UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ LUIZ CARLOS KLEIN … · Sendo Mãe, com letra maiúscula. A...

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE

Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):

ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL

GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO

Itajaí – 2011

A

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM

CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS

LUIZ CARLOS KLEIN JÚNIOR





Dissertação submetida ao Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade

Itajaí, Fevereiro de 2011

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K672c

Klein Júnior, Luiz Carlos, 1985- Contribuição ao estudo farmacognóstico de Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE) [manuscrito] : aspectos químicos e avaliação de seu potencial gastroprotetor e anti-hipernociceptivo / Luiz Carlos Klein Júnior. – 2011. 152 f. : il. ; 30 cm Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2011. “Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho”.

Bibliografia: f. 130-144.

1. Produtos naturais. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacognosia. 4. Química vegetal. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título. CDU: 615.32

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Luiz Carlos Klein Júnior

Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias

Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências

Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.

______________________________________________________ Valdir Cechinel Filho, Doutor

Orientador

______________________________________________________ Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora

Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

_______________________________________________________ Valdir Cechinel Filho, Doutor (UNIVALI)

Presidente

______________________________________________________________ Sérgio Faloni de Andrade, Doutor (UNIVALI)

Co-orientador

______________________________________________________________ Nara Lins Meira Quintão, Doutora (UNIVALI)

Membro interno

_____________________________________________________________ Vanderlan da Silva Bolzani, Doutora (UNESP)

Membro externo

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Itajaí, 24 de fevereiro de 2011

Dedico

esta dissertação àqueles que

sempre se dedicam a mim:

Maria Luiza e Luiz Carlos,

meus dedicados pais!!!

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AGRADECIMENTOS

Certa vez ouvi dizer que deveríamos agradecer apenas àquelas pessoas que não

são da família e que não receberam nenhuma remuneração por seu “auxílio”. As primeiras

não deveriam ser agradecidas pois não fizeram mais que sua obrigação de apoiar o

estudante, afinal são membros da família. Já os profissionais remunerados, da mesma

forma, fizeram o que lhes é incumbido conforme contrato de trabalho. Então também não

mereceriam agradecimentos.

Permito-me discordar veementemente desta opinião alheia. A família não é obrigada

a suportar ausências nos finais de semana pois artigos precisam ser terminados. Da mesma

forma, ela não precisa aturar o mau humor quando uma coluna cromatográfica não sai

conforme o esperado ou quando isolamos “uma mistura de glicose e frutose para adoçar o

café” (by FDM).

Os profissionais... Sim, são remunerados! Mas esta remuneração inclui responder e-

mails desesperados nos sábados, a meia-noite e quatorze minutos? O contrato de trabalho

prevê um orientador “caixa eletrônico” (disponível 24 horas por dia)? Duvido!

Assim sendo, nada mais justo e mandatório que fazer meus agradecimentos:

Mãe... impossível seria sem você. Me ouvindo, me fazendo ouvir, me colocando os

pés no chão quando a cabeça queria voar. Sendo Mãe, com letra maiúscula. A distância

nunca me deixou esquecer que você sempre foi e será o meu exemplo a ser seguido. Meu

norte (mesmo estando ao sul). Te amo;

Pai... impossível seria sem você. Sempre com sua opinião mais sensata e racional.

Ouvindo, pesando e expressando o essencial. Obrigado! E obrigado também por sua

compreensão e respeito ao meu ritmo e espaço. Te amo;

Família... especialmente Rodrigo, Taiana e Bety. Obrigado por me apoiarem, cada

qual à sua maneira, neste período, me respeitando e me aconselhando. Sempre “segurando

as pontas”;

Cechinel... meu orientador. Eterno pai científico e, sem dúvidas, amigo! Não há no

dicionário de língua portuguesa palavra para expressar meus mais sinceros

agradecimentos. Te admiro enquanto pesquisador, orientador, amigo, compositor, escritor...

ufa! Obrigado por me fazer uma pessoa melhor!

