa, também todas as frações diminuíram a

porcentagem de células na fase G1, sendo CBbF e CBbR as que provocaram

uma maior diminuição, de 73,3% (controle) para 31,3% e 52,1%,

respectivamente. Além disso, houve uma diminuição no número de células na

fase S provocada por todas as frações testadas. Já em relação à fase G2-M,

com exceção de CBbR, as demais frações aumentaram a porcentagem de

células nessa fase, principalmente CBbF, que aumento de 15,4% (controle)

para 56,6%. Em contrapartida, CBbF foi a única fração que não aumentou o

número de células na fase sub-G1, enquanto que CBbR aumentou de 0,0%

(controle) para 29,5%.

67

Figura 20. Análises de ciclo celular de células HeLa por citometria de fluxo após 48h de tratamento com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR. Após o

tratamento com as frações, as células foram coradas com PI e, em seguida, a análise de

citometria de fluxo foi realizada. Representação de Dot plots obtidos após análise no FlowJo.

Conteúdo de DNA

Controle

CBaF CBbF

CBbR CBaR

68

Conteúdo de DNA

Figura 21. Análises de ciclo celular de células SiHa por citometria de

fluxo após 48h de tratamento com CBaF, CBbF, CBaR e CBbR. Após o

tratamento com as frações, as células foram coradas com PI e, em seguida, a análise de

citometria de fluxo foi realizada. Representação de Dot plots obtidos após análise no

FlowJo.

Controle

CBaF CBbF

CBaR CBbR

69

5 DISCUSSÃO

A fitoterapia tem um papel siginificativo na prevenção e tratamento do

câncer há anos (CHOUDHARI, 2013; BIZZARRI, 2016; XIANG, WU, RAO,

2015). Atualmente os fármacos utilizados como agentes anticâncer

representam mais de 60% da sua origem a partir de fontes naturais tais como

plantas, organismos marinhos e microorganismos (CHAN et al, 2012; BADMUS

et al, 2015). Alguns estudos apontam o potencial das plantas medicinais como

candidatas a drogas anticâncer, principalmente, aquelas com capacidade de

induzir apoptose nas células tumorais (JIANG et al, 2005; ARUOMA et al, 2006;

ZHANG et al, 2007; PANDEY, MADHURI, 2009).

Diante disso, nesse estudo, foram investigados os efeitos citotóxicos e

pró-apoptóticos de frações das folhas e raiz de Croton blanchetianus Baill.

Primeiramente, foi avaliado o perfil fitoquímico das frações de Croton

blanchetianus. De acordo com os resultados da triagem fitoquímica por CCD,

todos as quatro frações enriquecidas apresentaram terpenos e alcaloides,

enquanto que os flavonoides estavam presentes em três destas (CBaF, CBaR

e CBbR). Dentre estes metabólitos secundários, os terpenos parecem ser

majoritários, principalmente em CBbF. Os nossos resultados são consistentes

com outros estudos que isolaram, ao longo dos anos, diferentes terpenos

(monoterpenos, sesquiterpenos e, principalmente, diterpenos) a partir das

folhas e raiz da espécie Croton blanchetianus (McCHESNEY, SILVEIRA,

CRAVEIRO, SHOOLERY, 1984; McCHESNEY, SILVEIRA, 1989;

McCHESNEY, CLARK, SILVEIRA, 1991; SILVEIRA, McCHESNEY, 1994).

Terpenos, alcaloides e flavonoides também foram encontrados em outras

plantas do gênero Croton, o qual é uma fonte rica nestes metabólitos

secundários. Qiu et al (2016) isolou dois novos diterpenos e um alcalóide de

Croton crassifolius [35]. Outros autores têm demonstrado também a presença

de alcaloides e flavonoides isolados a partir de extratos de folhas de várias

espécies deste gênero, tais como Croton sparsiflorus (SHAHWAR et al, 201),

Croton echinocarpus Baill (RAVANELLI et al, 2016), Croton bonplandianum

Baill (BURGOS et al, 2015), Croton betulaster (COELHO et al, 2016) e Croton

sphaerogynus Baill (SANTOS et al, 2015).

70

Devido sua variedade de metabólitos secundários, Croton blanchetianus

apresenta grande potencial biológico. Assim, foi analisado, in vitro, a atividade

citotóxica das frações frente às linhagens celulares de câncer cervical humano

HeLa e SiHa pelo método do MTT. Conforme resultados desse estudo, todas

as frações diminuíram significativamente a viabilidade celular de ambas as

células de maneira concentração-tempo dependentes. Quando se analisa os

valores de IC50, pode-se observar que CBbF foi a mais potente, uma vez que

concentrações menores dessa fração foram suficientes para reduzir a

viabilidade celular das linhagens HeLa e SiHa em 50%. Dessa forma, podemos

hipotetizar que a atividade citotóxica das frações possa estar relacionada com

a ação dos terpenos ou alcaloides, uma vez que CBbF não apresentou

flavonoides como metabólitos secundários na análise de CCD. Levando-se em

consideração que vários estudos já isolaram terpenos de folhas de Croton

blanchetianus e que, em nosso estudo, a fração CBbF apontou forte presença

de terpenos, há uma probabilidade maior de que os terpenos sejam os

responsáveis pelo efeito citotóxico apresentado por essa espécie. De fato,

vários estudos têm demonstrado a atividade citotóxica de terpenos extraídos de

espécies do gênero Croton. Recentemente, novos diterpenos foram isolados

dos galhos e folhas da Croton tiglium L e a avaliação citotóxica in vitro revelou

