Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho ... · presentes em todos os momentos me...

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas

Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland: Caracterização biológica e

prospecção terapêutica do extrato metanólico incorporado ou não

em sistema nanoestruturado para aplicação no tratamento da

candidíase vulvovaginal.

Matheus Aparecido dos Santos Ramos

Profa. Dra. Taís Maria Bauab

Orientadora

Araraquara

2015

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas

Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland: Caracterização biológica e

prospecção terapêutica do extrato metanólico incorporado ou não

em sistema nanoestruturado para aplicação no tratamento da

candidíase vulvovaginal.

Matheus Aparecido dos Santos Ramos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área

de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e

Medicamentos, da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, UNESP, como parte dos

requisitos necessários para a obtenção do Título

de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Profa. Dra. Taís Maria Bauab

Orientadora

Araraquara

2015

Dedicatória

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Matheus Ap. Santos Ramos

Dedicatória

Aqui quero dedicar não só este trabalho, mas todas as lutas, todas as

glórias e todo meu amor à mulher que representa o mais belo dos

sentimentos, o amor. Quero dedicar todos os sorrisos, todas as bênçãos e

tudo que ainda está por vir. Dedico este trabalho a mais guerreira de todas

as mulheres, a mais sensata e a mais humana que já conheci. Aquela que

consegue olhar no fundo dos meus olhos e ver além daquilo que é

transparecido. Com muito amor no coração e em minha alma, digo com

toda certeza do mundo que tudo isso é para você minha MÃE (Fátima

Ramos), e aproveito para agradecer a Deus me dar o privilégio de me fazer

seu filho.

Eu amo você mamãe!!!

Agradecimento Especial

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Agradecimento especial

Repleto de uma emoção sem tamanho sentida ao escrever este

agradecimento, quero dizer que hoje eu acredito com toda a certeza do

mundo que existem anjos sem asas que habitam a terra, anjos que fazem

dos nossos dias mais intensos, mais produtivos e cheios de vitórias.

Aqui quero deixar toda minha gratidão a peça chave deste trabalho,

a mulher responsável por todo meu crescimento profissional e pessoal,

simplesmente por me fazer crescer mais e mais a cada dia, além disso,

aquela que representa o meu espelho de um profissional do futuro. Com um

imenso respeito e admiração agradeço a minha orientadora (professora,

amiga...mãe), Profa. Dra. Taís Maria Bauab, que desde o primeiro dia me

aceitou não só como mais um orientado, mas como um merecedor de tudo

aquilo que me proporcionou e continua me proporcionando a cada dia.

É quase impossível descrever toda gratidão que sinto, uma vez que

neste trabalho estão minhas lutas, glórias e desejos, mas apesar de tudo isso

existe algo maior, algo que me impulsionou a enxergar além daquilo que se

pode ver, sendo assim, este trabalho representa o sonho da minha vida,

aquilo que dá essência a todos os dias de luta e perseverança e nada disso

teria acontecido sem uma sábia orientação amor e confiança.

Deixo o meu muito obrigado a esta profissional que abriu todas as

portas e deu todas as possibilidades para tornar meu sonho realidade.

Obrigado por me fazer um aluno melhor a cada dia e sempre confiar

naquilo que faço.

Agradecimentos

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Agradecimentos

Acredito que ninguém consegue nada sozinho. Todas as conquistas

são acompanhadas de pessoas que contribuem para sua concretização,

sejam elas de maneira direta ou indireta. Aqui quero agradecer todas as

pessoas que fizeram do meu sonho a realidade que vivo hoje!

Dou início agradecendo toda proteção espiritual e tudo que sou.

Virtudes oriundas de três elementos muito importantes em minha vida, Deus,

Jesus Cristo e Nossa Senhora de Aparecida. Obrigado por sempre estarem

presentes em todos os momentos me dando coragem e força para não

desistir daquilo que sempre acreditei e alimentei em meu coração.

Agradeço as quatro partes que compõem o meu coração e minha alma...

(1) A minha mãe Fátima Ramos por todo amor, amizade e compreensão.

Novamente repito, você é a luz da minha vida e a força que me leva além

daquilo que eu posso ver e imaginar. Amo-te mais que a mim mesmo.

(2) Ao meu pai Edivaldo Ramos, aquele que acredito ser o responsável por

toda minha garra e determinação, uma vez que geneticamente transferiu

isso a mim. Obrigado pelo apoio e respeito ao meu sonho.

(3) A minha irmã, Natalia Ramos, por sempre estar ao meu lado e dar conta

do recado perante toda a minha ausência. Obrigado por ser quem é e por

dar sentido a minha vida. Obrigado por fazer parte da minha história e do

meu dia a dia. Não consigo imaginar um futuro sem você por perto, sendo

assim, te levo sempre comigo ande quer que eu vá. Amo-te

incondicionalmente.

(4) Ao meu sobrinho Pedro Henrique Ramos Araújo, que banhado de

inocência de criança me traz força para querer ainda mais alcançar todos

Agradecimentos

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os meus objetivos. O futuro nos pertence meu anjinho e o titio sempre estará

lutando por você. Amo você meu pedacinho de chão.

Aos meus avós José Joaquim Santos e Matilde Santos. O amor e

simplicidade de vocês me dão força para crescer e lutar por aquilo que

quero. Amo cada um de vocês da forma mais bonita e transparente que

existe.

Ao meu avô Guilhermino Ramos (in memorian), que aonde quer que

esteja me transmite a certeza da sua proteção e amor em todos os

momentos. Tantos anos se passaram e sua presença ainda é constante na

minha vida e sei que me protege de todos os perigos e me dá forças para

buscar tudo aquilo que almejo. Saudades do seu carinho!

Agradeço com o coração repleto de amor e extrema gratidão a

pessoa que me mostrou que eu sou capaz de fazer tudo o que faço. A

pessoa que me olhou nos olhos e disse “vai, você é capaz e tem potencial”,

aquela que sempre está ao meu lado em todos os momentos e todas as

ocasiões, que dança, ri, chora e sofre comigo. Todo o meu agradecimento a

você, Luciani Gaspar de Toledo, minha amiga, irmã de alma e minha

protetora incondicional. Obrigado por sempre estar presente e fazer essa

caminhada algo mais fácil, com mais sentido. Obrigado por permanecer

firme na nossa promessa de nunca nos separarmos por onde quer que

qualquer um esteja. Agradeço-te não só por ser quem é, mas por me deixar

fazer parte da sua vida e partilharmos juntos os mesmos sonhos. Amo você

minha loirinha.

Ao meu amigo, companheiro e inseparável parceiro Felipe Guioti que

tem um papel de extrema importância na minha vida e no meu dia a dia.

Obrigado por estar sempre comigo, por partilhar meus problemas e

simplesmente por ser assim como é. Acredito que aqui não conseguirei

explicar a dimensão do que você representa para mim, mas tenha certeza

de uma coisa, você fez e faz toda diferença na minha vida.

Agradecimentos

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Ao meu primo e melhor amigo, Robson Zanovello simplesmente por ser

parte de mim e meu porto seguro. Obrigado por todo amor, todo carinho e

companheirismo de sempre. Amo você!

À Profa. Dra. Margarete Teresa Gottardo de Almeida simplesmente por

ter sido a primeira a acreditar na minha capacidade e me dar a

oportunidade de mostrar aquilo que eu sou e posso ser ao me receber em

seu laboratório. Agradeço-a de todo o meu coração por sempre estar

disposta a ajudar e contribuir para o meu conhecimento profissional.

Aos integrantes do “quinteto fantástico”, meus amigos de infância, de

longas datas e que sempre estão ao meu lado mesmo com toda distância e

ausência: Ana Paula Barreto, Giovani Jacomini, Amábili Souza e Bruno

Pelegrini. Sem o apoio, amizade e amor de todos vocês essa jornada seria

muito mais difícil e cheia de saudade. Amo vocês de uma forma

inexplicável.

Na mesma intensidade que acima descrevi, agradeço minha amiga e

mãe postiça Silvana Barreto (Balaco), por sempre me receber com um sorriso

no rosto e fazer de todas as minhas voltas para casa muito mais especiais.

Aos amigos que conquistei ao longo desta caminhada: Sérgio

Muknicka (Celini), Leandro Lopes (Lebito), Camila Benjamim, Fábio Garcia,

Hércules Dias, Carlos Eduardo Brantis (MK) e Alex Canavesi,. Vocês fizeram e

fazem toda diferença todos os dias. Obrigado pelo carinho e todos os finais

de semana rindo e curtindo juntos. Cada um tem um significado muito

importante para mim.

A Larissa Sposito (Laruxa), que em tão pouco tempo já tem um espaço

todo especial dentro do meu coração. Obrigado por tudo que sempre está

disposta a fazer por mim.

Um grande obrigado a todos os funcionários do Departamento de

Ciências Biológicas (DCB) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Araraquara (minha morada), em especial à equipe técnica da disciplina

microbiologia, Ednéia, Débora, Marisa e Silvia, por sempre estarem dispostas

a ajudar e dar todo suporte necessário.

Agradecimentos

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A toda equipe do meu local de trabalho, segunda casa e meu lugar

predileto de Araraquara, “Laboratório de Fiosiologia de Micro-organismos”.

Cada um de vocês (Bruna Bonifácio, Kamila Negri, Victor Lucena (Mano),

Angélica Dias (Anchélica), Felipe Hilário (Fililipinho), Patricia Bento, Isadora

Masiero, Raquel Martins (Rouge), Maria Luiza Duarte (Malu), Erina Samezima,

Tais Jovenazzo, Beatriz Souto, Julia Hunger e a mais nova integrante Larissa

Sposito) tem uma grande contribuição em tudo o que foi feito até agora,

agradeço-os de todo o meu coração. Obrigado pelas amizades,

brincadeiras e por me deixarem fazer parte do dia a dia de vocês.

A toda equipe do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de

Medicina de São José do Rio Preto-FAMERP, meu primeiro contato com a

pesquisa. Natália Seron, Eduardo Reis, Mayara Gambellini, Mayra Arroyo e

Luis Paulo Teixeira, obrigado por me ajudar a dar os primeiros passos e fazer

da minha iniciação científica uma das melhores épocas da minha vida. Na

mesma intensidade de amor, quero agradecer a super técnica deste

laboratório, Luceli Ferreira. Obrigado por sempre estar disposta a ajudar

quem quer que seja e por ter pegado na minha mão a primeira vez que eu

entrei no laboratório, você foi uma peça indispensável para o início da

minha jornada.

A todos os amigos do Laboratório de Micobacteriologia da FCFAR,

Érica Lopes, Leonardo Marinho, Paula Souza, Isabel Silva, Joas Silva, Camila

Maringolo, Débora e Cesar (mini), por partilharem de um companheirismo

saudável e cheio bons momentos. Agradeço também ao responsável pelo

laboratório, Prof. Dr. Fernando Pavan por toda prestatividade para a

realização dos ensaios de citotoxicidade.

A doutoranda Giovana Calixto por toda ajuda com o

desenvolvimento farmacotécnico deste trabalho. Obrigado por me dar todo

o suporte e prestatividade de sempre.

Agradeço ao Prof. Dr. Marlus Chorilli por me dar a chance de trabalhar

sob sua supervisão na área de nanotecnologia farmacêutica, além de

Agradecimentos

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sempre estar disponível para ajudar em tudo que fosse necessário. Obrigado

por me dar a chance de continuar nesta área durante o meu doutorado.

À Profa. Dra. Lourdes Campaner dos Santos pela doação da planta

para que este trabalho pudesse ser realizado.

Agradeço a secretária do DCB Margarete Rossi, não só por sempre

estar disposta a me ajudar em tudo o que for preciso e também pela sua

risada contagiante e cheia de alegria, mas também por ter se tornado uma

amiga, a qual tenho muito estima e quero que esteja sempre comigo.

Marga, você fez toda a diferença nestes anos.

A Joselma Duque (Jojoca), técnica do Laboratório de Saúde Pública,

por todo carinho e amor que sempre teve comigo e com todos os que estão

ao seu redor. Nossos almoços ao seu lado são inigualáveis!

Com muito carinho agradeço a toda equipe da limpeza da FCFAR,

em especial, agradeço as funcionárias Nice e Edna por sempre cuidarem

muito bem não só do meu local de trabalho, mas por se importarem comigo

e transmitir a mim um amor puro e livre de pretensões. Amo vocês meninas!

Às meninas da portaria, Olivia e Tiana, por sempre me receberem com

um sorriso no rosto desejando coisas boas para o dia.

Ao Prof. Dr. Leonardo Gorla, que mesmo ausente do laboratório tem

colaborado para o meu crescimento profissional.

Ao Prof. Dr. Marcelo Araújo por todo suporte para o desenvolvimento

dos ensaios in vivo.

Às meninas da seção técnica de Pós-graduação, Claudia, Joyce,

Daniela e Flávia, agradeço por toda a prestatividade de sempre. Vocês são

demais.

A todos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-

UNESP/FCFAR.

A biblioteca da FCFAR pela disponibilidade de ajuda nas correções

das referências bibliográficas desta dissertação.

A CAPES pelo auxílio financeiro concedido.

RESUMO

O uso indiscriminado e generalizado de drogas antifúngicas levou a um rápido desenvolvimento de cepas resistentes aos medicamentos empregados na terapêutica clínica, caracterizando-se como a principal causa de inúmeros casos de inadequação do pacienta à terapia medicamentosa disponível. Os produtos naturais vêm ganhando destaque nos últimos anos por fornecer uma nova abordagem medicamentosa para o tratamento de processos patológicos, dentre esses, os infecciosos. No decorrer da evolução genética e fisiológica dos micro-organismos, as ciências microbiológicas encontram-se em expansão, preocupando-se em introduzir novas triagens terapêuticas frente às afecções fúngicas, com especial atenção àquelas adquiridas por espécies do gênero Candida. Isto se deve das Candidas serem as leveduras mais frequentemente envolvidas nas infecções micóticas capazes de causar dano ao organismo humano, como a candidíase vulvovaginal. O uso de produtos naturais na descoberta de novos antifúngicos mostra-se de extrema importância, a exemplo, destaca-se a espécie Syngonanthus nitens que vem se mostrando ativa na descoberta do potencial antifúngico contra Candida spp. A nanotecnologia farmacêutica apresenta-se como uma importante ferramenta para aprimorar a biodisponibilidade de produtos de origem natural, ao oferecer sistemas de liberação de fármacos modernos como os sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM) empregados para veiculação de extratos vegetais. As plantas pertencentes a família Eriocaulaceae mostram-se promissoras na atividade antifúngica, o que instiga o aprofundamento destas investigações, assim como a descoberta de novos métodos de aplicabilidade. Frente ao atual cenário, este trabalho teve o objetivo de avaliar o potencial antifúngico do extrato metanólico de escapos de Syngonanthus nitens incorporado e não incorporado em SPCLM voltado ao tratamento da candidíase vulvovaginal. O estudo foi desenvolvido aplicando-se metodologias in vitro e in vivo para elucidar o perfil antifúngico pretendido, tendo-se obtidos resultados satisfatórios no que se diz respeito à aplicabilidade do mesmo no tratamento e prevenção da CVV. Nos resultados foram observados que o extrato vegetal mostrou-se ativo contra todas as cepas empregadas no estudo além de mostrar-se satisfatório nos testes biológicos realizados, todavia, apresentou ação superior quando foi incorporado no sistema de liberação de fármacos, mostrando que a incorporação no sistema apresenta vantagens em relação ao extrato na forma não incorporada. Como conclusão, observou-se que o extrato é ativo contra as espécies de Candida, além de que a incorporação do mesmo no SPCLM desenvolvido potencializou suas propriedades antifúngicas, uma vez que foi evidenciado aumento da atividade sobre todas as linhagens de Candida analisadas, além disso, pode-se concluir que o sistema pode ser um importante veículo para aplicação de princípios ativos por via intravaginal.

Palavras-chave:; Syngonanthus nitens; Candida sp.; Candidíase vulvovaginal; Nanotecnologia farmacêutica; Sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos.

ABSTRACT

The indiscriminate and widespread use of antifungal drugs with potential led to a rapid development of resistant strains to drugs used in clinical, therapeutic and this is characterized as the main cause of numerous cases of inappropriate patient to drug therapy available. Natural products have been gaining prominence in recent years for providing a new drug therapy for the treatment of pathological processes, among these, infectious. During the genetic and physiological evolution of micro-organisms, microbiological sciences are expanding, worrying to introduce new therapeutic trials ahead to fungal diseases, with special attention to those acquired by Candida species, this being one of yeasts more often involved in mycotic infections can cause harm to human body, such as vulvovaginal candidiasis. The use of natural products in the discovery of new antifungal is extremely important, the example, is the Syngonanthus nitens species (gold grass) that has proved active in the discovery of antifungal potential against Candida spp. The pharmaceutical nanotechnology presents itself as an important tool to improve the bioavailability of natural product origin, offering modern drug release systems as precursors of mucoadhesive liquid crystal systems (PMLCS) employees for placement of plant extracts. The plants belonging to family Eriocaulaceae show promise in antifungal activity, which encourages the deepening of these investigations, as well as the discovery of new methods of applicability. Front of the current scenario, this work aimed to evaluate the antifungal potential of the methanol extract of Syngonanthus nitens scapes incorporated and not incorporated in PMLCS focusing on the treatment of vulvovaginal candidiasis. The study was conducted by applying in vitro and in vivo antifungal methods intended to elucidate the profile, having obtained satisfactory results as regards the applicability thereof in the treatment and prevention of VVC. The results were observed that the herbal extract was shown to be active against all strains used in the study as well as prove satisfactory in biological tests, in addition to presenting top action when it was incorporated into the drug delivery system. In conclusion, it was observed that the extract is active against Candida species, besides the incorporation of even PMLCS developed improved its antifungal properties, since an improvement in activity was observed in all the strains of Candida analyzed further , one can conclude that the system can be an important vehicle for the application of active ingredients intravaginally

Keywords: Syngonanthus nitens; Candida species; Vulvovaginal candidiasis;

Pharmaceutical Nanotechnology; Precursor mucoadhesive liquid crystal systems

Lista de Figuras

Figura 1. Fotomicrografia de C. albicans (8500x) .................................................................. 29

Figura 2. C. krusei observada sob microscopia óptica (100x)................................................ 30

Figura 3. Fotomicrografia de Candida glabrata (8500x) ......................................................... 32

Figura 4. C. tropicalis observada sob microscopia óptica (100x) ........................................... 33

Figura 5. C. parapasilosis observada por microscopia óptica (100x)..................................... 35

Figura 6. Estruturas de naftopiranonas e xantonas comuns em plantas da .......................... 44

Figura 7. Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhlland – “capim dourado” .................................... 45

Figura 8. Artesanato produzido com os escapos de S. nitens ............................................... 46

Figura 9. Representação esquemática o arranjo dos cristais líquidos em função da ........... 54

Figura 10. Constituintes do SPCLM ........................................................................................ 65

Figura 11.Ensaio de microdiluição com levedura revelado com TCC.................................... 70

Figura 12. Reação de oxidação do TTC ................................................................................. 71

Figura 13. Ensaio do biofilme in vitro revelado com XTT ....................................................... 73

Figura 14.Reação de redução do XTT .................................................................................... 74

Figura 15. Diagrama de fases pontual do SPCLM constituído de AO (fase oleosa), PRO

(tensoativo) e DP (fase aquosa). ............................................................................................. 83

Figura 16. Fotomicrografia do ensaio com MVA por microscopia de luz polarizada sob

aumento de 20x ........................................................................................................................ 87

Figura 17. Formulações submetidas à análises reológicas contínuas ................................... 87

Figura 18. Reograma da formulação 25 (F25) ........................................................................ 88

Figura 19. Reograma da formulação 26 (F26) ........................................................................ 88

Figura 20. Trabalho da força bioadesiva ................................................................................. 90

Figura 22. Trabalho da força mucoadesiva F26 ..................................................................... 91

Figura 23. Força mucoadesiva de F26..................................................................................79

Figura 24. Formulação 25* com o extrato incorporado ......................................................... 92

Figura 25. Formulação 26* com o extrato incorporado .......................................................... 92

Figura 26. Formulação 25 antes e após a incorporação do extrato ....................................... 92

Figura 27. Formulação 26 antes e após a incorporação do extrato ....................................... 93

Figura 28. Fotomicrografia de 12 horas do ensaio de inibição de hifa de C. albicans (ATCC

10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X ............. 97


10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X ............. 97


10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X . 98


10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X . 98

Figura 32. Time kill de C. albicans ATCC 10231………………..…………………………....…90

Figura 33. Time kill de C. albicans CAV 3............................................................................. 102

Figura 34. Time kill de C. krusei ATCC 6258.........................................................................91

Figura 35. Time kill de C. krusei CKV 3………………..……………………………………...…91

Figura 36.Time kill de C. glabrata ATCC 2001 ……………………..…………………………..91

Figura 37. Time kill de C. glabrata CGV 3 ............................................................................ 103

Figura 38.Time kill de C. tropicalis ATCC 750.......................................................................92

Figura 39. Time kill de C. tropicalis CTV 2.............................................................................92

Figura 40.Time kill C. parapsilosis ATCC22019……………..…………………………………..92

Figura 41. Time kill C. parapsilosis ....................................................................................... 104

Figura 42. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa .......... 105

Figura 43. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa .......... 106

Figura 44. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa ATCC após dois ................. 106

Figura 45. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa CAV 3 após dois ................. 107

Figura 46. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio terapêutico de CVV in vivo

com a cepa ATCC 10231 ....................................................................................................... 107


com a cepa CAV 3 .................................................................................................................. 108

Figura 48. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio de profilaxia ................... 111

Lista de Tabelas

Tabela 1. Relação de cepas clínicas de Candida sp. ............................................................. 63

Tabela 2. Cepas fúngicas e concentração dos extratos usados no ensaio de time kill ........ 75

Tabela 3. Grupos experimentais e tratamentos do ensaio de tratamento da CVV causada

por C. albicans. ......................................................................................................................... 78

Tabela 4. Considerações gerais dos grupos experimentais do ensaio profilático ................. 80

Tabela 5. Formulações analisadas por MLP ........................................................................... 84

Tabela 6. Resultados da microscopia de luz polarizada para a avaliação do comportamento

precursor de cristais líquidos da formulação 25 ...................................................................... 85


precursor de cristais líquidos da formulação 26 ...................................................................... 86

Tabela 8. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações em

contato com MVA ..................................................................................................................... 89

Tabela 9. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações sem a

adição de MVA ......................................................................................................................... 90

Tabela 10. Concentração inibitória mínima do extrato metanólico de escapos de S. nitens

não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. albicans ............................................. 93


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. krusei................................................. 94


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. glabrata ............................................. 94


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. tropicalis ............................................ 94


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. parapsilosis ....................................... 95

Tabela 15. Resultados da análise de citotoxicidade in vitro ................................................... 96

Tabela 16. Resultados da avaliação do perfil de inibição hifal exercido pelo extrato de S.

nitens não incorporado sobre C. albicans (ATCC 10231) ....................................................... 96


nitens incorporado no SPCLM sobre C. albicans (ATCC 10231) ........................................... 98

Tabela 18. Controles e ação do extrato não incorporado e incorporado no SPCLM frente aos

biofilmes de C. albicans ........................................................................................................... 99


biofilmes de C. krusei ............................................................................................................. 100


biofilmes de C. glabrata .......................................................................................................... 100


biofilmes de C. tropicalis ........................................................................................................ 101


biofilmes de C. parapsilosis .................................................................................................... 101

Tabela 23. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os

animais do ensaio experimental ............................................................................................. 110

Tabela 24. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os

grupos do ensaio experimental .............................................................................................. 113

Lista de abreviaturas e siglas

AO- Ácido Oleico

ASD- Ágar Sabouraud Dextrose

ASD+clo- Ágar Sabouraud Dextrose acrescido de cloranfenicol

ATCC- Americam Type Culture Collection

CE- Campo escuro

CEUA- Comitê de Ética do Uso de Animais

CFM- Concentração Fungicida Mínima

CIM- Concentração Inibitória Mínima

CL- Cristal Líquido

CLL- Cristais líquidos Liotrópicos

CLSI- Clinical Laboratory Standart Institute

CLT- Cristais Líquidos Termotrópicos

CM- Cruz de Malta

CP C974P- Carbopol®

CP- ciclofosfamida

CSD- Caldo Sabouraud Dextrose

CVV- Candidíase Vulvovaginal

CVVR- Candidíase Vulvovaginal Recorrente

DMSO- Dimetilsulfóxido

DP- Dispersão Polimérica

E- Estrias

E+CM- Estrias com Cruz de Malta

FA- Fase Aquosa

FO- Fase Oleosa

HPV- Human Papiloma Virus

MLP- Microscopia de Luz Polarizada

MOPS-Ácido 3-[N-morfino] propanossulfônico

MVA- Muco Vaginal Artificial

OMS- Organização Mundial da Saúde

PBS- Phosphate Buffered Saline (Tampão Fosfato de Sódio)

PP- Policarbofil®

PRO- Procetyl® AWS

RPMI 1640- Roswell Park Memorial Institute medium

SIDA- Síndrome de Imunodeficiência Adquirida

SLC- Sistema Líquido Cristalino

SLT- Sistema Líquido Transparente

SLTr- Sistema Líqiuido Translúcido

SPCL- Sistema Precursor de Cristais Líquidos

SPCLM- Sistema Precursor de Cristais Líquidos Mucoadesivos

SUS- Sistema Único de Saúde

SVO- Sistema Viscoso Opaco

SVT- Sistema Viscoso Transparente

SVTr- Sistema Viscoso Translúcido

T- Tensoativo

TTC- Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio

UFC- Unidade Formadora de Colônia

UFC/mL- Unidade Formadora de Colônia por mililitro

VB- Vaginose Bacteriana

XTT- 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5- [carbonilo (fenilamino)]-2H-tetrazólio-

hidróxido

Sumário

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 20

2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 24

2.1. Principais doenças infecciosas vaginais ............................................................ 24

2.1.2. Candidíase vulvovaginal ................................................................................ 25

2.1.2.1. Principais espécies de Candida envolvidas na candidíase vulvovaginal ..... 27

2.1.2.1.1. Candida albicans (C. albicans) ................................................................. 28

2.1.2.1.2. Candida krusei (C. krusei) ........................................................................ 29

2.1.2.1.3. Candida glabrata (C. glabrata) ................................................................. 31

2.1.2.1.4. Candida tropicalis (C. tropicalis) ............................................................... 32

2.1.2.1.5. Candida parapsilosis (C. parapsilosis) ...................................................... 34

2.1.2.2. Principais fatores de virulência de Candida spp. ......................................... 35

2.2. Plantas medicinais e Fitoterápicos .................................................................... 37

2.2.1. Produtos naturais como novos agentes antimicrobianos ................................ 40

2.2.3. A família Eriocaulaceae .................................................................................. 43

2.2.3.1. O gênero Syngonanthus............................................................................. 44

2.2.3.1.1. Syngonanthus nitens (Bong.) Rulland ...................................................... 44

2.2.3. Determinação da atividade antimicrobiana de produtos naturais .................... 47

2.2.4. Ensaios experimentais in vivo de candidíase vulvovaginal ............................. 48

2.3. Nanotecnologia farmacêutica como ferramenta para o aprimoramento de

princípios bioativos naturais ..................................................................................... 50

2.3.1. Sistemas líquido-cristalinos ............................................................................ 53

3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 60

3.1. Objetivo geral .................................................................................................... 60

3.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 60

4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 62

4.1 Procedência e preparação do extrato vegetal .................................................... 62

4.2. Cepas fúngicas ................................................................................................. 63

4.2.1. Preparo das suspensões fúngicas .................................................................. 64

4.3. Desenvolvimento do sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos

(SPCLM) .................................................................................................................. 64

4.3.1. Elaboração do diagrama de fases ternário ..................................................... 65

4.3.1.1. Análise por microscopia de luz polarizada (MLP) ........................................ 66

4.3.1.2. Seleção das formulações para análises farmacotécnicas e biológicas ........ 66

4.3.1.3. Ensaio do efeito muco nos sistemas ........................................................... 66

4.3.1.4. Análises reológicas contínuas (curva de fluxo) ............................................ 67

4.3.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva ...................................................... 68

4.3.2. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM ................................................... 68

4.4. Ensaios antifúngicos in vitro .............................................................................. 69

4.4.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ................................. 69

4.4.1.1. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ............................ 69

4.4.1.2. Leitura com revelador .................................................................................. 70

4.4.3. Análise citotóxica in vitro ................................................................................ 71

4.4.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans ............. 72

4.4.5. Formação de biofilme in vitro ......................................................................... 72

4.4.6. Ensaio Time kill .............................................................................................. 74

4.5. Ensaios experimentais de CVV in vivo .............................................................. 75

4.5.1. Ensaio terapêutico experimental in vivo de CVV causada por C. albicans ..... 76

4.5.1.1. Grupos experimentais e tratamento terapêutico .......................................... 77

4.5.1.2. Análise da eficácia do tratamento ................................................................ 78

4.5.1.3. Análise da recidiva de infecção e eutanásia ................................................ 79

4.5.1.4. Análises estatísticas .................................................................................... 79

4.5.2. Ensaio in vivo de profilaxia de CVV causada por C. krusei ............................ 79

5. RESULTADOS ..................................................................................................... 83

5.1. Desenvolvimento do sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos ....... 83

5.1.1. Elaboração do diagrama de fases ternário ..................................................... 83

5.1.1.1. Microscopia de luz polarizada (MLP) ........................................................... 84

5.1.2. Escolha da formulação para análises farmacotécnicas e biológicas ............... 84

5.1.3. Ensaio de efeito muco nos sistemas .............................................................. 85

5.1.4. Análises reológicas contínuas (Curva de fluxo) .............................................. 87

5.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva (mucoadesão) ................................. 90

5.1.6. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM ................................................... 91

5.2. Análises antifúngicas in vitro ............................................................................. 93

5.2.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ................................. 93

5.2.2. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ............................... 95

5.2.3. Análise citotóxica in vitro ................................................................................ 96

5.2.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans ............. 96

5.2.5. Ensaio de inibição do biofilme in vitro ............................................................. 99

5.2.6. Ensaio Time kill ............................................................................................ 102

5.3. Análises antifúngicas in vivo............................................................................ 105

5.3.1. Ensaio terapêutico de CVV causada por C. albicans ................................... 105

5.3.2. Ensaio profilático de CVV causada por C. krusei ......................................... 111

6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 115

7. CONCLUSÃO .................................................................................................... 146

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 148

9. Anexos ............................................................................................................... 166

__________________________________________________

__________________________________________________ Matheus Aparecido dos Santos Ramos

1. Introdução

Não faças de ti um sonho a realizar. Vai. Sem caminho marcado. Tu és o de todos os caminhos.

(Cecília Meireles)

Introdução 20

__________________________________________________

__________________________________________________ Matheus Ap. Santos Ramos

1. INTRODUÇÃO

Dentre os micro-organismos responsáveis por promover estados patológicos

que levam ao declínio da saúde humana, encontra-se àqueles pertencentes ao

gênero Candida, estando associados a casos de infecções superficiais, profundas e

sistêmicas, com destaque aos portadores de doenças de base como o diabetes, e

também em imunossuprimidos, neutropênicos e transplantados. (KIM e SUDBERY,

2011). A patogenicidade das espécies de Candida envolve mecanismos atribuídos

aos fatores de virulência, como a capacidade de se defender do sistema imunológico

do hospedeiro, aderência, formação de biofilme em tecidos ou em dispositivos

médicos, e produção de enzimas hidrolíticas prejudiciais como proteases,

fosfolipases e hemolisina (SARDI et al., 2013).

Nos últimos anos tem-se observado um expressivo aumento de infecções

fúngicas causadas por espécies não-albicans, como Candida tropicalis, Candida

glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida lusitaniae, o que se

classifica como um problema, visto que espécies pertencentes a esta classe

apresentam-se, em sua maioria, resistentes aos principais fármacos empregados na

terapêutica clínica (BARBEDO e SGARBI, 2010).

Embora seja um micro-organismo comensal da biota humana, trato

gastrintestinal e mucosas oral e vaginal, a espécie C. albicans apresenta-se como o

principal agente etiológico de doenças fúngicas oportunistas que acometem

mulheres de todas as faixas etárias, principalmente a candidíase vulvovaginal

(CVV), sendo encontrada em 85% a 95% dos casos de infecções. Desordens

vaginais ocasionadas por Candida spp atingem cerca de 70-75% das mulheres

prevalentemente jovens e com idade fértil ao menos uma vez durante a vida. Casos

de recorrência também são observados, classificando-se como o desencadeamento

de quatro ou mais episódios infecciosos durante o ano, necessitando, assim, de

políticas cujas abordagens medicamentosas sejam mais rigorosas e assíduas, nas

quais se observam efeitos colaterais capazes de gerar uma série de desconfortos a

paciente (TIYYAGURA et al., 2013).

A terapia medicamentosa em casos de infecções fúngicas apresenta

limitações, como o alto custo dos fármacos disponíveis na clínica, toxicidade

elevada, interações medicamentosas, biodisponibilidade insuficiente do princípio

ativo e emergência de cepas resistentes (ENDO et al. 2010; TYAGI e MALIK, 2010).

Introdução 21

__________________________________________________


Diversos antifúngicos têm sido indicados no tratamento destas infecções, como os

pertencentes as classes de poliênicos, azólicos, equinocandinas, entre outros,

todavia, com o uso indiscriminado destes antimicrobianos associado as

características genéticas e fisiológicas do fungo, nota-se um expressivo aumento do

perfil de resistência aos fármacos integrantes destas classes (CALABRESE et al.,

2013; WEI et al., 2011). Neste sentido, as ciências da saúde têm se preocupado

cada vez mais com o exacerbado crescimento do número de cepas multirresistentes

aos antimicrobianos atualmente empregados na prática clínica, e em decorrencia

deste fato, as plantas medicinais emergem na pesquisa de novos fármacos

antifúngicos, apresentando propriedades bioativas importantes, justificada

principalmente pela presença de metabólitos secundários como taninos, flavonoides

e fenóis (CRAGG e NEWMAN, 2013).

Diversas plantas têm sido estudadas a fim de evidenciar o potencial

antimicrobiano. Neste sentido, algumas famílias de espécies vegetais encontram-se

em destaque na área científica, como a Eriocaulaceae. Possui 11 gêneros e

aproximadamente 1400 espécies. A maioria das plantas desta família são

conhecidas como “sempre-vivas” de acordo com o conhecimento popular brasileiro.

Esta denominação é justificada por possuírem escapos inflorescentes que se

mantêm íntegros por longos períodos e devido a isso são utilizados na confecção de

ornamentos decorativos e acessórios (ANDRADE et al., 2010). A maioria das

espécies comercializadas como “sempre vivas” pertencem ao gênero Syngonanthus,

sendo encontradas no Brasil, principalmente nas regiões do estado de Goiás e na

Serra do Jalapão no estado do Tocantins, onde é conhecida como “capim dourado”

(SCHMIDT et al., 2007). A espécie Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland encontra-

se em expressiva evidência nos últimos anos. Pacífico et al. (2011) ao analisarem os

escapos e capítulos da mesma, encontraram cerca de 17 compostos derivados de

flavonas e apigenina, além de seis moléculas inéditas. Araújo et al. (2013)

detectaram um importante potencial antifúngico presente nos escapos de S. nitens

frente a quatro espécies do gênero Candida, sendo ainda elucidado um importante

perfil terapêutico do composto herbal em questão, quando submetido a modelo

experimental de CVV que confirmou seu potencia anti-Candida.

Embora a utilização de produtos naturais na triagem de novos

medicamentos seja apreciável e de grande importância, algumas desvantagens são

Introdução 22

__________________________________________________


observadas quanto ao desenvolvimento de investigações clínicas e farmacológicas,

como por exemplo, a dificuldade de solubilização da amostra vegetal, e até mesmo

pela baixa disponibilidade naturalmente apresentada pelo composto. Neste sentido,

a nanotecnologia farmacêutica abre novos horizontes na otimização da veiculação

destes compostos, a fim de promover uma melhor interação entre o princípio

medicamentoso com o sítio de ação, visando a eliminação de efeitos colaterais e

otimização do potencial terapêutico (SINGH et al., 2013; BONIFÁCIO et al., 2014).

Ferramentas nanotecnológicas são muito utilizadas no estabelecimento de

plataformas seguras de veiculação de drogas com o objetivo de desenvolver

sistemas de liberação de fármacos, a exemplo encontra-se as microemulsões,

nanopartículas poliméricas, naopartículas lipídicas sólidas, lipossomas, e mais

recentemente, observa-se a utilização de cristais líquidos com a finalidade de

aprimorar a ação terapêutica e seletividade da droga (CHORILLI et al., 2011).

Os sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM)

classificam-se como uma promissora alternativa no tratamento da candidíase

vulvovaginal. Suas características são interessantes para administração vaginal,

pois podem se apresentar líquidos, facilitando a administração da formulação, por

exemplo, por seringa. Contudo, ao entrar em contato com a mucosa vaginal, o SPCL

tem a capacidade de incorporar água, se tornando uma mesofase líquido-cristalina

mais viscosa, o que pode promover liberação controlada e, consequentemente,

resultar em maior substantividade dos componentes do extrato vegetal (SILVA et al.,

2014).

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2. Revisão da

Literatura

“Se podemos sonhar, também podemos tornar nossos sonhos realidade”.

(Walt Disney)

http://pensador.uol.com.br/autor/walt_disney/

Revisão da Literatura 24

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2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Principais doenças infecciosas vaginais

Em termos gerais, mulheres de todas as faixas etárias estão propensas a

desenvolverem algum tipo de infecção em seu sistema reprodutor, onde fatores

como alterações imunológicas, falta de higiene adequada, aspectos genéticos e

doenças de origem sexualmente transmissíveis caracterizam-se como os fatores

primordiais para o desencadeamento de enfermidades severas que colocam a

saúde da mulher em um elevado grau de risco e complexidade, levando em muitos

casos ao óbito das mesmas (BROCKLEHURST et al., 2013).