Faloni... meu “co-chefe”, como tenho mania de chamar. Obrigado por seu apoio e por

sua amizade. Um dos melhores “conselheiros” que tive. Obrigado também pela colaboração

neste e noutros projetos;

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Tania... te agradeço enquanto professora, coordenadora e amiga. Grato por sua

colaboração nesta dissertação, bem como por seu enorme apoio enquanto mestrando. Seu

profissionalismo e dedicação são inspiradores;

Nara... agradeço especialmente a você por vários motivos: professora, colaboradora

importante desta dissertação e por suas valiosas considerações enquanto membro interno

da banca. Ainda, obrigado por sua disponibilidade, mesmo com a Julia “no colo”;

Márcia e Ângela... obrigado por suas sugestões como banca interna, bem como por

suas atuações como Professoras;

Niero e Christiane Meyre... obrigado por sempre estarem dispostos a sanar minhas

dúvidas e pela colaboração no Laboratório de Pesquisa em Fitoquímica;

Profa. Dra. Vanderlan da Silva Bolzani... agradeço por ter aceito participar da minha

banca de defesa de dissertação, o que, indubitavelmente, irá contribuir significativamente

para o melhoramento deste trabalho;

Prof. Franco Delle Monache (FDM)... grato por seu auxílio na determinação estrutural

dos compostos isolados, bem como por seus e-mails bem humorados;

Demais docentes do PMCF... obrigado por, em maior ou menor grau, contribuírem

para minha formação;

Funcionários... especialmente Joel, Helenize, Maggie, Juliano , Pedro e Luciana que

auxiliaram de forma tão signficativa para a concretização desta dissertação;

Amigos e colegas do PMCF... Aline, Philipe, José, Isabel, Marivane, Jaqueline,

Thaisa, Alessandro, Gislaine e Nicole. A muitos, devo parte desta dissertação. A todos,

grande parte da diversão! Obrigado.

Zhelmy... mi hermanita! Muchas gracias por tu amistad, por tu conocimiento y por tus

oídos! 2010 fue mucho mejor con tu presencia.

Colegas de laboratório… especialmente Priscila, Bruna, Luisa e Mariana. Tanto

aprendemos juntos, rimos juntos e erramos juntos. Se fosse diferente, nem teria graça.

Amigos fora da UNIVALI... especialmente Joi, Daia, Má e Ale por terem me apoiado,

das mais diversas formas, enquanto mestrando. Obrigado por seus ouvidos (ou olhos)!

Instituições... UNIVALI e CAPES por seu apoio financeiro direto ou indireto. FAPESC

e CNPq pelas bolsas de mestrado que me foram concedidas enquanto mestrando.

Os demais... que de alguma forma contribuíram para meu crescimento científico,

profissional e/ou pessoal durante estes dois anos, meu muito obrigado. Desculpem-me se

não incluo o nome de todos, mas infelizmente seria inviável.

Nada seria obtido, nenhum objetivo atingido, nenhuma meta alcançada, se não

fossem as colaborações. Esta dissertação é fruto de um importante trabalho conjunto.

Nenhum mérito é individual. Obrigado a todos...

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“Ninguém pode construir em teu lugar

as pontes que precisarás passar

para atravessar o rio da vida

- ninguém, exceto tu, só tu.

Existem, por certo, atalhos sem números,

e pontes, e semideuses

que se oferecerão para levar-te além do rio;

mas isso te custaria a tua própria pessoa;

tu te hipotecarias e te perderias.

Existe no mundo um único caminho

por onde só tu podes passar.

Onde leva? Não perguntes, segue-o!”

Nietzche

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO FARMACOGNÓSTICO DE Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):