que a maioria exibia efeito citotóxico em HeLa, A549 (Adenocarcinoma

pulmonar humano), HL-60 (Leucemia promielocítica aguda) e SGC-7901

(câncer gástrico humano) (NATH et al, 2013; WANG, J. et al, 2015). Um outro

estudo conseguiu isolar 14 diterpenos das partes aéreas da espécie Croton

laui, onde um destes apresentou citotoxicidade contra P-388 (leucemia murina)

e HL-60 (LIU et al, 2014). Os alcaloides, segunda classe de metabólitos

secundários mais presente neste gênero, são reconhecidamente citotóxicos e

também podem estar relacionados com o efeito antiproliferativo apresentado

pela Croton blanchetianus, uma vez que outros estudos já mostraram a

atividade citotóxica de alcaloides isolados de Croton sp. Montopoli e

colaboradores (2012), por exemplo, isolaram um alcaloide de Croton lechleri, o

qual inibiu a proliferação celular de linhagens celulares de melanoma humano.

Ademais, pode-se evidenciar, baseado nos valores de IC50, que a

linhagem HeLa foi mais susceptível à ação das frações quando comparado

com a linhagem SiHa. Wang, H. et al (2010) obtiveram resultado semelhante

71

ao analisar a ação da cisplatina nestas duas linhagens celulares como

coadjuvante na terapia fotodinâmica, onde a cisplatina foi mais efetiva nas

células HeLa do que na SiHa. Por outro lado, 3,3-diindolilmetano, um polímero

extraído de um vegetal, apresentou um maior efeito inibitório em SiHa (ZHU et

al, 2012; GOMES, et al, 2015). O que há em comum entre essas linhagens é

que as mesmas são HPV positivas. Contudo, o subtipo viral em cada uma é

diferente. Enquanto HeLa possui o HPV-18, SiHa possui o HPV-16. Sabe-se

que, dependendo do tipo de HPV, as suas oncoproteínas E6 e E7 podem agir

de maneiras diferentes em relação às proteínas do ciclo celular e vias de

reparo do DNA. Como exemplo, foi observado que a expressão da E6 do HPV-

16 resultou em fosforilação sustentada da ciclina Chk1, a qual é importante na

regulação do ciclo celular, enquanto que a E6 do HPV-8 diminuiu a fosforilação

da mesma ciclina (WIERINGA et al, 2015). Essa diferença de ação poderia

explicar o fato de as linhagens responderem de maneiras diferentes quando

expostas a um determinado composto.

O desenvolvimento de compostos que apresentem característica de

inibir ou retardar a proliferação de células tumorais sem afetar células normais

do organismo é um dos grandes desafios atuais na elaboração de compostos

anticancerígenos não tóxicos. Diante disso, realizou-se o mesmo ensaio de

MTT frente à linhagem de células fibroblásticas normais humanas (MCR5).

Com exceção de CBbF, as demais frações apresentaram fraca citotoxicidade

frente à linhagem normal quando utilizados até a concentração de 200 µg/ mL,

inclusive sendo menor que a citotoxicidade da cisplatina para a mesma célula,

mostrando que estas frações têm uma atividade citotóxica mais seletiva que a

cisplatina.

Tendo em vista o efeito citotóxico que as frações exerceram sobre as

células HeLa e SiHa, pôde-se deduzir que algum processo de morte celular

estava acontecendo, o qual foi amplamente estudada. De fato, a análise da

morfologia celular mostrou que as frações induziram mudanças morfológicas

importantes, típicas de células em processo de apoptose. Resultados

semelhantes foram obtidos por Das et al (2012) ao avaliar alterações nucleares

provocadas por um triterpeno extraído de Phytolacca decandra, onde células

de adenocarcinoma pulmonar tratadas in vivo e in vitro com esse composto

apresentaram condensação da cromatina e fragmentação nuclear. Um outro

72

estudo avaliou a morfologia nuclear da linhagem Jurkat (Leucemia de células T

humana) tratada com extratos contendo alcaloides extraídos de Jujube, onde

alterações morfológicas nucleares como condensação da cromatina e

formação de corpos apoptóticos foram observados (TAECHAKULWANIJYA,

2016).

Para melhor caracterizar o mecanismo de morte provocado pelas

frações de Croton blanchetianus, análises por citometria de fluxo também

foram realizadas após tratamento das células HeLa e SiHa com as frações. Na

avaliação da morte celular, nosso estudo demonstrou que Croton blanchetianus

induziu apoptose nas células HeLa e SiHa, evidenciada pela externalização da

fosfatidilserina da membrana celular através da marcação com anexina V, o

primeiro evento do processo apoptótico. Já na avaliação do ciclo celular, houve

um aumento de marcações positivas em Sub-G1, indicando que estas frações

induzem morte celular por ativar apoptose, e algumas delas inibiram

proliferação celular ao promover a parada do ciclo celular na fase G2/M. Assim

como no nosso estudo, um diterpeno isolado de Croton tonkinensis também foi

capaz de aumentar a proporção de células de câncer de coloretal marcadas

com anexina V, evidenciando que as mesmas sofreram apoptose (THUONG et

al, 2014). Outro terpeno isolado de Santalum album Linn induziu apoptose e

inibiu proliferação celular ao promover a parada do ciclo celular na fase G2/M

(SANTHA et al, 2013). Alcaloides extraídos da espécie Chelidonium majus L.

(Papaveraceae) também exibiram propriedades apoptogênicas em células

leucêmicas humanas ao provocar exposição da fosfatidilserina e aumentar o

número de células na fase Sub-G1 do ciclo celular, além de provocar parada do

ciclo celular na fase G2/M (HAVELEK et al, 2016).