As vaginites ocasionadas por micro-organismos são muito comuns, e na

maioria das vezes são estabelecidas após contaminação por protozoários, fungos,

bactérias e até mesmo vírus (CAMARGO et al., 2011)

A vaginite bacteriana (VB) é classificada como uma perturbação da microbiota

vaginal onde os lactobacilos normalmente habitantes comensais da região vaginal

são substituídos por um aumento expressivo de bactérias, como Gardnerella

vaginalis, Mobiluncus sp., e micoplasmas genitais. Em muitos casos a VB é

caracterizada por um aumento do pH vaginal e também por um elevado aumento do

odor fétido nesta região. As VB podem ser transmitidas sexualmente, todavia

interações imunológicas e contaminações diretas são as mais frequentes (GALLO et

al., 2012).

Outros micro-organismos encontrados em casos de infecções vaginais são

os pertencentes ao gênero Candida. Tratam-se de fungos leveduriformes comensais

da microbiota vaginal que podem desencadear a candidíase vulvovaginal (CVV), que

se caracteriza por inflamação verdadeira de vulva e vagina. (ZIARRUSTA, 2002;

LINHARES et al., 2005; BARBEDO e SGARBI, 2010).

Levando em consideração o elevado patamar em que as doenças de origem

sexualmente transmissíveis se encontram, faz-se notória intensificação de políticas

de controle da proliferação de DSTs em mulheres, visto ao exacerbado número de

casos de estabelecimento de doenças como a sífilis, gonorreia, infecção pelo vírus

papiloma humano (HPV) dentre outros tipos de injúrias originadas por este tipo de


__________________________________________________

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via de transmissão, podendo desencadear patologias de grande complexidade como

o câncer (WORKOWSKI et al., 2010; SIEGEL, 2012).

2.1.2. Candidíase vulvovaginal

Considerada uma infecção de complexidade relativa na maioria dos casos, a

CVV classifica-se como um importante problema de saúde pública, neste sentido,

torna-se indispensável que profissionais atuantes em áreas como a ginecologia,

micologia e infectologia conheçam sua patogenia de maneira atualizada para que

dessa forma auxiliem no manejo da infecção (GAZETA-JÚNIOR et al., 2011).

O gênero Candida constitui-se de aproximadamente 200 diferentes espécies

de fungos leveduriformes, que vivem como comensais nos mais diversos nichos

corporais, como orofaringe, cavidade bucal, dobras da pele, secreções brônquicas,

vagina, urina e fezes (BARBEDO e SGARBI, 2010). Em termos clínicos, a

candidíase pode ser cutânea, mucosa, mucocutânea ou visceral. O fungo possui

preferência de crescimento e proliferação em contato com superfícies quentes e

úmidas, gerando frequentemente as vaginites, e em neonatos a chamada “dermatite

das fraldas” e a candidíase oral (NYIRJESY, 2008). Estas são as manifestações

mais usuais do estado infeccioso e, embora normalmente não apresentem ameaça à

vida do hospedeiro, em casos graves a infecção pode adquirir nível sistêmico

colocando o paciente em risco. As formas cutaneomucosas severas são menos

comuns e subdivide-se em duas categorias: candidíase cutaneomucosa crônica,

com prevalência em pacientes que possuem disfunções de caráter imunológico

como àqueles portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) e

portadores de doenças crônicas hereditárias como o lúpus, e, a candidíase vaginal

crônica, desencadeada principalmente por fatores de risco como a gravidez, uso de

contraceptivos orais, antibioticoterapia e o diabetes mellitus dos tipos 1 e 2

A sintomatologia da CVV depende do nível de infecção e da localização do

tecido inflamado, podendo apresentar-se de forma isolada ou associada com outros

tecidos, com principal sintoma o prurido vulvovaginal que pode variar como ardor ou

dor à micção, corrimento branco, grumoso, inodoro e com aspecto caseoso

(semelhante ao aspecto físico da coalhada); hiperemia, edema vulvar, fissuras e

maceração da vulva; dispareunia e vagina e colo do útero recoberto por placas


__________________________________________________

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brancas ou branco-acinzentadas, aderidas à mucosa. (ARAÚJO, 2011; GAZETA-

JÚNIOR et al., 2011).

Em geral, a maioria das pacientes deve responder prontamente ao tratamento

realizado com antifúngicos disponíveis em prática clínica, como o fluconazol,

miconazol e nistatina, todavia, nos últimos anos este o tratamento vem mostrando-

se ineficaz principalmente pelo alto índice de resistência dos fungos aos derivados

azólicos. Nestes casos, a nistatina é muito empregada, mas a aplicação local de

uma solução fraca de ácido bórico ou e principalmente o uso de creme vaginal a

base de anfotericina B e introdução de óvulos de flucitosina são alternativas

empregadas atualmente (DENNING e HOPE, 2010). Os fármacos azólicos são

contra indicados durante a gravidez devido ao risco de desenvolvimento de

teratogênese fetal, portanto, torna-se altamente prejudicial para mulheres que

estejam em idade fértil e que queiram engravidar (SOBEL, 2007). Nestes casos,

cremes vaginais a base de anfotericina B são empregados, porém, a utilização a

longo prazo apresenta riscos à saúde mulher visto os efeitos nefrotóxicos atribuídos

a este fármaco (CHAI et al., 2013).

Algumas mulheres que possuem sintomatologia positiva de CVV podem

apresentar um ou mais episódios infecciosos de forma esporádica ou ocasional,

podendo estes estar diretamente relacionados aos fatores imunológicos e

nutricionais da paciente, enquanto outras podem ter sintomas frequentes ou graves

classificando-as em um patamar de risco elevado, onde a patogênese passa a ser

chamada de candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR). A CVVR classifica-se como

a eventualidade de três ou mais episódios de CVV durante um ano, aonde as

principais causas podem estar ligadas à resistência do fungo aos fármacos

empregados no tratamento, predisposição genética, interferência da prostaglandina

E2 presente no sêmen masculino, aumento da produção de citoquinas Th2 e

produção insatisfatórias de Th1, visto que mulheres que possuem uma alta produção

de Th1 estão menos propensas a desenvolverem casos de CVVR (LINHARES et al.,

2005).

Neste caso, o tratamento deve portar-se de forma diferente aos casos de CVV

de caráter simples, pois a maioria dos antifúngicos utilizados nestes casos

infecciosos possuem ação fungistática, ou seja, inibem o crescimento fúngico mas


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não o elimina por completo. Em CVVR o emprego de fármacos fungistáticos mostra-

se insatisfatório, visto que a presença de células leveduriformes mesmo estando em

menores quantidades são suficientemente capazes de promover o

desencadeamento do estado infeccioso novamente. Como solução, especialistas

indicam um tratamento mais intenso como frenquentes aplicações de fármacos por

via intravaginal, adminstração oral de antifúngico, dieta com baixa quantidade de

acúcares, suplementação vitamínica afim de fortalecer o hospedeiro e,

principalmente, a elucidação da espécie leveduriforme para que o tratamento seja

mais preciso e direto, visto a suscetibilidade distintas aos fármacos empregados em

prática clínica (LINHARES et al., 2005; POWELL e NYRJESY, 2014).

2.1.2.1. Principais espécies de Candida envolvidas na candidíase vulvovaginal

Em pacientes que possuem algum tipo de imunodeficiência, principalmente

aqueles portadores do vírus HIV (Human Immunodeficiency Virus), têm-se dado uma

expressiva atenção às doenças causadas por fungos, já que a redução de linfócitos

CD4+ predispõe o paciente a diversas infecções fúngicas, sejam elas de origem

patogênica ou relacionadas ao comensalismo entre o hospedeiro e o micro-

organismo, principalmente aquelas causadas por fungos leveduriformes

pertencentes ao gênero Candida, como a candidíase vulvovaginal (BARBEDO e

SGARBI, 2010).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a candidíase vulvovaginal

compreende cerca de 95% das infecções do trato genital feminino, caracterizando-

se como uma patologia de grande importância, sendo indispensável a realização do

diagnóstico para a melhor adequação do paciente ao tratamento (MORALES e

YANETH, 2012). Estima-se que 80 a 90% dos casos desta patologia são

ocasionados pela espécie Candida albicans e cerca de 10% a 20% e não menos

importantes, a outras espécies chamadas de não albicans (Candida tropicalis,

Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida lusitaniae)

(CONSOLARO et al., 2004; BARBEDO e SGARBI, 2010; LINHARES et al., 2005).

Embora a maioria dos casos de CVV sejam desencadeados pela espécie C.

albicans, nos últimos anos tem-se observado um expressivo aumento de infecções

causadas por espécies não albicans, o que se classifica como um problema, visto


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que espécies pertencentes a esta classe apresentam-se em sua maioria, resistentes

aos principais fármacos empregados na terapêutica clínica, como exemplo, a

espécie C. krusei por apresentar naturalmente um perfil de resistência intrínseca ao

fluconazol (MONTERO et al., 2010).

2.1.2.1.1. Candida albicans (C. albicans)

C. albicans (Figura 1) é classificada como um fungo dimórfico (leveduriforme)

comensal de caráter oportunista, habitante de nichos corporais de humanos, como

orofaringe, trato gastrointestinal, mucosa oral e principalmente vaginal; podendo

também ser encontrada em animais habitando-os de forma comensal assim como

nos seres humanos. (MOLERO et al., 1998).

Considerada como o agente etiológico de diversas doenças de origem

fúngica, esta caracteriza-se como a espécie mais prevalente em casos de CVV, e

está diretamente relacionada com os casos de recorrência de infecção (SOBEL,

2010).

C. albicans é a espécie mais abundante e significativa que coloniza de forma

comensal todos os seres humanos. Eventualmente, pode causar infecções

potencialmente letais, especialmente em pacientes imunocomprometidos ou

criticamente doentes. Quanto à sua colonização, esta pode acontecer em qualquer

fase da vida do indivíduo, a qual varia desde o momento do nascimento, ocorrência

de transmissão relacionada com a contaminação dentro do ambiente familiar, até ao

contato direto com determinado sítio contaminado, como exemplo ressalta-se o ato

sexual como o principal fator de desencadeamento de infecções. Por sua vez,

reporta-se a expressiva capacidade de infestação que esta levedura possui, no

sentido de que um número limitado de estirpes de C. albicans podem colonizar ao

mesmo tempo, uma, ou várias membranas e mucosas de um mesmo indivíduo (KIM

et al., 2011).

A rápida proliferação e fixação em tecidos e mucosas é um fator preocupante,

pois esta levedura possui considerável plasticidade morfogênica. Neste sentido,

podem desenvolver-se tanto na forma leveduriforme com na forma de hifas. A

disseminação hifal denomina-se como um fator de risco em casos de infecções, visto


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que a ocupação e proliferação em tecidos do corpo humano ocorrem de forma mais

abrangente, atingindo principalmente as mucosas e órgãos como fígado, pele e

útero (ANGEBALT et al., 2013)

Figura 1. Fotomicrografia de C. albicans (8500x)

Fonte: Science Photo Library, 2014a.

Outro fator agravante e que leva a falhas no tratamento medicamentoso, dá-

se principalmente à característica de C. albicans ser a espécie frequentemente

associada com a formação de biofilme, especialmente em implantes médicos, e isso

tem um impacto significativo sobre a morbidade e mortalidade dos pacientes. A

formação do biofilme fúngico é importante para a patogenia da levedura, sendo

considerada como sendo uma característica de virulência e de resistência do micro-

organismo (HERWALD e KUMAMOTO, 2014). Por apresentar tal característica, C.

albicans tornou-se o principal modelo para o estudo dos mecanismos que

fundamentam a formação de biofilmes de fungos morfologicamente complexos, e

compostos de formas de leveduriformes, pseudo-hifas e hifas verdadeiras

(BONHOMME e ENFERT, 2013).

2.1.2.1.2. Candida krusei (C. krusei)

A espécie C. krusei (Figura 2), caracteriza-se como um fungo leveduriforme

com células em formato ovóide e quando cultivada em meio de cultura sólido exibe


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colônias espessas, largas, de coloração branca ou levemente amarelada com

aspecto físico rugoso (LACAZ et al., 2012).

Figura 2. C. krusei observada sob microscopia óptica (100x)

Fonte: O autor

Esta espécie emerge nos últimos anos como um fungo oportunista de alto

grau de complexidade na terapêutica antifúngica frente aos pacientes infectados,

principalmente em imunocomprometidos. Isto justifica-se pelo fato de apresentar

perfil de resistência intrínseca aos fármacos derivados de azóis, como o fluconazol,

principal medicamento utilizado em casos de infecções fúngicas (ABBAS et al.,

2000). Neste sentido, a terapêutica nos casos de infecções por esta levedura muitas

vezes é insatisfatória e de pouca adesão do paciente ao tratamento, gerando custos

elevados à terapia e expondo os hospedeiros a drogas que apresentam efeitos

colaterais superiores, como os fármacos anfotericina B, voriconazol, posaconazol e

ravuconazol, utilizados em terapias onde o agente infeccioso possui resistência ao

fluconazol (KATHIRAVAN et al., 2012).

Estudos têm demonstrado infecções desencadeadas por C. krusei em

pacientes que receberam fluconazol e anfotericina B em terapias contra infecções

causadas por outras espécies de Candida (PFALLER et al., 2008). Schuster et al.

(2013) confirmaram esta ocorrência ao investigarem os fatores de risco ao

desenvolvimento de candidemias ocasionadas por C. krusei, reportando a provável

contribuição do fluconazol de forma sinérgica no desencadeamento do estado


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patológico em hospedeiros vulneráveis, que na maioria das vezes são portadores de

algum tipo de câncer, neutropenia, pós-cirúrgicos, tratado com hemodiálise.

Embora os episódios de CVV causadas por C. krusei estejam presentes nos

10% dos casos de infecções por espécies não albicans, a eventualidade do estado

patológico mostra-se preocupante, visto a incidência elevada nas falhas terapêuticas

uma vez que esta espécie tende a apresentar um declínio da suscetibilidade aos

antifúngicos empregados na rotina clínica, e esta afirmação vai além da inatividade

do fluconazol no tratamento, no sentido de que resistência aos fármacos derivados

de poliênios (ex. anfotericina B) e equinocandinas (ex. caspofungina) vem sendo

citadas na literatura (MONTERO et al., 2010). Em relação aos sinais e sintomas de

vaginites por C. krusei, estes parecem ser indistinguíveis dos casos de CVVs

causadas por outras espécies de Candida. Apesar de rara, a CVVR causada por C.

krusei é uma causa considerada intratável (PFALLER et al., 2008; GUZEL et al.,

2013).

2.1.2.1.3. Candida glabrata (C. glabrata)

C. glabrata (Figura 3) é uma espécie de fungo leveduriforme que coloniza

comensalmente o trato gastrointestinal e genitourinário, e até algum tempo atrás

acreditava-se possuir caráter patogênico, no entanto, inofensivo ao ser humano

(LACAZ et al., 2012). A crescente utilização da terapia imunossupressora em

conjunto com a utilização de fármacos antifúngicos de amplo espectro, observou-se

um aumento expressivo das infecções por esta espécie, o que mudou o cenário

clínico dos episódios infecciosos, assim como as abordagens medicinais.

Trata-se da única espécie de Candida que não apresenta pseudo-filamentos,

o que transmite a errônea idéia da mesma apresentar um perfil de virulência menor

em relação a outras espécies (LACAZ et al., 2012).

As infecções por C. glabrata mostram-se de grande complexidade em

quadros clínicos diversos, onde podem-se apresentar como superficiais (infecções

cutâneas e mucosas) e também em casos extremos de infecção generalizadas de

alta complexidade como é o caso das candidíases invasivas (SARDI et al., 2013).

Na atualidade, C. glabrata é considerada a segunda levedura mais patogênica

que atinge os seres humanos, ficando atrás somente da C. albicans (QUINTIN et al.,


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2013). Esta espécie está envolvida diretamente em infecções fúngicas invasivas que

vão desde as infecções locais até níveis sanguíneos. Nos casos de infecções

sistêmicas, o tratamento torna-se difícil, devido ao alto índice de casos de

resistência aos derivados de azóis, com destaque ao fluconazol.

Figura 3. Fotomicrografia de Candida glabrata (8500x)

Fonte: CORMACK et al. (1999).

Em relação aos episódios de CVV, C. glabrata é considerada como o agente

etiológico mais frequente em casos infecciosos com espécies não albicans isoladas,

representando cerca de 34,5% dos casos, assim como nos casos de candidúria, o

que classifica-se como um problema devido ao alto padrão de resistência aos o que

gera dificuldades na abordagem terapêutica para a eliminação dos sinais e sintomas

da doença (SOBEL, 2010; HETTICARACHCHI et al., 2010).

Apesar de C. glabrata ser classificada como a segunda ou terceira espécie

mais frequente de isolados clínicos em todo mundo, as infecções causadas por essa

espécie no Brasil, são considerados episódios raros em comparação com outras

espécies (LOPES, 2010).

2.1.2.1.4. Candida tropicalis (C. tropicalis)

A espécie leveduriforme C. tropicalis (Figura 4) caracteriza-se como um dos

principais agentes etiológicos das candidíases invasivas. As altas taxas de


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incidências são observadas (assim como a maioria das espécies do gênero

Candida) em pacientes que possuam algum tipo de distúrbio imunológico,

neutropênicos, portadores do diabetes e também em indivíduos idosos

(KOTHAVADE et al., 2010).

Figura 4. C. tropicalis observada sob microscopia óptica (100x)

Fonte: O autor

Caracteriza-se como agente etiológico frequente em casos de candidemia em

muitos hospitais brasileiros, sendo a segunda espécie mais comumente isolada.

Casuísticas do Brasil confirmam que as três espécies mais prevalentes isoladas de

urina em pacientes hospitalizados são: Candida albicans, Candida tropicalis e

Candida glabrata. Estes estudos demonstram prevalências de 35,5 a 70% para

Candida albicans; 4,6 a 52,5% para Candida tropicalis e 7 a 8,8% para Candida

glabrata (MENEZES et al., 2009). Embora apresente a capacidade de

disseminações invasivas, C. tropicalis é geralmente suscetível a todos os

antifúngicos, todavia, vários casos de resistência cruzada entre fluconazol e outros

derivados de azois em isolados clínicos foram relatados, especialmente na região da

Ásia-Pacífico (FORASTIERO et al., 2013). Por outro lado, a resistência à anfotericina

B exercido por esta espécie é considerado raro.

A preocupação em casos de infecções por esta espécie vai além da sua

participação nos episódios de CVV, ela está relacionada com as incidências de

infecções sistêmicas, como as meningites (BAGHERI et al., 2010).


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Jiang et al. (2013) consideram a C. tropicalis resistente a 5-fluorocitosina e

nível moderado de resistência ao fluconazol, todavia, com o aumento do consumo

desenfreado de fármacos antifúngicos principalmente nos casos de profilaxia à

pacientes portadores de imunodeficiências, estas espécies estão propensas a

desenvolverem resistência aos antifúngicos usuais.

2.1.2.1.5. Candida parapsilosis (C. parapsilosis)

C. parapsilosis (Figura 5) compreende-se como um fungo leveduriforme,

diplóide e sem reprodução sexual conhecida. Suas colônias são claras, de

morfologia variável, células arredondadas, ovais a alongadas que formam

ocasionalmente os pseudomicélios. C. parapsilosis é encontrada naturalmente como

um fungo comensal na pele humana, sendo frequentemente isolado das mãos e

trato gastrointestinal. (LAFFEY et al., 2005).

Inicialmente, assim como C. glabrata, esta espécie foi considerada como não

patogênica, e somente em 1940 foi considerada um micro-organismo patogênico a

partir de um caso de endocardite grave em um paciente usuário de droga injetável,

desde então este patógeno mostrou-se diretamente ligado a diversos tipos de

infecções, o que o classifica nos dias de hoje como um agente patogênico

emergente (SINGARAVELU et al., 2014).

As taxas de infecções causadas por C. parapsilosis aumentou

consideravelmente, sendo evidenciada por relatos que as indicam como a segunda

mais comumente espécie de Candida isolada de hemoculturas e, em alguns países

europeus e hospitais sul-americanos, supera até mesmo C. albicans (SILVA et al.,

2012). Esse fenômeno tem sido atribuído a uma variedade de fatores de risco,

incluindo capacidade de crescimento tanto em meios de hiperalimentação com altas

concentrações de glicose até mesmo em dispositivos médicos intravasculares

(cateteres venosos, central e periférico, cateteres de hemodiálise e diálise

peritoneal), dispositivos protéticos (prótese intracardíaca e de articulações), além de

que a doença invasiva pode ocorrer sem colonização prévia, sendo transmitida

horizontalmente através de contaminação de fontes externas ou pelas mãos dos

profissionais de saúde antes ou durante o manuseio do paciente (RIBAS, 2012).


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Figura 5. C. parapasilosis observada por microscopia óptica (100x)

Fonte: Science Photo Library, 2014b.

Os determinantes da virulência da candidíase causada por C. parapsilosis

incluem a capacidade de adesão com formação de biofilmes, de alternar entre a

morfologia de levedura e o crescimento filamentoso, e secreção de enzimas

hidrolíticas extracelulares, tais como lipases, fosfolipases ou proteinases

(SINGARAVELU et al., 2014).

Em relação aos processos infecciosos, uma atenção maior é dada em casos

de infecções em neonatos, pois a presença desta espécie em mãos humanas pode

contribuir para a transmissão horizontal deste organismo em unidades de terapia

intensiva neonatal. Fatores de risco para as infecções neonatais por C. parapsilosis

invasivas são o peso do neonato (<1.500 g), prematuridade, colonização prévia,

nutrição parenteral, cateteres, e uso de antibióticos e esteróides. Fontes exógenas

de infecção podem ser importantes, mas a colonização da pele, trato gastrointestinal

e respiratório frequentemente precedem infecções invasivas neonatais (PAMMI et

al., 2013).

2.1.2.2. Principais fatores de virulência de Candida spp.


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A capacidade das espécies de Candida ocasionar doenças está relacionada

com mecanismos que envolvem diversos fatores de virulência, que incluem a

transição morfológica entre levedura e hifa, capacidade de se defender contra o

sistema imunológico do hospedeiro, aderência, formação de biofilme no tecido do

hospedeiro ou em dispositivos médicos, e produção de enzimas hidrolíticas

prejudiciais como proteases, fosfolipases e hemolisina (SARDI et al., 2013;

HOLLAND et al, 2014).

A resistência aos azólicos entre as espécies de Candida causada por

mutações genéticas, a supra-expressão do alvo da droga e a regulação dos seus

métodos de transporte são cada vez mais comuns e mecanismos alternativos, tais

como a formação de biofilme e de defeitos mitocondriais, têm sido recentemente

relatadas (SILVA et al., 2012).

A formação de hifa desempenha função importante na invasão de tecidos. As

formas filamentosas (hifa e pseudohifa) das espécies de Candida tem demonstrado

aumento da resistência à fagocitose quando comparado com a levedura. A virulência

de C. albicans está estritamente relacionada com a capacidade de formação de

hifas, sendo esta transição levedura-hifa crucial para o desenvolvimento da infecção

(TSANG; BANDARE; FONG, 2012). A morfologia hifal de C. tropicalis é similar a de

C. albicans e está relacionada com a invasão de epitélio oral. Entretanto, a

capacidade de C. parapsilosis invadir epitélio oral não está relacionado com

produção de pseudohifa (SILVA et al, 2012). As hifas promovem ao fungo a

capacidade de sobrepor da defesa do hospedeiro e também constituem um fator

essencial para a patogenicidade por formar biofilmes (VYLKOVA, LORENZ, 2014).

O evento primário da infecção por Candida é a aderência aos tecidos do

hospedeiro, após uma colonização inicial. A aderência contribui para a permanência

da levedura dentro do hospedeiro e é considerada essencial para o estabelecimento

da doença e também em dispositivos médicos formando biofilme (SILVA et al.,

2012). A formação de biofilme é um processo sequencial incluindo a aderência da

levedura, proliferação das células, formação de hifas na parte superior do biofilme,

acúmulo de material de matriz extracelular e dispersão das células a partir do

biofilme. (MAYER et al., 2013).


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Muitas espécies de Candida apresentam capacidade de formar biofilme,

entretanto ocorrem amplas variações estruturais de espécie para espécie

(PANNANUSSORN et al., 2013). O biofilme de C. albicans é formado por uma

camada basal compacta de células leveduriformes e uma camada mais espessa e

menos compacta de hifa, envolvidos por uma matriz extracelular composta

principalmente de carboidratos, proteínas, fósforo e hexosamina. Por outro lado, C.

parapsilosis não tem a capacidade de formar hifas verdadeiras e o biofilme é

composto somente de células leveduriformes e pseudohifas, altos níveis de

carboidrato e quantidade baixa de proteína (MAYER; WILSON; HUBE, 2013; SILVA

et al, 2012). Todavia, a matriz extracelular do biofilme de C. glabrata apresenta altos

níveis de carboidratos e proteínas, enquanto para C. tropicalis as quantidades de

carboidratos e proteínas são baixas (SILVA et al., 2012).

2.2. Plantas medicinais e Fitoterápicos

O uso de produtos oriundos de fontes naturais na terapêutica medicamentosa

é conhecido desde os primórdios da humanidade. A Etnofarmacologia, classifica-se

como a principal ferramenta de análise de novos fármacos na terapêutica moderna,

visto que o conhecimento popular denomina-se como um suporte promissor na

investigação de plantas com princípios biológicos medicinais (CRAGG e NEWMAN,

2013). Desde 1976 a OMS busca promover o uso de terapias alternativas levando

em consideração o conhecimento técnico da medicina ocidental quanto ao emprego

dos produtos naturais na terapêutica. Cerca de 85% da população mundial utiliza

medicamentos fitoterápicos, neste sentido, desde meados da década de 80

estudiosos brasileiros tentam quantificar o uso de plantas medicinais pela

população, tendo como principal alvo de estudo as mulheres grávidas e mães de

crianças com até 5 anos de idade, levando em consideração de que a cultura do uso

de terapias naturais é passada de geração em geração (FERREIRA et al., 2014).

Em tese, a OMS define o conceito de planta medicinal como qualquer planta

que possui em um dos órgãos ou em toda sua composição, substâncias com

propriedades terapêuticas que sejam ponto de partida na síntese de produtos

químicos ou farmacêuticos (LIMA et al., 2010). Recentemente a indústria

farmacêutica tem dado atenção aos fármacos oriundos de produtos naturais


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associado à vasta aplicabilidade na investigação de diversos tipos de tratamentos de

doenças de caráter agudo, crônico e até mesmo cumulativo, além do baixo custo, o

qual se torna um atrativo à população em geral (CRAGG e NEWMAN, 2013).

As plantas medicinais denominam-se como sendo uma parte importante da

riqueza natural brasileira. Elas servem como importantes agentes terapêuticos, bem

como valiosas matérias-primas para a fabricação de numerosas soluções

tradicionais e modernas que visam o bem estar e manutenção da saúde do homem.

Podem ser utilizados na síntese de produtos farmacêuticos e cosméticos, na

indústria de alimentos e em muitos outros campos da ciência moderna, como a

veterinária e a estética (YADAV et al., 2010).

É valido salientar que as plantas medicinais foram durante muito tempo, o

único, e principal recurso terapêutico no tratamento de enfermidades de alto risco à

saúde do homem. Com o avanço da medicina alopática de origem sintética cada vez

mais numerosa e moderna, principalmente nos países mais desenvolvidos,

resultaram-se os tratamentos medicamentosos realizados a partir de drogas

sintéticas, onde gradativamente foram introduzidos no cotidiano da população por

meio de propagandas que prometiam a cura das mais diversas doenças em um

curto período de tempo de tratamento (BADKE et al., 2011). Neste sentido, com o

aumento do número de doenças e o desencadeamento de estados patológicos cada

vez mais resistentes à terapia convencional, a fitoterapia ganhou força no Brasil nos

últimos anos, apresentando-se como fonte promissora na descoberta de novos

princípios biologicamente ativos.

A produção de plantas medicinais, aromáticas e o processamento das

mesmas, são atividades econômicas que contribuem para o desenvolvimento social

e econômico do país, além de servir de aporte para o desenvolvimento de novas

pesquisas de caráter crítico e investigativo para a busca de novos fármacos

fitoterápicos (MATEESCU et al., 2014).

Por definição, os fármacos fitoterápicos são aqueles provenientes de plantas

medicinais cujos seus princípios ativos podem aliviar os sintomas e até mesmo curar

doenças, além de serem prioritariamente dotados de menores efeitos secundários

quando comparados aos fármacos de origem sintética (TROJAN-RODRIGUES et al.,

2012). Estima-se que 25% do faturamento da indústria farmacêutica brasileira são


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obtidos pelas vendas de derivados de plantas medicinais, observando-se um

aumento substancial a cada ano (FERREIRA et al., 2014) . A fim de controlar o

consumo desses produtos, muitos países criaram seus próprios regulamentos, no

Brasil, os critérios médicos, antropológicos, sociais, botânicos e econômicos são

coordenados pela Comissão de Seleção de Plantas, aonde é possível encontrar

todos os parâmetros necessários para o desenvolvimento de pesquisas e

normatização dos medicamentos fitoterápicos para implementação no Sistema

Único de Sáude (SUS), a fim de implementar o uso destes medicamentos na rede

de saúde pública brasileira (MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2006). O uso tradicional de

plantas para o tratamento de doenças por parte do público e da confirmação do seu

efeito biológico têm estimulado o seu uso terapêutico. No entanto, o avanço da

pesquisa sobre os componentes em tais plantas demonstra que o uso destas é para

além da sua utilização medicina popular. Neste sentido, é necessária a maior

integração entre os pesquisadores, as instituições e o seguimento industrial privado

e público (FERREIRA et al., 2014).

Apesar do uso disseminado de plantas medicinais para muitas funções, é de

extrema importância frisar que muitos efeitos colaterais adversos são evidenciados,

sendo alguns deles considerados muito graves, tais como reações alérgicas,

mutações genéticas, intoxicação, teratogenicidade, carcinogênese e interações

medicamentosas, os quais podem limitar o uso dos produtos naturais na terapêutica.

O uso indiscriminado destes produtos por falta de informação da população, no

sentido de que existe uma falsa idéia de que determinada planta pode ser utilizada

para o tratamento de inúmeros processos patológicos (panacéia), gera uma série de

problemas à saúde do paciente. A falta de um controle de qualidade mais rigoroso

destes medicamentos também é um fator de risco no sucesso da terapia

medicamentosa e está diretamente relacionado com a promoção de efeitos

colaterais, como as contaminações por metais pesados, herbicidas ou pesticidas

utilizados na lavoura das matérias primas (NIGGEMANN e GRUBER, 2003;

ALMEIDA et al., 2005).

Diversas áreas da medicina estão se tornando adeptas ao uso de plantas

medicinais ou fármacos fitoterápicos propriamente ditos, para o tratamento de

diversos tipos de patologias, como o diabetes mellitus (CHANG et al., 2013), vários


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tipos de câncer (CRAGG et al., 2009) e com mais frequência, a microbiologia busca

a atualização do arsenal terapêutico antimicrobiano empregando produtos naturais

como fonte primária de investigação (GYAWALI e IBRAHIM, 2014).

2.2.1. Produtos naturais como novos agentes antimicrobianos

Os antimicrobianos constituem um grupo especial de agentes terapêuticos,

geralmente produzidos e obtidos a partir de organismos vivos. Embora o avanço

técnico e científico da síntese de novos medicamentos seja observado nos últimos

anos, a medicina moderna encontra-se em expressiva busca por novos fármacos

capazes de atuarem efetivamente no controle de doenças causadas por micro-

organismos de caráter patogênico e oportunista. Ultimamente observa-se que a

procura por novas abordagens medicamentosas frente a diversos tipos de doenças

oriundas de processos infecciosos encontra-se em declínio e desatualização

(CRAGG e NEWMAN, 2012). Na última década, apenas sete novos fármacos foram

aprovados para a terapia do tratamento de infecções bacterianas. O número de

aprovações de novos medicamentos utilizados neste tipo de terapêutica caiu

substancialmente em relação ao observado em meados da década de 1980, onde,

em média quatro novas drogas eram introduzidas no mercado a cada ano. Não se

sabe ao certo quais são as principais causas de tal eventualidade, todavia as razões

mais plausíveis que justificam tal declínio são dadas a uma combinação de fatores,

como aqueles oriundos de uma mudança do sistema de regularização de novas

drogas, o aumento das normas de segurança de medicamentos, bem como falha de

técnicas de descoberta de medicamentos modernos, como o processo “High

throughput screening” (triagem de alta produtividade), um método computadorizado

ultramoderno abrangendo testes em série utilizando sistemas robóticos, amplamente

empregado por centro de pesquisas de indústrias farmacêuticas a nível mundial

(BROWN et al., 2014).

Algumas famílias botânicas possuem naturalmente constituintes químicos

importantes que podem ser utilizados na investigação de novos compostos com

atividade antimicrobiana, neste sentido, o conhecimento prévio adquirido, desde

conceitos etnofarmacológicos e até mesmo de dados apresentados à comunidade

científica são de extrema importância para o desenvolvimento de investigações


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científicas que busquem a inovação na área quimioterápica com foco nas doenças

infecciosas (VIEIRA et al., 2014).

Em relação ao tratamento de afecções causadas por fungos, observa-se

significativa escassez de fármacos que possuam efetividade elevada e baixos

índices de efeitos colaterais. Os fármacos mais empregados são àqueles derivados

de azóis, como o cetoconazol, itraconazol e com mais frequência e aplicabilidade o

fluconazol. Embora sejam princípios ativos capazes de atuarem contra fungos

filamentosos e leveduriformes, o índice de multirresistência a estes tipos de drogas

exercidos por inúmeros gêneros fúngicos é proporcionalmente crescente à elevada

taxa de hospedeiros acometidos ou até mesmo aos óbitos causados pela infecção

(PFALLER, 2012). Os efeitos colaterais desencadeados por antifúngicos sintéticos é

na maioria das vezes um cofator de agravamento do estado patológico do paciente,

visto que reações relacionadas com hepatoxicidade e principalmente disfunções

renais estão diretamente ligados ao consumo de medicamentos pertencentes a esta

classe, como por exemplo, o uso da anfotericina B, rotineiramente empregado em

casos de resistência à azóis, onde o uso prolongado deste tipo de medicamento leva

a reações nefrotóxicas (CHAI et al., 2013).

Os produtos naturais vem se mostrando atrativos no desenvolvimento de

pesquisas clínico-farmacológicas com o objetivo de controlar e até mesmo erradicar

formas microbianas associadas com o desenvolvimento de patologias que atingem o

homem moderno (SALEEM, 2010). Neste sentido, as plantas medicinais são o

principal foco de investigação na área antimicrobiana, justificado pela variedade de

componentes ativos e principalmente à abrangência da aplicabilidade sob vários

tipos de doenças infecciosas, sendo esta capacidade atribuída principalmente à

presença de metabólitos secundários (SIMÕES et al., 2007).

Os metabolitos secundários compreendem-se como compostos orgânicos que

não estão diretamente envolvidos nos processos de crescimento, desenvolvimento e

reprodução dos organismos vegetais, mas desempenham um papel importante nas

defesas vegetais contra a herbivoria e outras defesas relacionadas ao meio de

desenvolvimento e sobrevivência. (SIMÕES et al., 2007; GARCIA e CARRIL,

2009). Estes compostos possuem atividade antimicrobiana, antioxidante,

antiproliferativo de células tumorais além de serem amplamente empregados na


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indústria de cosméticos. Os principais grupos destes compostos que são

responsáveis pela atividade antimicrobiana de plantas incluem compostos fenólicos,

àcidos fenólicos, quinonas, saponinas, flavonóides, taninos, fenazinas, cumarinas,

lignanas, neolignanas, terpenóides e principalmente os alcalóides (HAYEK et al.,

2013).

A atividade antimicrobiana dos metabólitos oriundos de compostos naturais

pode ser influenciada por vários fatores incluindo a fonte botânica, tempo de

colheita, o estágio de desenvolvimento da planta, método de extração, composição

química, estrutura, e os grupos funcionais. Além disso, os componentes de

alimentos e aditivos, que podem interagir com os compostos antimicrobianos

desempenham um papel importante na utilização de compostos naturais como

conservantes de alimentos, por exemplo, a ligação não específica do peptídeo

antimicrobiano catiônico de partículas de alimentos carregados negativamente

podem reduzir o efeito do peptídeo antimicrobiano em sistemas alimentares

(JUNEJA et al., 2012).

Os mecanismos de ação dos produtos naturais são diversos e distintos. A

membrana citoplasmática classifica-se como o sítio de ação mais comum dos

metabólitos secundários, eles atuam tanto na lise da estrutura desencadeando o

extravasamento do conteúdo celular e consequentemente a morte, quanto na

formação da mesma. A interação com o material genético e síntese de proteínas

também é uma fator predisponente na promoção da ação terapêutica, neste caso,

quando em contato com o material genético é capaz de promover alterações na

codificação do DNA microbiano, resultado em ineficazes transcrições promovendo a

desorganização de funções vitais para a célula (HAYEK et al., 2013; GYAWALI e

IBRAHIM, 2014).

È importante salientar que variações na estrutura química e composição dos

compostos naturais empregados como fármacos resultam em diferenças na ação

antimicrobiana e na diversidade estrutural de compostos derivados de plantas. O

impacto da ação antimicrobiana exercida contra diversos tipos de micro-organismos

depende da sua configuração estrutural. Como exemplo, os compostos fenólicos

possuem grandes variações estruturais e são um dos mais diversos grupos de

metabólitos secundários. Os grupos hidroxílicos (OH) presentes nestes compostos


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podem ser a causa de ação inibidora uma vez que estes podem interagir com a

membrana celular dos micro-organismos, para desestabilizar as estruturas de

membranas e como consequência promovem a lise celular (XUE et al., 2013).

2.2.3. A família Eriocaulaceae

Composta por 10 gêneros e 1200 espécies, as Eriocaulaceaes destacam-se

por serem uma das famílias de monocotiledôneas incomuns mais representativas

dos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço – no estado de Minas Gerais e

também da Serra do Jalapão no Estado do Tocantins, não só pela grande riqueza

especificamente observada, mas também pelo elevado número de táxons

endêmicos desta formação geológica (COSTA et al., 2008; ANDRADE et al., 2011).