ASPECTOS QUÍMICOS E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL GASTROPROTETOR E ANTI-HIPERNOCICEPTIVO

Luiz Carlos Klein Júnior

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Fevereiro/2011 Orientador: Valdir Cechinel Filho, Doutor Co-orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de páginas: 152. Polygala cyparissias é uma planta popularmente conhecida como pinheiro da praia ou gelol. É etnofarmacologicamente utilizada como analgésico local de aplicação tópica, já tendo sido evidenciada a atividade antinociceptiva da planta. Caracteriza-se quimicamente pela presença de xantonas. Considerando que tais metabólitos já possuem atividade anti-úlcera descrita, objetivou-se o estudo químico da espécie e a avaliação do potencial gastroprotetor e anti-hipernociceptivo. Para tanto, foram utilizados métodos cromatográficos clássicos no isolamento dos metabólitos principais de P. cyparissias e métodos in vivo e in vitro para verificar seu potencial farmacológico. A partir do extrato acetônico (EA), foi possível isolar: espinasterol (PC1), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4) e 1,7dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (PC5). Da fração metanólica obteve-se pela primeira vez para a planta um flavonóide denominado astragalina (PC6). Para avaliar a atividade gastroprotetora do EA e da fração metanólica (FM) de P. cyparissias utilizou-se os modelos de lesão gástrica induzida por etanol/HCl e indometacina/betanecol. Nesses modelos, respectivamente, para o EA obteve-se um índice de gastroproteção (IG) na dose de 250 mg/kg de 67,4 ± 4,8% e 77,9 ± 7,2%. Já para a FM, os IGs nas mesmas doses foram 74,5 ± 6,1% e 75,0 ± 2,9%. Além disto, através dos modelos de úlcera induzida por etanol/HCl associada a um inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME) e a um quelante dos grupamentos sulfidrila (NEM) foi evidenciada a significativa (p<0,01) participação do óxido nítrico (NO) e dos grupamentos sulfidrila (SHs) na gastroproteção promovida pelo extrato e fração de P. cyparissias. No modelo curativo de úlcera crônica induzida por ácido acético, o EA e a FM geraram um índice de cura de 67,5 ± 5,5% e 58,4 ± 4,4%, respectivamente. Avaliando o efeito gastroprotetor de PC1, PC2 e PC3 no modelo de lesão induzida por etanol/HCl, obteve-se os seguintes IGs: 86,2 ± 3,4%, 71,3 ± 9,4% e 81,1 ± 5,8%, respectivamente. Também, objetivando verificar a ação de P. cyparissias sobre Helicobacter pilory, realizou-se o ensaio de diluição do extrato e fração em ágar sólido, porém não foi observado efeito sobre o crescimento bacteriano. A atividade anti-hipernociceptiva, foi avaliada frente a diferentes agentes: carragenina, lipopolissacarídeo (LPS), adjuvante completo de Freund (CFA), prostaglandina E2 (PGE2) e epinefrina. Foi realizado também o modelo de constrição parcial do nervo ciático (CPNC). Nos modelos de hipernocicepção inflamatória (carragenina, LPS, CFA e PGE2) as inibições encontradas para as doses mais efetivas do extrato metanólico (EM) de P. cyparissias foram: 67,8 ± 3,4%, 89,0 ± 4,8%, 42,6 ± 3,4% e 88,5 ± 11,5%, respectivamente. Na hipernocicepção induzida por epinefrina, o extrato apresentou atividade anti-hipernociceptiva apenas nos primeiros 15 minutos. Já no modelo de CPNC, a maior inibição foi de 44,4 ± 4,6%. Os compostos PC1 a PC4 foram avaliados na hipernocicepção induzida por carragenina, sendo que apenas PC1, PC3 e PC4 foram ativos, com inibições de: 41,6 ± 6,2%, 47,8 ± 5,2% e 63,6 ± 4,4%, para as doses mais efetivas. Assim sendo, foi possível isolar seis metabólitos diferentes de P. cyparissias, sendo um deles o

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flavonóide astragalina, obtido pela primeira vez para a espécie. Além disto, demonstrou-se o potencial gastroprotetor e curativo do EA, FM e de alguns metabólitos, estando estas atividades relacionadas ao NO e aos SHs. Por fim, o EM e PC1, PC3 e PC4 evidenciaram ação anti-hipernociceptiva, principalmente em modelos de hipernocicepção inflamatória. Palavras-chave: Polygala cyparissias. Gastroproteção. Anti-hipernocicepção. Xantonas

CONTRIBUTION TO THE PHARMACOGNOSTIC STUDY OF Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin (POLYGALACEAE):

CHEMICAL ASPECTS AND EVALUATION OF THE GASTROPROTECTIVE AND ANTI-HYPERNOCICEPTIVE POTENTIAL

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Luiz Carlos Klein Júnior February/2011

Supervisor: Valdir Cechinel Filho, PhD. Co-Supervisor: Sérgio Faloni de Andrade, PhD. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of pages: 152.