Muitos fármacos anticâncer têm seu mecanismo de ação baseados na

interação com o DNA, agindo em células que se encontram no ciclo celular.

Fármacos ciclo específicos derivados de produtos naturais representam

importantes agentes antineoplásicos utilizados na clínica atualmente como, por

exemplo, os alcalóides da vinca (vincristina e vimblastina) e o taxol

(Placlitaxel®) (ALMEIDA et al., 2005). Na fase G2/M existe um sistema de

checagem fundamental que impede a entrada da célula na fase M do ciclo

celular, caso o genoma esteja danificado. Fármacos que agem sobre o ciclo

celular, induzindo parada na fase G2/M, levam a célula à morte por apoptose, e

73

geralmente atuam sobre a topoisomerase II que é um alvo importante no

tratamento do câncer (KOLB et al., 2012).

Sabe-se que o HPV desenvolve várias estratégias para bloquear

apoptose mediada pelo hospedeiro e, com isso, células de câncer cervical

HPV-positivas exibem uma habilidade significativamente prejudicada para

ativar os “checkpoints” do ciclo celular e induzir apoptose (WIERIGAN et al,

2016). Ainda assim, as frações obtidas das folhas e raiz de Croton

blanchetianus foram capazes de induzir alterações no ciclo celular e apoptose

em linhagens de câncer cervical humano positivas para HPV-18 (HeLa) e HPV-

16 (SiHa).

Com os dados atuais não se pode ainda afirmar quais seriam os

componentes das frações enriquecidas que estariam envolvidos no processo

de indução de morte, nem o mecanismo completo pelo qual estes compostos

estariam agindo nas células. Espera-se que estudos posteriores possam

responder essas questões. Contudo, alguns trabalhos têm descrito alguns

mecanismos pelos quais outras espécies de Croton sp. induziram morte

celular. Afriyie et al (2015) mostrou que um extrato obtido da raiz de Croton

membranaceus induziu apoptose em células de hiperplasia prostática benigna

através da regulação positiva do mRNA e, consequentemente, dos níveis de

Bax, uma proteína pró-apoptótica. Outro estudo revelou que um diterpeno

isolado de Croton antisyphiliticus induziu apoptose pela inibição de NF-κB e

ativação da caspase 8 (FERNANDES et al, 2013). Mais recentemente, um

alcaloide extraído da Catharanthus roseus provocou apoptose em células de

leucemia humana através do aumento da expressão de Bax e diminuição da

expressão de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica), além de aumentar a atividade

das caspases-3 e -9, sugerindo que a apoptose ocorreu principalmente através

da via intrínseca (WANG et al, 2016).

Em síntese, esse estudo mostrou que as células HeLa e SiHa expostas

às frações testadas de Croton blanchetianus sofreram alterações morfológicas

e bioquímicas, como mostrado pela perda de viabilidade celular, retração

celular, vesículas na membrana celular, condensação da cromatina,

fragmentação nuclear, externalização de fosfatidilserina, acúmulo de

fragmentos de células na fase sub-G1 e, ainda, algumas frações induziram

parada do ciclo celular em G2/M.

74

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

De acordo com os resultados deste estudo, pôde-se evidenciar a

capacidade citotóxica das frações obtidas a partir das folhas e raíz de Croton

blanchetianus, associada à morte celular por uma via apoptótica frente as

linhagens de câncer cervical humano HeLa e SiHa.

Este é o primeiro estudo que mostra as propriedades citotóxicas e pró-

apoptóticas da espécie Croton blanchetianus em linhagens celulares de câncer

cervical humano. Portanto, Croton blanchetianus parece ser uma fonte natural

promissora para o desenvolvimento de agentes para o tratamento do câncer

cervical.

Contudo, o presente estudo aponta para a necessidade de investigação

mais aprofundada no âmbito fitoquímico para que se possa isolar os produtos

biologicamente ativos dessas frações responsáveis pelas atividades

observadas e elucidar seus mecanismos de ação.

75

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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88

8 ANEXO

Croton blanchetianus induces apoptosis and cell cycle arrest at G2/M phase in human cervical cancer cells

Kleyton Thiago Costa de Carvalhoa, Dayanne L. Gomes de Oliveira

b, Themístocles da Silva Negreiros

Netoc, Cleine Aglacy Nunes Miranda

a, Antônio Gouveia de Oliveira

c, Raquel Brandt Giordani

c, Hugo

Alexandre de Oliveira Rochab, Janaina Cristiana de Oliveira Crispim

*a

aDepartament of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, Brazil; bDepartament of Biochemistry, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil;

cDepartament of Pharmacy, School of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal,

Brazil

* Corresponding author.

E-mail address: [email protected]

A B S T R A C T

Objective. The present study aimed to investigate, in vitro, the cytotoxic and pro apoptotic effects of leaves and root fractions from Croton blanchetianus (CB) against human cervical cancer HeLa and SiHa cells.

Material and Methods. Fractions were obtained by pH variation in which the acid solution (pH 2) provided the acid fractions from leaves (CBaF) and roots (CBaR) and the aqueous fraction was basified (pH 9), obtaining the basic fractions from leaves (CBbF) and roots (CBbR). Phytochemical screening was evaluated by thin layer chromatography using Sulfuric Vanilin, Dragendorff Reagent and Natural A Reagent as developers. Cytotoxic activity and apoptosis rates were determined with MTT and annexin V/PI assays, respectively. Nuclear morphological changes were evaluated by fluorescence with DAPI stanning and flow cytometry was used to cycle assay.