A família se divide em duas subfamílias: Eriocauloidae Ruhland e Paepalanthoideae

Ruhland. Com relação à distribuição geográfica de Eriocaulaceae no mundo,

espécies desta família ocorrem em sua maioria em regiões pantropicais. No Brasil,

observa-se espécies dos gêneros Eriocaulon, Paepalanthus, Syngonanthus,

Leiothrix, Tonina, Comanthera e Actinocephalus, ou seja, dos 10 gêneros presentes

na família, 8 são de ocorrência brasileira, sendo alguns deles endêmicos a uma

determinada região do território nacional (EICHEMBERG e SCATENA, 2011;

GIULIETTI et al., 2012).

São conhecidas como “sempre-vivas”, por possuírem escapos inflorescentes

que se mantém íntegros por longos períodos, e neste sentido, são muito utilizadas

na confecção de ornamentos e acessórios. A atividade biológica destas plantas

iniciou com a descoberta do metabólito paepalantina, classificada como uma

naftopiranona (Figura 6), que rotineiramente não é encontrado em plantas mas sim

em micro-organismos fúngicos como aqueles do gênero Penicillium spp. (ZANUTTO,

2013).


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Figura 6. Estruturas de naftopiranonas e xantonas comuns em plantas da família Eriocaulace

Fonte: ZANUTTO, 2013.

Embora a maioria das Eriocaulaceas ainda não serem muito usadas na

prática medicinal e sim artesanal, espécies desta família possuem uma grande

diversidade química, e portanto, fonte de novas moléculas que possuam atividade

biológica.

2.2.3.1. O gênero Syngonanthus

O gênero Syngonanthus inclui aproximadamente 200 espécies, distribuídas

nas Américas e África. O maior número encontra-se na América do Sul,

principalmente no Brasil, nos estados de Minas Gerais e Bahia, com

aproximadamente 180 espécies (PACÍFICO et al., 2011).

Em relação à química do gênero, 25 espécies representativas já foram

estudadas, e nelas foram identificadas grandes quantidades de flavonas, com

predominância de O-glicosídeos e C-glicosideos derivados do flavonóide luteolina, e

com menor frequência O-glicosideos derivados da apigenina (RAMOS et al., 2005).

Ricci et al. (1996) estudaram a taxonomia de 13 espécies de Syngonanthus, e

detectaram a presença de 24 flavonas, sobretudo derivados 7-O-glicosilados da

luteolina e 6-hidroxiluteolina, além de O-glicosídeos da apigenina.

2.2.3.1.1. Syngonanthus nitens (Bong.) Rulland

Conhecida popularmente como “capim dourado” (Figura 7), esta espécie

pertencente à família Eriocaulaceae classifica-se como uma importante fonte de

renda para muitas famílias da região da Serra do Jalapão no estado do Tocantins,


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Brasil. Os escapos inflorescentes desta planta são utilizados como matéria prima na

confecção de ornamentos decorativos e acessórios, e neste sentido movimentam a

economia local incentivando a exportação de vários tipos de produtos (GIULIETTI et

al., 2012; BERLIM et al., 2014).

Figura 7. Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhlland – “capim dourado”

Fonte: SAMPAIO et al., 2010.

O artesanato de capim-dourado inicialmente era feito somente por indígenas

da etnia Xerente do estado do Tocantins. As peças produzidas por eles eram usadas

em casa ou trocadas por outros produtos a fim de manter seu consumo próprio. Por

volta de 1930, a arte de tecer o capim dourado foi aprendida por famílias do povoado

da Mumbuca, na região do Jalapão. Desde o final da década de 1990 as peças

feitas com os escapos de capim-dourado (Figura 8) tornaram-se bastante

conhecidas e vendidas em todo o Brasil e no mundo a fora, principalmente em

países como os Estados Unidos e Alemanha (SAMPAIO et al., 2010; OLIVEIRA e

GARCIA, 2011;FICHINO et al., 2012).

Nos últimos anos nota-se uma expressiva utilização de S. nitens em

investigações químicas e biológicas a fim de verificar a aplicabilidade desta na

triagem de novos quimioterápicos, colocando a espécie em um patamar de destaque

na comunidade científica. Pacifico et al. (2011) identificaram 17 compostos, entre

flavonas e xantonas, incluindo 6 novas moléculas, em extratos de S. nitens, o que

colaborou para a ampliação de estudos biológicos da espécie.


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Figura 8. Artesanato produzido com os escapos de S. nitens

Fonte: SAMPAIO et al., 2010.

A presença de fenóis, flavonoides e xantonas nesta planta é um indicativo de

um promissor perfil antimicrobiano. Cardoso et al. (2012) em um estudo quantitativo

de flavonoides, naftopiranonas e xantonas de espécies da família Eriocaulaceae

observaram a presença de luteolina no extrato metanólico dos capítulos e escapos

de S. nitens e a 3,6-dimetoxi-1,5,7-trihidroxixantona presente apenas no extrato

metanólico dos capítulos.

Araújo et al. (2013) determinaram o potencial biológico dos escapos de S.

nitens contra bactérias e fungos patogênicos, elucidando parâmetros

antimicrobianos importantes, além disto, evidenciaram o potencial terapêutico do

extrato metanólico desta planta no tratamento da candidíase vulvovaginal causada

por Candida albicans.

O perfil estrogênico e mutagênico da espécie em questão foi avaliado por

Oliveira et. al. (2013). Os autores relataram que as xantonas isoladas do extrato

metanólico de S. nitens podem ser úteis como fitoestrógenos, fornecendo uma nova

oportunidade para desenvolver agentes hormonais, além disto, a presença de

flavonas e xantonas, também poderiam ser utilizadas como um novo agente

antimutagênico, visto que apresentou resultados satisfatórios na investigação.


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2.2.3. Determinação da atividade antimicrobiana de produtos naturais

A determinação da atividade antimicrobiana de produtos vegetais caracteriza-

se como uma etapa importante na caracterização do potencial biológico de qualquer

substância que esteja destinada à aplicabilidade na área medicamentosa

antimicrobiana (DAS et al., 2010).

Diversas metodologias podem ser utilizadas para a determinação da atividade

antimicrobiana in vitro, sendo aplicados em estudos de triagem de novas

substâncias ativas. O método de difusão em ágar avalia a capacidade do composto

testado em impedir o crescimento de um micro-organismo sob um meio de cultura

sólido (BONEV et al., 2008). O método de diluição em microplacas ou também

conhecida como microdiluição, é por sua vez o que há de mais viável na triagem de

novos fármacos antimicrobianos com a vantagem de se trabalhar com pequenas

quantidade de compostos, como os extratos vegetais. Com ela é possível determinar

a concentração inibitória mínima (CIM), sendo esta denominada como a menor

concentração capaz de inibir o crescimento microbiano que representa a

concentração em que o medicamento precisa estar para que desempenhe a ação

terapêutica (DAS et al., 2010). A bioautografia, com a qual é possível verificar a

capacidade de inibição dos componentes presentes por exemplo em extratos,

partindo-se de ensaios cromatográficos realizados em placas de cromatografia de

camada delgada (CHOMA e GRZELAK, 2011). O ensaio de tempo de morte (Time

kill) possibilita avaliar a influencia do composto testado sob o crescimento

microbiano, com este método de triagem é possível descobrir qual o tempo

necessário para que o composto testado promova a diminuição, ou total paralisação

do crescimento e também a morte do micro-organismo, com isso determina-se o

tempo em que o agente quimioterápico precisa ser readministrado para controlar o

estado infeccioso (DAS et al., 2010).

Metodologias in vivo também podem ser empregadas para analisar o

potencial antimicrobiano de produtos de origem vegetal, uma vez que um modelo

animal é estabelecido porque se acredita replicar de forma adequada a condição sob

investigação objetivando estabelecerem-se respostas e manifestações clínicas da

mesma forma que são observadas com os seres humanos em casos de infecção

(OZ e PULEO, 2011; DELOGU et al., 2011).


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2.2.4. Ensaios experimentais in vivo de candidíase vulvovaginal

Com a finalidade de promover uma plataforma segura de testes avaliativos de

drogas potencialmente promissoras em casos de infecções fúngicas, os modelos

experimentais in vivo vem sendo empregados. Diversos modelos clinicamente

relevantes vem sendo desenvolvidos com a finalidade de avaliar interações

patógeno-hospedeiro, eficácia e farmacocinética de fármacos antifúngicos, e vacinas

para candidíases sistêmicas e de mucosa. Os modelos experimentais in vivo de CVV

têm sido úteis na identificação de fatores sobre a influência hormonal na infecção, a

virulência das leveduras, a susceptibilidade e o tratamento da infecção

(REPENTIGNY, 2004; ARAÚJO, 2011).

A capacidade de exercer controle sobre as variáveis experimentais que

incluem a cepa do fungo, espécie hospedeira, concentração do inóculo, via de

administração, e administração da farmacoterapia, representam grandes vantagens

da experimentação animal, especialmente quando combinada com modelos

validados estatisticamente onde o estado clínico da patologia mimetiza os mesmos

sinais e sintomas observados em humanos. Os animais de laboratório mais

utilizados são os ratos consanguíneos, embora os modelos de infecção por fungos

fossem desenvolvidos em primatas, coelhos, cobaias, ratos, hamsters, pássaros,

peixe-zebra, e caninos. A ampla disponibilidade de reagentes imunológicos definidos

e linhagens murinas, e o baixo custo e espaço relativo associado com a manutenção

de colônias em comparação com espécies hospedeiras maiores, tem impulsionado o

uso do rato de laboratório frente à modelos de infecção por fungos (HOHL, 2014).

Ensaios experimentais de CVV in vivo permitem avaliar o desempenho de

novos antifúngicos de uma forma mais precisa e confiável, uma vez que se trabalha

com um organismo vivo. Todavia, algumas considerações a respeito das

características dos animais utilizados no desenvolvimento de protocolos de infecção

devem ser levadas em conta, como a viabilidade do animal ao estado infeccioso,

defesa imunológica e principalmente as características relacionadas com o ciclo

hormonal do animal.

Os roedores, com destaque as ratas fêmeas, mostram-se animais aplicáveis

ao desenvolvimento de modelos de infecção por Candida albicans. Todavia,

diferentemente dos seres humanos, esta espécie não é habitante comensal de


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mucosa vaginal, o que torna necessário criar condições adequadas para que a

mesma possa se desenvolver e proliferar-se na vagina dos animais. Assim, o uso de

agentes quimioterápicos é muito utilizado para promover o desencadeamento de

imunossupressão nos animais (ROMANI et al., 2011; ARAÚJO et al., 2013;

CASSONE et al., 2014).

A imunossupressão de animais é muito importante no desencadeamento de

diversos tipos de infecções, em especial, as infecções fúngicas que em sua maioria

possuem caráter oportunista e necessitam que o sistema imunológico do hospedeiro

esteja comprometido para seu desenvolvimento e proliferação (HUYAN et al., 2011).

O agente quimioterápico ciclofosfamida (CP) vem sendo muito empregado

como agente imunossupressor no desenvolvimento de protocolos experimentais de

infecções fúngicas (ARAÚJO et al., 2013; SVEKO et al., 2013). Influencia as células

de tecidos normais, incluindo células do sistema imunológico, células de medula

óssea (em especial o desenvolvimento de células sanguíneas), promovem a

ativação de linfócitos (que se proliferam e produzem anticorpos), células fetais,

células foliculares do cabelo e as células epiteliais do intestino delgado. CP

enfraquece tanto a resposta imune celular e humoral. Seu efeito é dose-dependente,

mas até mesmo uma única administração pode prejudicar temporariamente o

sistema imunológico (WÓJCIK, 2014).

Outro requisito indispensável para o desenvolvimento de CVV em roedores é

a adequação do ciclo estral dos mesmos. O requisito essencial para o

estabelecimento da infecção por fungos pertencentes ao gênero Candida, é a

indução de um estado de pseudo-estro (falso cio). Neste sentido, em modelos

experimentais in vivo de CVV têm sido útil na identificação de fatores relativos às

influências hormonais sobre a infecção, a virulência das leveduras, e a

susceptibilidade ao tratamento da infecção. Nestes modelos, a chave para

estabelecer uma infecção persistente é o estado de pseudo-estro prolongado. Este

estado é, muitas vezes, induzido pela administração subcutânea de estradiol, por

sua vez, na ausência de tratamento com estrógeno, a infecção é de curta duração,

com pouca secreção vaginal, que dificultam as análises dos resultados (CARRARA

et al., 2010).


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O tratamento com estrogênio induz a formação de um epitélio escamoso no

ambiente vaginal. Além disso, inibe a resposta imune do hospedeiro e aumenta o

conteúdo de glicogênio, os substratos de pH e de crescimento que facilitam a

adesão de Candida no tecido epitelial. Também tem sido relatado que o estrogênio

pode afetar diretamente as células fúngicas, aumentando o número de células

leveduriformes que possuam formação de tubos germinais, as quais estão

relacionadas diretamente com o seu aumento e proliferação (CHENG et al., 2006;

MOSCI et al., 2013).

2.3. Nanotecnologia farmacêutica como ferramenta para o aprimoramento de

princípios bioativos naturais

A nanotecnologia caracteriza-se como uma importante ciência para alavancar

os avanços das aplicações de nanomateriais em todos os campos da medicina

tradicional. Neste sentido, inúmeras aplicações de nanomateriais para diagnóstico e

tratamento têm sido descritas na literatura desde seu surgimento. O emprego desta

ferramenta na área farmacêutica como plataformas veiculadoras de princípios

bioativos foi uma das primeiras áreas a crescer neste cenário, e uma das que mais

se desenvolveu ao longo dos anos (SINGH et al., 2013; CANCINO et al., 2014).

A ação de muitos fármacos no organismo muitas vezes é limitada pela baixa

solubilidade dos princípios ativos naturais ou sintéticos, altas dosagens, toxicidade

elevada, tempo de meia vida insuficiente e principalmente elevados índices de

degradação in vivo. Por sua vez, a liberação controlada de drogas é um campo da

pesquisa científica moderna que tem despertado interesse de pesquisadores, pois, a

liberação de um fármaco no local específico da ação terapêutica é uma das

limitações das indústrias biotecnológicas e farmacêuticas (SILVA et al., 2014). Essa

liberação consiste em deixar que o fármaco atue no sítio específico e em uma

concentração segura (YADAV et al., 2011).

A nanotecnologia tem contribuído em diversas áreas médicas, entretanto, têm

algumas desvantagens. Um dos principais fatores negativos apontados por

pesquisadores clínicos além do alto custo e da dificuldade da implementação da

escala industrial, é a facilidade da inalação de partículas nanométricas, ocasionando

doenças pulmonares com alto grau de periculosidade levando muitas vezes a óbito o


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paciente, dentre outras doenças que levam a severos comprometimentos a

homeostasia do corpo humano. Por se tratar de partículas em escala nano, há um

elevado risco de envenenamento em massa, ou seja, há um acúmulo de substâncias

bioativas que podem desencadear efeitos toxicológicos a nível sistêmico,

principalmente em casos de nanopartículas tóxicas que possuem afinidade pelo

cérebro (YADAV et al., 2011; SINGH et al., 2013). Em termos de análises biológicas

das nanopartículas, há um grande avanço de técnicas quantitativas para elucidações

morfológicas e estruturais, porém, existem deficiências em métodos de análises

qualitativas acessíveis e padronizados que oferecem suporte confiável e eficaz, o

que dificulta o exato entendimento e elucidações de mecanismos de ação entre

outros fatores que venham a auxiliar a compreensão a nível biológico (ELSAESSER

et al., 2010).

A nanotecnologia farmacêutica busca cada vez mais inserir novas

abordagens tecnológicas para a ampliação dos benefícios apresentados por

sistemas carreadores de fármacos. Neste sentido, nos últimos anos tem-se

observado um aumento da utilização de produtos naturais em sistemas carreadores

de fármacos, visto que medicamentos de origem natural apresentam vantagens em

relação aos fármacos sintéticos, isso porque esses compostos possuem menores

efeitos colaterais quando sua atividade farmacológica e toxicológica é comparada

aos sintéticos (MASSON et al., 2005; SIMÕES et al., 2007; BONIFÁCIO et al., 2014).

Um exemplo de componente vegetal útil no desenvolvimento de emulsões em

escala nanotecnológica é o óleo vegetal, isto se deve às suas propriedades

favoráveis no que se diz respeito à baixa viscosidade e peso molecular. O seu uso é

justificado devido ao menor poder de oclusão quando comparado aos óleos

minerais, o que permite uma maior capacidade de penetração na pele e como

consequência o aumento da veiculação de agentes terapêuticos (CHANDLER, 2002;

BERNARDI et al., 2011).

A utilização de produtos naturais como os extratos vegetais são de extrema

importância e aplicabilidade principalmente na terapêutica antimicrobiana,

entretanto, alguns problemas são observados. A maioria dos constituintes

biologicamente ativos dos extratos, como os flavonoides, taninos e terpenoides são

altamente hidrossolúveis, mas apresentam baixa absorção, ou por serem incapazes


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de atravessar a membrana lipídica das células ou por apresentarem tamanho

molecular elevado, dificultando sua absorção e consequentemente promovendo a

perda de parâmetros relacionados com a eficácia dos mesmos (KESARWANI e

GUPTA, 2013). Este problema justifica o fato de uma série de plantas medicinais

apresentarem potencial in vitro satisfatório, e pouca ou nenhuma ação in vivo. Além

disso, algumas substâncias consideradas essenciais à formulação acabam muitas

vezes não sendo utilizadas simplesmente por apresentar-se incompatível juntamente

com os demais componentes da formulação ou até mesmo por apresentar

propriedades indesejáveis (BONIFÁCIO, 2014).

O uso da nanotecnologia farmacêutica na veiculação de extratos medicinais

tem aberto novos horizontes para uma melhor atividade e promoção da liberação de

nanopartículas. Neste sentido, a estratégia de aplicação da nanotecnologia em

extratos vegetais, em especial, vem sendo bastante citada na literatura uma vez que

os sistemas nanoestruturados demonstram ser capazes de potencializar a ação de

extratos de plantas, reduzindo a dose necessária e os efeitos colaterais, e

melhorando sua atividade biológica (GHOSH et al., 2013; RAJENDRAN et al., 2013).

Bonifácio et al. (2014) publicaram uma revisão bibliográfica enfatizando a

utilização de sistemas de liberação de fármacos para a incorporação de produtos de

origem natural com a finalidade de promover o aumento da biodisponibilidade dos

mesmos. Os autores apresentaram sistemas de grande importância e muito

utilizados na terapêutica moderna, sendo eles: nanopartículas poliméricas,

nanopartículas lipídicas sólidas, sistemas líquidos cristalinos, lipossomas e

microemulsão. Seguindo a mesma tendência, Kesarwani e Gupta (2013)

apresentaram uma revisão onde é possível verificar a utilização de vários sistemas

nanotecnológicos de liberação de fármacos empregando plantas medicinais. As

pesquisas apresentadas pelos autores demonstram que a veiculação em bases

nanotecnológicas promoveu a melhora da ação farmacológica em todos os casos

analisados.

O desempenho ideal de princípios ativos sintéticos ou oriundos de fontes

naturais é dependente principalmente do fornecimento de quantidades suficientes

dos mesmos. Para isso, os novos sistemas de liberação de drogas devem promover

a deposição do princípio bioativo em quantidades e concentrações suficientes


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durante o período de tratamento, e por sua vez, promover perfeito direcionamento

para o sítio de ação desejado. A perda parcial ou total de uma atividade específica

pode ser observada quando o extrato recebe tratamentos do tipo isolação ou

purificação dos constituintes. Além disso, alguns componentes são altamente

sensíveis ao pH ácido do estômago, promovendo sua destruição e posterior perda

do efeito desejado, neste sentido, alguns compostos como os extratos vegetais não

são utilizados clinicamente justamente pelo fato de apresentarem perda da atividade

terapêutica, simplesmente por apresentarem empecilhos como estes (AJAZUDDIN,

2010; BONIFÁCIO et al., 2014).

2.3.1. Sistemas líquido-cristalinos

Os cristais líquidos (CL) foram descobertos a mais de 100 anos pelo botânico

austríaco Friederich Renitzer ao observar a presença de dois pontos de fusão no

benzoato de colesterilo, mas, somente depois da década de 60 é que estudos a fim

de avaliar suas propriedades e aplicações foram relatados, sendo assim, há uma

expansão da utilização de CLs nas mais variadas áreas da ciência para diversos

fins, que vai desde a expansão tecnológica de produtos de cunho eletrônico a

veiculação de fármacos insolúveis em água (HIRD, 2007; HEGGMAN et al., 2007).

Por definição um cristal líquido é caracterizado como sendo um fluído

intermediário entre a fase sólida cristalina, ordenada tridimensionalmente, e a fase

líquida isotrópica desordenada, onde a temperatura exerce um papel fundamental

para a formação das estruturas que constituem cada tipo de fase, a Figura 9 ilustra

esta informação (BONIFÁCIO et al., 2014).


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Figura 9. Representação esquemática o arranjo dos cristais líquidos em função da

temperatura

Fonte: Adaptado de Bonifácio et al. (2014).

Em um sólido cristalino as unidades da fase (íons, moléculas, por exemplo)

estão em um arranjo ordenado em três dimensões, ou seja, possuem uma

orientação e uma posição dentro de uma célula unitária de longo alcance. Em um

líquido isotrópico as unidades perdem tal arranjo e se encontram aleatoriamente

dispersas no espaço. Nesta fase as propriedades ópticas, elétricas, magnéticas, são

invariáveis. Para um CL a ordem posicional é parcial ou totalmente perdida, porém a

ordem orientacional é mantida. Devido a tal arranjo, os CLs apresentam

propriedades físicas típicas do estado sólido cristalino e propriedades mecânicas

semelhantes às do estado líquido, o que caracteriza sua fluidez. Possue

conformações anatômicas que os classificam como sendo ordenados ou

desordenados, sendo assim evidenciadas pela sua facilidade de efluxo, e, por este

aspecto, podem ser nomeados de mesofases e suas moléculas constituintes como

mesógenos (BONIFÁCIO et al., 2014).

Os sistemas líquido-cristalinos são formados por moléculas de tensoativo que

se autoagregam na presença de água, formando uma variedade de estruturas.

Quando esses tensoativos são incorporados em uma mistura imiscível de óleo e

água, eles podem se situar na interface entre o óleo e a água, resultando em

diferentes estruturas líquido-cristalinas (SILVA et al., 2014). As fases líquido-


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cristalinas são divididas em duas grandes categorias, sendo uma delas os cristais

líquidos liotrópicos (CLL) e a outra os cristais líquidos termotrópicos (CLT). Os CLL

são constituídos por moléculas anfifílicas (ex. tensoativos), as quais apresentam

duas regiões distintas: uma parte polar (hidrofílica, iônica) também chamada de

cabeça e uma parte apolar (hidrofóbica, hidrocarboneto) conhecida por cadeia. A

parte polar é solúvel em água e a parte da cadeia, apolar, se auto-associa em uma

unidade geradora da mesofase, a micela. Nos CLLs, a fase líquido-cristalina é

dependente da concentração do solvente e da temperatura (LIU et al., 2013). As

mesofases de CLLs podem ser consideradas como micelas ordenadas com arranjo

molecular caracterizado por regiões hidrofóbicas e hidrofílicas de maneira alternada.

Conforme o aumento da concentração de tensoativo, diferentes formas líquido-

cristalinas podem ser obtidas, como as hexagonais, cúbicas e lamelares (CHORILLI

et al., 2011).

A mesofase hexagonal apresenta-se como micelas empacotadas em arranjo

hexagonal e são separadas por uma região contínua de água. Este tipo de mesofase

pode ser classificado em fase reversa, onde é formada por canais aquosos

circundando as extremidades polares do tensoativo, com a porção apolar localizada

ao redor dos cilindros, ou pode ser classificada em fase normal, onde as cabeças

polares do tensoativo localizam-se na região externa dos cilindros. Por meio de

microscopia de luz polarizada observa-se anisotropia, com estruturas estriadas e

sua menor viscosidade em relação à fase cúbica, portando-se como uma importante

propriedade que facilita suas aplicações práticas (YARIV et al., 2010).

A mesofase cúbica, ou também chamada de isotrópica viscosa, é formada por

micelas normais (fase contínua polar) ou reversas (fase contínua apolar)

empacotadas em arranjo característico cúbico. Não é birrefringente quando

observada em microscópio de luz polarizada como as fases lamelar e hexagonal

(CALIXTO, 2013).

As mesofases lamelares são bicamadas alternadas de moléculas ordenadas

de tensoativo e de solvente, de modo que as cadeias hidrofóbicas do mesmo são o

centro da lamela e sua parte hidrofílica está em contato com a camada de solvente.

Essa fase é caracterizada por sua fluidez e anisotropia na forma de cruz de malta

(WANG e ZHOU, 2009).


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Em relação aos CLT, são designados assim em função de seu

comportamento mesomórfico a ser induzido por meio da variação de temperatura. A

presença da mesofase pode ser observada quando se funde um sólido cristalino ou

mesmo quando se resfria um líquido isotrópico, na ausência de solvente. Os CLT

são formados por moléculas com forte anisometria geométrica, sendo a unidade

geradora do mesomorfismo (perfil líquido-cristalino) a própria molécula (BISOYI e

KUMAR, 2011).

A presença de orientações ordenadas das interfaces classifica-se como um

fenômeno comum e essencial aos estados líquidos cristalinos. No entanto, quando

se tem o objetivo de caracterizar os comportamentos das fases de sistemas líquidos

cristalinos é de extrema importância que se conheça a existências de outros tipos de

mesofases, as quais não são CL. Sendo assim, é comum se deparar com

microemulsões isotrópicas, mesofases esponjosas e emulsões, cujas interfaces não

possuem qualquer tipo de ordem com propriedade orientacional (TAHAR-DJEBBAR

et al., 2011).

O desenvolvimento de um sistema de liberação de fármacos confiável e

eficaz, focando no estabelecimento de tratamentos seguros e potencialmente

favoráveis contra patologias, instiga diversos pesquisadores a pleitearem uma

plataforma veiculadora de fármacos que possibilite a distribuição do mesmo na via

de administração pretendida, priorizando a melhor interação fármaco-receptor e a

redução de efeitos deletérios. Sendo assim, a escolha de um sistema que atenda a

todas as necessidades faz-se de extrema valia, principalmente em sistemas

carreadores de fármacos incorporados em CLs (PRAÇA et al., 2012).

Os sistemas líquidos cristalinos (LCs) têm atraído grande atenção devido à

possibilidade de se obter partículas estruturadas com o uso de métodos

instantâneos e modular as forças formadas com estímulos fisiológicos, tais como,

pH, temperatura e força iônica (KRAINEVA et al., 2005). De acordo com Formariz et.

al (2005) os LCs podem ser administradas através de diversas vias, como oral, retal,

subcutânea, tópica, transdérmica, intramuscular e endovenosa, sendo que os

critérios para a escolha dos componentes para cada um desses fins devem ser

estabelecidos de acordo com características próprias de cada uma dessas, levando

em consideração fatores como viscosidade, pH, interação entre as moléculas e o


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solvente empregado, dentre outros, para que assim, haja perfeita harmonia entre o

fármaco e o sistema, sendo que esta desempenha um importante papel no controle

da liberação do princípio ativo. Gabboun et al. (2001) confirmam essa alegação ao

ressaltarem que a razão de liberação de fármacos incorporados em LCs dependerá

da estrutura da mesofase e os componentes que as formam, assim como as

características físico-químicas do fármaco, tornando possível o emprego de CLs

como veículos carreadores de fármacos, os quais podem ser capazes de controlar a

liberação das substâncias neles incorporados havendo consonância entre este e a

via de administração (STEVENSON et al., 2005).

A grande vantagem de se fazer o uso de CLs como sistema de liberação de

fármacos é promover uma melhor estabilidade física e um amplo potencial de

solubilização dos fármacos (CHORILLI et al., 2011). A incorporação de princípios

bioativos pode ser realizada tanto na parte polar quanto na apolar do sistema,

dependendo de sua solubilidade, além da possibilidade de incorporação entre as

moléculas de tensoativo (CHORILLI et al., 2013).

O desenvolvimento de formulações a base de CLs, para aplicações em

diversas vias de administração, inclusive a via vaginal, apresenta-se como

promissor. O tratamento de patologias por via intravaginal utilizando CLs como

plataforma promissora de veiculação de fármacos, ainda é recente e necessita de

implementações em termos de desenvolvimento científico e tecnológico (SILVA et

al., 2014).

A alta viscosidade de algumas mesofases líquido-cristalinas como as cúbicas

torna difícil a sua administração, pois, a aplicação de um sistema precursor de

cristais líquidos mucoadesivos pode levar à formação da rede líquido-cristalina após

o contato com o substrato biológico, através de estímulo orgânico, como

temperatura ou fluído biológico, por exemplo, a saliva ou muco (CALIXTO, 2013). O

interessante é que pelo fato de apresentarem-se líquidos em estado de repouso ou

em temperaturas ambientes, os SPCL podem mudar sua conformação no local de

aplicação, por exemplo, em uma aplicação intravaginal, ao entrar em contato com o

muco ou corrimento vaginal ocorre à incorporação da água existente, sendo assim,

assume um caráter mais viscoso, assumindo um novo perfil estrutural (SILVA et al.,

2014).


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Além da possibilidade da mudança estrutural do sistema, a adição de

componentes bioadesivos à formulação pode gerar uma melhora do perfil biológico

do mesmo, ou seja, estes produtos promovem um maior tempo de contato com a via

de administração e neste sentido desencadeiam uma liberação mais intensa e direta

no local de ação, além de promover total aproveitamento do princípio ativo, pois não

ocorre o escoamento do mesmo, e em contrapartida proporciona um conforto maior

ao indivíduo que o utiliza (BRUSCHI et al., 2007). Sistemas de liberação de

fármacos que possuem característica bioadesiva podem ser planejados para serem

aderidos não só em mucosas que contenham grandes quantidades de água, como a

vaginal, mas também em substratos como a pele e as mucosas nasal, ocular, bucal,

respiratória, urinária e gastrintestinal, melhorando, dessa forma, a biodisponibilidade,

a absorção e o transporte de fármacos, assim como, reduzindo os efeitos sistêmicos

indesejáveis e a necessidade de repetidas doses, o que pode aumentar a adesão do

paciente ao tratamento (CALIXTO, 2013).

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3. Objetivos

Gosto daquele que sonha o impossível. (Johann Goethe)

http://pensador.uol.com.br/autor/johann_goethe/

Objetivos 60

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Determinar o potencial antifúngico do extrato metanólico de escapos de

Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhlland incorporado ou não incorporado em um

sistema de liberação de fármacos precursor de cristais líquidos mucoadesivos, com

enfoque no tratamento da candidíase vulvovaginal.

3.2. Objetivos específicos

Avaliar in vitro a ação antifúngica do extrato metanólico de escapos de S. nitens

contra cepas clínicas e padrão (ATCC) de Candida spp.

Desenvolver e caracteriza, sob o aspecto físico-químico um sistema nanoestruturado

de liberação de fármacos (cristais líquidos mucoadesivos) aplicável na incorporação

do extrato vegetal.

Avaliar in vitro a ação antifúngica do extrato vegetal após a incorporação no sistema

de liberação de fármacos contra cepas clínicas e padrão (ATCC) de Candida spp.

Determinar o perfil de virulência in vitro da cepas de Candida spp. pelos testes de

capacidade de inibição de hifas, formação de biofilme e Time kill.

Avaliar a citotoxicidade in vitro do extrato vegetal antes e após a incorporação no

sistema de liberação de fármacos.

Avaliar a ação profilática do extrato vegetal incorporado ou nao no sistema de

liberação de fármacos frente a modelo experimental in vivo de CVV causada pela

Candida krusei (modelo com não-albicans).

Avaliar a ação terapêutica do extrato vegetal incorporado e não incorporado no

sistema de liberação de fármacos frente a modelo experimental in vivo de CVV

causada por Candida albicans (modelo com a espécie prevalente na CVV).

Comparar a aplicabilidade do extrato vegetal incorporado ou não no sistema de

liberação de fármacos voltando-se ao tratamento da candidíase vulvovaginal.

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4. Material e Métodos

Sonhos determinam o que você quer. Ação determina o que você conquista.

(Aldo Novak)

http://pensador.uol.com.br/autor/aldo_novak/

Material e Métodos 62

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4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Procedência e preparação do extrato vegetal

O extrato metanólico dos escapos de Syngonanthus nitens foi obtido a partir da

amostra vegetal cedida pelo Laboratório de Fitoquímica, do Departamento de

Química Orgânica do Instituto de Química de Araraquara - Universidade Estadual

Paulista “Julio de Mesquita Filho” (UNESP), sob coordenação da Profa. Dra.Lourdes

Campaner dos Santos.

A coleta do material vegetal foi realizada por Crysthiano Borges Pereira na

Serra do Jalapão no estado do Tocantins, Brasil. A identificação do mesmo foi

realizada pelo Prof. Dr. Paulo Takeo Sano (USP/SP). Uma exsicata de número SPF

189975 foi depositada no IB-USP São Paulo.

O extrato vegetal foi preparado pelo método de extração exaustiva de

percolação simples (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010). O processo de extração

foi iniciado com o intumescimento prévio dos escapos da planta triturados, (500 g)

em contato com o solvente (metanol), por duas horas antes do início da percolação.

Após o tempo de intumescimento, o conjunto (metanol + planta vegetal) foi colcado

no percolador e devidamente preenchido com papel de filtro, de maneira rápida e

uniforme para que não houvesse a formação de bolha no interior do mesmo. O início

do processo de percolação deu-se após a deposição de mais metanol dentro do

percolador. A percolação teve duração de 21 dias. O extrato percolado foi

novamente filtrado em papel de filtro e concentrado em rotaevaporador sob pressão

reduzida em temperatura inferior a 40ºC.

Após, iniciou-se o processo de eliminação da quantidade de residual de

solvente (metanol) em capela de exaustão. O extrato foi submetido à liofilização.

Para o uso nos ensaios biológicos, foi preparado uma solução do extrato a

2000 μg/mL em DMSO a 20% e q.s.p. 1 mL de meio de cultura RPMI estéril, e

solubilizado em banho maria por ultrasson. A solução obtida foi mantida como

estoque até o início dos experimentos em temperatura de -20 ºC (ARAÚJO et al.,

2013).


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4.2. Cepas fúngicas

As cepas clínicas utilizadas são parte da coleção micológica do Laboratório

de Microbiologia do Departamento de Doenças Dermatológicas, Infecciosas e

Parasitárias da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP,

cedidas pela Profa. Dra. Margarete Teresa Gottardo de Almeida, responsável pelo

laboratório.

Foram utilizadas 22 cepas de Candida spp., sendo 17 de origem clínica e 5

ATCC. As características das cepas clínicas das espécies C. albicans (5), C.

glabrata (3), C. krusei (3), C. tropicalis (3) e C. parapsilosis (3) são apresentadas na

Tabela 1.

Tabela 1. Relação de cepas clínicas de Candida sp.

Amostra

Espécie

Origem

Clínica

Resistência

Sensibilidade

CAV 1

C. albicans

Secreção vaginal

Sintomática

Itraconazol, cetoconazol, fluconazol

anfotericina B,

CAV 2

C. albicans

Secreção vaginal

Sintomática

Cetoconazol, itraconazol, fluconazol

anfotericina B,

CAV 3

C. albicans

Secreção vaginal

Sintomática


anfotericina B,

CAV 4

C. albicans

Secreção vaginal

Sintomática


anfotericina B,

CAV 5

C. albicans

Secreção vaginal

Sintomática


anfotericina B,

CGV 1

C. glabrata

Secreção vaginal

Sintomática

cetoconazol, Itraconazol, fluconazol

anfotericina B,

cetoconazol, itraconazol

CGV 2

C. glabrata

Secreção vaginal

Assintomática


anfotericina B,

cetoconazol, itraconazol,

CGV 3

C. glabrata

Secreção vaginal

Assintomática


anfotericina B,

cetoconazol, itraconazol,

CKV 1

C. krusei

Secreção vaginal

Sintomática

cetoconazol, Itraconazol, fluconazol*

anfotericina B

CKV 2

C. krusei

Urina

Não descrita


anfotericina B


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CKV 2

C. krusei

Unha do pé

Não descrita


anfotericina B

CTV 1

C. tropicalis

Secreção vaginal

Assintomática

cetoconazol,

Itraconazol, fluconazol

Anfotericina B, fluconazol

CTV 2

C. tropicalis

Secreção vaginal

Sintomática

cetoconazol,


Anfotericina B, cetoconazol

CTV 3

C. tropicalis

Secreção vaginal

Sintomática

Cetoconazol,


Anfotericina B, cetoconazol

CPV 1

C.parapsilosis

Secreção vaginal

Assintomática

cetoconazol,


anfotericina B, cetoconazol, itraconazol,

fluconazol

CPV 2

C.parapsilosis

Secreção vaginal

Sintomática

cetoconazol,


anfotericina B, cetoconazol, itraconazol,

fluconazol.

CPV 3

C.parapsilosis

Secreção vaginal

Sintomática

cetoconazol,


anfotericina B, cetoconazol, itraconazol.

*Resistência natural

Adicionalmente, foram utilizadas 1 cepa ATCC de cada espécie clínica;

As cepas padrão (ATCC) foram: C. albicans (ATCC 10231), C. krusei (ATCC

6258), C. glabrata (ATCC 2001), C. tropicalis (ATCC 750), e C. parapsilosis (ATCC

22019), da micoteca do Laboratório de Fisiologia de Micro-organismos da Faculdade

de Ciências Farmacêuticas de Araraqura-UNESP.

Todas as leveduras foram mantidas em caldo sabouraud dextrose (ASD)

acrescido de 20% de glicerol e congeladas à temperatura de - 20ºC. Para o uso, as

mesmas foram repicadas em 2 mL de caldo sabouraud dextrose e incubadas à 37ºC

em estufa microbiológica por 48 horas.

4.2.1. Preparo das suspensões fúngicas

Após o crescimento das leveduras em ASD foram transferidas para PBS

estéril e diluídas até escala 0,5 de McFarland (106 UFC/mL). A concentração das

leveduras foi confirmada por leitura espectrofotométrica a 620 nm e contagem em

Câmara de Neubauer. Desta suspensão foi realizada uma diluição 1/1000 obtendo-

se uma suspensão de 103 UFC/mL utilizada nos experimentos (GABRIELSON et al.,

2002;CLSI, 2008).