Polygala cyparissias is a plant popularly known as “pinheiro da praia” or “gelol”. It is ethnopharmacologically used as topical anesthetic, and its antinociceptive activity has already been demonstrated. It is chemically characterized by the presence of xanthones. Considering that these metabolites display antiulcer activity, the aim of this work was to carry out a chemical study of the species, and evaluate its gastroprotective and anti-hypernocicetive potential. Traditional chromatographic methods were used to isolate the major metabolites of P. cyparissias, and in vivo and in vitro methods were used to verify the pharmacological activity. From the acetone extract (AE), it was possible to isolate the following: spinasterol (PC1), 1,3-dihydroxy-7-methoxyxanthone (PC2), 1,7-dihydroxy-2,3-methylenedioxyxanthone (PC3), 1,3,6,8-tetrahydroxy-2,7-dimethoxyxanthone (PC4) and 1,7-dihydroxy-2,3-dimethoxyxanthone (PC5). From the methanol fraction, a flavonoid was isolated for the first time, which was named astragalin (PC6). To evaluate the gastroprotective activity of the AE and the MF (Methanolic Fraction) of P. cyparissias, the ethanol/HCl- and indomethacin/bethanecol-induced ulcer models were used. For the AE, at a dose of 250 mg/kg, a gastroprotection index (GI) of 67.4 ± 4.8% and 77.9 ± 7.2% was obtained, respectively. For the MF, the GIs at in the same dose were 74.5 ± 6.1% and 75.0 ± 2.9%. Also, using the ethanol/HCl-induced ulcer model with a nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME) and a chelant of the sulphydril groups (NEM), a significant (p<0.01) involvement of the nitric oxide (NO) and sulphydril groups (SHs) in gastroprotection was demonstrated, a response elicited by the extract and the fraction of P. cyparissias. In the chronic curative model of ulcer induced by acetic acid, the AE and the MF demonstrated cure indices of 67.5 ± 5.5% and 58.4 ± 4.4%, respectively. Evaluating the gastroprotector effect of PC1, PC2 and PC3 in the ethanol/HCl-induced ulcer, GIs of: 86.2 ± 3.4%, 71.3 ± 9.4% and 81.1 ± 5.8% were obtained, respectively. Also, seeking to verify the action of P. cyparissias on Helicobacter pilory, the agar solid dilution assay was used, but no effect was observed on bacterial growth. The anti-hypernociceptive activity was evaluated in models induced by: carrageenan, lipopolysaccharide (LPS), Freund’s complete adjuvant (FCA), prostaglandin E2 (PGE2) and epinephrine. The partial constriction of the sciatic nerve model (PCSN) was also used. In the models of inflammatory hypernociception (carrageenan, LPS, FCA and PGE2), the inhibitions, demonstrated at the most effective doses of the methanol extract (ME) of P. cyparissias were: 67.8 ± 3.4%, 89.0 ± 4.8%, 42.6 ± 3.4% e 88.5 ± 11.5%, respectively. In the hypernociception induced by epinephrine, the extract demonstrated anti-hypernociceptive activity in the first 15 minutes. In the neuropathic model of hypernociception induced by PCSN, the inhibition was 44.4 ± 4.6%. Compounds PC1 to PC4 were also evaluated in the hypernociception induced by carrageenan, but only PC1, PC3 and PC4 were effective, with inhibitions of: 41.6 ± 6.2%, 47.8 ± 5.2% and 63.6 ± 4.4%. Thus, it was possible to isolate six different metabolites from P. cyparissias, one of them the flavonoid astragalin, being obtained for the first time for the plant. The gastroprotector and curative potential of AE, MF and some metabolites

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was also demonstrated, these activities being related to the NO and SHs. Finally, the EM and PC1, PC3 and PC4 elicited anti-hypernociceptive activity, particularly in models of inflammatory hypernociception. Key words: Polygala cyparissias. Gastroprotection. Anti-hypernociception.

Xanthones.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação do ramo de Polygala cyparissias. ....................................34

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Figura 2: Foto de Polygala cyparissias.....................................................................34

Figura 3: Foto da flor de Polygala cyparissias..........................................................34

Figura 4: Estrutura química dos compostos isolados de Polygala cyparissias: espinasterol (1), salicilato de metila (2), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (3), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6-trihidroxi-2,7-dimetoxixantona (5), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8)...........................................................................35

Figura 5: Esquema demonstrando a sensibilização dos neurônios secundários. Esta sensibilização ocorre quando há um estímulo sustentado emitido pelos nociceptores periféricos. Na fase aguda há a liberação de glutamato e substância P, ligando-se a receptores NMDA, AMPA e NK-1 (A). Todavia, com uma estimulação sustentada, há uma expressão exagerada de receptores, especialmente NMDA através de c-fos e c-jun, levando à sensibilização do neurônio secundário (B). (Fonte: adaptado de MARCHAND, 2008). .................................................................................................45