Results. According to results, all fractions exhibited terpenoids, alkaloids and flavonoids, except CBbF that showed no flavonoids. All fractions decreased significantly cell viability of HeLa and SiHa cells in a concentration- and time-dependent manner (p<0,01), promoted cellular and nuclear morphological changes and induced apoptosis and cell cycle arrest (p<0,05).

Conclusion. This is the first study that demonstrated cytotoxic and pro apoptotic effects of Croton blanchetianus on HeLa and SiHa cells. Therefore, Croton blanchetianus appears to be a valuable natural source for the development of agents for the treatment of cervical cancer.

Key words: Euphorbiaceae, Croton blanchetianus, Cervical cancer, cytotoxicity, apoptosis, HeLa, SiHa

mailto:[email protected]

89

Introduction

Cervical cancer is the third most common cancers in women worldwide [1-

3]and the fourth major cause of cancer death in the woman in developing countries,

remaining a critical public health problem [4-7].In Brazil, it was estimated 16,340 new

cases of Cervical cancer in 2016 [8].High-risk human papillomaviruses (HPVs) such as

HPV 16, 18, 31 and 33 have been attributed to be the major risk factors for cervical

cancer, out of which HPV-16 and -18 account for almost 70% of the cancers [9, 10].

Platinum-based chemotherapy in combination with radiotherapy or surgery is

now mainly used to treat Cervical cancer, but the efficacy is limited especially in

advanced-stage disease. Furthermore, these treatments could easily lead to adverse

reactions and drug resistance, accordingly the recurrent and metastatic disease still

remains a problem [10-14].Thus, it is necessary to seek antitumor drugs of high

efficacy and low toxicity for the treatment of cervical cancer.

Recently, Complementary and Alternative Medicine (CAM) is gaining popularity

as a chemopreventive approach towards the management as well as prevention of

cancer [10, 14]. Drugs currently in use as anti-cancer have over 60% of their origin

from natural sources such as plants, marine organisms and microorganisms [13, 15].

Various scientific studies have suggested the potential of medicinal plants as anti-

cancer drug candidates [16], mainly compound-induced tumor cell apoptosis and

inhibition of proliferation which might play important roles in the control and

prevention of cancer [17-19].

Croton blanchetianus (CB), known as “black marmeleiro”, belongs to the family

Euphorbiaceae and it is a widely disseminated shrub found in northeast Brazil. Its

leaves and bark are used as popular medicines for treating gastrointestinal

disturbances, rheumatism and cephalalgia [20]. Furthermore, Croton sp. are rich

sources of terpenoids, alkaloids and flavonoids displaying a broad spectrum of

biological activities, such as antimycobacterial [21], antifungal [22], antiplasmodial

[23], antiviral [24], antiinflammatory [25] and cytotoxic [26-28]activities.

Some studies have demonstrated cytotoxic activity of plants of this genus

against human tumor cell lines. Croton tiglium L was shown to inhibit the growth,

stimulate apoptosis, or enhance differentiation in human tumor cell lines derived

90

frompatients with melanoma or prostate, breast, colon, or lung cancer [29]. In other

research, methanolic extracts of the roots of Croton membranaceus exhibited

markedly cytotoxic activities against DLD-1 (colorectal adenocarcinoma) and MCF-7

(breast adenocarcinoma)[30, 31]. These results lend some support for the use of this

genus in traditional medicines for the treatment of cancer.

However, until now there are no studies that show the cytotoxic and pro

apoptotic activities of Croton blanchetianus in tumor cell lines. Thus, this study aimed

to investigate, in vitro, the cytotoxic and pro apoptotic effects of leaves and root

extracts from Croton blanchetianus (CB) against human cervical cancer HeLa and SiHa

cells.

Materials and Methods

Plant Materials

Leaves and roots of Croton blanchetianus were collected in Serra Negra, Rio Grande do

Norte, Brazil, in April, 2014. They were identified by Msc. Alan de Araújo Roque, from

Federal University of Rio Grande do Norte, and a voucher specimen was deposited at

the Herbarium of the Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil, under the

reference number 16077. The authorization for harvesting the plant material was

conceded by SISBIO (number 32749-2) and the permission to access the Brazilian

genetic patrimony was allowed by CNPq (number 010142/2012-6).

Extracts preparation

Plant material (leaves and roots) was previously dried in an air circulating oven at 45

°C, crushed and subjected to exhaustive maceration with 95% ethanol ( 1:10 [w / v]

plant:solvent ratio) at room temperature. The crude extract was filtered, dried under

reduced pressure and solubilized in 5 % tartaric acid. The acid solution (pH 2) was

extracted with chloroform (CHCl3) to provide the acid fraction from leaves (CBaF) and

the acid fraction from roots (CBaR). The aqueous fraction was basified with 25% NaOH

to pH 9, extracted with chloroform and then dried under reduced pressure to obtain

the basic fraction from leaves (CBbF) and the basic fraction from roots (CBbR).

91

Phytochemical Screening

During the phytochemical screening, the extracts were subjected to various qualitative

tests of color change, excitation by ultraviolet light and precipitation to identify various

secondary metabolities. The extracts were further more analyzed bythin layer

chromatography (TLC) using aluminum sheets, coated with silica gel F254 (Macherey-

Nagel) as adsorvent and hexane system: ethyl acetate (5:5, v/ v) as mobile phase. The

compounds were detected with vanillin sulfuric acid (4%), Dragendorff Reagent and

Natural Product Reagent (0,5%), observing the spots under short- and long- wave UV

light.