(SPCLM)


__________________________________________________


Para a elaboração do SPCLM empregou-se o ácido oleico (AO) como fase

oleosa e álcool cetílicoetoxilado e propoxilado – Procetyl® AWS (PRO) como

tensoativo. A fase aquosa foi constituída de uma dispersão polimérica (DP) à 5%

sintetizada a partir de dois polímeros, Policarbofil® -2,5% (PP) e Carbopol® C974P -

2,5% (CP), suspensos em água Mili-Q® por meio de agitação mecânica e com o pH

ajustado à 7,0 com trietanolamina.

A Figura 10 apresenta os constituintes utilizados para o desenvolvimento das

formulações.

Figura 10. Constituintes do SPCLM

a= Procetyl

® ; b= Dispersão polimérica; c= Ácido oléico

4.3.1. Elaboração do diagrama de fases ternário

À temperatura ambiente, diferentes proporções (0 a 100% m/m) de cada fase

dos sistemas foram homogeneizadas por meio de agitação em vórtex resultando

desse modo na construção do diagrama de fase ternário composto por 36

formulações. Todas as formulações que não estavam em pH 7,0 foram ajustadas

com trietanolamina (base fraca). Todas as formulações foram classificadas

visualmente como sistemas viscosos transparentes (SVT), sistema viscoso

translúcido (SVTr), sistema viscoso opaco (SVO), sistema líquido transparente

(SLT), sistema líquido translúcido (SLTr), sistema líquido opaco (SLO) ou sistemas


__________________________________________________


que apresentaram separação de fases (SF). Desse modo, foi possível delimitar as

diferentes regiões no diagrama de fases.

4.3.1.1. Análise por microscopia de luz polarizada (MLP)

A partir das 36 formulações obtidas no diagrama de fases, excluíram-se

aquelas regiões que se apresentaram opacos ou com separação de fases. Deste

modo, 22 pontos foram eleitos para a realização da observação por MLP.

Uma gota de cada formulação foi colocado em uma lâmina de vidro coberta

com uma lamínula e, em seguida, examinada através do microscópio de luz

polarizada Olympus® BX41 acoplado com Seção QColor3 (Olympus America Inc.), a

25 ± 0,5 º C. Deste modo comportamento isotrópico ou anisotrópico das amostras foi

obtido, onde os pontos puderam ser classificados em cruz de malta (CM); estrias (E);

estrias + cruz de malta (E+CM) e campo escuro (CE).

4.3.1.2. Seleção das formulações para análises farmacotécnicas e biológicas

A escolha da formulação ideal para a realização das triagens antifúngicas in

vivo e in vitro, assim como as caracterizações farmacotécnicas por microscopia de

luz polarizada, reologia e bioadesão in vitro, basearam-se nas características

observadas em cada uma das formulações obtidas, selecionando aquelas líquidas e

localizadas numa região de transição para cristal líquido para poderem atuar como

sistema precursor de cristal líquido, neste sentido, foram eleitas duas formulações.

Após a incorporação do extrato, as formulações foram novamente

analisadas por MLP a fim de investigas possíveis alterações estruturais.

4.3.1.3. Ensaio do efeito muco nos sistemas

A fim de verificar in vitro a propriedade precursora de cristais líquidos,

foi desenvolvido um muco vaginal artificial preparado como descrito por Owen e

Katz. (2000). Para a preparação de 1L da formulação, pesou-se 3,51g de NaCl,

1,40g de KOH, 0,222g de Ca(OH)2, 0,018g de albumina de soro bovino, 2,00g de

ácido láctico, 1,00g de ácido acético, 0,16 g de glicerol, 0,4 g de ureia, 5,0g de


__________________________________________________


glucose e 15g de mucina. Após a completa mistura, o pH foi ajustado para 4,2

utilizando HCl 0,1%. Para avaliar o efeito do muco nas formulações (incorporadas /

não incorporadas com o extrato), foram acrescentados 5, 10, 30, 50 e 100% do

fluido vaginal simulado em relação à massa inicial (2g). Este ensaio foi realizado

com o SPCLM sem e com o extrato vegetal incorporado (2000 µg/mL). Amostras

representativas de cada porcentagem adicionada foram analisadas através da MLP,

para que possíveis mudanças estruturais fossem elucidadas. Uma gota de cada

formulação foi colocada numa lâmina de vidro coberta com uma lamínula e, em

seguida, examinada através do microscópio de luz polarizada Olympus BX41

acoplado com Seção QColor3 Olympus America Inc., a 25 ± 0,5 º C. Este ensaio

permitiu avaliar de modo in vitro, o comportamento exercido pelo sistema

desenvolvido quanto à formação de cristais líquidos em contato com muco vaginal.

4.3.1.4. Análises reológicas contínuas (curva de fluxo)

As formulações selecionadas (25 e 26) foram submetidas à análise reológica

com e sem a incorporação do extrato vegetal, e também do MVA incorporado na

proporção 1:1, para que se observassem quaisquer alterações antes e após a

incorporação do extrato de S. nitens e também do MVA.

O fluxo contínuo foi analisada numa tensão controlada através do reômetro

AR2000 ® (TA Instruments, New Castle, DE, EUA), equipado com uma geometria de

placas paralelas (40 mm de diâmetro) e com gap de 200 µm, a 37 ± 0,1 °C, em três

replicatas. Amostras das formulações foram cuidadosamente aplicada sobre a placa

inferior, assegurando o mínimo de contato e deixou-se equilibrar durante 3 minutos

antes da análise. A taxa de cisalhamento utilizada foi de 0, 01 a 100s-1 para a curva

ascendente e de 100 a 0, 01s-1 para a curva descendente, durante 120 segundos

cada. O teste foi realizado em triplicata.

O índice de índice de consistência e fluxo foram determinados a partir da Lei

de potência como descrito na Equação 1 para a análise quantitativa de

comportamento de fluxo.


__________________________________________________


Equação 1.

onde: "τ" é a tensão de cisalhamento; "ɤ" é a taxa de cisalhamento; "K" é o índice de

consistência e "η" é índice de fluxo.

4.3.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva

Para a realização deste ensaio foi utilizada a mucosa vaginal de suíno, cedida

por um frigorífico local. A força necessária para remover o sistema selecionado da

superfície da mucosa vaginal foi avaliada in vitro, utilizando o analisador de textura

TA-XT plus® (Stable Micro Systems, Surrey Inglaterra), no modo Adhesion Test.

Todas as amostras foram testadas com e sem MVA na forma não incorporada e

incorporada com o extrato vegetal à 37 ± 0.5 ºC.

Uma região com 2 mm de espessura mucosa vaginal foi fixada na parte

inferior da sonda do equipamento e hidratada com MVA por 30s. Após, o teste foi

iniciado abaixando a sonda do equipamento a uma velocidade constante (1mm s-1)

até entrar em contato com a superfície da amostra (formulação). A mucosa e a

amostra foram mantidas em contato durante 60 segundos e nenhuma força foi

aplicada durante este intervalo. Após 60 segundos, a sonda subiu a uma velocidade

de 0.5mm.s-1 até que o contato entre as superfícies da mucosa e da formulação

fosse cessado, e então essa força mucoadesiva necessária para ocorrer o

destacamento foi medida, refletindo a característica mucoadesão . Este ensaio foi

desenvolvido em sete repetições as quais fora foram analisados a 37 ± 0,5 ° C.

4.3.2. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM

Em relação ao extrato incorporado, a concentração de 4x o valor da CIM do

extrato não incorporado obtida sobre cada espécie de Candida foi utilizada pra a

incorporação no SPCLM e posterior análise através deste e dos outros métodos de


__________________________________________________


análise desenvolvido neste estudo. O extrato foi adicionado diretamente no SPCLM

onde o conjunto (SPCLM+extrato) foi submetido à sonicação para completa

solubilização no meio.

4.4. Ensaios antifúngicos in vitro

4.4.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

A avaliação da atividade antifúngica e determinação da CIM foi realizada

pela técnica de microdiluição de acordo com a metodologia descrita segundo o

documento M27-A3 da CLSI (2008), com modificações.

Em cada orifício das microplacas (96 poços) foi acrescentado meio de

cultura RPMI 1640, ajustado ao pH7,0 com tampão MOPs (ácido 3-[N-morfolino]

propanossulfônico) e esterilizado por membrana filtrante.

Adicionalmente foram acrescentados 100 μL das soluções dos extrativos

vegetais e realizada a diluição seriada de 1000 a 7,8 μg/mL. Em seguida foram

distribuídos 100 μL das suspensões dos micro-organismos (item 4.2.1.) em cada

orifício das microplacas.

Como controle positivo foi utilizado anfotericina B (16,0 a 0,06 µg/mL) e o

fluconazol (512 a 1,0 µg/mL). Também foi realizado o controle do meio de cultura, do

crescimento leveduriforme, esterilidade dos extratos vegetais e solvente. As

microplacas foram incubadas em estufa microbiológica à 37ºC por 48 horas. Os

testes foram realizados em triplicata.

4.4.1.1. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)

Após incubação das microplacas, foi realizada a determinação da CFM com

o objetivo de avaliar a capacidade do reestabecimento do crescimento fúngico após

48 horas de contato com a substância teste. Com o auxílio de palitos de madeira

estéreis, a mistura de cada poço foi repicada em Agar sabourand dextrose. As

placas foram incubadas à 37ºC por 48 horas e após a incubação, foi observado o

crescimento ou não das colônias leveduriformes.


__________________________________________________


4.4.1.2. Leitura com revelador

Foram adicionados 20 μL de solução aquosa de 2% de cloreto de 2,3,5-

trifeniltetrazólio (TTC), e incubação a 37ºC por 3 horas. A ausência de crescimento

do micro-organismo mantém as soluções dos poços incolores, enquanto a coloração

vermelha representa crescimento do mesmo (DUARTE et al., 2005). A Figura 11

ilustra um teste realizado com cepas de Candida sp revelado com o TTC.

Figura 11.Ensaio de microdiluição com levedura revelado com TCC

Fonte: O autor

O TTC é um indicador de oxirredução utilizado para diferenciar tecidos

metabolicamente ativos daqueles não ativos, principalmente relacionado com a

viabilidade celular. O mecanismo baseia-se na redução enzimática do 2,3,5-

trifeniltetrazólio (incolor) em 1,3,5-trifenilformazan (cor avermelhada) em tecidos

vivos devido à atividade de várias desidrogenases, enzimas importantes na oxidação

de compostos orgânicos e portanto no metabolismo celular (GABRIELSON et al.,

2002). A Figura 12 representa a reação de oxidação do TTC.


__________________________________________________


Figura 12. Reação de redução do TTC

NN

N+

NCl

-

NH

N

N

N

desidrogenases

2,3,5 trifeniltetrazólico

(incolor)

1,3,5 trifenilformazan

(avermelhado)

Fonte: O autor

4.4.3. Análise citotóxica in vitro

As linhagens VERO (ATCC® CCL-81™) e HeLa foram utilizadas na

determinação da citotoxicidade (IC50). As células foram mantidas em garrafas de

cultura com 5% de CO2, contendo 10 mL de cultura DMEM (Vitrocell®) enriquecido

com 10% de soro fetal bovino, sulfato de gentamicina (50 mg/L) e anfotericina B (2

mg/L), a 37ºC. As células utilizando uma solução de tripsina/EDTA (Vitrocell®),

centrifugadas (2000 rpm por 5 min) e contadas em câmara de Neaubauer ajustando

para 3,4 x 105 células/mL em meio DMEM. Desta suspensão, foram depositados 200

µL em cada orifício de uma microplaca de 96 orifícios obtendo uma concentração

celular de 6,8x104 células/poço e incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por

24 horas para aderência celular a microplaca. A seguir foram preparadas diluições

seriadas do extrato metanólico de escapos de S. nitens incorporado e não

incorporado no SPCLM, de maneira a se obter concentrações de 1000 a 3,90 µg/mL.

Foram adicionadas aos poços das microplaca após a retirada de todo o meio e das

células que não aderiram, sendo novamente incubadas por 24 horas. A

citotoxicidade dos compostos foi determinada pela adição de 30 µL do revelador

resazurina (0,01%) e leitura após 6 horas de incubação. A leitura foi realizada no

leitor de microplacas SpectraFluor Plus (TECAN®), utilizando-se filtros de excitação

e emissão nos comprimentos de ondas de 530 e 590 nm respectivamente. A


__________________________________________________


citotoxicidade (IC50) foi definida como a maior concentração do composto capaz de

permitir a viabilidade de pelo menos 50% das células (O'BRIEN et al., 2000).

Estes ensaios foram realizados no Laboratório de Micobacteriologia da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP, sob supervisão do

Prof. Dr. Fernando Rogério Pavan.

4.4.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans

Este ensaio foi desenvolvido segundo Araújo et al. (2013). Para análise da

atividade sobre a inibição de formação de hifas, uma suspensão previamente

preparada foi cultivada por 24 horas para se obter C. albicans (ATCC 10231) em

filamentação. A cepa fúngica foi ressuspensa a uma concentração de 2,5 x

10³cél/mL em solução de PBS pH 7,2 e a partir daí, uma alíquota de 20 μL deste

crescimento foi adicionado a poços contendo meio RPMI 1640 acrescido de soro

fetal bovino (10%) e gentamicina (1%) e a solução do extrato de S. nitens

incorporado/não incorporado no SPCL, avaliada nas concentrações de 2000 ug/mL

a 7,81 ug/mL. Ao final de 12 e 24 horas, foi analisada a inibição da formação das

hifas em microscópio de luz invertida com aumento de 400 x e registrada uma

imagem do campo observado para cada concentração. Anfotericina B à 16μg/mL foi

utilizada como controle positivo. Também foram realizados os controles do

crescimento fúngico, esterilidade do solvente e meio de cultura.

4.4.5. Formação de biofilme in vitro

O método de formação do biofilme foi realizado como descrito por Pitangui et

al. (2013) com modificações. Inicialmente 100μL das suspensões dos inóculos (5,0 x

108 cel/mL-1) preparadas em solução salina estéril (0,9%) foram adicionados em

placas de microdiluição com 96 poços. As mesmas foram incubadas sob rotação a

37 ºC durante 2 horas a 80 rpm para a pré-adesão do biofilme. O sobrenadante foi

removido de cada poço e, em seguida, 100 μL de meio RPMI foram adicionados e

procedeu-se a incubação das mesmas à 37° C por 48 horas, incluindo troca do meio

RPMI depois de transcorridas 24 horas. Após todo o período de incubação, o

sobrenadante foi removido e os poços foram lavados com 100μL de solução salina


__________________________________________________


estéril (0,9%). Foram adicionados 100μL do material vegetal incorporado e não

incorporado, nas concentrações de 20, 10, 5, 2.5, 1.2 e 0.6 mg/mL. As microplacas

foram novamente incubadas durante 24 horas a 37 °C. Como controle positivo foi

utilizado anfotericina B nas concentrações de 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.2 e 0.1 mg/mL.

Também foram realizados controles com o SPCLM puro e com o DMSO à 20%. Os

ensaios foram executados em triplicata e a revelação dos mesmos foi feita pela

redução do 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5- [carbonilo (fenilamino)]-2H-

tetrazólio-hidróxido (XTT®). A presença de viabilidade fúngica foi representada pela

coloração vermelha e ausência da mesma manteve os poços incolores.

A Figura 13 apresenta um teste revelado com o XTT aonde é possível

observar a viabilidade celular (coloração vermelha) e a ausência da mesma

(ausência de coloração).

Figura 13. Ensaio do biofilme in vitro revelado com XTT

Fonte: O autor

Este teste parte do princípio de que quando o XTT entra em contato com as

células vivas do fungo produtor de biofilme é reduzido por desidrogenases

mitocondriais metabolicamente ativas o que gera o desenvolvimento da coloração

laranja, característica da substância Formazan. A Figura 14 apresenta a reação de

redução do XTT.


__________________________________________________


Figura 14.Reação de redução do XTT

Fonte: Klein, 2012.

4.4.6. Ensaio Time kill

A fim de verificar o tempo que o extrato (incorporado e não incorporado)

necessita para promover a morte ou diminuição do crescimento fúngico, o ensaio foi

realizado segundo Zore et al., 2011. A Tabela 2 apresenta as cepas utilizadas no

estudo.

Em um tubo de ensaio contendo 9mL meio de cultura RPMI 1640 com a

levedura previamente padronizada (2,5x103 células/mL) foi adicionado 1mL do

extrato vegetal não incorporado e incorporado no SPCLM na concentração de 2x o

valor de CIM obtido (item 4.4.1.).

A mistura foi incubada a 37 ºC e, a partir daí, nos tempos 0 min, 30 min, 1, 2,

4, 8, 12, 24, 36 e 48 horas, foram retirados 500µL do conteúdo do mesmo e diluídos

em solução tamponada de PBS estéril na proporção 1:1. Foram submetidos à

centrifugação a 5.000 rpm por 2 minutos e após, todo o sobrenadante foi descartado

e o precipitado ressuspendido em 1 mL de PBS estéril. A partir desta suspensão, foi

realizado uma diluição 1:10 novamente com o tampão PBS e uma alíquota de 100µL

foi semeada na superfície de placas de ASD com auxílio de uma alça de Drigalski

estéril. Após 48 horas de incubação, procedeu-se a contagem das colônias.


__________________________________________________


Tabela 2. Cepas fúngicas e concentração dos extratos usados no ensaio de time kill

Cepas fúngicas Espécie Extrato não incorporado*

Extrato incorporado

ATCC 10231 C. albicans 500µg/mL 125µg/mL

CAV 3 C. albicans 500µg/mL 62,5µg/mL

ATCC 6258 C. krusei 250µg/mL 125µg/mL

CKV 3 C. krusei 125µg/mL 62,5µg/mL

ATCC 2001 C. glabrata 125µg/mL 7,8µg/mL

CGV 2 C. glabrata 125µg/mL 15,6µg/mL

ATCC 750 C. tropicalis 500µg/mL 250µg/mL

CTV 2 C. tropicalis 500µg/mL 250µg/mL

ATCC 22019 C. parapsilosis 500µg/mL 15,6µg/mL

CPV 1 C. parapsilosis 500µg/mL 62,5µg/mL

4.5. Ensaios experimentais de CVV in vivo

Os ensaios experimentais de CVV in vivo (profilático e terapêutico) foram

submetidos ao Conselho de Ética do Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP/FCFAR), tendo obtido o número de

protocolo: CEUA 34/2013 (Anexo 1).

Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Ciências

Biológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, com

temperatura e ventilação adequada, 12 horas de ciclo claro/escuro e, fez-se livre o

consumo de água e alimento durante o decorrer de todo o experimento. Os animais

foram alojados em gaiolas com dimensões de 50x60x22cm forradas com maravalha

esterilizada, e permaneceram durante 7 dias na sala experimental antes do início

dos procedimentos.

O ensaio terapêutico de CVV foi realizado com a espécie C. albicans como

agente patológico visto à prevalência da mesma nos casos de infecções. Já o ensaio

de profilaxia objetivou empregar uma cepa de linhagem não-albicans, sendo assim,


__________________________________________________


foi encolhida a espécie C. krusei devido sua resistência intrínseca ao fluconazol e

ser considerada de difícil tratamento nos casos de CVV.

4.5.1. Ensaio terapêutico experimental in vivo de CVV causada por C. albicans

Foram realizados ensaios com 2 cepas de C. albicans, uma de origem clínica

(CAV 3) e outra padrão (ATCC 10231), nos quais, foram empregadas ratas fêmeas

da linhagem Wistar (Rattus novergicus) com 8 semanas de idade, pesando entre

150-200 g.

O ensaio foi desenvolvido de acordo com Araújo et al. (2013), com

modificações. Inicialmente, os animais foram submetidos a um estado de

imunossupressão através da administração de 0,3 mL de ciclofosfamida – SIGMA®

(50 mg/p.c.) em dose única por via intraperitoneal e, para que houvesse a obtenção

do estado pseudo-estro, foi injetado 0,1 mL de solução de estradiol – SIGMA® (20

mg/mL) por via subcutânea no dia da imunossupressão, e nos 10 dias

subsequentes. O estado hormonal foi verificado de acordo com as considerações de

Marcondes et al. (2002), através de análises microscópicas da morfologia celular

encontrada no fluido vaginal dos animais, obtido através da lavagem com 0,1 mL de

solução PBS tamponada estéril, onde a presença de células epiteliais cornificadas e

anucleadas indicaram a fase pseudo-estro.

Após o a adequação do ciclo estral dos animais de cada grupo específico,

procedeu-se a infecção intravaginal com uma suspensão de 5.0x107 células/mL de

C. albicans (ATCC 10231 e CAV 3) preparadas em solução PBS tamponada estéril.

através da injeção de 0,1mL da suspensão fúngica com auxílio de um

micropipetador . Para verificação da infecção, após dois dias da inoculação foram

realizadas lavagens vaginais com 0,1 mL de solução tamponada de PBS estéril,

submetidas a análise microscópica e cultivadas em Ágar Sabouraud Dextrose

acrescido de cloranfenicol (ASD+clo). As placas foram incubadas a 37º C durante 48

horas. A presença de células leveduriformes livres ou em brotamento observadas

sob microscopia óptica e o crescimento de unidades formadoras de colônias (UFC)

no meio de cultura foi considerado positivo para a infecção.


__________________________________________________


4.5.1.1. Grupos experimentais e tratamento terapêutico

Foram empregados 13 grupos experimentais constituídos de 6 animais

(n=78). A Tabela 3 apresenta os grupos experimentais e seus respectivos

parâmetros de tratamentos estabelecidos para a determinação do potencial

antifúngico do extrato metanólico dos escapos de S. nitens.

Os tratamentos empregados nos ensaios foram realizados duas vezes ao dia

durante 8 dias. Os grupos 3 e 9, utilizados como controle com antifúngico, foram

procedidos com o emprego de um creme vaginal a base de cloridrato de tetraciclina

(25 mg/g) + anfotericina B (12,5 mg/g) (EMS® São Paulo, Brasil). Os grupos 5,7, 11

e 13 (tratamento com S. nitens incorporado/não incorporado) tiveram a

administração do extrato na concentração de 2 vezes o valor da CIM do extrato não

incorporado, obtida na triagem in vitro (500 ug/mL). Os grupos 4, 6, 10 e 12 foram

constituídos dos veículos/ solventes utilizados para a administração do extrato.

Todos os animais foram submetidos a pesagem diária durante o período de

tratamento, os valores encontrados foram comparados àqueles pertencentes ao

grupo controle negativo de infecção (não infectados - Grupo 1). Estes dados

permitiram observar fatores como a desnutrição e/ou obesidade que por ventura

foram ocasionados pela administração do extrato ou ao estabelecimento do estado

patológico.


__________________________________________________


Tabela 3. Grupos experimentais e tratamentos do ensaio de tratamento da CVV causada

por C. albicans.

Grupo experimental

Especificação Tratamento

Grupo 1*

Controle negativo de

infecção

Solução de PBS estéril

Grupo 2*

Controle de infeção


Grupo 3*

Controle positivo com

antifúngico

0,1 mL de creme antifúngico

Grupo 4*

Controle do solvente

0,1 mL de solução à 20% de

DMSO

Grupo 5*

Tratamento 1

0,1 mL do extrato puro (500 ug/mL)

Grupo 6*

Controle do SPCL

0,1 mL do SPCL sem o

extrato

Grupo 7*

Tratamento 2

0,1 mL do SPCL com o extrato (500 ug/mL)

Grupo 8**

Controle de infecção


Grupo 9**

Controle positivo com

antifúngico

0,1 mL de creme antifúngico

Grupo 10**

Controle do Solvente

0,1 mL de solução à 20% de

DMSO

Grupo 11**

Tratamento 3 0,1 mL do extrato puro (500

ug/mL)

Grupo 12**

Controle do SPCL

0,1 mL do SPCL sem o extrato

Grupo 13**

Tratamento 4

0,1 mL do SPCL com o

extrato (500 ug/mL)

* C. albicans ATCC 10231; ** C. albicans CAV 3

4.5.1.2. Análise da eficácia do tratamento

Para a verificação da eficácia dos compostos empregados em estudo, foram

realizadas análises microscópicas e cultura dos fluidos vaginais com o intuito de

determinar a carga fúngica vaginal. Nos dias 2, 4, 6 e 8 do período de tratamento, os


__________________________________________________


animais foram submetidos à coleta dos fluidos vaginais para que pudessem ser

procedidas as análises, os mesmos foram obtidos através de lavagem intravaginal

com 0,1 mL de solução tamponada de PBS (pH 7,4) estéril com auxílio de um

micropipetador. Após a obtenção do fluido, foram realizadas análises microscópicas

afim de verificar a presença ou ausência de leveduras no ambiente vaginal e,

também foi realizado a semeadura do mesmo em ASD+clo, e incubação a 37ºC em

48 horas, para que fosse quantificado o número de UFC em cada dia da análise do

tratamento.

4.5.1.3. Análise da recidiva de infecção e eutanásia

Após os 8 dias do término do período de tratamento, os animais foram

submetidos ao controle de recidiva da infecção afim de identificar e diagnosticar

posteriores estados infecciosos. Para este fim, foram procedidas análises

microscópicas e culturas dos fluidos vaginais coletados diariamente da mesma

maneira que foram coletados e analisados durante o período de análise da eficácia

do tratamento por um período de 7 dias. Os animais foram eutanasiados em câmara

de CO2.

4.5.1.4. Análises estatísticas

Os dados estatísticos foram analisados por ANOVA. Para a comparação dos

resultados dos tratamentos foi utilizado o teste de Tukey e para a comparação dos

resultados do tratamento e o controle foi empregando o teste de Dunnett.

4.5.2. Ensaio in vivo de profilaxia de CVV causada por C. krusei

Este ensaio foi desenvolvido de acordo com Araújo et al. (2013) e Zeng et al.

(2011). Foram empregadas ratas fêmeas da linhagem Wistar (Rattus novergicus)

com 8 semanas de idade e peso entre 150-200 g. Os animais foram distribuídos em

seis grupos experimentais compostos por 4 animais em cada. A Tabela 4 apresenta

todas as considerações referentes aos grupos experimentais.


__________________________________________________


Inicialmente, os animais dos grupos 3, 4, 5 e 6 foram levados a um estado de

imunossupressão com a aplicação intraperitoneal de solução de ciclofosfamida –

SIGMA® (50 mg/ p.c.) no primeiro dia do experimento, para que pudessem se tornar

susceptíveis ao desenvolvimento do estado patológico posteriormente.

Todos os animais foram tratados duas vezes ao dia com seus respectivos

agentes terapêuticos durante 10 dias que antecederam a infecção.O tempo deste

tratamento baseou-se no tempo de morte e/ou declínio do crescimento fúngico

obtido no ensaio time kill. Do 5º ao 10º dia de tratamento pré-infecção, os animais

foram submetidos à indução do estado pseudo-estro com aplicação subcutânea de

solução de estradiol – SIGMA® (0,2 mg/mL.) uma vez ao dia. O percurso da

mudança do ciclo estral dos animais foram observados por microscopia óptica a

partir de lavagens vaginais com solução tamponada de PBS estéril (100µL),

segundo Marcondes et al. (2002) onde a presença de células epiteliais cornificadas

e anucleadas representou a fase estral pretendida.

Tabela 4. Considerações gerais dos grupos experimentais do ensaio profilático

Grupo experimental Número de animais Condições de experimento

Tratamento desenvolvido*

Grupo 1 4 Negativo de infecção Solução de PBS estéril

Grupo 2

4

Infectados sem

imunossupressão


Grupo 3

4

Infectados com

imunossupressão


Grupo 4

4

Infectados e tratados

com antifúngico

Creme vaginal de

anfotericina B

Grupo 5 4 Infectados e tratados

com o extrato não

incorporado

Extrato não

incorporado a 250

µg/mL

Grupo 6 4 Infectados e tratados

com o extrato

incorporado

Extrato incorporado a

250 µg/mL

* realizado 2 vezes ao dia

Após 10 dias de tratamento pré-infecção e da prévia indução do estado

pseudo-estro, os animais foram infectados com uma suspensão de C. krusei

(5,0x106 células/mL) por via intravaginal (100µL) com auxílio de um micropipetador.


__________________________________________________


Os animais foram mantidos em repouso durante 2 dias que procedeu-se a infecção

para a fixação do inoculo e, somente depois deste período, foram realizadas

lavagens vaginais com PBS estéril para a verificação da carga fúngica vaginal,

sendo esta realizada com a observação microscópica do lavado vaginal à fresco e

também com a cultura do mesmo em ASD acrescido de cloranfenicol (ASD+clo).

O tratamento teve duração de mais 10 dias após a infecção dos animais,

onde foram coletados os lavados vaginais nos dias 2, 4, 6, 8, e 10, para a verificação

microscópica da presença de células fúngicas e também a cultura do mesmo em

ASD+clo.

Após o período de análise dos resultados, os animais foram eutanasiados em

câmera de CO2.

__________________________________________________


5. Resultados

“O mundo está nas mãos daqueles que tem a coragem de sonhar e

correr o risco de viver seus sonhos” (Paulo Coelho)

Resultados 83

__________________________________________________


5. RESULTADOS


5.1.1. Elaboração do diagrama de fases ternário

A leitura do diagrama foi realizada no sentido horário, onde o lado direito

refere-se ao tensoativo, o esquerdo à fase aquosa e a base à fase oleosa. A Figura

15 apresenta as 36 formulações obtidas a partir da mistura dos constituintes do

sistema, o qual foi classificado visualmente sob auxílio de luz direta em: sistema

opaco, sistema líquido transparente, sistema líquido translúcido, sistema viscoso

transparente, sistema viscoso translúcido e sistemas que apresentaram separação

entre as fases.

Figura 15. Diagrama de fases pontual do SPCLM constituído de AO (fase oleosa), PRO

(tensoativo) e DP (fase aquosa).

AO

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

PRO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

DP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sistema Viscoso Opaco

Separação de Fases

Sistema Líquido Translúcido

Sistema Viscoso Translúcido

Sistema Líquido Transpente

Sistema Viscoso Transparente

Resultados 84

__________________________________________________


De acordo com os dados observados no diagrama de fases desenvolvido,

houve uma maior prevalência de pontos com aparência líquida transparente

(30,5%), em seguida, aqueles que mostraram-se viscosos e opacos (22,2%) e, em

ordem decrescente: separação de fases (16,7%), viscosos translúcidos (13,9%),

líquidos translúcidos (11,1%) e por fim os viscosos porém transparentes (5,6%).

5.1.1.1. Microscopia de luz polarizada (MLP)

A Tabela 5 apresenta os resultados das amostras selecionadas para serem

analisadas por microscopia de luz polarizada, assim como as mesofases

correspondentes de cada formulação de acordo com as características visualizadas.

Tabela 5. Formulações analisadas por MLP

Amostra Estrutura Visualizada Mesofase

F14 E F16 Campo escuro Microemulsão

F17 Estrias Hexagonal

F18 Cruz de malta Lamelar

F19, F20 E F21 Campo escuro Microemulsão


F23 Estrias + Cruz de malta Transição p/ fase cúbica

F24, F25 E F26 Campo escuro Microemulsão


F28 Estrias + Cruz de malta Transição p/ fase cúbica

F29 Campo escuro Microemulsão

F30 E F31 Estrias Hexagonal

F32, F33, F34, F35 E F36 Campo escuro Microemulsão

As estruturas visualizadas: Estrias, Cruz de Malta, Campo escuro e

Estrias+Cruz de Malta, comprovam a presença de mesofases que correspondem

aos sistemas líquido-cristalinos (CHORILLI et al., 2011).

5.1.2. Escolha da formulação para análises farmacotécnicas e biológicas

Resultados 85

__________________________________________________


Após a análise de todas as formulações obtidas por meio do diagrama de

fases ternário foram escolhidas as formulações 25 e 26 para prosseguir a

investigação. As formulações apresentaram-se como campo escuro na análise por

MLP o que o que as classifica como um provável SPCLM.

A Formulação 25, eleita por possuir todos os critérios necessários para sua

aplicabilidade, foi composta de 40% de fase oleosa (AO), 20% de fase aquosa (DP)

e 40% de tensoativo (PRO). Esta formulação foi empregadas em todas análises

antifúngicas in vitro e in vivo desenvolvidas com as cepas de C. albicans.

A Formulação 26, também eleita por possuir todos os critérios necessários

para sua aplicabilidade, foi composta de 50% de fase oleosa (AO), 10% de fase

aquosa (DP) e 40% de tensoativo (PRO). Esta formulação foi empregadas em todas

análises antifúngicas in vitro de C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis,

assim como no ensaio profilático in vivo com C. krusei.

5.1.3. Ensaio de efeito muco nos sistemas

Após a incorporação do extrato (2000 µg/mL), as formulações foram

submetidas à adição do muco vaginal artificial (MVA), a fim de verificar o

comportamento precursor de cristais líquidos das mesmas. As Tabelas 6 e 7

apresentam os resultados da análise por microscopia de luz polarizada para as

formulações F25 e F26 respectivamente.


precursor de cristais líquidos da formulação 25

Teste

Viscosidade

Estrutura

visualizada

Mesofase

F25+5% de MVA + Campo escuro Microemulsão

F25+10% de MVA ++ Campo escuro Microemulsão

F25+30% de MVA +++ Cruz de Malta Lamelar

F25+50% de MVA ++++ Estrias Hexagonal

F25+100% de MVA +++++ Campo escuro Cúbica

+= viscosidade

Resultados 86

__________________________________________________


Tabela 7. Resultados da microscopia de luz polarizada para a avaliação do

comportamento precursor de cristais líquidos da formulação 26

Teste

Viscosidade

Estrutura

visualizada

Mesofase

F26+5% de MVA + Campo Escuro Microemulsão

F26+10% de MVA ++ Campo escuro Microemulsão

F26+30% de MVA +++ Cruz de Malta Lamelar

F26+50% de MVA ++++ Estrias Hexagonal

F26+100% de MVA +++++ Campo Escuro Cúbica

+ =viscosidade

Nota-se que ambas as formulações comportaram-se de maneira idêntica,

apresentado os mesmos resultados em todas as concentrações de MVA avaliadas.

A viscosidade das formulações cresce diretamente proporcional à concentração de

MVA, o que demonstra que quanto maior a quantidade de MVA, maior é a

viscosidade do sistema. O mesmo procedimento foi repetido com as formulações

puras (sem extrato), sendo encontrados os mesmos resultados, o que pode afirmar

que a introdução do extrato no sistema não interfere estruturalmente no seu

comportamento precursor de cristais líquidos.

As formulações acrescidas de 5 e 10% de MVA apresentaram-se líquidas e

campo escuro pela análise por MLP, característico de microemulsão. As com 30 e

50% mostraram-se bem delimitadas com a presença de cruz de malta (30%) e

estrias (50%), o que caracteriza as fases lamelar e hexagonal respectivamente.

Apesar da formulação acrescida de 100% de MVA também apresentar a mesma

característica (campo escuro) que àquelas com 5 e 10%, a alta viscosidade em que

o conjunto (SPCLM+MVA) apresentou-se, classifica-o como característico de fase

cúbica.

A Figura 16 representa o teste desenvolvido em ambas as formulações, com

a presença do MVA nas suas respectivas concentrações avaliadas (5, 10, 30, 50 e

100%) através de MLP.

Resultados 87

__________________________________________________


Figura 16. Fotomicrografia do ensaio com MVA por microscopia de luz polarizada (20x) das

formulações F25 e F26

a - e: SPCLM com 5, 10, 30, 50 e 100% de MVA respectivamente / f - j: SPCLM+extrato com 5, 10, 30, 50 e 100% de MVA respectivamente

5.1.4. Análises reológicas contínuas (Curva de fluxo)

A Figura 17 representa a as formulações 25 e 26 que foram submetidas às

análises reológicas contínuas.

Figura 17. Formulações submetidas à análises reológicas contínuas

a= formulações sem o extrato, com e sem a presença de MVA; b= formulações com o extrato, com e sem a presença de MVA.

Os gráficos apresentando os resultados das análises reológicas das

formulações 25 (P25) e 26 (P26) incorporado e não incorporado com e sem a adição

de MVA estão expressos nas Figuras 18 e 19.

Resultados 88

__________________________________________________


Figura 18. Reograma da formulação 25 (F25)

0 50 100

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

T

en

são

de C

isalh

am

en

to (

Pa)

Taxa de Cisalhamento (1/s)

P25 + muco + extrato

P25 + muco

P25

P25 + extrato

Símbolos cheios curva ascendente, símbolos vazios curva descendente.

Figura 19. Reograma da formulação 26 (F26)

0 20 40 60 80 100

0

20

40

60

Te

nsão

de

cis

alh

am

en

to (

Pa)

Taxa de cisalhamento (1/s)

F26 + EXTRATO + MUCO

F26 + MUCO

F26 + EXTRATO

F26

Símbolos cheios curva ascendente, símbolos vazios curva descendente.

Resultados 89

__________________________________________________


A partir das curvas de fluxo observadas é possível supor que ambas as

formulações submetidas à adição de MVA independente de conter o extrato

incorporado, se comportaram como fluidos não newtonianos, do tipo pseudoplástico

com tixotropia, uma vez que a curva de volta não sobrepõe a de ida. . Porém,

observou-se diminuição na área de histerese das formulações, revelando que o

retorno à reestruturação acontece de maneira mais rápida, ou seja, possui a

capacidade de retornar a sua forma original quando a tensão é diminuída, o que é

desejado para a aplicação proposta.

Em relação às formulações sem a presença de MVA observou-se

comportamento idêntico entre as mesmas, onde pode-se classificá-las como

sistemas Newtonianos independentemente da presença ou não do extrato vegetal.

A Tabela 8 apresenta os dados matemáticos referentes ao comportamento de

fluxo obtido no ensaio reológico com as formulações acrescidas de MVA.

Tabela 8. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações em

contato com MVA

Formulações n* K*

F25 + EXT + MUCO 0,30 17,64

F25 + MUCO 0,23 55,11

F26 + EXT + MUCO 0,27 10,88

F26 + MUCO 0,01 29,36

*valores representado pelas médias (±DP) obtidas a partir de três replicatas.

Através dos valores observados conclui-se que as formulações apresentam

um comportamento pseudoplástico, pois apresentaram valores de n <1 e com

tixotropia, ou seja, eles foram capazes de retornar para a sua estrutura original

quando a tensão de corte foi removida, a qual se mostrou com um aumento do seu

índice de consistência (k). Este comportamento é característico dos sistemas de

líquido-cristalinos, devido à formação da estrutura cristalina semi-sólida ( REN et al.,

2012).