Figura 6: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-1). Em cinza destacado os compostos isolados...........53

Figura 7: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-15). Em cinza destacado os compostos isolados. ........57

Figura 8: Organograma de isolamento dos compostos da fração metanólica de Polygala cyparissias (PCTL-2B). Em cinza destacado os compostos isolados.........60

Figura 9: Espinasterol. .............................................................................................76

Figura 10: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado. .......77

Figura 11: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado expandido na região de 0,70 a 2,10 ppm. .................................................................77

Figura 12: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterada expandido na região de 3,45 a 3,80 ppm e 4,90 a 5,30 ppm. ...................................78

Figura 13: Espectro de RMN ¹³C do composto PC1 em CDCl3................................79

Figura 14: 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona. ................................................................82

Figura 15: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada. .............83

Figura 16: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada expandido na região de 6,5 a 8,0 ppm........................................................................................83

Figura 17: 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona....................................................84


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Figura 20: 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona. ................................................86


Figura 22: 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona. ..........................................................88



Figura 25: Kaempferol 3-O-β-D-glicosilado. .............................................................90

Figura 26: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD. ..............................91

Figura 27: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD expandido na região de 5,0 a 9,0 ppm. ......................................................................................................91

Figura 28: Espectro de RMN ¹³C do composto PC6 em CD3OD..............................92

Figura 29: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 1 descrito na Tabela 10.......................................95


Figura 31: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 3 já descrito.........................................................96




Figura 35: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 7 descrito na Tabela 15.......................................99 Figura 36: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 8 descrito na Tabela 16.....................................100

Figura 37: Cromatograma obtido para PC2 isolado de P. cyparissias, conforme método 8 descrito na Tabela 16. .............................................................................101

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Figura 38: Cromatograma em três dimensões obtido para PC3 isolado de P. cyparissias, conforme método 8 descrito na Tabela 16. .........................................101

Figura 39: Cromatograma obtido para o solvente utilizado para a solubilização de PC2, conforme método 8 descrito na Tabela 16. ....................................................102

Figura 40: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM....................................................................................104

Figura 41: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM....................................................................................104

Figura 42: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM....................................................................................106

Figura 43: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM....................................................................................107

Figura 44: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou L-NAME (70 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle. ∆ mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p<0,01). ..................109

Figura 45: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou NEM (10 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle. ∆ mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p<0,01).....................................110

Figura 46: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.), pelo extrato acetônico (125 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por ácido acético 20% (50 µl) em camundongos (n = 6), no modelo de úlcera crônica. Os resultados estão expressos em média ± EPM.....................................................................................................112

Figura 47: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e pelos compostos isolados de P. cyparissias em lesões induzidas por etanol/HCl

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(60%/0,3M) em camundongos (n = 6): espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.) e 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.). Os resultados estão expressos em média ± EPM...........................................................................................................114

Figura 48: Intensidade de hipernocicepção, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................117

Figura 49: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.........................................................................118

Figura 50: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (0,3-3 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µl/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.........................................................................120

Figura 51: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de PGE2 (0,1 nmol/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.........................................................................121

Figura 52: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de epinefrina (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001................................................................123

Figura 53: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3 e 10 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a constrição parcial do nervo ciático. Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. FOP = falso operado.............................123

Figura 54: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC1 (0,02 – 0,24 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são

17

expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................126

Figura 55: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC2 (0,04 – 0,39 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001................................................................................................127



LISTA DE TABELAS

18

Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias.................................................................................................................51

Tabela 2: Junção das frações obtidas na CC1. ........................................................51

Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias.................................................................................................................55


Tabela 5: Junção das frações obtidas na CC flash 11..............................................56

Tabela 6: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da fração metanólica de P. cyparissias.................................................................................................................58


Tabela 8: Gradiente de eluição da CC4 na purificação da fração 13-15 da CC3. ....59


Tabela 10: Descrição do método 1. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = MeOH. Fluxo de 1 ml/min. .....................................................................................................62

Tabela 11: Descrição do método 2. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min. .....................................................................................................62



Tabela 14: Descrição do método 6. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min..........................................................................................63

Tabela 15: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min. ..................................................................................63

Tabela 16: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 0,8 ml/min. ...............................................................................64

Tabela 17: Rendimentos dos extratos e frações obtidos de P. cyparissias. .............75