Cell culture

HeLa (human cervical adenocarcinoma) and SiHa (Squamous cell carcinoma) cells

infected with HPV 18 e 16, respectively, were kindly provided by Prof.ª Dr.ª Ana Paula

Lepique (Departament of Imunology, University of São Paulo-USP). The cells lines were

maintained in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) and supplemented with

10% of fetal bovine serum (FBS) and 1% of penicillin and streptomycin (100 U/mL

penicillin and 100 𝜇g/mL streptomycin) at 37°C in a humidified atmosphere containing

5% CO2.

Cytotoxicity Activity

Cytotoxicity activity was determined using the MTT assay as described by Mossman,

1983 [32]. The MTT assay is based on the reduction of MTT by mitochondrial

dehydrogenases of viable cells to a purple formazan product. Briefly, HeLa and SiHa

cells were seeded into 96-well plates at a density of 5 × 103cells/well and cultured

overnight at 37 °C, 5% CO2, next the cells were treated with different concentrations

(25, 50, 100, 200 and 400 µg/ mL) of extracts of CB for 24, 48 and 72 h. After

treatment, the cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS) and

applying MTT (1 mg/mL) dissolved in 100 μL of fresh medium to determine cell

viability. Cells were then incubated for 4 h at 37 °C, 5% CO2. The MTT-formazan

product dissolved in 100 μL of ethanol was estimated by measuring the absorbance at

570 nm in a Multiskan Ascent Microplate Reader (ThermoLabsystems, Franklin, MA,

92

USA). Proliferation is presented as a percentage of cell proliferation under no

treatment conditions. The IC50 value was defined as the concentration of sample

which reduced absorbance by 50% relative to the vehicle treated control and it was

obtained from the log dose cytotoxic effects of the extracts. The standard drug

cisplatin was used as the positive control and Dimethyl Sulfoxide 1% (DMSO) as

negative control. All concentrations were tested in triplicate and the experiment was

repeated at least two times.

Cell Morphology

HeLa and SiHa cells were treated with extracts of Croton blanchetianus in different

concentrations (50 and 200 µg/ mL) for 24 hours and cells morphology were examined

using an inverted optical microscope (TE-Eclipse 300, Nikon, Melville, NY, USA).

Apoptosis assay

In order to evaluate the effects of extracts on cell death, a FITC/Annexin V Apoptosis

Kit (e-Bioscience, San Diego, USA) was used, with Dead Cell Annexin FITC and

propidium iodide (PI), for Flow Cytometry. Cells were grown in 12-well plates until they

reached confluence of 1 × 105 cells/mL and were then stimulated to enter G0 in a

medium without serum for 24 h. Next, cells were to exit G0 by adding DMEM

supplemented with 10% FCS, in the presence of extracts CBaF, CBbF, CBaR and CBbR

(200µg/mL). A negative control was prepared with the presence only of DMSO 1%

(vehicle). After 24 h, HeLa and SiHa cells were trypsinized, collected and washed with

cold PBS. The supernatant was discarded and cells were resuspended in 50μL of 1×

Binding Buffer. Five microlitres of Annexin V-FITC and 1 μL of PI solution 100 μg/mL

was added in the cell suspension. Cells were incubated for 15 min at room

temperature and kept under light protection. After the incubation period, 300 μL of

binding buffer for annexin V 1× was added and cells were analyzed by flow cytometry

(FASCANTO II flow cytometer, BD Biosciences, São Paulo, SP, Brazil), measuring

fluorescence emission at 530–575 nm for annexin V and 630/22 nm for PI. A total of

10.000 events were acquired. FlowJo software v. 9.3.2 (Tree Star, Inc., Ashland, OR,

USA) was used for data analysis as described in Costa et al., 2011 [33].

93

Nuclear morphology

The changes in the nuclear morphology of HeLa and SiHa cells following exposure to

100 and 200 µg/ mL ofCBaF, CBbF, CBaR and CBbR, respectively, were examined using

the DNA-specific fluorochrome DAPI. Cells were plated at a density of 5x104 cells/well

in a 24-well plate and after 24 h of incubation, cells were treated with MEDC and

MEDM for 48 h. Cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde in

PBS for 30 min at room temperature. After washing twice with PBS, cells were

maintained in PBS containing 0.1% Triton X-100 at room temperature for 30 min. Fixed

cells were washed with PBS and stained with DAPI (1 μg/mL) solution for 30 min at

room temperature. Nuclear morphology of apoptotic cells with condensed cromatin

and nuclear fragmentation was examined under a fluorescent microscope (TE-Eclipse

300, Nikon, Melville, NY, USA). Data presented are representative of those obtained in

at least two independent experiments done in duplicate.

Cell cycle analysis

HeLa and SiHa cells were placed in a 6-well plate (2 × 105 cells/mL) and were then

stimulated to enter G0 in a medium without serum for 24 h. Next, cells were to exit G0

by adding DMEM supplemented with 10% FCS, in the presence of CBaF, CBbF, CBaR

and CBbR (100 μg/mL for HeLa and 200 μg/mL for SiHa). After 24 h, the cells were

harvested washed twice with cold PBS and centrifuged, cell pellets were fixed in 70%

alcohol for 30 min at 4°C. After washing twice with PBS to remove alcohol excess, cells

were incubated in PBS containing 0.01% Triton-X and RNase (4 mg/mL) at 37 °C for 1 h.

Subsequently, 2 μL of PI and 200 μL of PBS were added protected from light. The DNA

content was analyzed using a FACS Calibur flow cytometer. A total of 10.000 events

were acquired. For data analysis was used FlowJo® Analysis Software version 9.3.2.

Data presented are representative of those obtained in at least two independent

experiments done in duplicates.

Statistical analysis

Two independent experiments were conducted in triplicate for each concentration of

tested compound. All values were presented as means ± SD and evaluated for

94

statistical significance with one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. P

values less than 0,05 were considered significant.