Em relação às formulações sem a presença do MVA conclui-se através dos

dados matemáticos (Tabela 9) que ambas mostraram-se comportamento de fluxo

Resultados 90

__________________________________________________


característico de um líquido Newtoniano, ou seja, as formulações não sofrem

nenhuma intervenção sobre a imposição e a retirada da taxa de cisalhamento, os

valores de n próximo a 1 e o declínio “K” são as principais características deste

tipos de sistemas (BERNEGOSSI, 2013).

Tabela 9. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) das formulações sem a

adição de MVA

Formulações n* K*

F25 1.0 0.059

F25 +EXTRATO 1.0 0.069

F26 0,991 0,033

F26 + Extrato 0,900 0.031

*valores representado pelas médias (±DP) obtidas a partir de três replicatas.

5.1.5. Avaliação in vitro da força mucoadesiva (mucoadesão)

As Figuras 20 a 23 apresentam os resultados obtidos no teste de

mucoadesão in vitro referentes ao trabalho e a força bioadesiva que as formulações

exerceram sobre a mucosa vaginal.

Figura 20. Trabalho da força bioadesiva Figura 21. Força bioadesiva de F25 de F25

Formulações

F25

F25 + EXTRATO

F25 + MUCO

F25 + MUCO + EXTRATO

Tra

ba

lho

da

Fo

rça

Mu

co

ad

es

iva

(m

N.s

)

0

5

10

15

20

25

30

Formulações

F25

F25 + EXTRATO

F25 + MUCO

F25 + MUCO + EXTRATO

Fo

rça M

uco

ad

esiv

a (

mN

)

0

3

6

9

12

15

18

Resultados 91

__________________________________________________


Figura 22. Força mucoadesiva de F26 Figura 23. Trabalho da força mucoadesiva F26

Formulações

P26

P26 + EXTRATO

P26 + MUCO

P26 + MUCO + EXTRATO

Fo

rça

mu

co

ad

es

iva (

mN

)

0

2

4

6

8

10

12

14

Formulações

P26

P26 + EXTRATO

P26 + MUCO

P26 + MUCO + EXTRATO

Tra

ba

lho

da

Fo

rça

Mu

co

ad

es

iva

(m

N.s

)

0

500

1000

1500

2000

Os resultados mostraram que a incorporação de extrato não causou

alterações significativas no mucoadesão das formulações (p> 0,05), mas quando foi

adicionado o MVA na proporção 1:1, houve um significativo aumento dos parâmetros

mucoadesivos. Estes resultados podem pressupor que quando as formulações

entrarem em contato com o muco vaginal poderão ser capazes de aderir mais

fortemente com a mucosa e, consequentemente, irão permanecer durante mais

tempo no ambiente vaginal devido à característica de mucoadesividade.

5.1.6. Incorporação do extrato vegetal no SPCLM

Após os resultados preliminares da CIM do extrato não incorporado frente a

todas as cepas empregadas no estudo, partiu-se para a incorporação do mesmo na

concentração de 4x o valor obtido.

A incorporação foi realizada inicialmente com a incorporação do extrato

vegetal diretamente no SPCLM puro e, após esta adição, o conjunto

(SPCLM+extrato) foi submetido à sonicação por meio de banho ultrassônico em

temperatura ambiente não excedendo o tempo de 30 minutos, para que não

houvesse possíveis degradações tanto do sistema quanto do extrato. As Figuras 24

e 25 apresentam as formulações com os extratos incorporados em suas respectivas

concentrações.

Resultados 92

__________________________________________________


Figura 24. Formulação 25* com o extrato incorporado

*empregada na avaliação antifúngica in vitro com as cepas de C. albicans

Figura 25. Formulação 26* com o extrato incorporado

*empregada na avaliação antifúngica in vitro com as cepas não-albicans.

Após a incorporação do extrato, as formulações foram submetidas à análise

por microscopia de luz polarizada sob aumento de 20x, a fim verificar se a

introdução do extrato interferiu na estrutura do SPCLM. As Figuras 26 e 27

apresentam as formulações antes e após (escolhida a maior concentração para a

análise) a incorporação do extrato vegetal.

Figura 26. Formulação 25 antes e após a incorporação do extrato

a= SPCLM puro; b= SPCL+extrato

Resultados 93

__________________________________________________


Figura 27. Formulação 26 antes e após a incorporação do extrato

a= SPCLM puro; b= SPCL+extrato

Através das análises por MLP possível confirmar que o extrato vegetal não

interferiu na estrutura do sistema, sendo observado campo escuro antes e após a

incorporação, característico da mesofase microemulsão, portanto, esta análise

comprovou que mesmo após a incorporação do extrato o sistema permaneceu com

a propriedade precursora de cristais líquidos.

5.2. Análises antifúngicas in vitro

5.2.1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

As Tabelas 10 a 14 apresentam os resultados de CIM obtidos na avaliação da

atividade antifúngica do extrato frente a todas as cepas empregadas no estudo,

assim como seus respectivos resultados da avaliação com os antifúngicos

empregados como controles positivos.


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. albicans

CIM (µg/mL)

Amostra

S. nitens

não incorporado

S. nitens

incorporado

fluconazol

anfotericina B

ATCC 10231 250 62,5 R 0,12

CAV 1 125 62,5 R 0,12

CAV 2 250 62,5 R 0,12

CAV 3 125 31,2 R 0,12

CAV4 125 62,5 R 0,50

CAV5 250 62,5 R 0,25

(R) resistência

Resultados 94

__________________________________________________



não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. krusei

CIM (µg/mL)

Amostra

S. nitens

não incorporado

S. nitens

incorporado

fluconazol

anfotericina B

ATCC 6258 125 62,5 R 0,50

CKV 1 125 31,2 R 1,00

CKV 2 125 31,2 R 1,00

CKV 3 62,5 31,2 R 1,00

(R) resistência


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. glabrata

CIM (µg/mL)

Amostra

S. nitens

não incorporado

S. nitens

incorporado

fluconazol

anfotericina B

ATCC 2001 62,5 3,9 R 0,25

CGV 1 62,5 7,8 R 0,50

CGV 2 62.5 7,8 R 0,50

CGV 3 125 15,6 R 1,00

(R) resistência


não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. tropicalis

CIM (µg/mL)

Amostra analisada

S. nitens

não incorporado

S. nitens

incorporado

fluconazol

anfotericina B

ATCC 2001 250 125 128 0,50

CTV 1 500 250 R 0,25

CTV 2 250 125 R 2,00

CTV 3 500 125 R 4,00

(R) resistência

Resultados 95

__________________________________________________



não incorporado e incorporado no SPCLM frente a C. parapsilosis

CIM (µg/mL)

Amostra

S. nitens

não incorporado

S. nitens

incorporado

fluconazol

anfotericina B

ATCC 2001 250 7,8 16 0,50

CPV 1 250 62,5 R 0,25

CPV 2 500 62,5 R 0,50

CPV 3 500 31,2 R 0,50

(R) resistência

Os resultados obtidos comprovaram a ação antifúngica exercida pelo extrato

vegetal, visto que o mesmo mostrou-se ativo para todas as cepas de Candida spp.

estudo. A melhor atividade foi demonstrada para C. glabrata (CIM entre 62,5-125

µg/mL), C. krusei (CIM entre 62,5-125 µg/mL), C. albicans (CIM entre 125-250

µg/mL), C. tropicalis (CIM entre 250-500µg/mL) e C. parapsilosis (CIM entre 250-

500µg/mL), em ordem decrescente.

Para o extrato incorporado os resultados mostraram-se mais promissores,

visto que promoveu a diminuição da CIM de todas as cepas testadas como foram

apresentadas nas Tabelas 10 a 14. Ressaltamos os resultados obtidos coms as

cepas de C. albicans onde a CIM do extrato incorporado passou de 250 para 62,5

µg/mL em 3 cepas, de 125 para 62,5 µg/mL em outras 2 cepas e de 125 para 31,2

µg/mL na outra cepa. As linhagens não-albicans apresentaram resultados de

extrema importância, nas cepas de C. krusei foram evidenciados valores de 31,5-

52,5 após a incoporação do extrato, C. glabrata: 3,9 a 15,6 µg/mL, C. tropicalis: 125-

250 e C. parapsilosis: 7,8 a 62,5 µg/mL.

5.2.2. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)

As cepas de Candida apresentaram comportamento fungistático, ou seja,

após a retirada de uma alíquota de todos os poços da microplaca houve crescimento

fúngico em todas as concentrações testadas (>1000 µg/mL).

Resultados 96

__________________________________________________


5.2.3. Análise citotóxica in vitro

A Tabela 15 apresenta os resultados de citotoxicidade in vitro obtidos com o

extrato incorporado e não incorporado.

Tabela 15. Resultados da análise de citotoxicidade in vitro

Amostras analisadas *IC 50* Vero® *IC 50* HeLa®

F25 com extrato incorporado <3,90 <3,90

F25 pura <3,90 <3,90

Extrato em DMSO 20% 943,6 >1000

DMSO 20% Sem toxicidade a partir de 1,25%

Sem toxicidade a partir de 1,25%

*valores em µg/mL

O extrato não incorporado não apresentou toxicidade em ambas a linhagens

avaliadas, já quando incorporado no SPCLM houve significativo aumento do perfil de

toxicidade, o que mostra-se importante quando avaliados sobre a linhagem HeLa,

devido ao seu perfil tumoral.

5.2.4. Análise do perfil inibitório sobre a formação de hifas em C. albicans

Os resultados encontrados na avaliação do efeito inibitório do crescimento

hifal do extrato não incorporado sobre C. albicans (ATCC 10231) estão

apresentados na Tabela 16. As Figuras 28 e 29 apresentam as imagens do teste

através das fotomicrografias obtidas da microscopia de luz invertida sob aumento de

40x.


nitens não incorporado sobre C. albicans (ATCC 10231)

Tempo

Concentrações avaliadas

Extrato não incorporadoa

AMB 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8

12horas - - - - + + + + +

24 horas - - - + + + + + +

a valores em µg/mL; (-) ausência de crescimento hifal; (+) crescimento hifal

Resultados 97

__________________________________________________



10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X

a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de

1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente.


10231) realizado com o extrato de S. nitens não incorporado sob aumento de 40X

a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de

1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente.

As análises realizadas com o extrato incorporado no SPCLM estão

apresentadas na Tabela 17, e as imagens do ensaio estão apresentadas nas

Figuras 30 e 31.

Resultados 98

__________________________________________________



nitens incorporado no SPCLM sobre C. albicans (ATCC 10231)

Tempo

Concentrações avaliadasa

Extrato incorporado no SPCLM

AMB 1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8

12horas - - - - - - + + +

24 horas - - - - - - + + +

a valores em µg/mL; (-) ausência de crescimento hifal; (+) crescimento hifal


10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X

a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de 1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente


10231) realizado com o extrato de S. nitens incorporado no SPCLM sob aumento de 40X

a=controle de crescimento; b=anfotericina 16 µg/mL; c – j= SPCLM+extrato nas concentrações de 1000 à 7,8 µg/mL em ordem decrescente

Resultados 99

__________________________________________________


Em relação ao extrato incorporado no SPCLM, a inibição de hifas se deu à

concentração de 31,2 após 12 e 24 horas de ensaio.

5.2.5. Ensaio de inibição do biofilme in vitro

A Tabela 18 apresenta os resultados do ensaio in vitro de inibição do biofilme

frente a todas as cepas de C. albicans empregadas no estudo.


biofilmes de C. albicans

Biofilme de C. albicans

Amostras analisadasa

Extrato

incorporado

Extrato não incorporado

anfotericina B

DMSO 20%

SPCLM sem incorporação

ATCC 10231 1,25 > 20,0 4,0 - -

CAV 1 10,0 > 20,0 8,0 - -

CAV 2 20,0 > 20,0 4,0 - -

CAV 3 10,0 > 20,0 8,0 - -

CAV 4 1,25 > 20,0 16,0 - -

CAV 5 1,25 > 20,0 16,0 - -

avalores em mg/mL; (-) sem inibição.

O extrato não incorporado não possui a capacidade de inibição do biofilme de

todas as cepas fúngicas, já o extrato na forma incorporada exerceu notório potencial

de inibição.

As Tabelas 19 a 21 apresentam os resultados do teste de inibição do biofilme

frente às linhagens não-albicans.

Resultados 100

__________________________________________________



biofilmes de C. krusei

Biofilme de

C. krusei


Extrato

incorporado


anfotericina B

DMSO 20%


ATCC 6258 > 20,0 > 20,0 16,0 - -

CKV 1 > 20,0 > 20,0 8,0 - -

CKV 2 10,0 > 20,0 8,0 - -

CKV 3 > 20,0 > 20,0 4,0 - -


Em C. krusei nota-se que novamente o extrato não incorporado não exerceu

ação sobre o biofilme fúngico e, em relação a sua atividade quando incorporado no

SPCLM se observa atividade frente a uma única cepa fúngica (CKV 2), neste

sentido, esta espécie comportou-se como a linhagem de biofilme mais resistente

neste estudo.


biofilmes de C. glabrata

Biofilme de C. glabrata


Extrato

incorporado


anfotericina B

DMSO 20%


ATCC 2001 10,0 > 20,0 0,5 - -

CGV 1 > 20,0 > 20,0 2,0 - -

CGV 2 20,0 > 20,0 4,0 - -

CGV 3 > 20,0 > 20,0 1,0 - -


Já em C. glabrata foi observado atividade anti-biofilme do extrato incorporado

no SPCLM em duas cepas (ATCC e CGV 2), todavia o assim como C. albicans e C.

krusei, o extrato não incorporado não foi capaz de desenvolver atividade inibitória.

Resultados 101

__________________________________________________



biofilmes de C. tropicalis

Biofilme de

C. tropicalis


Extrato

incorporado


anfotericina B

DMSO 20%


ATCC 750 > 20,0 > 20,0 0,5 - -

CTV 1 20,0 > 20,0 0,2 - -

CTV 2 2,5 > 20,0 2,0 - -

CTV 3 20,0 > 20,0 2,0 - -


Os resultados obtidos com a linhagem da espécie C. tropicalis mostraram-se

superiores aos das espécies anteriormente analisadas. O extrato incorporado

desempenhou ação frente ao biofilme de todas as cepas clínicas analisadas

mostrando-se inativo apenas para aquele desenvolvido com a cepa ATCC. Em

relação à atividade do extrato não incorporado, novamente não foi observado

capacidade inibitória.


biofilmes de C. parapsilosis

Biofilme de

C. parapsilosis


Extrato

incorporado


anfotericina B

DMSO 20%


ATCC 22019 1,2 > 20,0 0,2 - -

CPV 1 1,2 > 20,0 0,5 - -

CPV 2 0,6 10,0 1,0 - -

CPV 3 20,0 > 20,0 0,5 - -


Como apresentado pela Tabela 22, os efeitos inibitórios exercidos pelo extrato

incorporado frente aos biofilmes das cepas de C. parapsilosis foram os mais

promissores. A atividade foi evidenciada em todas as cepas empregadas, embora

Resultados 102

__________________________________________________


CPV 3 tenha se mostrado mais resistente, as demais cepas apresentaram

sensibilidade ao composto relativamente baixa. Em relação aos efeitos inibitórios do

extrato não incorporado, foi evidenciada atividade frente a uma cepa clínica (CPV 2).

5.2.6. Ensaio Time kill

As Figuras 32 a 41 apresentam o comportamento do crescimento das cepas

em contato com o extrato vegetal não incorporado e incorporado, assim como o

controle de crescimento e com o fármaco anfotericina B.

Confirmando as análises de CFM, o extrato vegetal não possui a capacidade

de promover a morte do micro-organismo, ele apenas promove a sua diminuição de

crescimento e proliferação.

Figura 32. Time kill de C. albicans ATCC 10231 Figura 33. Time kill de C. albicans CAV 3

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

10x103

20x103

30x103

40x103

50x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

10x103

20x103

30x103

40x103

50x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Nota-se que em ambas as cepas houve semelhança em relação ao tempo de

crescimento fúngico, o qual manteve-se equilibrado até o tempo de 8 horas, após

esse período a proliferação de UFC manteve-se mais constante em maior

quantidade.

Resultados 103

__________________________________________________


Figura 34. Time kill de C. krusei ATCC 6258 Figura 35. Time kill de C. krusei CKV 3

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

20x103

40x103

60x103

80x103

100x103

120x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

20x103

40x103

60x103

80x103

100x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

No estudo com as cepas de C. krusei os resultados foram distintos.

Comparando os resultados entre o extrato incorporado e não incorporado, no ensaio

com a cepa ATCC a ação inibitória de crescimento do SPCLM+extrato foi superior

ao extrato não incorporado, onde o crescimento manteve-se controlado e constante

até o tempo de 8 horas e, após esse período, aumentou em maior intensidade,

todavia, se manteve menor em relação ao controle de crescimento ao final de 48

horas. A cepa CAV 3 mostrou-se mais resistente a ambas as formas de

administração do extrato. A forma não incorporada controlou o crescimento fúngico

de forma mais eficaz que o extrato incorporado. Com relação ao SPCLM+extrato,

embora seu crescimento tenha sido controlado até o tempo de 8 horas, após esse

período, este se mostrou altamente intenso a ponto de igualar-se ao controle de

crescimento no final do experimento.

Figura 36.Time kill de C. glabrata ATCC 2001 Figura 37. Time kill de C. glabrata CGV 3

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

20x103

40x103

60x103

80x103

100x103

120x103

140x103

160x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

20x103

40x103

60x103

80x103

100x103

120x103

140x103

160x103

180x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Em C. glabrata os resultados foram potencialmente promissores. Embora em

concentrações distintas, ambas as formas de administração do extrato foram

Resultados 104

__________________________________________________


capazes de equilibrar o crescimento fúngico até o tempo de 8 horas, assim como as

espécies anteriormente analisadas. O diferencial do ensaio com esta espécie é dado

quando a ação inibitória de crescimento do extrato incorporado e não incorporado é

comparada à anfotericina B. Com a cepa ATCC, a ação do extrato não incorporado

foi semelhante ao fármaco utilizado como controle até o tempo de 24 horas, já com a

cepa CGV 3, notou-se ação superior, pois anfotericina B mostrou-se menos ativa

que ambas as formas de administração do extrato.

Figura 38.Time kill de C. tropicalis ATCC 750 Figura 39. Time kill de C. tropicalis CTV 2

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

50x103

100x103

150x103

200x103

250x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

20x103

40x103

60x103

80x103

100x103

120x103

140x103

160x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

As cepas de C. tropicalis mostram também que ambas as formas de

administração do extrato foram capazes de controlar o crescimento fúngico, todavia,

o extrato incorporado mostrou-se mais ativo para a cepa clínica, ação semelhante à

anfotericina B, já o extrato não incorporado comportou-se de maneira semelhante

em ambas as cepas.

Figura 40.Time kill de C. parapsilosis ATCC22019 Figura 41. Time kill de C. parapsilosis CPV1

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

10x103

20x103

30x103

40x103

50x103

60x103

70x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Tempo em minutos

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

UF

C/m

L

0

20x103

40x103

60x103

80x103

100x103

Crescimento

anfotericina B

Extrato

SPCLM+Extrato

Resultados 105

__________________________________________________


Já os resultados com as cepas da espécie C. parapsilosis nota-se que foram

os mais distintos, especialmente com a cepa padrão, onde o crescimento do fungo

em contato com o extrato não incorporado manteve-se totalmente equilibrado até o

tempo de 8 horas e, após este, período aumentou de forma abundante, superando

até mesmo o controle de crescimento. Em relação ao extrato incorporado, a ação foi

melhor quanto à anfotericina B e ao extrato não incporporado. Na cepa clínica os

resultados do extrato incorporado também seguiram este mesmo padrão de

ação,todavia, a ação do mesmo foi superior quando comparados com todas as

cepas empregadas no estudo. Já o extrato não incorporado se mostrou mais ativo

em relação à cepa padrão. Nota-se que em todas as cepas empregadas nesta

investigação, tanto o extrato na forma incorporada e não incorporada mantiveram o

crescimento fúngico em equilíbrio de crescimento até o tempo de 8 horas.

5.3. Análises antifúngicas in vivo

5.3.1. Ensaio terapêutico de CVV causada por C. albicans

Todos os animais foram induzidos ao estado pseudo-estro com dez dias de

aplicação de solução de estradiol por via subcutânea duas vezes ao dia, onde foram

considerados preparados para receberem a suspensão fúngica. As Figuras 42 e 43

apresentam as células do epitélio vaginal dos grupos experimentais obtidas através

do lavado vaginal com solução estéril de PBS e coradas pelo método de Giemsa,

onde é possível observar a predominância de células cornificadas e anucleadas, as

quais correspondem ao ciclo estral pseudo-estro.

Figura 42. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa ATCC após 10 dias de aplicação de estradiol por via subcutânea.

a= grupo 2; b= grupo 3; c= grupo 4; d= grupo 5; e= grupo 6; f= grupo 7

Resultados 106

__________________________________________________


Figura 43. Células do epitélio vaginal dos animais do ensaio anti-CVV com a cepa

CAV 3 após 10 dias de aplicação de estradiol por via subcutânea.


Após dois dias da inoculação fúngica os animais foram submetidos à lavagem

vaginal com tampão PBS estéril, e os lavados obtidos foram semeados em ASD+clo

e também submetidos à análise microscópica para a verificação da presença de

células fúngicas. As Figuras 44 e 45 apresentam as imagens dos lavados vaginais

nos grupos submetidos à infecção, corados por meio da coloração de Giemsa e

analisados sob aumento de 20x. Nota-se que em todos os lavados há presença de

células fúngicas leveduriformes (indicadas pela seta) em meio às células epiteliais

cornificadas e anucleadas, indicando que os animais encontravam-se infectados

com o patógeno e também que todos estavam no estado pseudo-estro quando a

infecção foi estabelecida.

Figura 44. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa ATCC após dois dias de infecção


Resultados 107

__________________________________________________


Figura 45. Lavados vaginais do ensaio anti-CVV com a cepa CAV 3 após dois

dias de infecção


A Figura 46 apresenta o comportamento dos grupos experimentais nos dias

de tratamento do ensaio realizado com a cepa ATCC 10231.


com a cepa ATCC 10231

Dias de Tratamento

DIA 2 DIA 4 DIA 6 DIA 8

Lo

g U

FC

/mL

0

1

2

3

4

5

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

Grupo 5

Grupo 6

Grupo 7

Grupo 1: negativo de infecção; Grupo 2: positivo de infecção;Grupo 3: tratados com anfotericina B; Grupo 4: trados com DMSO 20%; Grupo 5: tratados com o extrato não incorporado; Grupo 6: tratados com o o SPCLM; Grupo 7: tratados com o extrato incorporado.

Resultados 108

__________________________________________________


Em relação ao grupo controle positivo de infecção (grupo 2) nota-se que todos

os animais mantiveram-se infectados até o final do experimento. Os grupos 4 e 6

mostraram que tanto o solvente utilizado para solubilizar o extrato quanto o SPCLM

não possuem ação terapêutica, neste sentido, comprova que a ação antifúngica é

atribuída ao extrato vegetal.

O extrato vegetal incorporado no SPCLM exerceu perfil de cura logo no

segundo dia de tratamento frente aos animais do grupo 7, já aqueles tratados com o

extrato não incorporado foram considerados curados no quarto dia de tratamento,

todavia, estes resultados foram superiores ao tratamento observado nos animais do

grupo controle positivo com anfotericina B (grupo 3), onde foram considerados

curados apenas no 8º dia de tratamento.

A Figura 47 apresenta o comportamento dos grupos experimentais nos dias

de tratamento do ensaio realizado com a cepa clínica CAV 3.


com a cepa CAV 3

Dias de Tratamento

DIA 2 DIA 4 DIA 6 DIA 8

Lo

g U

FC

/mL

0

1

2

3

4

5

Grupo 1

Grupo 8

Grupo 9

Grupo 10

Grupo 11

Grupo 12

Grupo 13

Grupo 1: negativo de infecção; Grupo 8: positivo de infecção;Grupo 9: tratados com anfotericina B; Grupo 10: trados com DMSO 20%; Grupo 11: tratados com o extrato não incorporado; Grupo 12: tratadoscom o o SPCLM; Grupo 13: tratados com o extrato incorporado.

Resultados 109

__________________________________________________


Embora em concentrações fúngicas superiores, os grupos controles 8, 10 e

12 mostraram comportamento idêntico ao observado no ensaio com a cepa ATCC

10231. Da mesma forma, o grupo 9, tratado com anfotericina B, foi considerado

curado somente no 8º dia de tratamento.

Novamente, os animais tratados com o extrato incorporado no SPCLM foram

curados após 2 dias de tratamento, já os que foram tratados com o extrato não

incorporado apenas no 6º dia.

A Tabela 23 apresenta características gerais observadas no ensaio

experimental, como o número de animais infectados, assim como a carga fúngica de

todos os grupos experimentais durante o período de análise do tratamento realizado

no experimento.

Resultados 110

__________________________________________________


Tabela 23. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os animais do ensaio experimental

Grupo

experimental

Dia 2 Dia 4 Dia 6 Dia 8

Animais

infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais

infectados

(%)

Log

UFC/mL

±DP

Animais

infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais

infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Grupo 1 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00

Grupo 2 6/6 (100) 3,88±0,16 6/6 (100) 3,75±0,08 6/6 (100) 3,81±0,09 6/6 (100) 3,90±0,09

Grupo 3 6/6 (100) 3,39±0,08 6/6 (100) 2,95±0,05 5/6 (83) 1,77±1,37 0/6 (0) 0±0,00

Grupo 4 6/6 (100) 3,74±0,20 6/6 (100) 3,80±0,16 6/6 (100) 3,70±0,14 6/6 (100) 3,89±0,08

Grupo 5 6/6 (100) 2,39±0,07 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00

Grupo 6 6/6 (100) 3,65±0,06 6/6 (100) 3,74±0,14 6/6 (100) 3,81±0,07 6/6 (100) 3,79±0,09

Grupo 7 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00

Grupo 8 6/6 (100) 3,85±0,03 6/6 (100) 4,22±0,03 6/6 (100) 4,22±0,02 6/6 (100) 4,20±0,06

Grupo 9 6/6 (100) 3,85±0,05 6/6 (100) 3,62±0,33 4/6 (66) 3,48±0,20 0/6 (0) 0±0,00

Grupo 10 6/6 (100) 3,75±0,03 6/6 (100) 3,89±0,16 6/6 (100) 3,93±0,12 6/6 (100) 3,93±0,06

Grupo 11 6/6 (100) 3,16±0,07 4/6 (66) 2,32±0,19 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00

Grupo 12 6/6 (100) 3,72±0,06 6/6 (100) 4,01±0,06 6/6 (100) 4,02±0,07 6/6 (100) 3,87±0,12

Grupo 13 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00 0/6 (0) 0±0,00

Resultados 111

__________________________________________________


5.3.2. Ensaio profilático de CVV causada por C. krusei

As análises microbiológicas da morfologia das células do epitélio vaginal dos

animais para comprovar que todos os animais estavam na fase pseudo-estro

mostraram-se satisfatórias após 5 dias de aplicação de solução de estradiol por via

subcutânea 2x ao dia, apresentando células anucleadas e cornificadas. As culturas

do fluido vaginal dos grupos positivos de infecção mostraram-se positivas. Estes

dados confirmaram que todos os animais encontravam-se nas mesmas condições

antes do período de tratamento pós-infecção. A Figura 48 apresenta o

comportamento dos grupos experimentais do ensaio de profilaxia analisado a partir

de dois dias após a infecção (dia 0) e nos dez dias de tratamento subsequentes

(dias 2, 4, 6, 8 e 10).

Figura 48. Comportamento dos grupos experimentais do ensaio de profilaxia

Dias de análise após infecção

0 2 4 6 8 10 12

Lo

g U

FC

/mL

0

1

2

3

4

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

Grupo 5

Grupo 6

De acordo com o dados é possível observar que o tratamento realizado com

extrato incorporado (grupo 6) antes da infecção com a cepa fúngica foi capaz de

impedir o desencadeamento do estado infeccioso. Os animais deste grupo

experimental não apresentaram carga fúngica vaginal após dois dias de inoculação

de C. krusei e este padrão permaneceu fixo até o final do experimento.

Resultados 112

__________________________________________________


O grupo experimental 5 (tratados com o não extrato incorporado)

desenvolveram infecção após a inoculação da suspensão fúngica, todavia, a carga

fúngica evidenciada mostrou-se menor em comparação aos controles positivos de

infecção (grupo 2 e 3). Os animais foram considerados curados após 4 dias de

tratamento pós-infecção, igualmente ao comportamento do grupo experimental 4

(tratados com anfotericina B).

Em relação ao comportamento dos controles positivos de infecção (grupo 2 e

3) notou-se expressiva diferença. Como esperado, os animais do grupo 2 (infectados

sem indução do estado imunossupressivo) desenvolveram uma infecção fraca com

duração de apenas 4 dias, todavia estes resultados eram previstos já que a CVV é

considerada uma doença oportunista. Já os animais do grupo positivo de infecção

imunossuprimidos antes da infecção (grupo 3) mantiveram-se infectados até o final

do experimento.

A Tabela 24 apresenta características gerais observadas no ensaio

experimental como o número de animais infectados, assim como a carga fúngica de

todos os grupos experimentais durante o experimento.

Resultados 113

__________________________________________________


Tabela 24. Número de animais infectados e quantificação da carga fúngica em todos os grupos do ensaio experimental

Grupo experimental

Dia 0

Dia 2

Dia 4

Dia 6

Dia 8

Dia 10

Animais infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Animais infectados

(%)

Log UFC/mL

±DP

Grupo 1 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00

Grupo 2 4/4 (100) 2,96±0,03 4/4 (100) 2,87±0,06 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00

Grupo 3 4/4 (100) 3,37±0,07 4/4 (100) 3,45±0,05 4/4 (100) 3,35±0,17 4/4 (100) 3,35±0,17 4/4 (100) 3,70±0,14 4/4 (100) 3,26±0,10

Grupo 4 3/4 (75) 2,08±1,39 2/4 (50) 1,17±1,35 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00

Grupo 5 3/4 (75) 1,72±1,15 3/4 (75) 1,73±1,18 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00

Grupo 6 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (100) 3,74±0,14 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00 0/4 (0) 0±0,00

__________________________________________________


6. discussão O impossível só existe para aqueles que não acreditam na possibilidade de realizar seus sonhos.

(Danielle Oliveira)

http://pensador.uol.com.br/autor/danielle_oliveira/

Discussão 115

__________________________________________________


6. DISCUSSÃO

Classificada como uma infecção verdadeira de vulva e vagina, a CVV

desperta interesse na busca de novos compostos com ação antifúngica que visem

controlar ou eliminar os seus sinais e sintomas, uma vez que quadros infecciosos

estão diretamente ligados ao aprofundamento de efeitos maléficos à saúde da

mulher uma vez que são capazes de desencadear episódios mais agressivos da

doença, como a CVVR que por sua vez pode evoluir para o desenvolvimento de

neoplasias (SOBEL, 2010).

Neste estudo avaliou-se a atividade antifúngica do extrato metanólico de

escapos de S. nitens incorporado ou não incorporado em um sistema de liberação

de fármacos precursor de cristais líquidos mucoadesivos. A investigação da ação

antifúngica envolvendo este extrato foi realizada por Araújo et al (2013), que avaliou

a atividade terapêutica de um creme vaginal contendo o extrato de S. nitens na

prospecção do tratamento da CVV. A atividade antifúngica envolvendo o sistema de

liberação de fármacos precursor de cristais líquidos mucoadesivos é inexistente na

literatura, que da a este trabalho o caráter inovador no estudo de atividade

antifúngica utilizando o extrato vegetal.

A investigação da potencialidade antifúngica de Syngonanthus nitens

investigada neste trabalho é justificada pelos resultados obtidos em estudos

anteriores por nosso grupo de pesquisa, onde foi comprovada a ação desta planta

frente às espécies de Candida através de diferentes abordagens investigativas,

incluindo desde a quantificação química dos componentes presentes na mesma até

ensaios biológicos com relevância para a área farmacêutica (ARAÚJO, 2011;

ARAÚJO et al., 2013), que nos estimularam a continuidade destes estudos.

Considerando os resultados de CIM obitos neste estudo, foi possível

classificar o extrato metanólico de escapos de S. nitens como potencialmente

promissor na atividade antifúngica frente às cepas leveduriformes de diferentes

espécies de Candida.

A literatura não apresenta uma classificação consensual em relação aos

valores de CIM obtida por produtos naturais. Aligiannis et al. (2001) consideram

CIMs com valores iguais ou menores que 500 μg/mL como inibidores potentes; CIMs

entre 600 e 1500 μg/mL como inibidores moderados e CIMs acima de 1600 μg/mL

Discussão 116

__________________________________________________


como inibidores fracos. Webster et al. (2008) estabeleceram como satisfatório outro

valor de CIM igual ou menor que 1000 μg/mL. Neste sentido, os resultados

reportados nesta investigação mostram-se promissores.

A investigação de novas moléculas com perfil antifúngico frente a cepas

leveduriformes não-albicans classifica-se como uma abordagem de extrema

importância para a pesquisa farmacêutica que busca a manutenção e bem estar da

saúde do homem moderno, visto que a incidência de infecções por espécies deste

perfil encontram-se em expansão nos últimos anos, o que se classifica como um

fator de risco devido ao índice de resistência intrínseca aos fármacos empregados

na prática clínica, principalmente ao fluconazol (DEORUKHKAR e SAINI, 2013).

A resistência intrínseca ao fluconazol e o aumento do índice de ineficiência da

anfotericina B apresentada em casos de infecções por C. krusei é um fator

preocupante, neste sentido a busca por novas abordagens medicamentosas que

promovam a inibição do fungo em questão é de extrema relevância (LI et al., 2014).

Portanto, na triagem antifúngica deste estudo os resultados encontrados na

determinação da CIM mostraram-se inovadoras, visto que o extrato vegetal

apresentou capacidade inibitória frente a todas as cepas empregadas com

concentrações do extrato capazes de inibir o crescimento das linhagens que

variaram de 125 a 62,5 µg/mL.

A atividade de outros extratos vegetais pertencentes à família Eriocaulaceae

contra linhagens de fungos leveduriformes não-albicans vem sendo observada nos

últimos anos. Araújo et al. (2011) evidenciaram a ação do extrato de Leiothrix spiralis

(Eriocaulaceae) frente a diversas espécies de Candida spp., (a mesma cepa padrão

de C. krusei empregada neste estudo, ATCC 6258).

Os resultados encontrados frente às cepas de C. glabrata mostram que o

extrato de S. nitens se comportou como mais promissor no desempenho da

atividade antifúngica sobre a espécie leveduriforme. Com exceção da cepa clínica

CGV 3, que obteve CIM de 125 µg/mL, as demais linhagens empregas no estudo

foram sensíveis ao extrato vegetal a partir de 62,5 µg/mL, neste sentido o extrato,

vegetal foi considerado como forte agente inibidor devido as características de

multirresistência das cepas utilizadas nesta investigação.

Discussão 117

__________________________________________________


As espécies C. tropicalis e C. parapsilosis também mostraram-se sensíveis ao

extrato vegetal, embora em maiores concentrações (500 a 250 µg/mL).

A espécie C. albicans foi avaliada neste presente estudo com um número

maior de cepas, justificada por ser a espécie mais frequente em infecções, e

considerado o patógeno oportunista mais comum na espécie humana. Em relação

aos valores de CIM encontrados, estes se mostraram promissores considerando o

perfil resistente aos fármacos fluconazol, itracolnazol, cetoconazol e outros

derivados de azóis. A comprovação de que o extrato é ativo contra a espécie em

questão pode ser obtida com as observações feitas por Araújo et al. (2013) que além

de investigar o potencial contra uma linhagem padrão (ATCC), também evidenciou

ação em cepas de origem clínica, o que mostra semelhança com os resultados

observados com as linhagens isoladas de região vaginal deste estudo. Quanto à

concentração do extrato que inibiu o crescimento fúngico descrita por Araújo e

colaboradores com a espécie leveduriforme em questão, esta se mostrou diferente

das observadas neste estudo, o que é esperado, visto diferença entre as cepas

empregadas na investigação uma vez que são de procedência distinta.

A resistência às drogas antifúngicas tem sido monitorada principalmente em

cepas de Candida spp. em quadros infecciosos humanos, além disso, o tratamento

das infecções causadas por fungos pertencentes a este gênero é limitado a um

número pequeno de agentes antifúngicos, o que inclui poliênicos como nistatina e

anfotericina B; azólicos, entre eles o cetoconazol, itraconazol e fluconazol; e

derivados azólicos recentes, como o voriconazol e o posaconazol (RIDDELL et al.,

2011).

Os fármacos utilizados na terapêutica antifúngica apresentam importantes

efeitos colaterais. O fluconazol, um dos controles positivos utilizados na

determinação da CIM deste estudo, é um antifúngico triazólico de amplo espectro

com atividade fungistática tempo-dependente. O tratamento utilizando esse fármaco

requer que a concentração sérica do mesmo se mantenha em níveis mais elevados

no organismo, acima da CIM, em maior parte do intervalo de dosagem. Clinicamente

falando, o uso indiscriminado deste fármaco pode levar a reações adversas

significativas, sendo que a mais importante destas é hepatotoxicidade, onde o

espectro de toxicidade pode variar de leve elevações transitórias dos níveis de

Discussão 118

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transaminases à hepatite, colestase e insuficiência hepática fulminante (BEN-AMI et

al., 2012). Neste estudo, todas as cepas clínicas empregadas mostaram-se

resistente a esse fármaco, o que mostra a importância de todos os resultados de

CIM obtidos com o extrato vegetal. As únicas que foram sensíveis foram as cepas

padrão de C. tropicalis e C. parapsilosis.

O fármaco anfotericina B, também utilizado como controle positivo nesta

investigação, apresentou atividade contra todas as cepas testadas em baixas

concentrações. Todavia, embora os resultados tenham sido promissores, o uso

deste fármaco na terapêutica clínica de doenças oportunistas está associado a

efeitos adversos como a nefrotoxicidade e febre com calafrios, reação aguda à

infusão intravenosa, já que os parâmetros farmacocinéticos deste fármaco não

permitem a administração oral (KLEPSER, 2011).