Tabela 18: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC1 em comparação com dados da literatura para o espinasterol, ambos em CDCl3. .......................................................................................................................79

Tabela 19: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC6 e comparação com dados da literatura para a astragalina, ambos em CD3OD. .....................................................................................................................94

19

Tabela 20: Efeito do extrato acetônico e frações clorofórmica e metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001. ......................................................103

Tabela 21: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e veículo em úlcera induzida por indometacina (100 mg/kg; v.o.)/betanecol (5 mg/kg; i.p.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001. ......................................................105

Tabela 22: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) na dose de 125 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético 20% (ensaio curativo). Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05 e ** p<0,01. ....................................................................................................................111

Tabela 23: Efeito do espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.), omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001. ..................................................................................................................114

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

20

ABTS – Ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolino)-6-sulfônico

ACN – Acetonitrila

AcOEt – Acetato de etila

AINE – Anti-inflamatório não-esteróide

AMP – Adenosina monofosfato

AMPA – Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico

ANOVA – Análise de variância

ASIC – Canal iônico sensível ao ácido

ATCC – Coleção de cultura do tipo Americana

ATP – Adenosina trifosfato

AUC – Área sob a curva

BK – Bradicinina

CC – Cromatografia em coluna

CCD – Cromatografia em camada delgada

CCDP – Cromatografia em camada delgada preparativa

CFA – Adjuvante completo de Freund

cGMP – Guanosina monofosfato cíclico

CGRP – Peptídeo relacionado ao gene de calcitonina

CIM – Concentração inibitória mínima

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência

COX – Ciclooxigenase

CPNC – Constrição parcial do nervo ciático

DCM - Diclorometano

EPM – Erro padrão da média

FOP – Falso operado

IC – Concentração inibitória

IG – Índice de gastroproteção

IL – Interleucina

i.p. – Intraperitoneal

i.pl. – Intraplantar

J – Constante de acoplamento

L-NAME – N-nitro-L-arginina metil éster

LPS – Lipopolissacarídeo

MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno

21

MEK – Quinase ativadora da MAPK

NEM – N-etilmaleimida

NGF – Fator de crescimento neuronal

NIQFAR – Núcleo de investigações químico-farmacêuticas

NMDA – N-metil-D-aspartato

NO – Óxido nítrico

NOS – Óxido nítrico sintase

PC1 – Espinasterol

PC2 – 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona

PC3 – 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona

PC4 – 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona

PC5 – 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona

PC6 – Astragalina

PG – Prostaglandina

PGE2 – Prostaglandina E2

PKA – Proteína quinase A

PKC – Proteína quinase C

RMN ¹H e ¹³C – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13

SH – Grupamento sulfidrila

SNC – Sistema nervoso central

TFA – Ácido trifluoracetico

TNF-α – Fator de necrose tumoral α

ULI – Índice de lesão ulcerativa

UNIVALI – Universidade do Vale do Itajaí

v.o. – Via oral

WDR – Neurônio de faixa ampla

δ – Deslocamento químico

SUMÁRIO

22

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................24

2 OBJETIVOS...........................................................................................................26

2.1 Objetivo geral ................................................................................................27

2.2 Objetivos específicos ...................................................................................27

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................28

3.1 Plantas medicinais ........................................................................................28

3.2 Família Polygalaceae ....................................................................................31

3.3 Gênero Polygala ............................................................................................32

3.4 Espécie Polygala cyparissias ......................................................................33

3.5 Aspectos gerais relacionados à úlcera .......................................................36

3.5.1 Úlcera relacionada à infecção por Helicobacter pylori...............................37

3.5.2 Úlcera relacionada ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides...............38

3.5.3 Úlcera relacionada ao estresse.................................................................39

3.6 Algumas plantas estudadas com potencial gastroprotetor ......................39

3.7 Aspectos gerais relacionados à dor............................................................41

3.7.1 Fisiologia da nocicepção aguda ................................................................41

3.7.2 Cronificação da dor ...................................................................................43

3.8 Algumas plantas estudadas com potencial antinociceptivo.....................47

4 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................49

4.1 Materiais e equipamentos ............................................................................49

4.2 Análise fitoquímica .......................................................................................49

4.2.1 Material vegetal .........................................................................................49

4.2.2 Obtenção dos extratos ..............................................................................50

4.2.3 Purificação e identificação dos compostos isolados..................................50

4.2.4 Perfil cromatográfico do extrato de P. cyparissias ....................................61

4.2.4.1 Preparo das amostras.........................................................................61

4.2.4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico ......................................61