Results

Croton blanchetianus presents different classes of secondary metabolites

The phytochemical screening revealed the presence of terpenoids and alkaloids in all

extracts from leaves and roots of Croton blanchetianus tested, while flavonoids were

not only found in the fraction CBbF. In the TLC analysis, a complex chromatographic

profile was observed after spraying the plate with vanillin sulfuric acid. It was possible

to observe violet-purple bands in all fractions, suggesting the presence of terpenoids.

By spraying the chromatrogram with Dragendorff reagent (specific to identify alkaloids

compounds), the development of orange zones indicate the presence of alkaloids and

orange and blue fluorescent color (UV 365 nm) were observed in CBaF, CBaR and CBbR

using Natural Product Reagent (specific to identify flavonoids). This colors are

characteristics of flavonoids.

Croton blanchetianus exhibits cytotoxicity on HeLa and SiHa cells

To determine the effect of Croton blanchetianus extracts on the viability of HeLa and

SiHa cells, the MTT assay was conducted. HeLa and SiHa cells were treated with

different concentrations of CBaF, CBbF, CBaR and CBbR extracts (25, 50, 100, 200 and

400 µg/ mL) for 24, 48 and 72h. According to the results, all tested extracts

significantly decreased the viability of HeLa and SiHa cells in a dose- and time-

dependent manner, as shown in Fig. 1A-D and Fig. 2A-D. Based on the results of the

cytotoxicity assay, the IC50 was calculated for all extracts tested for both cells under

study (Table I). According to the IC50, it can be observed that HeLa cells was more

sensitive to treatments than SiHa cell, because lower concentrations of the extracts

were able to inhibit the viability of the cells by 50%, while for SiHa were required

higher concentrations to achieve the same cytotoxic effect. Other information is that

CBbF was the most potent in both cells having the lowest IC50 values.

95

Figure 1.Effect of extracts of Croton blanchetianus on the viability of HeLa cells. HeLa cells were treated with different

concentrations of CBaF, CBbF, CBaR and CBbR (25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) for 24, 48 and 72h. Treated cells with DMSO 1%

(vehicle) were used as control.The data represent the mean±SD of three replicates and two independent experiments. *

Significant difference from the control (p < 0.05).CISP = Cysplatin

Figure 2. Effect of extracts of Croton blanchetianus on the viability of SiHa cells. SiHa cells were treated with different

concentrations of CBaF, CBbF, CBaR and CBbR (25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) for 24, 48 and 72h. Treated cells with DMSO 1%

(vehicle) were used as control.The data represent the mean±SD of three replicates and two independent experiments. *

Significant difference from the control (P< 0.05). CISP = Cysplatin

96

Croton blanchetianus promotes morphological changes of HeLa and SiHa cells

The direct observation using an inverted microscope revealed that morphological

changes occurred in HeLa and SiHa cells treated with increasing concentrations (50 and

200 µg/ mL) of Croton Blanchetianus extracts for 24 h, such as shrinkage (reduced cell-

to-cell contacts) and membrane blebbing. In addition, the frequency of round cells

(probably dead cells) increased with increasing concentration (Fig. 3 e Fig.4).Among

the extracts tested, CBbF and CBbR were those that promoted greater morphological

changes in the strains studied.

IC50 Value ( µg/ mL)

Extract HeLa SiHa

24h 48h 72h 24h 48h 72h

CBaF 265.8 156.5 158.2 343.7 203.9 143.7

CBbF 147.7 118.1 106.9 207.3 185.0 104.1

CBaR 249.3 125.9 124.5 274.9 193.3 140.8

CBbR 267.8 98.8 113.8 249.7 169.4 125.5

Table I. IC50 values of the leaves and root extracts of Croton blanchetianus effects on HeLa and SiHa cell lines

for 24, 48, and 72 h treatments.

97

50 µg/ mL 200 µg/ mL 50 µg/ mL 200 µg/ mL

Controle Controle

CBaF

CBbF

CBaR

CBbR

Figure 3. Morphological changes of HeLa cells after treatment

with CBaF, CBbF, CBaR and CBbR. HeLa cells were treated with

extracts (50 and 200 µg/mL) for 24 h. DMSO 1% was used as

control. After incubation, the cells were examined under light

microscopy (100x).

Figure 4. Morphological changes of SiHa cells after treatment

with CBaF, CBbF, CBaR and CBbR. SiHa cells were treated with

extracts (50 and 200 µg/mL) for 24 h. DMSO 1% was used as

control After incubation, the cells were examined under light

microscopy (100X).

98

Croton blanchetianus induces apoptosis of HeLa and SiHa cells

In order to determine whether the cytotoxicity of CB extracts on HeLa and SiHa cells is

related to the induction of apoptosis, the percentage of cells undergoing apoptosis was

determined by dual staining with Annexin-V/ PI using flow cytometry (Fig. 5A and B).

With respect to HeLa, it can be observed that all extracts significantly increased the

percentage of positive cells for annexin (Annexin V-FITC + / PI-) compared to the

control, while the percentage of positive cells for PI (Annexin V-FITC / PI +) remained

low, suggesting an initial apoptosis. Among all the extracts, CBbF was the most induced

apoptosis in HeLa cells, increasing the percentage of positive cells for annexin (Annexin

V-FITC + / PI-) from 5.2% to 45.8%. Regarding the SiHa line, except CBbF extract, which

caused an increase only in the percentage of positive cells for annexin and PI (19.2%)

(Annexin V-FITC + / PI +), suggesting the presence of cells in late apoptosis, all other

extracts promoted an increase in both the percentage of positive cells for annexin and

PI (annexin V-FITC + / PI +) and, to a lesser extent, in positive cells only for PI (annexin

V-FITC / PI +) indicating the presence of a larger number of cells in late apoptosis than

necrosis.