Ambos os fármacos tem sido usados como primeira escolha na terapêutica de

doenças fúngicas por terem como alvo de ação a membrana celular dos mesmos,

reportando-se como aplicável no tratamento de patologias oportunistas,

principalmente aquelas causadas por fungos leveduriformes do gênero Candida,

como a CVV. Os derivados de azóis são compostos sintéticos onde seu mecanismo

baseia-se na inibição da esterol-14-α-desmetilase, um sistema enzimático

microssomal que esta diretamente relacionada com a dependência do citocromo

P450, promovendo defeitos na síntese do ergosterol na membrana citoplasmática e

levando ao acúmulo de 14-α-metilesteróis. Esses metilesteróis não possuem a

mesma forma e propriedades físicas que o ergosterol e levam à formação da

membrana com propriedades alteradas, que não desempenha as funções básicas

necessárias ao desenvolvimento do fungo (HEGAZY et al., 2012). Os polienos (ex.

anfotericina B) ligam-se a uma porção esterol, basicamente ergosterol, sendo este

um componente essencial presente na membrana das leveduras, onde formam-se

poros ou canais, ocasionando um aumento na permeabilidade da membrana que

gera o extravasamento de constituintes celulares, levando à sua morte (GRAY et al.,

2012).

Os fármacos derivados de azóis causam menos reações adversas que a

anfotericina B, porém são menos potentes que a mesma. Podem ter ação

fungistática ou fungicida. O uso excessivo dos azóis levou ao aparecimento de

Discussão 119

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resistência em espécies suscetíveis. Além disso, os azóis ainda apresentam a

desvantagem da resistência cruzada. Portanto, a busca de novos compostos

antifúngicos são objetos de investigação contínua (NOGUEIRA, 2012).

Algumas abordagens terapêuticas são empregadas para combater a

patogenicidade apresentada por C. albicans, sendo as principais a indução da

secreção de proteases, fosfolipases e a capacidade de alterar a morfologia das

células leveduriformes de brotamento na forma de hifas ou filamentos (AGEBAULT

et al., 2013). A transformação da fase leveduriforme para a fase de hifas é

influenciada principalmente por condições ambientais, caracterizando-se como a

mais patogênica. As hifas são túbulos longos, delgados e contínuos com septos que

separam cada núcleo e são estruturas que exercem importante papel na invasão da

mucosa e as torna resistentes a ação de células de defesa como macrófagos e

neutrófilos que, além das formas leveduriformes, estão presentes tanto em relação

de comensalismo quanto no processo patogênico com o hospedeiro (LACAZ et al.,

2012). A capacidade de formação de hifas atribuída por C. albicans é um fator de

risco em casos de infecções, visto a capacidade de proliferação em tecidos,

desencadeando em muitos casos o estabelecimento de infecções sistêmicas, sendo

assim, diversos estudos com o objetivo de impedir o crescimento hifal de C. albicans

vêm sendo observado nos últimos anos. Chevalier et al. (2012) avaliaram a

capacidade de inibição de hifas utilizando o extrato aquoso de Solidago virgaurea

frente a mesma cepa padrão de C. albicans empregada neste estudo (ATCC 10231)

e comprovaram que o extrato vegetal foi capaz de inibir a proliferação hifal. Em

estudos realizados por Vediyappan et al. (2013) com uma fração de Gymnema

sylvestres, foi identificado um promissor efeito inibitório (50 µg/mL) de hifas em C.

albicans em 24 horas de contato. Araújo et. al (2013) constataram a ação do

mesmo extrato metanólico de escapos de S. nitens nas concentrações de 500, 250 e

125 µg/mL empregando a cepa de C. albicans NCPF 3153 nos tempos de 12 e 24

horas.

Neste estudo, a inibição e a redução da formação de hifas foram observadas

pelo extrato de escapos de S. nitens nas concentrações de 1000 a 250 µg/mL após

12 horas e, de 1000 a 500 µg/mL após 24 horas, o que pode sugerir que a atividade

antifúngica verificada pelo extrato vegetal atribui-se tanto à inibição da formação

Discussão 120

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como à redução da concentração hifal. Estes dados classificam-se como uma

referência importante para a caracterização do mecanismo de ação antifúngico do

extrato estudado.

Assim, as principais razões para o interesse em investigar e identificar

compostos de origem vegetal e suas atividades biológicas são justificadas pela

ampla gama de substâncias presentes nas plantas que podem ser utilizadas no

tratamento de infecções crônicas bem como doenças infecciosas, aumento da

resistência microbiana aos medicamentos, alta taxa de efeitos colaterais nos

medicamentos sintéticos, segurança e eficácia com menor efeito adverso de

medicamentos produzidos a partir de fontes naturais, o custo da terapia bem como o

aumento de doenças emergentes (ABDOLLAHZADEH et al., 2011; SASIDHARAN et

al., 2011).

Na pesquisa de novos medicamentos fitoterápicos, os flavonóides presentes

nas plantas medicinais são considerados como fortes agentes terapêuticos em

casos de doenças de origem microbiana, além disso, atividades antivirais,

antiproliferativas, antimutagênicas, antitrombótica e antioxidante também são

atribuídas a estes compostos (ORHAN et al., 2010). Neste sentido, a presença de

compostos fenólicos em espécies da família Eriocaulaceae se caracteriza como um

modelo promissor na avaliação de mecanismos envolvidos na atividade

antimicrobiana (CUSHNIE e LAMB, 2011). Em relação aos efeitos antimicrobianos

exercidos pelos flavonóides, as ações resultam de uma interação destes compostos

com a membrana celular dos micro-organismos alvo, provavelmente devido à sua

capacidade de complexar com proteínas extracelulares e com a parede celular

(SAVOIA, 2012).

Candiracci et al. (2012) investigaram a ação antifúngica de flavonóides

extraídos de um extrato de mel italiano frente a espécie C. albicans, tendo

demonstrado que os flavonóides foram capazes de atuar fortemente contra a cepa,

além de exercer um importante perfil inibidor de hifas.

Em estudo realizado por Araújo (2011), foi observada a presença de

flavonóides em quantidades significativas (36,7%) no extrato metanólico dos

escapos de S. nitens, no entanto, os resultados da presente investigação podem ser

justificados à presença destes compostos nesta concentração, além disso, as

Discussão 121

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xantonas e flavonas presentes no extrato (PACÍFICO et al., 2011; ZANUTTO, 2013)

também podem estar relacionadas com o sucesso da atividade antifúngica.

A formação de biofilme é um importante marcador de virulência atribuído à

espécie C. albicans. O evento inicial na patogênese de doenças infecciosas fúngicas

é a adesão microbiana aos tecidos dos hospedeiros, sendo estas mediadas por

macromoléculas denominadas adesinas, as quais caracterizam-se em estruturas da

superfície do micro-organismo que interagem com receptores específicos nas

células do hospedeiro (NOBILE et al., 2012).

Existe uma grande dificuldade na descoberta de novos compostos que

possuam ação contra biofilmes fúngicos, visto a complexidade dos mecanismos de

ação atribuídos e principalmente à alta concentração da carga fúngica presente,

neste sentido, a busca por novas moléculas para a eliminação do mesmo é

constante e permanece em extrema expansão nos dias atuais (BLANKENSHIP e

MITCHELL, 2006; FANNING e MITCHELL, 2012).

Em relação aos resultados encontrados neste estudo, com exceção de uma

cepa clínica de C. parapsilosis (CPV 2), não foram evidenciados ações inibitórias do

extrato vegetal nas análises de inibição do biofilme in vitro frente as espécies

estudadas em todas as concentrações avaliadas (20, 10, 5, 2.5, 1.2 e 0.6 mg/mL).

A capacidade de um composto inibir o crescimento de um micro-organismo é

uma etapa fundamental na elucidação do potencial antimicrobiano do mesmo. O

ensaio Time-Kill é um método empregado para se determinar o tempo em que a

substância-teste impede o desenvolvimento do micro-organismo a ser testado. Ele

fornece a dinâmica de ação desta substância e sua interação com o tempo, sendo

assim, fornece a informação necessária de quanto tempo é preciso para realizar-se

a administração do antibiótico novamente. Normalmente, as investigações de novos

compostos antimicrobianos utilizam este método de análise para complementar os

resultados obtidos na determinação da CIM do composto avaliado (NÓBREGA et al.,

2013).

Neste estudo foi realizado o ensaio de Time-Kill do extrato de escapos de S.

nitens na concentração de 2x a CIM obtida para todas as cepas padrão (ATCC) das

cinco espécies estudas assim como a cepa clínica que apresentou melhor atividade

na determinação da CIM. Como controle positivo de inibição foi utilizado o fármaco

Discussão 122

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anfotericina B na concentração de 32 µg/mL, a escolha deste fármaco se deu por ser

o antibiótico de primeira escolha no tratamento de doenças relacionadas a cepas de

Candida que possuam resistência aos fármacos derivados de azóis, o que é o caso

de todas as cepas clínicas deste estudo, assim como três das cinco espécies das

cepas padrões.

Os resultados encontrados confirmaram a ação fungistática observada no

ensaio de determinação da CFM, ou seja, quando as células leveduriformes são

retiradas de um meio de stress (meio de cultura+extrato) e repicadas em um meio de

cultura rico e livre de interferentes, há o desenvolvimento do crescimento fúngico

novamente, o que indica que não houve morte celular (ação fungicida) e sim a

diminuição do crescimento e proliferação da cepa. Alguns estudos utilizam o ensaio

de Time kill para avaliar a ação antifúngica de produtos vegetais frente a espécies

de Candida spp. adotando fármacos antifúngicos como controles positivos de

inibição do crescimento.

Neste estudo observou-se que em todas as cepas o extrato vegetal promove

o controle do crescimento fúngico, sem a morte celular. Até o tempo de 8 horas foi

observado um equilíbrio no crescimento e, após esse período, todas as cepas

proliferaram-se de forma constante e mais acentuada. Ao final de 48 horas foi

possível confirmar que o extrato vegetal mantém o crescimento em menor proporção

em relação ao controle de crescimento. Como exceção, da a cepa padrão de C.

parapsilosis, apresentou equilíbrio no crescimento do fungo em presença do extrato

vegetal até o tempo de 8 horas e, após este, período aumentou de forma abundante,

superando até mesmo o controle de crescimento. Em relação ao controle com o

fármaco anfotericina B, foi evidenciada ação fungistática em todas as cepas

estudadas com a concentração utilizada (32 µg/mL), confirmando também os

resultados obtidos no ensaio de determinação da CFM.

Recentemente, um estudo realizado por Alshami et al. (2014) também

evidenciou um comportamento fungistático do extrato vegetal de Hibiscus sabdariffa

frente a cepas clínicas de C. albicans resistentes ao fluconazol isoladas de pacientes

com infecção no trato urinário. Ao avaliarem a ação do extrato frente ao crescimento

leveduriforme pelo método de Time kill não foi evidenciada a morte celular de todas

Discussão 123

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as cepas empregadas, todavia, houve uma expressiva diminuição do crescimento no

decorrer do tempo de 48 horas.

Ali et al., 2010 avaliaram a ação antifúngica de uma substância isolada

(hidroxicavicol) do extrato aquoso das folhas de Piper betle contra as espécies C.

albicans e C. glabrata. Os autores demonstraram que a concentração de 4x o CIM,

testada pelo Time kill, foi capaz de inibir o crescimento de C. albicans no tempo de

10 horas e a de 8x inibiu o crescimento fúngico com 1 hora. Em C. glabrata, foi

evidenciado inibição com a concentração de 4x a CIM no tempo de 8 horas, e na de

8x o tempo necessário foi de 4 horas.

Kaomongkolgit et al., (2009) avaliaram a ação antifúngica de uma fração

hexânica (alfa-mangostin) do extrato de pericarpos de mangostão (Ganrcinia

mangostana), uma fruta popularmente conhecida da Indonésia, muito utilizada em

casos de diarréia e tratamento de doenças de pele. Os autores avaliaram a ação

frente à espécie C. albicans inicialmente pelo método de microdiluição e o valor de

CIM obtido foi utilizado na concentração de 2x e 4x para o desenvolvimento do

ensaio de Time kill. Os resultados mostraram que o composto vegetal apresentou

atividade superior aos antifíngicos nistatina e cloritromazol, sendo observada a

morte das leveduras a partir do tempo de 10 minutos de contato com o composto

testado em ambas as concentrações avaliadas.

Os testes de citotoxicidade in vitro são amplamente empregados na

investigação de novos compostos. São os primeiros testes utilizados para avaliar a

toxicidade das substâncias para a aplicação, e vêm sendo empregados como

adjuvante dos testes in vivo, possibilitando a substituição ao uso de animais na

avaliação da toxicidade de substâncias e preparações (KEEP et al., 2011). Neste

trabalho, não foi observada a toxicidade do extrato de S. nitens frente às linhagens

celulares testadas, o que pode indicar que o extrato vegetal não interfere na

viabilidade das células do hospedeiro e, sua ação se dá atuando somente sobre o

micro-organismo causador da doença.

Como demonstrado, os resultados com o extrato vegetal foram inovadores e

de grande relevância, neste sentido, a investigação do potencial antifúngico do

extrato após a incorporação em um sistema de liberação de fármacos foi aplicável

na elucidação da caracterização biológica do mesmo.

Discussão 124

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A importância de se incorporar extratos vegetais em sistemas

nanotecnológicos de liberação esta ligada principalmente ao aumento da atividade

biológica dos mesmos, e isto é extremamente válido para o desenvolvimento de

pesquisa de novos fármacos antimicrobianos (BONIFÁCIO et al., 2014). Além disso,

alguns problemas relacionados com a solubilidade destes compostos a serem

analisados biologicamente levam à utilização de plataformas nanotecnológicas de

liberação. A vantagem de utilizar um sistema de liberação de fármaco para a

veiculação de princípios ativos se faz na idéia de uma síntese programada do

sistema, ou seja, é possível desenvolver um sistema que possua características

favoráveis com o local de aplicação pretendido, neste sentido, a escolha dos

componentes das fases do mesmo é de extrema importância (PETROS e

DESIMONE, 2010).

Embora nos últimos anos seja visto a utilização de produtos oriundos de

fontes naturais na produção de sistemas nanoestruturados para a veiculação de

fármacos, ou até mesmo na elaboração de cosméticos de alto grau tecnológico, não

há relatos na literatura da incorporação destes compostos em sistemas líquido-

cristalinos emprego na terapêutica de doenças fúngicas, o que torna este trabalho

promissor.

A nanotecnologia farmacêutica utiliza matérias primas naturais como

componentes de formulações de alto padrão tecnológico, neste sentido, tem-se

observado cada vez mais a utilização de óleos vegetais na produção de sistemas de

liberação de fármacos, incluindo dos sistemas líquido cristalinos. Santos et al. (2011)

propuseram a elaboração de emulsões contendo óleos oriundos de plantas vegetais

nativas do Brasil, a fim de avaliar o potencial de formação de fases líquidas

cristalinas lamelares. Foram utilizados óleos vegetais de Andiroba

(CarapaguyanensisAubl. – Meliaceae), damasco (Prunusarmenioca L. - Rosaceae),

abacate (Persea americana Mill. - Lauraceae), castanha do Brasil (Bertholletia

excelsa Bonpl. - Lecythidaceae), buriti (Mauritia flexuosa L. - Arecaceae), cupuassu

(TheobromagrandiflorumWilld. exSpreng.Schum - Sterculiaceae), calêndula

(calendulaofficinalis L. - Asteraceae), maracujá (Passiflora edulisSims. -

Passifloraceae) e pequi (Caryocar brasiliense Camb. - Caryocaraceae) como

constituintes da fase oleosa, além destes, também foram empregados o óleo mineral

Discussão 125

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e parafina líquida. Todas as emulsões formadas foram consideradas estáveis com

exceção apenas daquela que foi preparada a partir de óleo mineral. Os autores

evidenciaram ainda que a mistura de diferentes surfactantes com cargas diferentes

de HLB não interferem na promoção de um sistema nanoestruturado onde há

formação de cristais líquidos contendo óleos vegetais como constituinte de fase

oleosa.

Neste trabalho foram desenvolvidos ensaios biológicos com dois sistemas

nanotecnológicos de liberação de fármacos empregando cristais líquidos, sendo

estes sistemas precursores de cristais líquidos mucoadesivos (SPCLM) constituídos

de ácido oleico como fase oleosa, PEG-5 Ceteth-20 (Procetyl-AWS®) como

tensoativo mucoadesivo e uma dispersão polimérica sintetizada a partir de dois

polímeros em proporções iguais (Policarbophyl+Carbophol®) como fase aquosa. A

escolha deste sistema se deu pelo fato do mesmo mostrar-se favorável na

incorporação de extratos vegetais, além de apresentar-se como uma plataforma

segura de veiculação de fármacos para a via intravaginal (SILVA et al., 2014), sendo

esta o principal foco de investigação deste trabalho.

A escolha dos constituintes de um sistema de liberação de fármacos deve

basear-se em características que sejam favoráveis com o local de aplicação, sendo

assim, neste trabalho foi empregado o ácido oléico como a fase oleosa da

formulação por apresentar parâmetros favoráveis em relação à interação com a

membrana fúngica das espécies de Candida utilizadas nesta investigação. O Ácido

Oléico classifica-se como um ácido graxo essencial (Ômega 9), que por sua vez

participa diretamente no metabolismo do homem, desempenhando um papel

fundamental na síntese de hormônios. Em termos estruturais, é um ácido graxo de

cadeia longa que possui 18 carbonos na sua estrutura e por possuir uma dupla

ligação entre os carbonos, é considerado como um ácido graxo insaturado. Por tais

características apresentadas, é considerado um importante componente de

formulações farmacêuticas, sendo muito usado na produção de cosméticos por

apresentar emoliência favorável (MENDES et al., 2012). Além destes parâmetros, o

ácido oléico vem sendo muito utilizado em sistemas de liberação de fármacos para

promover o aprimoramento dos princípios ativos no que se diz respeito à sua

Discussão 126

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interação com as membranas, principalmente as da pele (WILLIAMS e BARRY,

2004).

O sistema desenvolvido baseou-se na característica de mucoadesividade no

ambiente vaginal, neste sentido, foram empregados materiais com propriedades

adesivas. A vantagem de se trabalhar com sistemas de liberação de fármacos com

propriedade mucoadesiva se faz na idéia de uma liberação mais intensa, ou seja, a

adesividade promove um contato direto com o local de aplicação fazendo com que

haja uma liberação por completo, além de impedir que o paciente venha a expelir o

conteúdo administrado, característica esta importante para um sistema de liberação

para via intravaginal. A escolha do tensoativo (PEG-5 Ceteth-20) nos sistemas

desenvolvidos baseou-se nestas características, uma vez que possui um expressivo

padrão de adesividade quando em contato com água, sendo assim, objetivou-se o

desencadeamento da adesão quando o sistema entrasse em contato com o muco

vaginal da mulher.

Os materiais adesivos incorporados nas formulações farmacêuticas podem

ser moléculas hidrofílicas de origem natural ou sintéticas, contendo numerosas

funções orgânicas, tais como grupos carboxilas, hidroxilas e aminas, que geram

ligações químicas com a superfície biológica (CALIXTO, 2013).

As fases aquosas dos sistemas (DP) também foram desenvolvidas com o

objetivo de promover a mucoadesão do mesmo. O carbohpol C974P e o

policarbophyl, constituintes da DP, são exemplos de polímeros sintéticos carregados

negativamente e são derivados do ácido poliacrílico. O comportamento bioadesivo é

justificado a processos físico-químicos, como interações hidrofóbicas, ligações de

hidrogênio e de van der Waals, que são controladas pelo pH e composição iônica

(KHUTORYANSKIY, 2011). Além desta característica, a utilização de polímeros na

fase aquosa teve como intenção promover uma liberação prolongada do extrato

vegetal, uma vez que o mesmo é retido na rede polimérica e tem sua liberação de

forma mais lenta e controlada. Nos sistemas que possuem alguma rede polimérica

em sua composição o fármaco pode estar homogeneamente disperso na matriz

polimérica, adsorvido em sua superfície ou dentro de um reservatório, onde a

liberação do mesmo envolve processos físicos e químicos, tais como: penetração de

Discussão 127

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água na matriz, difusão do fármaco pelos poros da matriz, degradação do polímero

ou por combinação dos últimos dois mecanismos (LAGES et al., 2014).

A partir do desenvolvimento do diagrama de fases nota-se que houve uma

maior prevalência de formulações com aparência líquida transparente (30,5%), em

seguida, aquelas que mostraram-se viscosas e opacas (22,2%) e, em ordem

decrescente: separação de fases (16,7%), viscosas translúcidas (13,9%), líquidas

translúcidas (11,1%) e por fim as viscosas porém transparentes (5,6%). A

caracterização farmacotécnica das formulações selecionadas para a análise de

microscopia por luz polarizada evidenciou estruturas que correspondem às

mesofases de cristais líquidos.

As formulações liquidas transparentes que apresentaram campo escuro

(63,6%) nas análises por MLP são correspondente à mesofase de microemulsão.

Nesta mesofase não há a presença de estruturas tridimensionais, porém, podem

comportar-se como sistemas precursores de cristais líquidos, onde em contato com

alguma substância aquosa se estruturam e formam fases mais rígidas. A formulação

(F18) que apresentou a estrutura de cruz de malta (4,5%) nas análises de MLP é

característica de mesofase lamelar. Nesta fase, as moléculas consistem em

bicamadas alternadas de moléculas de tensoativo e de solvente, de modo que as

cadeias hidrofóbicas do tensoativo são o centro da lamela e sua parte hidrofílica está

em contato com a camada de solvente (WANG e ZHOU, 2009).

Já aquelas que apresentaram estrias na MLP (22,7%) são características de

mesofases hexagonais, nestas mesofases, as micelas estão empacotadas em

arranjo hexagonal e são separadas por uma região contínua de água. Esta fase

pode ser classificada em fase reversa, formada por canais aquosos circundados

pelas cabeças polares do tensoativo, com a porção apolar localizada ao redor dos

cilindros, ou pode ser classificada em fase normal, onde as cabeças polares do

tensoativo localizam-se na região externa dos cilindros (YARIV et al., 2010).

Em relação às formulações que apresentaram estruturas de estrias e cruz de

malta (9,0%) nas análises, classificou-as como características de formulações que

estão em transição para a fase cúbica, ou seja, são formulações que estão em

partindo de uma característica mais líquida para se tornarem mais viscosas. A fase

cúbica, também conhecida como fase isotrópica viscosa, é formada por micelas

Discussão 128

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normais (fase contínua polar) ou reversas (fase contínua apolar) empacotadas em

arranjo cúbico (CALIXTO, 2013).

Também foram realizadas análises por MLP nas formulações utilizadas nos

ensaios biológicos após a incorporações dos extratos vegetais onde foi constatado

que a incorporação do mesmo não modificou a conformação estrutural do mesmo,

sendo assim, antes e após a incorporação ambas as formulações permaneceram

com a característica de mesofase microemulsão.

O ensaio do efeito muco nos sistemas revelou que a presença de MVA nas

formulações exerce expressiva interferência na mudança de conformação do

SPCLM. A viscosidade das formulações foi crescendo proporcionalmente à medida

que ocorreu a introdução de MVA o que indica que quanto mais muco, maior é a

estruturação do sistema.

A partir das análises por MLP foi possível comprovar o perfil precursor de

cristais líquidos das formulações, onde a presença de estruturas como cruz de

malta, estrias e campo escuro foram indicativas para tal (CHORILLI et al., 2011).

Com relação à formulação que continha 100% de MVA, sua mesofase se distingue

daquelas com 5 e 10%, embora tenham apresentado a mesma estrutura na MLP, e

isso é justificado a alta viscosidade que esta formulação se encontrou, o que a

classificou como mesofase cúbica, ou seja, a presença de campo escuro por MLP

mostrou que as moléculas estavam altamente complexadas e estruturadas que

impediram a passagem da luz.

No trabalho realizado por Calixto (2013) a fim de desenvolver uma formulação

precursora de cristais líquidos mucoadesivos com constituintes iguais aos utilizados

neste trabalho visando à veiculação de um peptídeo sintético para administração

oral, onde foi avaliado o efeito da adição de saliva em contato com o sistema,

também foi evidenciado que a medida em que se aumenta a quantidade de uma

substancia aquosa no sistema, no caso a saliva humana, há uma expressiva

mudança estrutural no mesmo e isso reflete diretamente na sua anisotropia.

As análises reológicas contínuas realizadas em sistemas precursores de

cristais líquidos permitem o estudo do comportamento de fluxo que o material em

análise apresenta quando este sofre uma determinada tensão, neste sentido, o que

define o comportamento de fluxo do material estudado é a correlação entre a tensão

Discussão 129

__________________________________________________


de cisalhamento e a taxa de cisalhamento analisada, que é representada

graficamente em diagramas denominados de curvas de fluxo (SAVIC et al., 2011).

Essas curvas nada mais são do que reflexos de duas etapas do estudo, no qual o

aumento da taxa de cisalhamento é revelado pela curva ascendente e a diminuição

da taxa desta é representada pela curva descendente (BERNEGOSSI, 2013). De

acordo com os dados obtidos por estas análises, classifica-se a partir da curva

ascendente, o material em análise, como newtoniano ou não newtoniano. Em

contrapartida, caso sejam não newtonianos, os materiais podem ser classificados

ainda como pseudoplásticos, plásticos ou dilatantes. Em relação à curva

descendente, os materiais podem ser diferenciados em tixotrópicos ou reopéticos

(CALIXTO, 2013). As formulações classificadas como não-newtonianos com

comportamento plástico necessitam de uma força prévia para iniciar o processo de

tensão de cedência. Já aquelas com comportamento pseudoplástico fornecem um

reograma onde a curva, da mesma forma que com os fluidos newtonianos, tem

como origem o zero; entretanto, a relação entre a taxa de cisalhamento e a

velocidade de cisalhamento não são lineares, ou seja, ao se aumentar a velocidade

de cisalhamento, diminui-se a viscosidade. Os fluidos não newtonianos com

comportamento dilatante é o inverso do pseudoplástico, ou seja, ao se aumentar a

velocidade de cisalhamento, observa-se aumento da viscosidade (LAHOUD e

CAMPOS, 2010).

No que se diz respeito às análises reológicas contínuas das duas formulações

eleitas para o desenvolvimento dos ensaios biológicos (F25 e F26) estas mostraram

características distintas.

Ambas as formulações que foram analisadas com a presença de MVA

independentemente de estarem incorporadas ou não, comportaram-se como

materiais não-newtonianos com perfil pseudoplástico na curva crescente e

tixotrópico na curva decrescente. Estes resultados mostram-se importantes visto que

a utilização de formulações que possuem estas características são muito

interessantes para a administração de fármacos por via vaginal, uma vez

apresentando este comportamento pseudoplástico são capazes de aumentar sua

viscosidade em função da força exercida sobre a mesma, neste sentido, as

formulações que foram desenvolvidas neste estudo podem desempenhar um papel

Discussão 130

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importante, visto que após a incorporação do muco naturalmente presente na

secreção genital, é possível obter-se um sistema com tal característica.

Outro fato importante a ser mencionado é a tixotropia elucidada na curva

decrescente, uma vez que materiais que possuem esta característica têm a

capacidade de reestruturar-se rapidamente após a aplicação (LEE et AL., 2009).

Dados da literatura mostram que a utilização de formulações vaginais com

características pseudoplásticas são amplamente empregadas. As observações feitas

por Narayana et al. (2009) demonstraram o mesmo comportamento das formulações

deste estudo (pseudoplastica e tixotrópica) sobre uma formulação de gel de

secnidazol preparada para administração vaginal. Os autores confirmaram que a

característica pseudoplástica da formulação foi interessante para o desenvolvimento

da aplicação proposta. Recentemente, Tuğcu-Demiröz et al. (2013) desenvolveram

um gel vaginal bioadesivo contendo oxibutinina e elucidaram os mesmos parâmetros

observados neste estudo.

Em relação às formulações isentas de MVA, as mesmas foram classificadas

como Newtonianas, sendo assim, comportaram-se de forma idêntica

independentemente da presença do extrato vegetal incorporado. As formulações

newtonianas são aquelas onde seus comportamentos de fluxo não se modificam a

medida que uma tensão é aplicada, neste sentido, mantém-se integras durante a

aplicação.

No que se diz respeito às estratégias empregadas no desenvolvimento de

sistemas de liberação de fármacos com propriedades mucoadesivas, estas estão

relacionadas com a habilidade do polímero ou sistema ficar aderido ao muco ou à

pele. Neste sentido, o material deve interagir com os componentes do muco ou

alterar sua estrutura por estímulos fisiológicos como pH, força iônica e temperatura.

O uso de formulações nanotecnológicas com propriedades mucoadesivas vem

sendo evidenciadas nos últimos anos e a presença de polímeros e agentes

tensoativos que promovam adesividade no local de aplicação estão diretamente

ligados ao sucesso do desenvolvimento e caracterização farmacotécnica da

propriedade esperada (CARVALHO et al., 2014). A vantagem encontrada em se

administrar fármacos por meio de formulações mucoadesivas se dá no sentido de

promover um contato direto com o sítio de aplicação e com isso gerar uma liberação

Discussão 131

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mais intensa e completa. Entretanto, no sistema desenvolvido nesse estudo, a

presença dos polímeros Carbophol® e Policarbopyl®, além do agente tensoativo

Procetyl-AWS forneceram uma característica adesiva ao sistema, a qual foi

confirmada com o teste de mucoadesão in vitro.

Sendo assim, nos ensaios de mucoadesão deste estudo foram reportados

parâmetros importantes nos dois sistemas (F25 e F26) submetidos à análise

bioadesiva in vitro utilizando mucosa vaginal de suíno. Primeiramente, constata-se

que a adição MVA nos sistemas aumentou significativamente a força bioadesiva em

relação aos sistemas sem a presença do mesmo, o que era esperado. A maior

bioadesão dos sistemas líquido-cristalinos pode ser explicada por suas propriedades

reológicas, ou seja, a elevação da sua viscosidade e sua característica elástica

contribui com o aumento do tempo de permanência da formulação na membrana

empregada no teste, neste sentido, o perfil pseudoplástico das formulações com a

presença de MVA está diretamente ligado aos resultados observados neste estudo.

Os valores de bioadesão das formulações incorporadas e não incorporadas com o

extrato vegetal e com a presença de MVA não demonstraram diferença significativa.

Como já mencionado, as razões dadas às propriedades mucoadesivas

observadas estão diretamente relacionadas com os polímeros e o tensoativo

empregados, todavia, uma atenção maior é dada aos polímeros, uma vez que a

intensidade da adesão é influenciada principalmente pela capacidade de interação

dos mesmos com a superfície administrada, em contrapartida, se a capacidade de

interação for demasiadamente elevada, a película formada pode ser muito

bioadesiva, e a sua remoção do substrato biológico pode ser muito difícil, o que

pode levar à danificação do epitélio vaginal. Além disso, a secreção contínua de

muco conduz à diluição subsequente do fármaco, e um longo tempo de adesão pode

levar à degradação enzimática do mesmo (KHUTORYANSKIY, 2011). Entretanto, a

concentração de polímeros nas formulações deste estudo (5%) é considerada baixa

e não possui a capacidade de promover a super adesão na mucosa vaginal, o que é

de extrema importância para a aplicação proposta.

Como demostrado, todas as análises farmacotécnicas dos sistemas foram

satisfatórias, neste sentido, mostrou-se aplicável na investigação do seu potencial

biológico sobre os testes empregados neste estudo para a elucidação do perfil

Discussão 132

__________________________________________________


antifúngico do extrato vegetal de S. nitens. Todas as análises que foram

desenvolvidas para o extrato não incorporado foram repetidas após a incorporação

do mesmo no SPCLM.

Em relação aos resultados observados na determinação da CIM foram

encontrados valores satisfatórios após a incorporação do extrato no SPCLM. Nos

ensaios desenvolvidos com as cepas de C. albicans foi observada significativa

diminuição dos valores de CIM após a incorporação do extrato no SPCLM, onde os

mesmos que anteriormente apresentavam-se entre 250 a 125 µg/mL passaram a

exibir valores de 31,2 a 62,5 µg/mL.

Nos ensaios realizados com as linhagens não-albicans os resultados

seguiram as mesmas considerações no que se diz respeito à diminuição da CIM. A

espécie C. krusei que apresentaram valores entre as cepas de 125 a 62,5 µg/mL

para o extrato não incorporado passaram a apresentar sensibilidade nas

concentrações de 31,2 a 63,5 após a incorporação do extrato no SPCLM. Em C.

glabrata, os resultados obtidos sobre as cepas passaram de 125 a 62,5 µg/mL

(extrato não incorporado) para 3,9 a 15,6 µg/mL após a incorporação, classificando-

se como os resultados mais promissores da investigação. Com as cepas de C.

tropicalis os resultados seguiram as mesmas tendências, sendo observada a

diminuição da CIM entre as cepas de 500 a 250 µg/mL para 125 a 250 µg/mL após a

incorporação, todavia, esta foi a espécie mais resistente observada no estudo. Em

relação aos resultados com as cepas de C. parapsilosis os valores encontrados

foram extremamente promissores. A espécie que anteriormente apresentou

concentrações de CIM mais elevadas em relação às outras linhagens empregadas

no estudo (500-250) assim como C. tropicalis, passou a mostrar sensibilidade a

partir da concentração de 7,8 a 62,5 após a incorporação do extrato no SPCLM.

Nas análises realizadas a fim de elucidar a concentração fungicida mínima

(CFM) observou-se que mesmo após a incorporação do extrato no SPCLM não foi

observada a morte dos micro-organismos, ou seja, o padrão de inibição do extrato

permaneceu como um suposto agente fungistático, promovendo a diminuição do

crescimento e proliferação do fungo, mas não o matando. Estes resultados

demonstram que embora os resultados obtidos na determinação da CIM tenham

sido promissores, o sistema nanoestruturado de liberação de fármacos não foi capaz

Discussão 133

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de mudar o perfil de ação exercido pelo extrato. No entanto, uma ação fungistática é

considerada como eficaz no tratamento de doenças fúngicas, uma vez que se

espera que o sistema imunológico do hospedeiro atue sinergicamente na ação

eliminatória do fungo, além de que, muitos fármacos com ação fungicida são tóxicos

e atingem células humanas saudáveis. Em contrapartida, levando em consideração

que o perfil fungistático necessita de ação complementar do sistema imunológico,

em casos onde o paciente é portador de alguma disfunção imunológica como

àqueles soropositivos para o HIV, a terapia com agentes fungistáticos pode mostrar-

se ineficaz.

Nos resultados de inibição de hifas de C. albicans os resultados também

seguiram as tendências de melhora de atividade como observado nos dados da

determinação da CIM. Após a incorporação do extrato no SPCLM a concentração

necessária para inibir o crescimento das hifas foi de 31,2 µg/mL, mostrando-se como

um valor fixo nos tempos de 12 e 24 horas, diferentemente dos resultados

encontrados com o extrato não incorporado, onde houveram variações da

concentração do extrato nos tempos de análise.

Nos resultados obtidos nos ensaio de tempo de morte (Time kill) nota-se que

o extrato incorporado no SPCLM exerceu ação inibitória sobre o crescimento de

todas as espécies (com exceção para C. krusei CAV 3) superiormente aos

resultados obtidos com o extrato não incorporado, embora tenha permanecido o

tempo de 8 horas de equilíbrio do crescimento. Em relação à concentração final de

micro-organismos no tempo de 48 horas foi observado que o extrato incorporado foi

capaz de manter um equilíbrio mais intenso, e em alguns casos igualando-se aos

resultados com o fármaco padrão anfotericina B. Apesar da incorporação, o extrato

incorporado não foi capaz de promover a morte dos fungos, o que confirma a

possível ação fungistática estabelecida nos resultados observados na determinação

da CFM.

A hipótese de que o extrato vegetal passou a mostrar-se mais ativo nos

ensaios de determinação da CIM, inibição de hifas e Time kill, parte do emprego dos

componentes do sistema de liberação de fármacos empregados, principalmente à

atuação do ácido oleico. Em relação a isso, estima-se que esse componente

exerceu uma função direta sobre a permeabilidade da membrana dos fungos, por

Discussão 134

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ser uma substancia de caráter lipofílico e de constituição celular, ou seja, a afinidade

entre a formulação e as células fúngicas podem ter promovido o aumento da

permeabilidade da membrana e com isso ter permitido a passagem do extrato para o

meio extracelular favorecendo sua ação no citosol, além disso, pode-se levar em

consideração uma ação exercida também na própria membrana, sendo esta o alvo

de inúmeros agentes antimicrobianos. Todavia, não se sabe ao certo quais são os

verdadeiros motivos que comprovem melhora tão significativa da ação antifúngica

observada, e isso justifica o desenvolvimento de uma investigação mais profunda do

mecanismo de ação do extrato na forma não incorporada e incorporada sobre as

espécies empregadas nesta investigação, entretanto, este não foi o objetivo deste

estudo.

A permeabilidade celular exercida pelo ácido oleico foi observada por Rowat

et al. (2006) ao investigarem a capacidade de permeação de um sistema liquido-

cristalino de fase lamelar em membranas de extrato córneo através de análise por

ressonância magnética nuclear, tendo atribuído que esse componente foi promissor

no aumento da permeabilidade da membrana e desempenhou papel fundamental

para a permanência da conformação do cristal líquido após a administração.

Nas análises realizadas com o extrato incorporado no SPCLM sobre a

inibição do biofilme in vitro foram evidenciados resultados de extrema importância,

uma vez que após a incorporação do extrato foi observada ação inibitória sobre as

espécies avaliadas, o que não foi evidenciado anteriormente em nenhuma linhagem.