4.3 Testes farmacológicos .................................................................................65

4.3.1 Animais .....................................................................................................65

4.3.2 Avaliação da atividade gastroprotetora .....................................................65

4.3.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl ...............................65

4.3.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteróide

associada à estimulação parassimpaticomimética .........................................66

4.3.2.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético..........................67

23

4.3.3 Estudo do mecanismo de ação gastroprotetor..........................................68

4.3.3.1 Participação do óxido nítrico ...............................................................68

4.3.3.2 Participação dos grupamentos sulfidrilas............................................68

4.3.4 Avaliação da atividade anti-Helicobater pilory ...........................................69

4.3.4.1 Cepa de Helicobater pilory..................................................................69

4.3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) .....................69

4.3.5 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva.............................................70

4.3.5.1 Análise do limiar mecânico através do von Frey eletrônico e

monofilamento de Von Frey............................................................................70

4.3.5.2 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina .......................71

4.3.5.3 Hipernocicepção mecânica induzida por lipopolissacarídeo (LPS).....72

4.3.5.4 Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de

Freund (CFA)..................................................................................................72

4.3.5.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela prostaglandina E2 (PGE2) .73

4.3.5.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina ..........................73

4.3.5.7 Hipernocicepção mecânica induzida por constrição parcial do nervo

ciático (CPNC) ................................................................................................73

4.3.6 Análise estatística .....................................................................................74

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................75

5.1 Análise fitoquímica .......................................................................................75

5.1.1 Extratos obtidos.........................................................................................75

5.1.2 Identificação dos compostos obtidos.........................................................76

5.1.2.1 PC1.....................................................................................................76

5.1.2.2 PC2.....................................................................................................81

5.1.2.3 PC3.....................................................................................................84

5.1.2.4 PC4.....................................................................................................86

5.1.2.5 PC 5....................................................................................................87

5.1.2.6 PC 6....................................................................................................90

5.1.3 Perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias ..................94

5.2 Testes farmacológicos ...............................................................................102

5.2.1 Avaliação da atividade gastroprotetora ...................................................102

5.2.2 Avaliação da atividade anti-Helicobacter pilory .......................................116

5.2.3 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva...........................................116

6 CONCLUSÕES ....................................................................................................130

24

REFERÊNCIAS.......................................................................................................132

ANEXO A – Artigo publicado................................................................................147

ANEXO B – Artigo de revisão aceito para publicação .......................................151

1 INTRODUÇÃO

25

O uso de plantas medicinais é provavelmente a terapêutica mais antiga

utilizada, com evidências que remetem à aproximadamente 3000 anos a.C.

(HALBERSTEIN, 2005; GURIB-FAKIM, 2006; LIU; WANG, 2008). Hoje em dia, as

plantas medicinais continuam sendo muito utilizadas, especialmente na atenção

primária à saúde, apesar do avanço da química sintética (GANESAN, 2008).

Além do seu uso etnofarmacológico, as plantas medicinais são importantes

fontes de moléculas biologicamente ativas como potenciais fitofármacos

(BARREIRO; BOLZANI, 2009). De fato, grande parte dos medicamentos hoje

disponíveis são de origem vegetal ou inspirados nestes (MCCHESNEY;

VENKATARAMAN; HENRI, 2007; BARREIRO; BOLZANI, 2009). Entretanto, mesmo

com todo o arsenal terapêutico atualmente disponível, estima-se que apenas 1% das

espécies presentes em florestas tropicais foram estudadas sob o âmbito

farmacêutico (GURIB-FAKIM, 2006), o que justifica fortemente estudos abordando

tais aspectos.