Croton blanchetianus promotes morphological changes of HeLa and SiHa cel

Untreated

Figura 5. Croton blanchetianus induces apoptosis of HeLa and SiHa cells. (A) Representative FACS pictograms of HeLa cells

untreated and treated with CBaF, CBbF, CBaR and CBbR (200 µg/ mL) for 24h are shown. (B)Representative FACS

pictogramsofSiHacellsuntreatedandtreatedwithCBaF, CBbF, CBaRandCBbR (200 µg/ mL) are shown. PercentofAnnexin V-

positive (early-apoptoticcells, lowerright quadrante) andAnnexin V/PI-double-positive cells (late-apoptoticcells, upperright

quadrante) are indicated. (C, D) The graphs indicating the percent apoptosis for HeLa and SiHa cells, respectively.

CBaF CBbF CBaR CBbR

B

A

Annexin V-FITC

PI

99

Croton blanchetianus promotes morphological changes of HeLa and SiHa cells

HeLa and SiHa cells were treated with CBaF, CBbF, CBaR and CBbR concentration of

100 and 200 µg/mL, respectively, for 48h and nuclear morphology was observed after

staining with DAPI. In Figures 17 and 18 can be observed, respectively, HeLa and SiHa

cells presenting pyknotic nuclei, chromatin condensation and apoptotic bodies of

different sizes. These nuclear morphological changes are typical characteristics of cells

undergoing apoptosis process, which strengthens the hypothesis that the cytotoxic

activity of the tested extract is related to the induction of apoptosis in SiHa and HeLa

cells. It is worth noting that these morphological changes were observed more

frequently when CBBF was used.

D

Figura 6. Morphological changes of HeLa cells after treatment with for 48 h followed by DAPI staining. (A)

Fluorescence microscope photographs of untreated cells; (B) cells treated with CBaF; (C) cells treated with CBbF;

(D) cells treated with CBaR; (E) cells treated with CBbR. Arrows indicate apoptotic bodies of nuclear

fragmentation, chromatin condensation and pyknotic nuclei.

100

Croton blanchetianus regulated cell cycle in HeLa and SiHa cells

To give a more concrete comprehension of the mechanism of HeLa and SiHa cell

growth inhibition by CBaF, CBbF, CBaR and CBbR, the cell cycle was analyzed by flow

cytometry after PI staining. After treatment with CB extracts for 48 h, HeLa and SiHa

cells displayed a increase in the percentage of cells in the sub-G1 phase and a decrease

in the percentage of cells in the G0-G1 phase (Fig. 8 and 9), confirming cell apoptosis.

In the Hela line, CBbF promoted an increase of cells in the G2-M phase. In the SiHa line,

all extracts decreased the percentage of cells in S phase while CBaF, CBbF and CBbR

increased the percentage of cells in G2-M phase, suggesting that this extracts delayed

cell cycle progression by arresting cells in the G2-M phase.

Figura 7. Morphological changes of SiHa cells after treatment with for 48 h followed by DAPI staining. (A)

Fluorescence microscope photographs of untreated cells; (B) cells treated with CBaF; (C) cells treated with CBbF;

(D) cells treated with CBaR; (E) cells treated with CBbR. Arrows indicate apoptotic bodies of nuclear

fragmentation, chromatin condensation and pyknotic nuclei.

B

A

101

Discussion

Although surgery and chemoradiotherapy can cure 80-95% of women with

early-stage disease and 60% of loco-regionally advanced cancer, disease recurrence

and metastasis are still a problem. Recently, much attention has been given to

identifying new alternative approaches that reduce morbidity and the characteristic

side effects of conventional chemotherapy [10]. Currently, herbal medicine plays a

significant role in the prevention and treatment of cancer [34].

In this study,we investigated the cytotoxic and pro apoptotic effects of extracts

from the leaves and root of Croton blanchetianus. First, we avaluated the

phytochemical composition of the extracts from CB. According to the results of

phytochemical screening, terpenoids and alkaloids were found in all the extracts, while

flavonoids while were present in CBaF, CBaR and CBbR. These results are consistent

Untreated CBaF CBbF CBaR CBbR

DNA Content

A

B

Figura 8. Cell cycle analysis of HeLa and SiHa cells at 48 h. After treatment with CBaF, CBbF, CBaR and CBbR, cells were

collected and stained with PI, and then flow cytometry analysis was performed. (A) Representation of the dot plots obtained

from flow cytometry.

102

with other studies that found the same secondary metabolites in plants of genus

Croton, which is rich source of terpenoids, alkaloids and flavonoids. Qiu et al (2016)

isolated two new diterpenoids and a diterpenoid alkaloid from Croton crassifolius [35].

Other authors have demonstrated the presence of alkaloids and flavonoids in the

various organs of species such as Croton sparsiflorus [36], C. echinocarpus Baill [37], C.

bonplandianum Baill [38], C. betulaster [39] and C. sphaerogynus Baill [40].