Nos biofilmes com as cepas de C. albicans foram evidenciadas inibições do extrato

incorporado variando entre as concentrações de 1,25 a 20,0 mg/mL as cepas

clínicas e da ATCC. Em relação aos resultados de inibição do biofilme de C. krusei

foi evidenciado que o padrão de resistência ao extrato permaneceu sobre quase

todas as cepas, excluindo-se uma cepa clínica (CKV 2) apresentando inibição na

concentração de 10,0 mg/mL. Nos biofilmes de C. glabrata foi observada atividade

inibitória após incorporação do extrato no SPCLM sobre duas cepas, ATCC 2001 e

CGV 2, apresentando concentrações inibitórias de 10,0 e 20,0 respectivamente. Em

C. tropicalis os resultados mostraram-se mais promissores que os observados nos

biofilmes de C. krusei e C. glabrata, onde foram evidenciados inibições sobre as três

cepas clínicas empregadas com concentração variando de 2,5 a 20 mg/mL. Por fim,

Discussão 135

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os biofilmes de C. parapsilosis foram os mais sensíveis ao extrato incorporado no

SPCLM, nestas cepas o padrão inibitório variou de 0,6 a 20,0 mg/mL, onde o menor

valor obtido foi contra a cepa que anteriormente mostrou-se sensível ao extrato na

forma não incorporada na concentração de 10,0 mg/mL (CPV 2), o que comprova

mais uma vez que a incorporação do extrato no SPCLM foi capaz de promover um

aumento da atividade antifúngica do mesmo.

De maneira semelhante aos ensaios de CIM e inibição de hifas, é

supostamente possível que ação observada esteja ligada ao aumento da

permeabilidade na membrana fúngica a qual promoveu um aumento da

substantividade do extrato vegetal. Igualmente, é possível também que a

propriedade mucoadesiva tenha interferido diretamente na inibição dos biofilmes,

uma vez que os mesmo mantiveram um contato direto com o sistema contendo o

extrato, de maneira constante e com liberação mais intensa e fixa no local. Os

componentes mucoadesivos (dispersão polimérica e tensoativo) podem ter sido os

principais adjuvantes desta etapa da ação, uma vez que foram capazes de fixar a

formulação contendo o extrato diretamente sobre o biofilme formado no poço da

microplaca, que, por sua vez, apresentava-se como uma película fixa e uniforme.

Williams e Barry (2004) afirmam em seu trabalho sobre as principais formas

de penetração de sistemas de liberação de fármacos em membranas e superfícies

corpóreas são relatadas para aquelas com propriedades adesivas. Shaikh et al.

(2011) afirmam que a utilização de sistemas de liberação de fármacos

mucoadesivos sobre biofilmes é prevalentemente mais propícia quando se emprega

algum agente capaz de promover uma adesão direta com o mesmo, citando os

polímeros como os mais promissores e eficazes para tal fim, o que demonstra mais

uma vez o papel mucoadesivo da dispersão polimérica utilizada como fase aquosa

da formulação.

Em um estudo realizado por Donnelly et al (2007) os autores avaliaram a

ação do azul de toluidina em um sistema mucoadesivo frente a aplicabilidade do

mesmo em casos de biofilme de orofaringe causado por espécies de Candida, tendo

observado que o perfil adesivo direto exercido sobre o biofilme foi o fator primordial

para a ação observada.

Discussão 136

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Nos ensaios de citotoxicidade com a linhagens HeLa e Vero foi constatado

que o SPCLM promoveu a inviabilidade celular, e esse padrão se manteve nos

ensaios com o sistema puro e incorporado. Não se sabe ao certo quais foram os

mecanismos envolvidos no processo de citotoxicidade, no entanto, não há relatos na

literatura que mostram este perfil tóxico.

Todos os resultados encontrados nas investigações antifúngicas in vitro

estabeleceram uma plataforma segura quanto a possível potencialidade do extrato

vegetal na terapêutica de afecções fúngicas oportunistas, sendo assim, foram

estabelecidos protocolos experimentais in vivo frente à análise da eficácia do extrato

incorporado e não incorporado no tratamento e profilaxia da CVV.

O diferencial de se trabalhar com modelos experimentais in vivo é promover

uma plataforma segura quanto à aplicabilidade do possível composto terapêutico a

ser analisado, uma vez que procura-se mimetizar os mesmos parâmetros

observados em casos de doenças humanas. Os roedores, principalmente aqueles

pertencentes à espécie Rattus novergicus, comportam-se como uma excelente

ferramenta para o desenvolvimento de infecções fúngicas vaginais por possuírem

epitélio parecido com o do ser humano, todavia, é necessário criar condições para o

desenvolvimento de CVV nestes animais, uma vez que espécies de Candida, com

especial atenção a Candida albicans não são colonizadoras comensais de ambiente

vaginal como em seres humanos (CASSONE et al., 2014).

Em termos gerais, para um desenvolvimento eficaz da patogenia da CVV é

necessário que haja uma aderência inicial da cepa leveduriforme na mucosa vaginal.

A partir daí iniciam-se os processos referentes à infecção, sendo inicialmente

assintomáticos caminhando para o desenvolvimento de sinais e sintomas, os quais

caracterizarão a veracidade do estado patológico no qual a paciente se encontra. Os

fatores predisponentes para o desencadeamento da infecção fúngica vaginal estão

ligados principalmente a condições relacionadas com a imunidade do hospedeiro,

além do mais, doenças como o diabetes mellitus, uso de corticóides de forma

crônica, antibioticoterapia, terapia estrogência e até mesmo a gravidez, são fatores

desencadeadores da CVV. Além destes, mulheres em fase luteal (fase da ovulação)

do ciclo menstrual são fortes candidatas ao desenvolvimento da CVV, e isso se

justifica pelo aumento dos níveis de estrógeno e progesterona e também a

Discussão 137

__________________________________________________


diminuição do pH no ambiente vaginal, sendo estes os principais fatores que

contribuem diretamente para o desenvolvimento da infecção, além de que, o

aumento dos níveis de estrógenos deixa o epitélio vaginal escamoso e aumenta os

níveis de glicogênios (SOBEL, 2010; BARBEDO e SGARBI, 2010).

No entanto, foi necessário criar condições favoráveis para o

desencadeamento do estado patológico nos animais. Inicialmente foi realizada a

imunossupressão dos mesmos utilizando o fármaco ciclofosfamida (50mg/ p.c.) por

via intraperitoneal. Esta etapa foi de total importância, uma vez que a CVV é

classificada como uma doença oportunista. Araújo et al. (2013) também realizaram o

estabelecimento da imunossupressão com a mesma droga e da mesma maneira

que foi realizado neste estudo tendo obtidos resultados favoráveis à infecção. Na

ausência de alguma forma de imunossupressão ou outro tipo de protocolo que

resulte neste fim, a carga fúngica no ambiente vaginal é variável e frequentemente

declina rapidamente.

Naglik et al. (2008) demonstraram através do emprego de ratos e

camundongos que após a infecção inicial, previamente estabelecida sem o uso de

agentes imunossupressores, decorrido uma semana é observado o declínio da

carga fúngica, a qual reduz-se naturalmente para um estado de portador, ou seja,

são observadas concentrações semelhantes àquelas encontradas em mulheres

sadias que não possuem CVV, apenas C. albicans em comensalismo no ambiente

vaginal. Angulo et al. (2002) utilizaram a ciclofosfamida para abordar o impacto da

infecção sistêmica subletal por Candida albicans por imunossupressão induzida em

um curso de tratamento intensivo com o agente imunossupressor. Os autores

observaram que na mesma concentração avaliada neste estudo (50 mg/ p. c.) não

há o risco de desenvolvimento de morte nos animais, porém, há o perfeito

desenvolvimento da infecção.

Como já mencionado, o desenvolvimento de uma infecção eficaz em roedores

se dá além da imunossupressão, uma vez que é necessário adequar o ciclo estral

de cada animal para criar condições hormonais favoráveis ao estabelecimento do

estado patológico, sendo assim, o estado pseudo-estro (falso cio) é o mais indicado

para tal fim. Neste estudo, todos os animais foram induzidos a este estado a partir

10 dias de aplicações subcutâneas (0,1 mL) de solução de estradiol (20 mg/mL)

Discussão 138

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duas vezes ao dia, onde fase foi avaliada segundo lavagens vaginais com solução

tamponada (pH 7,4) de PBS estéril para coleta de células epiteliais da mucosa

vaginal. Através de análises microscópicas da morfologia destas células foi possível

determinar a fase estral de todos animais, onde a ausência de núcleo e a forma

cornificada das mesmas indicaram que todos os animais encontravam-se no estado

pseudo-estro (Maecondes et al., 2002).

No estudo de Araújo et al. (2013) também foi utilizado o mesmo método de

confirmação, todavia, os animais empregados foram levados a este estado com

apenas 5 dias de aplicação de estradiol, o que se difere deste estudo, entretanto,

mesmo se tratando da mesma espécie empregada em ambos os ensaios

experimentais, é praticamente impossível reproduzir os mesmos resultados, uma vez

que a variação genética, mudança de local de experimento e procedência dos

animais interferem diretamente na fisiologia e comportamento dos mesmos (HOHL

et al., 2014).

Após a confirmação da do estabelecimento do ciclo estral em todos os

animais, procedeu-se o estabelecimento do estado infeccioso com inoculação de

uma suspensão fúngica das cepas a serem estudadas. Foi observado que as

suspensões de C. albicans contendo 5 x 107 Cél/mL (0,1 mL) foi capaz de

estabelecer o processo de infecção quando adminstrada intravaginalmente, em

todas as ratas que encontravam-se em estado pseudo-estro e imunossuprimidas.

Carrara et al. (2010) confirmaram em sua investigação de um novo modelo de

infecção por C. albicans em ratas, que com a mesma concentração de suspensão

fúngica utilizada neste estudo, todos os animais desenvolveram e mantiveram a

infecção durante 3 semanas de experimento. A infecção foi monitorada 2 dias após

inoculação para verificação da carga fúngica, através de cultivo do fluido vaginal

obtido por lavagem com solução tamponada estéril de PBS e análise microscópica

do mesmo para visualização de células fúngicas no ambiente vaginal. Foi

previamente estabelecido que a infecção fosse considerada positiva e suficiente

para iniciar o tratamento apresentando no mínimo 102 UFC/mL. Dessa forma, os

animais que não apresentaram colonização suficiente de C. albicans foram

novamente infectados com a mesma suspensão da levedura até apresentarem

carga fúngica favorável para o desenvolvimento da infecção.

Discussão 139

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A partir dos dados obtidos pode-se confirmar a suscetibilidade de ratas da

linhagem Wistar no desenvolvimento da CVV causada por C. albicans, além de

demonstrar que todas foram bem adaptadas para o desenvolvimento e manutenção

da CVV. A vantagem de se trabalhar com estes animais é que os mesmo são de

fácil manuseio e extremamente úteis como modelos experimentais in vivo para o

sistema genital feminino.

Ensaios experimentais in vivo de CVV desenvolvidos da mesma forma que

neste estudo são muito empregados pela comunidade científica para avaliar a

eficácia de produtos naturais no tratamento da infecção. Damke et al. (2011)

avaliaram de modo in vivo a utilização do extrato hidroalcoólico dos frutos de

Sapindus saponaria além de uma fração obtida desta espécie frente à infecções

estabelecidas em ratas com as espécies C. albicans e C. glabrata, empregando o

mesmo tratamento imunossupressivo e hormonal utilizado neste estudo, onde foi

possível evidenciar a ação terapêutica de ambos compostos no tratamento da

doença.

Zeng et al. (2011) também desenvolveram um ensaio experimental de CVV

causada por C. albicans utilizando terapia imunossupressora e indução do estado

pseudo-estro com a utilização de estradiol, para que pudesse ser avaliado o

emprego do óleo essencial de Anethum graveolens como agente terapêutico. Neste

estudo, foi constatado uma expressiva ação do óleo essencial frente à cura dos

animais infectados, comparando-se aos resultados obtidos com fármaco fluconazol,

empregado como controle positivo de tratamento.

Neste trabalho foram desenvolvidos infecções com duas diferentes cepas de

C. albicans, uma de origem padrão (ATCC 10231) e outra de origem clínica (CAV 3)

isolada da região vaginal de uma paciente sintomática e com diagnóstico positivo

para CVV. Foi avaliada especificamente a atividade terapêutica de extrato

metanólico de escapos de S. nitens, incorporado e não incorporado em um sistema

nanoestruturado precursor de cristais líquidos mucoadesivos desenvolvido com a

finalidade de promover o aprimoramento da atividade biológica do extrato.

Foi observado que em ambas as infecções (ATCC e CAV 3) o extrato vegetal

não incorporado e incorporado no SPCLM desempenhou perfil terapêutico em todos

animais que foram submetidos ao tratamento. Em relação ao extrato não

Discussão 140

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incorporado, foi constatada a cura dos animais infectados com a cepa ATCC após 4

dias de administração, já aqueles infectados com a cepa clínica CAV 3 foram

considerados curados no sexto dia de tratamento, o que é esperado, visto ao perfil

mais virulento que cepas de origem clínica apresentam.

Em relação ao tratamento com o extrato incorporado no SPCLM, concluiu-se

um importante perfil de cura em ambas as infecções (ATCC e CAV 3), uma vez que

todos os animais submetidos ao a administração do mesmo foram considerados

curados logo no segundo dia de análise da eficácia do tratamento. Os motivos desta

importante ação podem ser explicados segundo os mesmos parâmetros que foram

discutidos nos ensaios de determinação antifúngica in vitro, uma vez que a

formulação empregada exerceu papel fundamental no desempenho da eficácia do

tratamento, todavia, é justificável atribuir o padrão mucoadesivo como um forte

coadjuvante da atividade observada, uma vez que promoveu um contato íntimo com

o local infectado liberando o extrato vegetal de uma forma mais precisa e direta.

Fazendo-se uma relação entres os resultados do tratamento com o extrato não

incorporado é possível dar mais justificativa a esta afirmação, uma vez que no ato da

administração do extrato por via intravaginal os animais ejaculavam

automaticamente material depositado, fazendo com que uma quantidade mínima

permanecesse no ambiente para desempenhar a ação terapêutica.

O aperfeiçoamento do potencial antifúngico do extrato após a incorporação no

sistema de liberação de fármacos pode também ser confirmado quando se analisa

os dados apresentados pelos tratamentos realizados com a formulação sem a

presença do mesmo, uma vez que não exerceu perfil de cura nos animais

infectados, observado-se que o curso da infecção foi mantido íntegro até o final do

experimento.

O único dado literário que se refere à ação do extrato metanólico dos escapos

de S. nitens no tratamento da CVV são os desenvolvidos por Araújo et al. (2013),

que por sua vez, podem também confirmar a potencialidade do mesmo na terapia

antifúngica além de comprovar que a ação do extrato é aprimorada quando o

mesmo é veiculado por uma base nanotecnológica de liberação de fármacos, visto

que em seu estudo incorporou seu extrato em uma formulação convencional e

Discussão 141

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obteve a cura dos animais após 4 dias de tratamento, sendo esta mais tardia que a

observada na presente investigação.

É importante levar em consideração os resultados obtidos com o creme

vaginal de anfotericina B, uma vez que foi observada a cura dos animais apenas no

oitavo dia de análise, o que o mostra fraco perante os resultados com o extrato

incorporado e não incorporado. Estes dados são de extrema relevância, uma vez

que o extrato vegetal pode ser um possível candidato à substituição do fármaco na

terapêutica deste tipo de infecção.

A profilaxia de doenças fúngica é sem sombra de dúvida um item relevante na

pesquisa de novos fármacos. A terapêutica de doenças de caráter imunossupressor

em pacientes que estão em tratamento, como aqueles sujeitos a hemodiálise,

envolvem a utilização de fármacos antifúngicos como coadjuvantes complementares

do tratamento realizado, uma vez que são empregados como preventivos do

desencadeamento de eventos patológicos de caráter fúngico oportunista, como

aqueles oriundos de espécies do gênero Candida. Esta abordagem apresenta-se

como um fator de risco para o desenvolvimento da multirresistência ao fármaco

utilizado, o que torna ineficaz a eliminação do agente infeccioso, necessitando assim

de uma nova abordagem medicamentosa com a utilização de outras classes de

fármacos muitas vezes dotados de efeitos deletérios que dificulta a adesão do

paciente ao tratamento, principalmente quando isso ocorre em portadores de

disfunções imunológicas severas como a AIDS e outras doenças relacionadas

(PFALLER, 2012).

No sentido de promover uma melhor adequação do paciente ao tratamento,

as plantas podem oferecer um suporte seguro para controle e prevenção de

doenças infecciosas, uma vez que são dotadas de propriedades antimicrobianas

muitas vezes desconhecidas. Realizar uma terapia antifúngica com produtos de

origem natural classifica-se como uma importante ferramenta que visa eliminar

efeitos colaterais e com isso promover o bem estar e manutenção da qualidade de

vida do hospedeiro acometido (SALEEM, 2010).

Em razão da preocupação com o alto índice de doenças fúngicas, e da

eficácia observada no ensaio terapêutico de CVV causada por C. albicans, nesta

etapa do presente estudo foi avaliado o potencial profilático do extrato metanólico de

Discussão 142

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escapos de S. nitens incorporado ou não no SPCLM desenvolvido sobre uma

linhagem não-albicans, a fim de evidenciar se ambas as formas do extrato são

capazes de prevenir o desencadeamento da infecção. A espécie C. krusei (ATCC

6258) foi eleita como o agente patológico desta investigação por ser uma espécie

que apresenta resistência intrínseca ao fluconazol e estar relacionada com altos

índices de ineficácia dos agentes antifúngicos empregados em prática clínica.

A literatura apresenta importantes dados referentes à utilização de terapias

profiláticas voltadas à prevenção de doenças fúngicas causadas por Candida spp.

desenvolvidos com animais.

O Estudo realizado por Dai et al. (2011) avaliou o perfil profilático da terapia

fotodinâmica utilizando-se luz vermelha sobre corantes fenotiazínicos [azul de

metileno, azul de toluidina e um novo composto à base de azul de metileno (NMB)]

frente à prevenção do desenvolvimento da candidíase causada por C. albicans

sobre a pele de roedores saudáveis. Os dados obtidos no estudo demonstraram que

a terapia fotodinâmica em combinação com o corante azul (NMB) e luz vermelha,

pode reduzir significativamente a carga do fungo nas feridas de abrasão da pele

infectada.

Focando na busca de novos fármacos antifúngicos, Chami et al. (2004)

avaliaram o perfil profilático do carvacrol e eugenol frente à prevenção do

desenvolvimento da CVV causada por C. albicans em um modelo experimental in

vivo utilizando ratas ovariectomizadas da linhagem Wistar (Rattus novergicus). Os

autores evidenciaram que a utilização de ambos os compostos antes da introdução

da carga fúngica por via vaginal impediu o estabelecimento do estado infeccioso.

Os ensaios in vivo de profilaxia empregando produtos naturais voltados ao

combate do desenvolvimento da CVV causada por espécies não-albicans parece ser

uma etapa importante para a caracterização do potencial antifúngico de extratos

vegetais, visto que em muitos casos de infecções por esta classe de agentes

patogênicos são evidenciados episódios de multirresistência e alto índice de

disseminação para outras estruturas do corpo, o que dificulta ainda mais a adesão

do paciente ao tratamento (CORNELY et al., 2011).

O desenvolvimento do ensaio teve como principal objetivo tratar os animais

antes de receberem a carga fúngica por via vaginal. Inicialmente, com exceção de

Discussão 143

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um dos grupos positivos de infecção, foi realizada a imunossupressão com

ciclofosfamida (mesma quantidade e dosagem utilizada no ensaio terapêutico de

CVV). A razão de não se imunossuprimir um dos grupos positivos de infecção foi no

sentido de verificar o impacto da imunossupressão no desenvolvimento da infecção.

Anteriormente ao desenvolvimento da infecção procedeu-se a indução do estado

pseudo-estro em todos os animais através da aplicação de solução de estradiol (20

mg/mL) por via subcutânea (0,1 mL), da mesma forma que foi realizado no ensaio

terapêutico, diferenciando apenas na quantidade de dias de administração, uma vez

que os animais empregados neste estudo chegaram à fase estral pretendida com

cinco dias de tratamento com o hormônio. Os animais foram tratados por dez dias

com seus respectivos tratamentos antes da infecção duas vezes ao dia.

De acordo com as análises realizadas dois dias após a inoculação da

suspensão fúngica, foi possível constatar que os animais tratados com o extrato

incorporado no sistema nanoestruturado não desenvolveram a infecção, já aqueles

que foram tratados com o extrato não incorporado desenvolveram o estado

infeccioso, embora em menor concentração quando comparado ao grupo positivo de

infecção, igualmente aos resultados observados no grupo tratado com anfotericina

B. Esta infecção perdurou até o quarto dia de análise pós-infecção, onde todos os

animais foram considerados curados.

Em relação ao não desenvolvimento da infecção por parte do grupo tratado

com o extrato incorporado no SPCLM, conclui-se que a veiculação do composto

herbal não é somente capaz de tratar a patogenia desenvolvida em casos de

infecções por vaginais por C. albicans, mas também é extremamente promissor no

desempenho da prevenção de infecção por C. krusei. Estes dados refletem mais

uma vez que o sistema de liberação de fármacos é um potencializador da ação

biológica do extrato vegetal, onde as razões para tal eventualidade podem ser dadas

também às propriedades físicas e biológicas atribuídas ao SPCLM utilizado no

ensaio terapêutico de CVV, sendo elas, a mucoadesividade e a interação direta com

as células fúngicas leveduriformes.

Embora os resultados tenham sido importantes, faz-se necessário o

aprofundamento de investigações clínicas e farmacológicas voltadas à elucidação do

mecanismo de ação exercido pelo extrato vegetal não incorporado e incorporado no

Discussão 144

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SPCLM desenvolvido, uma vez que estas informações servirão de base para o

entendimento concreto e mais direto dos efeitos de tais compostos no organismo

humano, fornecendo assim uma plataforma segura para a incorporação dos mesmos

no arsenal terapêutico antifúngico.

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7. Conclusão

Entretanto, há algo a mais para se concluir... ...Deus não alimentaria em meu coração um sonho impossível de ser realizado!

(Matheus Ap. Santos Ramos)

Conclusão 146

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7. CONCLUSÃO

A partir de todas as análises realizadas neste estudo foi possível evidenciar a

prospecção biológica do extrato metanólico de escapos de Syngonanthus nitens

chegando-se as seguintes conclusões:

O extrato metanólico de escapos de S. nitens foi ativo contra as todas as cepas de

Candida empregadas no estudo.

O extrato vegetal mostrou-se promissor no desempenho da atividade antifúngica

frente aos principais fatores de virulência de Candida spp.

O sistema precursor de cristais líquidos mucoadesivos desenvolvido mostrou-se

favorável para a incorporação do extrato vegetal.

O potencial antifúngico do extrato de S. nitens foi aprimorado quando o mesmo foi

incorporado no SPCLM.

O SPCLM mostrou-se tóxico sobre linhagens celulares normais e tumorais de acordo

com as análises realizadas in vitro.

O extrato de S. nitens mostrou-se ativo no tratamento da CVV causada por C.

albicans e sua ação foi superior quando foi veiculado no SPCLM.

O extrato incorporado no SPCLM pode ser utilizado como agente profilático em

infecções vaginais por C. krusei.

O SPCLM desenvolvido pode ser empregado como veiculo para a administração de

fármacos por via intravaginal.

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8. Referências

Bibliográficas

O espelho e os sonhos são coisas semelhantes, é como a imagem do

homem diante de si próprio.

(José Saramago)

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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABBAS, J.; BODEY, G. P.; HANNA, H. A.; MARDANI, M.; GIRGAWY, E.; ABI-SAID, D.; WHIMBEY, E.; HACHEM, R.; RAAD, I.. Candida krusei fungemia. An escalating serious infection in immunocompromised patients. Arch. Intern. Med., v. 160, n. 17, p. 2659-26564, 2000. ABDOLLAHZADEH, S.; MASHOUF, R. Y.; MORTAZAVI, H.; MOGHADDAM, M. H.; ROOZBAHANI, N.; VAHEDI, M. Antibacterial and antifungal activities of Punica granatum peel extracts against oral pathogens. J. Dent. (Tehran), v. 8, n. 1, p. 1-6, 2011. AJAZUDDIN, S. S. Applications of novels drug delivery system for herbal formulations. Fitoterapia, v. 81, n. 7, p. 680-689, 2010. ALI, I.; KAHN, F. G.; SURI, K. A.; GUPTA, B. D.; SATTI, N. K.; DUTT, P.; AFRIN, F. In vitro antifungal activity of hydroxychavicol isolated from Piper betle L. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob., v. 9, p. 1-9, 2010.

ALIGIANNIS, N.; KALPOTZAKIS, E.; MITAKU, S.; CHINOU, I.B. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. J. Agric. Food Chem., v. 49, n. 9, p. 4168-4170, 2001. ALMEIDA, A.A.; MING, T.D.; CORRÊA, C.L.; LAVINAS, T. Verificação da qualidade dos fitoterápicos sene e boldo-do-chile comercializados na região de Campinas. Rev. Cien. Med., v.14, n.3, p.279-285, 2005. ALSHAMI, I.; ALHARBI, A. E. Hibiscus sabdariffa extract inhibits in vitro biofilm formation capacity of Candida albicans isolated from recurrent urinary tract infections.Asian. Pac. J. Trop. Biomed., v. 4, n. 2, p. 104-108, 2014. ÁLVARES, C. A.; SVIDZINSKI, T. I. E.; CONSOLARO, M. E. L. Candidíase vulvovaginal: fatores predisponentes do hospedeiro e virulência das leveduras. J. Bras. Patol. Med. Lab., v. 43, n. 5, p. 319-327, 2007. ANDRADE, M. J. G.; GIULIETTI, A. M.; HARLEY, R. M.; VAN DEN BERG, C.Blastocaulon(Eriocaulaceae), a synonym of Paepalanthus:Morphological and molecular evidence. Taxon, v. 60, n. 1, p. 178-184, 2011. ANDRADE, M. J. G.; GUILIETTI, A. M.; RAPINI, A.; QUEIROZ, L. P.; CONCEIÇÃO, A. S.; ALMEIDA, P. R. M.; VAN DER BERG, C. A comprehensive phylogenetic analysis of Eriocaulaceae: evidence from nuclear (ITS) and plastid (psbA-trnH and trnl-F) DNA sequences. Taxon. v. 59, p. 397-388, 2010. ANGEBAULT, C.; DJOSSOU, F.; ABÉLANET, S.; PERMAL, E.; SOLTANA, M. B.; DIANCOURT, L.; BOUCHIER, C.; WOERTHER, P. L.; CATZEFLIS, F.; ANDREMONT, A.; D’ENFERT, C.; BOUGNOUX, M. E. Candida albicans is not always the preferential yeast colonizing humans: a study in Wayampi Amerindians. J. Infect. Dis., v. 208, n. 10, p. 1705-1716, 2013.

Referências Bibliográficas 149

__________________________________________________


ANGULO, I.; JIMENEZ-DIAS, M. B.; GARCIA-BUSTOS, J. F.; GARGALLO, D.; HERAS, F. G.; FERNANDEZ, M. A. M.; FRESNO, M. Candida albicans infection enhances immunosuppression induced by cyclophosphamide by selective priming of suppressive myeloid progenitors for NO production. Cell. Immunol., v. 218, n. 1-2, p. 46-58, 2002. ARAÚJO, M. G. F. Caracterização do potencial biológico de Leiothrix spiralis Ruhland e Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland (Eriocaulaceae). 2011. 144f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, 2011. ARAÚJO, M. G. F.; HILÁRIO, F.; NOGUEIRA, L. G.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C.; BRUNETTI, I. L.; SOTOMAYOR, C. H.; BAUAB, T. M. Correlation among antioxidant, antimicrobial, hemolytic, and antiproliferative properties of Leiothrix spiralis leaves extract. International Journal of Molecular Sciences, v. 13, p. 9260-9277, 2012. ARAÚJO, M. G. F.; PACÍFICO, M.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C.; ICELY, P. A.; MIRÓ, M. S.; SCARPA, M. V. C.; BAUAB, T. M.; SOTOMAYOR, C. E. Evaluation of Syngonanthusnitens (Bong.) Ruhl. extract as antifungal and in treatment of vulvovaginal candidiasis. Med. Mycol,. v. 51, p. 673-682, 2013. BADKE, M. R.; BUDÓ, M. L. D.; SILVA, F. M.; RESSEL, L. B. Plantas Medicinais: o saber sustentado na prática do cotidiano popular. Esc. Anna Nery Rev. Enferm., v. 15, n. 1, p. 132-139, 2011. BAGHERI, F.; CERVELLIONE, K. L.; MARUF, M.; SANTUCCI JUNIOR, T. Candida parapsilosis meningitis associated with shunt infection in an adult male. Clin. Neurol. Neurosurg., v. 112, n. 3, p. 248-251, 2010. BARBEDO, L. S.; SGARBI, D. B. G. Candidíase. DST. J. Bras. Doenças Sex. Transm., v. 22, n. 1, p. 22-38, 2010. BEN-AMI, R.; OLSHTAIN-POPS, K.; KRIEGER, M.; OREN, I.; BISHARA, J.; WIENER-WELL, D. Y.; WEINBERGER, M.; ZIMHONY, O.; CHOWERS, M.; WEBER, G.; POTASMAN, I.; CHAZAN, B.; KASSIS, I.; SHALIT, I.; BLOCK, C.; KELLER, N.; KONTOYIANNIS, D. P.; GILADI, M. Antibiotic exposure as a risk factor for fluconazole-resistant Candida bloodstream infection. Antimicrob. Agents Chemother., v. 56, n. 5, p. 2518-2523, 2012. BERLIM, L. S.; GONÇALVES, H. A.; OLIVEIRA, V. S.; MATTOSO, N.; PRUDENTE, A. S.; BEZERRA-JÚNIOR, A. G.; SCHREINER, W. H. Syngonanthus nitens: why it looks like spun gold. Ind. Crops. Prod., v. 52, p. 597-602, 2014. BERNARDI, D.S.; PEREIRA, T.A. MACIEL, N.R.; BORTOLOTO, J.; VIEIRA. G.S.; OLIVEIRA, G.C.; ROCHA-FILHO, P.A. Formation and stability of oil-in-water nanoemulsions containing rice brain oil: in vitro and in vivo assessments. J Nanobiotechnology, v. 9, n. 44, p. 1-9, 2011.


__________________________________________________


BERNEGOSSI, J. Desenvolvimento, caracterização e ação anti-biofilme oral de sistemas nanoestruturados bioadesivos contendo o peptídeo KSL-W. 2014. 104f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, UNESP, 2014. BISOYI, H. K.; KUMAR, S. Liquid-crystal nanoscience: an emerging avenue of soft self-assembly. Chem. Soc. Rev., v. 40, p. 306–319, 2011. BLANKENSHIP, J. R.; MITCHELL, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr. Opin. Microbiol., v. 9, n. 6, p. 588-594, 2006. BONEV, B.; HOOPER, J.; PARISOT, J. Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method. J. Antimicrob. Chemother., v. 61, n. 6, p. 1295-1301, 2008. BONEV, B; HOOPER, J.; PARISOT, J. Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method. J. Antimicrob. Chemother., v. 61, p. 1295–1301, 2008. BONHOMME, J.; D'ENFERT, C. Candida albicans biofilms: building a heterogeneous, drug-tolerant environment. Curr. Opin. Microbiol., v. 16, n. 4, p. 398-403, 2013. BONIFÁCIO, B. V.; SILVA, P. B.; RAMOS, M. A. S.; NEGRI, K. M. S.; BAUAB, T. M.; CHORILLI, M. Nanotechnology-based drug delivery systems and herbal medicines: a review. Int. J. Nanomedicine., v. 9, p. 1-15, 2014. BROCKLEHURSTL, P.; GORSON, A.; HEATLEY, E.; MILAN, S. J. Antibiotics for treating bacterial vaginosis in pregnancy, Wiley. p. 1-3, 2013. BROWN, D. G.; LISTER, T.; MAY-DRACKA, T. L. New natural products as new leads for antibacterial drug discovery. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 24, p. 413–418, 2014. BRUSCHI, M.L. et al. Precursor system of liquid crystalline phase containing propolis microparticles for the treatment of periodontal disease: development and characterization. Drug. Dev. Ind. Pharm., v. 34, n. 3, p. 267-278, 2007. BRUXEL, F.; WILD, L. B.; FRAGA, M.; KOESTER, L. S.; TEIXEIRA, H. F. Nanoemulsões como sistemas de liberação parenteral de fármacos. Quim. Nova., v. 35, n. 9, p. 1827-1840, 2012. CALABRESE, E. C.; CASTELLANO, S.; SANTORIELLO, M.; SGHERRI, C.; QUARTACCI, M. F.; CALUCCI, L.; WARRILOW, A. G.; LAMB, D. C.; KELLY, S. L.; MILITE, C.; GRANATA, I.; SBARDELLA, G.; STEFANCICH, G.; MARESCA, B.; PORTA, A. Antifungal activity of azole compounds CPA18 and CPA109 against azole-susceptible and -resistant strains of Candida albicans. J. Antimicrob. Chemother., v. 68, p. 1111-1119, 2013.


__________________________________________________


CALIXTO, G.M.F. Desenvolvimento e caracterização de sistemas nanoestruturados bioadesivos contendo peptídeo análogo a adesina do Streptococcus mutans. 2013. 108f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, UNESP, 2013. CAMARGO, A. C. C.; MURTA, E. F. C.; MICHELIN, M. A.; PAULINELLI, R. R.; REIS, C. Avaliação de citocinas em Ssecreção endocervical de mulheres com candidíase, tricomoníase ou vaginite bacteriana, Rev. Pat. Trop., v. 40, p. 125-136 2011. CANCINO, J.; MARANGONI, V. S.; ZUCOLOTTO, V. Nanotecnologia em medicina: aspectos fundamentais e principais preocupações. Quim. Nova, v. 37, n. 3, p. 521-526, 2014. CANDIRACCI, M.; CITTERIO, B.; PIATTI, E. Antifungal activity of the honey flavonoid extract against Candida albicans. Food. Chem., v. 131, p. 493-499, 2012. CARDOSO, C. A. L.; ZANUTTO, F. V.; VARANDA, E. A.; SANO, P. T.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C. Quantification of Flavonoids, Naphthopyranones and Xanthones in Eriocaulaceae Species by LC-PDA. Am. J. Anal. Chem., v. 3, p. 138-146, 2012. CARRARA, M. A.; DONATTI, L.; DAMKER, E.; SVIDIZINSKI, T. I. E.; CONSOLARO, M. E. L.; BATISTA, M. R. A new model of vaginal infection by Candida albicans in rats. Mycopathologia, v. 170, n. 5, p. 331-338, Nov 2010. CARVALHO, F. C.; BRUSCHI, M. L.; EVANGELISTA, R. C.; GREMIÃO, M. P. D. Mucoadhesive drug delivery systems. Braz. J. Pharm. Sci., v. 46, n. 1, p. 1-17, 2010. CARVALHO, F. C.; CHORILLI, M.; GREMIÃO, M. P. D. Plataformas bio (muco) adesivas poliméricas baseadas em nanotecnologia para liberação controlada de fármacos - propriedades, metodologias e aplicações. Polímeros, v. 24, n. 2, p. 203-213, 2014. CASSONE, A. Vulvovaginal Candida albicans infections: pathogenesis, immunity and vaccine prospects. BJOG., v. 2014, p. 1-10, 2014. CHAI, L. Y. A.; NETEA, M. G.; TAI, B. C.; KHIN, L. W.; VONK, A. G.; TEO, B. W. SCHLAMM, H. T.; HERBRECHT, R.; DONNELLY, J. P.; TROKE, P. F.; KULLBERG, B. An elevated pro-inflammatory cytokine response is linked to development of amphotericin B-induced nephrotoxicity. J. Antimicrob. Chemother., v. 68, p. 1655–1659, 2013. CHAMI, F.; CHAMI, N.; BENNIS, S.; TROULLAS, J.; REMMAL, J. Evaluation of carvacrol and eugenol as prophylaxis and treatment of vaginal candidiasis in an immunosuppressed rat model. J. of Antimicrob. Chemother., v. 54, p. 909–914, 2004.


__________________________________________________


CHANDLER, M. Tecnologia água-em-óleo. Cosmet. Toiletries., v. 14, n. 6, p. 46-52, 2002. CHANG, C. L. T.; LIN, Y.; BARTOLOME, A. P.; CHEN, Y. C.; CHIU, S. C.; YANG, W. C. Herbal therapies for type 2 diabetes mellitus: chemistry, biology, and potential application of selected plants and compounds. Evid. Based Complement. Alternat. Med., v. 2013, p. 1-33, 2013. CHENG, G.; YEATER, K. M.; HOYER, L. L. Cellular and molecular biology of Candida albicans estrogen response. Eukaryot. Cell., v. 5, n. 1, p. 180-191, 2006. CHEVALIER, M.; MEDIONI, E.; PRÊCHEUR, I. Inhibition of Candida albicans yeast-hyphal transition and biofilm formation by Solidago virgaurea water extracts. J. Med. Microbiol., v. 61, n. 7, p. 1016-1022, 2012. CHOMA, I. M.; GRZELAK, E. M. Bioautography detection in thin-layer chromatography. J. Chromatogr. A., v. 1218, n. 19, p. 2684-2691, 2011. CHORILLI, M. ; RIGON, R. B. ; CALIXTO, G. ; CARTEZANI, P. M. ; RIBEIRO, M. C. A. P. ; POLACOW, M. L. O. ; CERRI, P.S. ; SARMENTO, V. H. ; SCARPA, M.V. . Rheological characterization and safety evaluation of non-ionic lamellar liquid crystalline systems containing retinyl palmitate. J. Biomed. Nanotechnol. , 2013. In press. CHORILLI, M.; PRESTES, P. S.; RIGON, R. B.; LEONARDI, G. R.; CHIAVACCI, L. A.; SARMENTO, V. H. V.; OLIVEIRA, A. G.; SCARPA, M. V. C. Structural characterization and in vivo evaluation of retinyl palmitate in non-ionic lamellar liquid crystalline system. Colloids Surf. B,, v. 85, p. 182-188, 2011. CLSI. Manual Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference methods for broth dilution antifungal susceptibility tests for yeasts; approved standards, CLSI document M27-A3,Wayne, PA., 2008. CONSOLARO, M. E. L.; ALBERTONI, T. A.; YOSHIDA, C. S.; MAZUCHELI, J.; PERALTA, R. M.; SVIDZINSKI, T. I. E. Correlation of Candida species and symptoms among patients with vulvovaginal candidiasis in Maringá, Paraná, Brazil. Rev. Iberoam. Micol., v. 21, p. 202-205, 2004. CORMACK, B. P.; GHORI, N.; FALKOW, S. An adhesin of the yeast pathogen candida glabrata mediating adherence to human epithelial cells. Science, v. 285, p. 578-582, 1999. CORNELY, O. A.; AVERSA, F.; COOK, P.; JONES, B.; MICHALLET, M.; SHEA, T.; VALLEJO, C. Evaluating the role of prophylaxis in the management of invasive fungal infections in patients with hematologic malignancy. Eur. J. Haematol., v. 87, n. 4, p. 289-301, 2011.

http://lattes.cnpq.br/8959008410802156

http://lattes.cnpq.br/2008100603446246


__________________________________________________


COSTA, F. N.; TROVÓ, M.; SANO, P. T. Eriocaulaceae na Cadeia do Espinhaço: riqueza, endemismo e ameaças. Megadiversidade, v. 4, n. 1/2, p. 89, 2008. CRAGG, G. M.; GROTHAUS, P. G.; NEWMAN, D. J. Impact of natural products on developing new anti-cancer agents. Chem. Rev.,v. 109, p. 3012–3043, 2009. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Natural products: a continuing source of novel drug leads. Biochim. Biophys. Acta., v. 1830, p. 3670–3695, 2013. CUSHNIE, T. P.; LAMB, A. J. Recent advances in understanding the antibacterial properties of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents, v. 38, n. 2, p. 99-107, 2011. DAI, T.; ARCE, V. J. B.; TEGOS, G. P.; HAMBLIB, M. R. Blue dye and red light, a dynamic combination for prophylaxis and treatment of cutaneous Candida albicans infections in mice. Antimicrob. Agents Chemother., v. 55, n. 12, p. 5710-5717, 2011. DAMKE, E.; TSUZUKI, J. K.; CORTEZ, D. A. G.; FERREIRA, I. C. P.; BERTONI, T. A.; BATISTA, M. R.; DONATI, L.; SVIDZINSKI, T. I. E.; CONSOLARO, M. E.; L. In vivo activity of Sapindus saponaria against azole-susceptible and -resistant human vaginal Candida species. BMC Complement. Altern. Med., v. 11, n. 35, p. 1-9, 2011. DAS, K.; TIWARI, R. K. S.; SHRIVASTAVA, D. K. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: current methods and future trends. J. Med. Plants Res., v. 4, n. 2, p. 104-111, 2010. DELOGU, L. G. DEIDDA, S.; DELITALA, G.; MARTINETTI, R. Infectious diseases and autoimmunity. J. Infect. Dev. Ctries., v. 5, n. 10, p. 679-687, 2011. DENNING, D. W.; HOPE, W. W. Therapy for fungal diseases: opportunities and priorities. Trends Microbiol., v. 18, n. 5, p. 195-204, 2010. DEORUKHKAR, S.; SAINI, S. Non albicans Candida species: its isolation pattern, species distribution, virulence factors and antifungal susceptibility profile. Int. J. Public. Health, v. 2, p. 533-538, 2013. DONNELLY, R. F.; McCARRON, P. A.; TUNNEY, M. M.; WOOLFSON, D. Potential of photodynamic therapy in treatment of fungal infections of the mouth. Design and characterisation of a mucoadhesive patch containing toluidine blue O. J Photochem. Photobiol. B., v. 86, n. 1, p. 59-69, 2007. DUARTE, M. C. T.; FIGUEIRA, G. M.; SARTORATTO, A.; REHDER, V. L. G.; DELARMELINA, C. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. J. Ethnopharmacol., v. 97, n. 2, p. 305-311, 2005. EICHEMBERG, M. T.; SCATENA, V. L. Handicrafts from Jalapão (TO), Brazil, and their relationship to plant anatomy. J. Torrey Bot. Soc., v. 138, n.1, p. 34-40, 2011.


__________________________________________________


ELSAESSER, A.; TAYLOR, A.; YANÉS, G. S.; McKERR, G.; KIM, E.; O’HARE, E.; HOWARD, C. V. Quantification of nanoparticle uptake by cells using microscopical and analytical techniques. Nanomedicine , v. 5, n. 9, p. 1447-1457, 2010. ENDO, E. H.; CORTEZ, D. A. G.; NAKAMURA, T. U.; NAKAMURA, C. V.; DIAS FILHO, B. P. Potent antifungal activity of extracts and pure compound isolated frompomegranate peels and synergism with fluconazole against Candidaalbicans. Res. Microbiol., v. 161, p. 534-540, 2010. FANNING, S.; MITCHELL, A. P. Fungal biofilms. PLoS Pathog., v. 8, n. 4, p. 1-4, 2012. FARMACOPEIA BRASILEIRA. 5. ed. Brasília: Fiocruz, 2010, p. 236-253. FERREIRA, T. S.; MOREIRA, C. Z.; CÁRIA, N. Z.; VICTORIANO, G.; SILVA JÚNIOR, W. F.; MAGALHÃES, J. C. Phytotherapy: an introduction to its history, use and application. Rev. Bras. Pl. Med., v.16, n.2, p. 290-298, 2014. FICHINO, B.; FIDELIS, A.; SCHMIDT, I.; PIVELLO, V. Efeitos de altas temperaturas na germinação de sementes de capim-dourado (Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland, (Eriocaulaceae): implicações para o manejo. Acta Bot. Bras., v.26 n.2, p. 508-511, 2012. FORASTIERO, A.; ARANGO, A. C. M.; IZQUIERDO, A. A.; FUOLI, L. A.; MARTINEZ, L. B.; PALAEZ, T.; LOPEZ, J. F.; GRIMALT, J. O.; LOPEZ, A. G.; CUESTA, I.; ZARAGOZA, O.; MELLADO, E. Candida tropicalis antifungal cross-resistance is related to different azole target (Erg11p) modifications. Antimicrob. Agents. Chemother., v. 57, n. 10, p. 4769-4781, 2013. FORMARIZ, T. P.; URBAN, M. C. C.; SILVA JÚNIOR, A. A.; GREMIÃO, M. P. D.; OLIVEIRA, A. G. Microemulsões e fases líquidas cristalinas como sistemas de liberação de fármacos, Rev. Bras. Cienc. Farm., v. 41, p. 302-313, 2005. GABBOUN, N.H.; NAJIB, N. M.; IBRAHIM, H. G.; ASSAF, S. Release of salicylic acid and diclofenac acid salts from isotropic and anisotropic non ionic surfactant systems across rat skin. Int. J. Pharm., v. 212, p. 73-80, 2001. GABRIELSON, J.; HART, M.; JARELÖV, A.; KUHN, I.; MCKENZIE, D.; MÖLLBY, R. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. J. Microbiol. Methods, v. 50, p. 63-73, 2002. GABRIELSON, J.; HART, M.; JARELÖV, A.; KUHN, I.; MCKENZIE, D.; MÖLLBY, R. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. J. Microbiol. Methods, v. 50, p. 63-73, 2002.


__________________________________________________


GALLO, M. F. ; MACALUSO, M.; WARNER, L.; FLEENOR, M. E.; HOOK, E. W.; BRILL, I.; WEAVER, M. A. Bacterial vaginosis, gonorrhea, and Chlamydial infection among women attending a sexually transmitted disease clinic: a longitudinal analysis of possible causal links, AEP., v. 22, p. 213-220, 2012. GARCIA, A. A.; CARRIL, E. P. Metabolismo secundário de plantas. RE, v. 2, n. 3, p. 119-145, 2009. GAZETA JÚNIOR, A.; GRIGOLETO, A. R. L.; FREGONEZI, P. A. G. Candidíase Vaginal: uma questão de educação em saúde. Braz. J. Health., v. 2, p. 89-96, 2011. GHOSH, V.; SARANYA, S.; MUKHERJEE, A.; CHANDRASEKARAN, N. Antibacterial microemulsion prevents sepsis and triggers healing of wound in wistar rats. Colloids Surf. B: Biointerfaces, v. 105, p. 152-157, 2013. GIULIETTI, A. M.; HENSOLD, N.; PARRA, L. R.; ANDRADE, M. J. G.; VAN DEN BERG, C.; HARLEY, R. M. The synonymization of Philodice with Syngonanthus (Eriocaulaceae). Phytotaxa, v. 60, p. 50-56, 2012. GOLDANI, L. Z.; SANTOS, R. P. Candida tropicalis as an emerging pathogen in Candida meningitis: case report and review. Braz. J. Infect. Dis., v. 14, n. 6, p. 631-633, 2010. GRAY, K. C.; PALACIOS, D. S.; DAILEY, I.; ENDO, M. M.; UNO, B. E.; WILCOOK, B. C.; BURKE, M. Amphotericin primarily kills yeast by simply binding ergosterol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S .A., v. 109, n. 7, p. 2234-2239, 2012. GÜZEL, A. B.; AYDIN, M.; MERAL, M.; KAIKANCI, A.; IIKIT, M. Clinical characteristics of Turkish women with Candida krusei vaginitis and antifungal susceptibility of the C. krusei isolates. Infect. Dis. Obstet. Gynecol., v. 2013, p. 1-8, 2013. GYAWALI, R.; IBRAHIM, S. A. Natural products as antimicrobial agentes.Food Control, v. 46, p. 412-429, 2014. HAYEK, S. A.; GYAWALI, R.; IBRAHIM, S. A. Antimicrobial Natural Products. FORMATEX, v. 1, p. 910-921, 2013. HEGAZY, S. K.; MOBROUK, M. M.; ELISISI, A. E.; MANSOUR, N. O. Effect of clarithromycin and fluconazole on the pharmacokinetics of montelukast in human volunteers. Eur. J. Clin. Pharmacol., v. 68, n. 9, p. 1275-1280, 2012. HEGMANN, T.; QI, H.; MARX, V. M. Nanoparticles in liquid crystals: synthesis, self-assembly, defect formation and potential applications. J.Inorg.Organomet., v. 17, p. 483-508, 2007.


__________________________________________________


HERWALD, S. E.; KUMAMOTO, C. A. Candida albicans niche specialization: features that distinguish biofilm cells from commensal cells. Curr. Fungal. Infect. Rep., v. 8, n. 2, p. 179-184, 2014. HETTIARACHCHI, N.; ASHBEE, H. R.; WILSON, J. D. Prevalence and management of non-albicans vaginal candidiasis. Sex. Transm. Infect., v. 86, n. 2, p. 99-100, 2010. HIRD, M. Fluorinated liquid crystals – properties and applications. Chem. Soc. Rev., v. 36, p. 2070-2095, 2007. HOHL, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J. Immunol. Methods., v. 410C, p. 100-112, 2014. HOLLAND, L. M.; SCHRODER, M. S.; TURNER, S. A.; TAFF, H.; ANDES, D.; GRÓZER, Z.; GÁCSER, A.; AMES, L., HAYNES, HIGGINS, D. G.; BUTLER. Comparative phenotypic analysis of the major fungal pathogens Candida parapsilosis and Candida albicans. PLoS Pathog., v. 10, n. 9, p. 1-18, 2014. HUYAN, X. H.; LIN, Y.; CHEN, T. G. R.; FAN, Y. Immunosuppressive effect of cyclophosphamide on white blood cells and lymphocyte subpopulations from peripheral blood of Balb/c mice. Int. Immunopharmacol., v. 11, n. 9, p. 1293-1297, 2011.

JIANG, C.; DONG, D.; YU, B.; CAI, G.; WANG, X.; JI, Y.; PENG, Y. Mechanisms of azole resistance in 52 clinical isolates of Candida tropicalis in China. J. Antimicrob. Chemother., v. 68, p. 778–785, 2013. JUNEJA, V. K.; DWIVEDI, H. P.; YAN, X. Novel natural food antimicrobials. Annu. Rev. Food Sci. Technol., v. 3, p. 381–403, 2012. KAOMONGKOLGIT, R.; JAMDEE, K.; CHAISOMBOON, N. Antifungal activity of alpha-mangostin against Candida albicans. J. Oral. Sci., v. 51, n. 3, p. 401-406, 2009. KATHIRAVAN, M. K.; SALAKE, A. B.; CHOTHE, A. S.; DUDHE, P. B.; WATODE, R. P.; MUKTA, M. S.; GADHWE, S. The biology and chemistry of antifungal agents: a review. Bioorg. Med. Chem., v. 20, n. 19, p. 5678-5698, 2012. KEPP, O.; GALLUZZI, L.; LIPINSKI, M.; YUAN, J.; KROEMER, G. Cell death assays for drug discovery. Nat. Rev. Drug. Discov., v. 10, n. 3, p. 221-237, 2011. KESARWANI, K.; GUPTA,R. Bioavailability enhancers of herbal origin: an overview. Asian Pac. J. Trop. Biomed., v. 3, n.4, p. 253-266, 2013. KHAN, M. S.; AHMAD, I. Biofilm inhibition by Cymbopogon citratus and Syzygium aromaticum essential oils in the strains of Candida albicans. J. Ethnopharmacol., v. 140, n. 2, p. 416-423, 2012.


__________________________________________________


KHUTORYANSKIY, V. V. Advances in mucoadhesion and mucoadhesive polymers. Macromol. Biosci., v. 11, n. 6, p. 748-764, 2011. KIM, J.; SUDBERY, P. Candida albicans, a major human fungal pathogen. J. Microbiol., v. 49, n. 2, p. 171-177, 2011. KLEIN, J. B. Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)-ona. 2012. 121 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas), Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2012. KLEPSER, M. The value of amphotericin B in the treatment of invasive fungal infections. J. Crit. Care, v. 26, n. 2, p. 225-235, 2011. KOTHAVADE, R. J.; KURA, M. M.; VALAND, A. G.; PANTHAKI, M. H. Candida tropicalis: its prevalence, pathogenicity and increasing resistance to fluconazole. J. Med. Microbiol., v. 59, n. Pt 8, p. 873-880, 2010. KRAINEVA, J.; NARAYANAN, R. A.; KONCRASHKINA, E.; THIYAGARAJAN, P.; WINTER, R. Kinetics of lamellar to cubic and intercubic phases transitions of pure and cytochrome C containing mono olein dispersions monitored by time-resolved small-angle x-ray diffraction, Langmuir, v. 21, p. 3559-3571, 2005. LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINS-VACCARI, E. C.; MELO, N. T.. Tratado de micologia médica. 9ª ed. São Paulo: Sarvier; 2002. 1120 p. LAFFEY, S. F.; BUTLER, G. Phenotype switching affects biofilm formation by Candida parapsilosis. Microbiology, v. 151, n. 4, p. 1073-1081, 2005. LAGES, C. A. S.; SILVA, J. N.; SILVA FILHO, E. C.; NUNES, L. C. C.; SILVA, B. B. Polímeros mucoadesivos para uso vaginal: uma prospecção tecnológica. Geintec,v. 4, n.1, p.622-631, 2014. LAHOUD, M.H.; CAMPOS, R. Aspectos teóricos relacionados à reologia farmacêutica. Visão Acadêmica, v.11, n.1, p. 65-73, 2010. LEE, C. H.; MOTURI, V.; LEE, Y. Thixotropic property in pharmaceutical formulations. J. Control. Release, v. 136, n. 2, p. 88-98, 2009. LI, H.; ZHANG, C.; CHEN, Z.; SHI, W.; SUN, S. A promising approach of overcoming the intrinsic resistance of Candida krusei to fluconazole (FLC)--combining tacrolimus with FLC. FEMS Yeast Res., v. 14, n. 5, p. 808-811, 2014. LIMA, J. F.; SILVA, M. P. L.; TELES, S.; SILVA, F.; MARTINS, G. N. Avaliação de diferentes substratos na qualidade fisiológica de sementes de melão de caroá [Sicana odorifera (Vell.) Naudim]. Rev. Bras. Pl. Med., v.12, n.2, p.163-167, 2010.


__________________________________________________


LIN, G.; EDNIE, L. M.; APPELBAUM, P. C. Antistaphylococcal activities of telavancin tested alone and in combination by time-kill assay. Antimicrob. Agents Chemother., v. 54, n. 5, p. 2201-2205, 2010. LINHARES, I. M.; GIRALDO, P. C.; CAETANO M. E.; NISSA, M. D.; GONÇALVES, A. K.; GIRALDO, H. P. D. Candidíase vulvovaginal recorrente: fisiopatogênese, diagnóstico e tratamento, Rev. Ciênc. Med. v. 14, p. 373-378, 2005. LIU, Z.; XU, Z.; HU, X.; GAO, C. Lyotropic liquid crystal of polyacrylonitrile-grafted graphene oxide and its assembled continuous strong nacre-mimetic fibers. Macromolecules, v. 46, p. 6931-6941, 2013. LOPES, R. G. clonagem, expressão heteróloga e obtenção de mutantes da trealase ácida de Candida glabrata. 2010. 87f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia), Universidade Estadual de Santa Catarina, Florianópolis, 2010. MANAIA, E. B.; KAMINSKI, R. C. K.; SOARES, C. P.; MENEU, F.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; CHIAVACCI, L. A. Liquid crystalline formulations containing modified surface TiO2 nanoparticles obtained by sol–gel process. J. Sol-Gel. Sci. Technol., v. 63, p. 251–257, 2012. MARCONDES, F. K.; BIANCHI, F. J.; TANNO, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Braz. J. Biol., v. 62, n. 4A, p. 609-614, 2002. MASSON, D.S.; MORAIS, G.G.; MORAIS, J.M.; ANDRADE, F.F.; SANTOS O.D.H.; OLIVEIRA, W.P.; ROCHA-FILHO, P.A. Polyhydroxyalcohols and peach oil addition influence on liquid crystal formation and rheological behavior of o/w emmulsions. J. Dispersion Sci. Technol., v. 26, p. 463-468, 2005. MATEESCU, I.; PAUN, L.; POPESCU, S.; ROATA, G.; SIDOROFF, M. Medicinal and aromatic plants - a statistical study on the role of phytotherapy in human health. Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, v. 71, n. 1, p. 14-19, 2014. MAYER, F. L.; WILSON, D.; HUBE, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence, v. 4, n. 2, p. 119-128, 2013. MENDES, D. B.; LEMES, L. S.; CRUZ, R. C. S.; MORAES FILHO, A. V.; CASTRO, M. L. L.; CARNEIRO, L. C. Teor de ácido óleico nos óleos de girassol, milho e soja. Revista de Trabalhos Acadêmicos, v. 3, n. 6, p. 19-25, 2012. MENEZES, E. A.; MENDES, L. G.; CUNHA, F. A. Antifungal resistance of Candida tropicalis isolated in the State of Ceará. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 42, n. 3, p. 354-365, 2009. MINISTÉRIO DA SAÚDE. A Fitoterapia no SUS e o Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos. 1.ed. Brasília: MS, 2006. 148p.


__________________________________________________


MOLERO, G.; DÍEZ-OREJAS, R.; NAVARRO-GARCIA, MONTEOLIVA, L.; PLA, J.; GIL, C.; SÁNCHEZ-PÉREZ, M.; NOMBELA, C. Candida albicans: genetics, dimorphism and pathogenicity. Int. Microbiol., v. 1, n. 2, p. 95-106, 1998. MONTERO, J. G.; MARTÍN, A. D.; CABRERA, E. G.; PIPAÓN, M. R. P.; CABALLERO, C. H.; MARTÍN, J. A.; CISNEROS, J. M.; LEYBA, C. O. Risk factors for fluconazole-resistant candidemia. Antimicrob. Agents Chemother., v. 54, n. 8, p. 3149–3154, 2010. MORALES, G. I.; YANETH, M. C. Candidiasis en mujeres en edad reproductiva que asistieron al hospital Eduardo Arredondo Daza en la ciudad de Valledupar, RCMT., v. 22, p. 13-21, 2012. MOSCI, P.; PIETRELLA, D.; RICCI, G.; PANDEY, N.; MONARI, C.; PERICOLINI, E.; GABRILLI, E.; PERITO, S.; BISTONI, F.; VECCHIARELLI, A. Mouse strain-dependent differences in estrogen sensitivity during vaginal candidiasis. Mycopathologia, v. 175, n. 2, p. 1-11, 2013. MOULARI, B.; LBOUTOUNNE, H.; CHAUMONT, J.; GUILLAUME, Y.; MILLET, J.; PELLEQUER, Y. Potentiation of the bactericidal activity of Harungana madagascariensis Lam. ex Poir. (Hypericaceae) leaf extract against oral bacteria using poly (D, L-lactide-co-glycolide) nanoparticles: in vitro study. Acta. Odontol. Scand., v. 64, n. 3, p. 153-158, 2006. NAGLIK, J. R.; FIDEL, P. L.; ODDS, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiol. Lett., v. 283, n. 2, p. 129-139, 2008. NARAYANA, R. C.; HARISH, N. M.; MOHAMMED, G. A.; PRABHAKARA, P.; SINGH, A. K.; SUBRAHMANYAAM, E. V. S. Formulation and in vitro evaluation of in situ gels containing secnidazole for vaginitis. Yakugaku. Zasshi., v. 129, n. 5, p. 569-574, 2009. NIGGEMANN, B.; GRUBER, C. Side-effects of complementary and alternative medicine. Allergy, v. 58, p. 707–716, 2003. NOBILE, C. J.; FOX, E. P.; NETT, J. E.; SORRELLS, T. R.; MITROVICH, Q. M.; HERNDAY, A. D.; TUCH, B. B.; ANDES, D. R.; JOHNSON, A. D. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell., v. 148, n. 1-2, p. 126-138, 2012. NÓBREGA, H. N.; FERREIRA, J. A. B.; ROMÃO, C. M. C. P. A.; CAPASSO, I. R. V. F. Atividade antimicrobiana in vitro de produtos antissépticos por meio de técnica time kill. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 72, n. 3, p. 226-233, 2013 NOGUEIRA, L. G. Avaliação do potencial antimicrobiano de Pouteria spp. e de triterpenos quinonametídeos com enfoque no Helicobacter pylori. 2012. 107 f.


__________________________________________________


Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, 2012. NYIRJESY, P. Vulvovaginal candidiasis and bacterial vaginosis. Infect. Dis. Clin. N. Am., v. 22, p. 637–652, 2008. O'BRIEN, J.; WILSON, I.; ORTON, T.; POGNAN, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur. J. Biochem., v. 267, n. 17, p. 5421-5426, 2000. OLIVEIRA, A. P. S.; SOUSA, J. F.; SILVA, M. A. S.; HILARIO, F.; RESENDE, F. A.; CAMARGO, M. S.; VILEGAS, W.; SANTOS, L. C.; VARANDA, E. A. Strogenic and chemopreventive activities of xanthones and flavones of Syngonanthus (Eriocaulaceae). Steroids, v. 78, p. 1053–1063, 2013. OLIVEIRA, P. G.; GARCIA, Q. S. Germination characteristics of Syngonanthus seeds (Eriocaulaceae) in campos rupestres vegetation in south-eastern Brazil. Seed. Sci. Res., v. 21, p. 39-45, 2011. ORHAN, D. D.; OZEÇELIK, B.; OZGEN, S.; ERGUN, F. Antibacterial, antifungal, and antiviral activities of some flavonoids. Microbiol. Res., v. 165, n. 6, p. 496-504, 2010. OWEN DH, KATZ D. A vaginal fluid simulant. Contraception, v. 59, p. 91-95, 2000. OZ, H. S.; PULEO, D. A. Animal models for periodontal disease. J. Biomed. Biotechnol., v. 2011, p. 754-857, 2011. PACÍFICO, M. ; NAPOLITANO, A.; MASULLO, M.; HILARIO, F.; VILEGAS, W.; PIACENTE, S.; SANTOS, L. C. Metebolite fingerprint of “capim dourado” (Syngonanthus nitens), a basis of Brazilian handcrafts. Ind. Crop. Prod., v. 33, p. 488-496, 2011. PAMMI, M.; HOLLAND, L., BUTLER, G.; GACSER, A.; BLISS, J. M. Candida parapsilosis is a significant neonatal pathogen: a systematic review and meta-analysis. Pediatr. Infect. Dis. J., v. 32, n. 5, p. 206-216, 2013. PANNANUSORN, S.; FERNANDEZ, V.; RÖMLING, U. Prevalence of biofilm formation in clinical isolates of Candida species causing bloodstream infection. Mycoses, v. 56, n. 3, p. 264-272, 2013. PETROS, R. A.; DESIMONE, J. M. Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications. Nat. Ver. Drug Discov., v. 9, n. 8, p. 615-627, 2010. PFALLER, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am. J. Med., v.125, n. 1A, p. 1-13, 2012.


__________________________________________________


PFALLER, M. A.; DIEKEMA, D. J.; GIBBIS, D. L.; NEWELL, V. A.; NAGY, E.; DOBIASOVA, S.; RINALDI, M.; BARTON, R.; VESELOV, A. Candida krusei, a multidrug-resistant opportunistic fungal pathogen: geographic and temporal trends from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program, 2001 to 2005. J. Clin. Microbiol., v. 46, n. 2, p. 515-521, 2008. PITANGUI, N. S.; SARDI, J. C. O.; SILVA, J. F.; BENADUCCI, T.; SILVA, R. A. M.; TAYLOR, G. B. M.; GIANNINI, J. S. M.; FUSCO-ALMEIDA, A. M.. Adhesion of Histoplasma capsulatum to pneumocytes and biofilm formation on an abiotic surface. Biofouling. v. 28, p. 711-718, 2012. POWELL, A.M.; NYIRJESY, P. Recurrent vulvovaginitis.Best. Pract. Res. Cl. Ob., 2014. In press. PRAÇA, F. S. G. ; MEDINA, W. S. G. ; PETRILLI, R.; BENTLEY, M. V. L. B. Liquid crystal nanodispersions enable the cutaneous delivery of photosensitizer for topical PDT: fluorescence microscopy study of skin penetration, Current Nanosci., v. 8, p. 535-540, 2012. QUINTIN, J.; ASMAR, J.; MATSKEVICH, A. A.; LAFARGE, M. C.; FERRANDON, D. The Drosophila Toll pathway controls but does not clear Candida glabrata infections. J. Immunol., v. 190, n. 6, p. 2818-2827, 2013. RAJENDRAN, R.; RADHAI, R.; KOTRESH, T. M.; CSISZAR, E. Development of antimicrobial cotton fabrics using herb loaded nanoparticles. Carbohydr. Polym., v. 91, n. 2, p. 613-617, 2013. RAMOS, C. O. C.; BORBA, F. L.; FUNCH, L. S. Pollination in Brazilian Syngonanthus (Eriocaulaceae) Species: evidence for entomophyly instead of anemophily. Annals of Botany , v. 96, p. 387-397, 2005. REPENTIGNY, L. Animal models in the analysis of Candida host–pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol., v. 7, p. 324-329, 2004. RIBAS, R. K. C. Produção e caracterização de uma lípase alcalina secretada por um isolado de Candida parapsilosis. 2012. 93 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2012. RICCI, C. V.; PATRÍCIO, M. B. C.; SALATINO, A.; GIULIETTI, A. M. Flavonoids of Syngonanthus Ruhl. (Eriocaulaceae): Taxonomic implications. Biochem. Syst. Ecol., v. 24, p. 577-583, 1996. RIDDELL, J.; COMER, G. M.; KAUFFMAN, C. A. Treatment of endogenous fungal endophthalmitis: focus on new antifungal agents. Clin. Infect. Dis., v. 52, n. 5, p. 648-653, 2011. ROMANI, L. Immunity to fungal infections. Nat. Rev. Immunol., v. 11, n. 4, p. 275-288, 2011.


__________________________________________________


ROWAT, A. C.; KITSON, N.; THEWALT, J. L. Interactions of oleic acid and model stratum corneum membranes as seen by 2H NMR. Int J Pharm, v. 307, n. 2, p. 225-31, 2006. SALEEM, M.; NAZIR, M.; ALI, M. S.; HUSSAIN, H.; LEE, Y. S.; RIAZ, N., JABBAR, A. Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates. Nat. Prod. Rep.,v. 27, p. 238–254, 2010. SAMPAIO, M. B.; SCHMIDT, I. B.; FIGUEIREDO, I. B.; SANO, P. T. Boas práticas de manejo para o extrativismo sustentável do capim dourado e buriti. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2010. 72 p. SANTOS, O. D. H.; MORAIS, J. M.; ANDRADE, F. F.; AGUIAR, T. A. , ROCHA-FILHO, P. A. Development of vegetable oil emulsions with lamellar liquid-crystalline structures. J. Disper. Sci. Technol., v. 32, p. 433-438, 2011. SARDI, J. C. O, SCORZONI, L.; BERNARDI, T.; FUSCO-ALMEIDA A. M.; GIANNINI, M. J. S. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Int. J. Med. Microbiol., v. 62, p. 10-24, 2013. SASIDHARAN, S.; CHEN, Y.; SARAVANAN, D.; SUNDRAM, K. M.; LATHA, L. Y. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med., v. 8, n. 1, p. 1-10, 2011. SAVIC, S.; LUKIC, M.; JAKSIC, I.; REICHL, S.; TAMBURIC, S.; GOYMANN, C.M. An alkyl polyglucoside-mixed emulsifier as stabilizer of emulsion systems: The influence of colloidal structure on emulsions skin hydration potential. J. Colloid Interface Sci., v. 358, n. 1, p. 182-191, 2011. SAVOIA, D. Plant-derived antimicrobial compounds: alternatives to antibiotics. Future Microbiol., v. 7, n. 8, p. 979-990, 2012. SCHMIDT, I. B.; FIGUEIREDO, I. B.; BORGHETTI, F.; SCARIOT, A. Produção e germinação de sementes de “capim dourado”, Syngonanthus nitens (Bong.) Ruhland (Eriocaulaceae): implicações para o manejo. Acta Bot. Bras., v. 22, p. 37-42, 2007. SCHUSTER, M. G.; MEIBOHM, A.; LIOYD, L. STROM, B. Risk factors and outcomes of Candida krusei bloodstream infection: a matched, case-control study. J. Infect., v. 66, n. 3, p. 278-284, 2013. SCIENCE PHOTO LIBRARY. Candida albicans. Disponível em: <http://www.sciencephoto.com/media/13711/view>. Acesso em: 24. Set. 2014a.

SCIENCE PHOTO LIBRARY. Candida parapsilosis. Disponível em: < http://www.sciencephoto.com/media/13695/view> . Acesso em: 26. Set. 2014b.


__________________________________________________


SEVKO, A.; FELDMAN, M. S.; KANTERMAN, J.; MICHELS, T.; FALK, C. S.; UMANSKY, L.; RAMACHER, M.; KATO, M.; SCHADENDORF, D.; BANIYASH, M.; UMANSKY, V. Cyclophosphamide promotes chronic inflammation-dependent immunosuppression and prevents antitumor response in melanoma. J. Invest. Dermatol.,v. 133, n. 6, p. 1610-1619, 2013. SHAIKH, R.; RAGHU, T; SINGH, R.; GARLAND, M. J.; WOOLFSON, A. D.; DONELLY, R. F. Mucoadhesive drug delivery systems. J Pharm Bioallied Sci, v. 3, n. 1, p. 89-100, 2011. SIEGEL, R.; NAISHADHAM, D.A. J. Cancer Statistics. Cancer J. Clin. v. 62, p. 10-29, 2012. SILVA, P. B.; RAMOS, M. A. S.; BONIFÁCIO, B. V.; NEGRI, K. M. S.; SATO, M. R.; BAUAB, T. M.; CHORILLI, M. Nanotechnological strategies for vaginal administration of drugs –a review. J. Biomed. Nanotechnol., v. 10, p. 2218-2243, 2014. SILVA, S.; NEGRI, M.; HENRIQUES, M.; OLIVEIRA, R.; WILLIAMS, D. W.; AZEREDO, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev., v. 36, p. 288–305, 2012. SIMÕES, C. M. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6ª. ed.; UFRGS: Porto Alegre, 2007. SINGARAVELUA, K.; GÁCSER, A.; NOSANCHUKA, J. D. Genetic determinants of virulence – Candida parapsilosis. Rev. Iberoam. Micol., v. 31, n. 1, p. 16-21, 2014. SINGH, R.; TIWARI, S.; TAWANIYA, J. review on nanotechnology with several aspects. IJRCEE., v. 2, p.1-8, 2013. SINGH, R.; TIWARI, S.; TAWANIYA, J. REVIEW ON nANOTECHNOLOGY WITH several aspects. IJRCEE., v. 2, n. 3, p. 1-8, 2013. SOBEL, D. J. Vulvovaginal candidiasis.The Lancet. v. 369, n. 9, p. 1961-1971, 2007. SOBEL, J. D. Genital candidiasis. Medicine, v. 38, n. 6, p. 286-290, 2010.

STEVENSON, C. L.; BENNETT, D. B.; LECHUGA-BALLESTEROS, D. Pharmaceutical liquid crystals: the relevance of partially ordered systems. J. Pharm. Sci. v. 94, p. 1861-1880, 2005. TAHAR-DJEBBAR, I.; NEKELSON, F.; HEINRICH, B.; DONNIO, B.; GUILLON, D.; KREHER, D.; MATHEVET, F.; ATTIAS, A. J. Lamello-columnar mesophase formation in a side-chain liquid crystal π-conjugated polymer architecture. Chem. Mater., v. 23, p. 4653-4656, 2011.


__________________________________________________


TIYYGURA, S.; TARANIKANTI, M.; ALA, S.; MATHUR, D. R. Prevalance of vulvovaginal candidiasis in women of reproductive age group. Int. J. of Biomed. Res., v. 4, p. 42-44, 2013. TROJAN-RODRIGUES, M.; ALVES, T. L. S.; SOARES, G. L. G.; RITTER, M. R. Plants used as antidiabetics in popular medicine in Rio Grande do Sul, Southern Brazil. J. Ethnopharmacol.v. 139, p. 155-163, 2012. TSANG, P. W.; BANDARA, H. M.; FONG, W. P. Purpurin suppresses Candida albicans biofilm formation and hyphal development. PLoS One, v. 7, n. 11, p. 1-8, 2012. TUĞCU-DEMIRÖZ, F.; ACARTÜRK, F.; ERDOĞAN, D. Development of long-acting bioadhesive vaginal gels of oxybutynin: formulation, in vitro and in vivo evaluations.Int. J. Pharm., v. 457, n. 1, p. 25-39, 2013. TYAGI, A. K.; MALIK, A. Liquid and vapour-phase antifungal activities of selected essential oils against Candida albicans: microscopic observations and chemical characterization of Cymbopogon citratus. BMC Complement. Altern. Med., v. 10, p. 1-11, 2010. VEDIYAPPAN, G.; DUMONTET, V.; PELISSIER, F.; D’ENFERT, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One, v. 8, n. 9, p. 1-11, 2013. VIEIRA, D. R. P.; AMARAL, F. M. M.; MACIEL, M. C. G.; NASCIMENTO, F. F. R. F.; LIBÉRIO, A. S. Plantas e constituintes químicos empregados em Odontologia: revisão de estudos etnofarmacológicos e de avaliação da atividade antimicrobiana in vitro em patógenos orais. Rev. Bras. Pl. Med., v.16, n.1, p.135-167, 2014. VYLKOVA, S.; LORENZ, M. C. Modulation of phagosomal pH by Candida albicans promotes hyphal morphogenesis and requires Stp2p, a regulator of amino acid transport. PLoS Pathog., v. 10, n. 3, p. 1-13, 2014. WANG, Z.; ZHOU, W. Lamellar liquid crystals of brij 97 aqueous solutions containing different additives. J. Solution Chem., v. 38, p. 659–668, 2009. WEBSTER, D.; TASCHEREAU, P.; BELLAND, R.J.; SAND, C.; RENNIE, R.P. Antifungal activity of medicinal plant extracts; preliminary screening studies. J. Ethnopharmacol., v. 115, n. 1, p. 140-146, 2008. WEI, G. X.; Xu, X.; Wu, C. D. In vitro synergism between berberine and miconazole against planktonic and biofilm Candida cultures. Arch. Oral Biol., v. 56, p. 565-572, 2011.

WILLIAMS, A. C.; BARRY, B. W. Penetration enhancers. Adv. Drug. Deliv. Rev., v. 56, n. 5, p. 603-618, 2004.


__________________________________________________


WÓJCIK, R.; SWIECICKA-GRABOWSKA, G. Reactivity of the immunological system of turkeys vaccinated with the Newcastle virus after intoxication with carbaryl. Pol. J. Vet. Sci., v. 7, n. 1, p. 9-13, 2004. WORKOWSKI, K. A.; BERMAN, S. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, MMWR. v. 59, p. 1-116, 2010. XUE, J., DAVIDSON, P. M., & ZHONG, Q. Thymol nanoemulsified by whey protein-maltodextrin conjugates: the enhanced emulsifying capacity and antilisterial properties in milk by propylene glycol. J. Agric. Food Chem., v. 61, p. 12720-12726, 2013. YADAV, P.; KUMAR, A.; MAHOUR, K.; VIHAN, V.S. Phytochemical analysis of some indigenous plants potent against endoparasites. J. Adv. Lab. Res. Biol., v. 1,p. 72-77, 2010. YARIV, D.; EFRAT, R.; LIBSTER, D.; ASERIN, A.; GARTI, N. In vitro permeation of diclofenac salts from lyotropic liquid crystalline systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 78, p. 185-192, 2010. ZANUTTO, F. A. Estudo químico e atividades mutagênica e antiradicalar de Paepalanthus chiquitensis Herzog (ERIOCAULACEAE). 2013. 175f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Araraquara, 2013. ZENG, H.; TIAN, J.; ZHENG, Y.; BAN, X.; ZENG, J.; MAO, Y.; WANG, Y. In vitro and In vivo activities of essential oil from the seed of anethum graveolens L. against Candida spp. Evid- Based. Compl. Alter. Med., v. 2011, p. 1-9, 2011. ZIARRUSTA, G. B. Vulvovaginitis candidiásica, Rev. Iberoam. Micol., v. 19, p. 22-24, 2002. ZORE, G. B.; THAKRE, A. D.; JADHAV, J, KARUPPAYIL, S. M. Terpenoids inhibit Candida albicans growth by affecting membrane integrity and arrest of cell cycle. Phytomedicine, v. 18, p. 1181-1190, 2011.

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9. Anexos

Se você acredita que está no caminho certo, não pare. Não desista, aguente firme. Não existe cedo ou tarde, tempo certo ou tempo errado... As coisas acontecem quando tem que acontecer.

(Laura Gusmão Ferraz)

Anexos 167

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