Due to diverse chemical constitution, Croton blanchetianus presents great

biological potential. Thus, we analyzed in vitro cytotoxicity of the extracts against HeLa

and SiHa cells. The cell viability inhibition effect of CB in HeLa and SiHa cells was

evident by both MTT analyses and cell morphological assessment. After treatment

with CB, cells shown typical apoptotic features characterized by shrinkage and

membrane blebbing. We also demonstrated that extracts of CB significantly decreased

the cell viability in both cell lines in dose- and time-dependent manner. However, HeLa

cells were more susceptible to the CB cytotoxic effect than SiHa cells according to the

IC50 values. Therefore, one can hypothesize this different susceptibility to the extracts

action can be for fate that HeLa and SiHa cells have different kind of HPV virus. HeLa

cells possess HPV 18, whereas HPV 16 is found in SiHa cells. For example, cisplatin, a

widely-used chemoterapy drug, also was more effective on HeLa cells compared to

SiHa cells [41]. Several studies have shown that species of the genus Croton have

cytotoxic activity. Recently, new diterpenoids were isolated from Croton tiglium L and

in vitro cytotoxic evaluation revealed that most new compounds displayed cytotoxic

activities against A549 (human lung adenocarcinoma epithelial), HL-60 (Acute

PromyelocyticLeukemia), HeLa and SGC-7901 (human gastric cancer) [30, 42].Another

study evaluated the cytotoxic activity of Croton caudatus var. tomentosus that

exhibited moderate inhibitory activity against HeLa, Hep G2 (human liver carcinoma),

MDA-MB-231 (human metastatic breast adenocarcinoma) and A549 [43].

Given the cytotoxic effect of CBaF, CBbF, CBaR and CBbR on HeLa and SiHa

cells, it could be deduced that any pathway of cell death was triggered by these

extracts. Therefore, other tests were conducted for this process to be better

understood. The data obtained from the nuclear morphologic analysis (fluorescence

microscopy) showed various characteristic structures of cells undergoing apoptosis

commonly described by several authors, such as chromatin condensation, apoptotic

103

bodies by nuclear fragmentation and presence of pyknotic nuclei. Similar results were

obtained by Das et al (2012) that evaluate nuclear changes caused by a triterpene

extracted from Phytolacca decandra where pulmonary adenocarcinoma cells treated in

vivo and in vitro with the compound showed chromatin condensation [44].

To further characterize the mechanism of death caused by Croton

blanchetianus extracts, flow cytometric analyzes were also performed after treatment

of HeLa and SiHa cells with the extracts.In the evaluation of cell death, our studies

demonstrated that Croton blanchetianus induced apoptosis in HeLa and SiHa cells,

shown by labeling externalized phosphatidylserine residues in the cell membrane by

Annexin V, a primary event of the apoptotic process. In the cell cycle analysis, there

was an increase in positive markings in sub-G1, indicating that they induce cell death

by activating apoptosis, and some enriched extracts inhibited cell proliferation by

promoting cell cycle arrest in G2/ M phase. As in our study a diterpene isolated from

Croton tonkinensis was also able to increase the proportion of colorectal cancer cells

stained with annexin V, showing that underwent apoptosis [45]. Other terpene

isolated from Santalum albumLinn induced apoptosis and inhibited cell proliferation

while promoting cell cycle arrest in G2/ M phase [46]. Alkaloids extracted from

Chelidonium majus L. (Papaveraceae) also exhibited apoptogenic properties on human

leukemic cells by causing exposure of phosphatidylserine, increase the number of cells

in sub-G1 phase of the cell cycle and cause cell cycle arrest in G2/ M [47].

HPV have developed numerous strategies to block host-mediated apoptosis,

mainly through viral oncoproteins HPV-E6 and HPV-E7. E7 exerts its effect by

inactivation of the Retinoblastoma 1 (Rb1) tumor suppressor gene, while E6 promotes

ubiquitin-mediated degradation of the p53 tumor suppressor. As a result of the action

of oncoproteins, HPV-positive cervical cancer cells display a significantly impaired

ability to activate cell cycle checkpoints and to induce apoptosis [48]. Nevertheless, CB

was able to induce apoptosis in HPV-16 (SiHa) and HPV 18 (HeLa) positive human

cervical cancer cell lines.

In summary, HeLa and SiHa cells exposed to CBaF, CBbF, CBaR and CBbR

exhibited morphological and biochemical changes, as shown by the loss of cell viability,

cell retraction, membrane blebbing, chromatin condensation, nuclear fragmentation,

externalization of phosphatidylserine, accumulation of cell debris in the sub-G1 phase

104

and cell cycle arrest at G2/M phase. These data, taken together, lead to propose that

the cytotoxic effect of Croton blanchetianus extracts is mainly due to their ability to

induce apoptosis.

More studies are needed to clarify the mechanisms by which CB is inducing

apoptosis. However, some researchs have described the mechanisms by which other

species of the Croton sp. induced cell death.Afriyie et al (2015) showed that an extract

obtained from Croton membranaceus root induced apoptosis throughupregulation of

mRNA and protein levels of Bax in the Benign prostatic hyperplasiacells [49]. Another

study reaveled that a kaurene diterpene isolated from Croton antisyphiliticus induced

apoptosis by inhibition of NF-κB and activation of caspase 8 [50].

In conclusion, this is the first study that demonstrated cytotoxic and pro

apoptotic properties of Croton blanchetianus on HeLa and SiHa cells. Therefore, Croton

blanchetianus appears to be a valuable natural source for the development of agents

for the treatment of cervical cancer. Further studies are in progress to isolate and

identify the compounds responsible for the observed activities.

Conflict of interest statement The authors declare that they have no conflicts of interest to report.

Acknowledgments

This work was supported by grants from Coordenação de Apoio de Pessoal deNível

Superior (CAPES) through Programa Nacional de CooperaçãoAcadêmica (PROCAD). The

authors would like thank the Departament of Biochemitry of Federal University of Rio

Grande do Norte for allowing us to use the facilities of the cell culture room.

105

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · mundo todo e a quarta principal causa de morte...

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