Além da variada constituição química inter-espécies, outro motivo para a

ampliação do número de moléculas potencialmente bioativas é a variação intra-

espécies (SCHUFFENHAUER; BROWN, 2006; ROLLINGER, 2009). Alguns fatores

que podem influenciar tal variação são: exposição solar, umidade, constituição do

solo, localização geográfica, período do ano, dentre outros (FIRENZUOLI; GORI,

2007). Isto sempre deve ser levado em consideração quando se estuda e utiliza uma

determinada planta medicinal, visto que estes fatores podem promover variações na

concentração de metabólitos secundários (moléculas potencialmente bioativas) e,

inclusive, modificá-los (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Considerando o uso de plantas medicinais como alternativa terapêutica, duas

patologias carentes de tratamento farmacológico efetivo e que vêm sendo foco de

estudos sob esta temática são a úlcera (FALCÃO et al., 2008) e a dor de caráter

persistente (CALIXTO et al., 2000). A úlcera se caracteriza por um desequilíbrio

entre os fatores agressivos e de proteção da mucosa gástrica (CHAN; LEUNG,

2002; LU; GRAHAM, 2006; RODRIGUES et al., 2008). Dentre os fatores etiológicos,

destacam-se a infecção por Helicobacter pylori, o uso de anti-inflamatórios não-

esteróides e o estresse (LU; GRAHAM, 2006). Já a dor crônica pode ser definida

como um processo sem estímulo contínuo ou patologia definida que dura mais que o

período normal de cura e recuperação (MEYR; SAFFRAN, 2008).

26

Estudos vêm demonstrando a atividade anti-úlcera e anti-hipernociceptiva de

espécies do gênero Polygala (LAPA et al., 2007, 2009). Particularmente, Polygala

cyparissias, utilizada popularmente por sua ação analgésica, já demonstrou

atividade sobre a nocicepção aguda induzida por diferentes mediadores químicos

(CAMPOS et al., 1997). Em adição, P. cyparissias é fitoquimicamente caracterizada

por xantonas (PINHEIRO et al., 1998), uma classe de metabólitos secundários

relacionada com atividade gastroprotetora (BO; LIU, 2004; BANERJI et al., 1994),

deixando indícios de que P. cyparissias possa apresentar atividade anti-úlcera. Uma

vez que a espécie apresenta ampla distribuição no Brasil, especialmente em Santa

Catarina (WURDACK; SMITH, 1971), no presente estudo propô-se o estudo químico

e farmacológico da espécie apresentada.

2 OBJETIVOS

27

2.1 Objetivo geral

Estudar a composição química de Polygala cyparissias St. Hil. & Moq., além

de verificar a potencial atividade gastroprotetora e anti-hipernociceptiva de seus

extratos, frações e compostos isolados.

2.2 Objetivos específicos

a) Isolar por métodos cromatográficos os principais constituintes químicos

presentes no extrato acetônico e na fração metanólica de P. cyparissias;

b) Identificar através de métodos espectroscópicos de ressonância magnética

nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e/ou de carbono-13 (RMN 13C) os compostos

isolados;

c) Obter perfil cromatográfico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

do extrato metanólico de P. cyparissias;

d) Avaliar a atividade gastroprotetora em camundongos do extrato acetônico e

fração metanólica de P. cyparissias através dos modelos de úlcera aguda

induzida por etanol/HCl e por anti-inflamatório não-esteróide (AINE)

associado à estimulação parassimpaticomimética, bem como suas atividades

sobre o sistema oxinitrérgico, grupamentos sulfidrilas (SHs) e sobre

Helicobacter pilory por diluição em ágar sólido;

e) Avaliar a atividade curativa do extrato acetônico e fração metanólica de P.

cyparissias no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético em

camundongos;

f) Avaliar a atividade gastroprotetora dos compostos isolados através do modelo

de úlcera aguda induzida por etanol/HCl em camundongos;

g) Investigar o efeito preventivo do extrato metanólico bruto de P. cyparissias

frente à hipernocicepção mecânica persistente induzida pela injeção i.pl. de

adjuvante completo de Freund (CFA), prostaglandina E2 (PGE2),

lipopolissacarídeo (LPS), carragenina e epinefrina em camundongos;

h) Avaliar o efeito curativo do extrato metanólico bruto de P. cyparissias sobre a

dor neuropática induzida pela contrição parcial do nervo ciático (CPNC) em

camundongos;

28

i) Avaliar o efeito preventivo dos compostos isolados sobre a hipernocicepção

mecânica induzida pela injeção i. pl. de carragenina em camundongos;

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Plantas medicinais

29

Diversas evidências demonstram que o uso de plantas medicinais é o modo

mais antigo e difundido de tratamento de várias enfermidades. Há aproximadamente

5000 anos, plantas já eram utilizadas com fins terapêuticos de forma empírica,

encontrando-se tal prática disseminada entre o povo mesopotâmico, egípcio e grego

(HALBERSTEIN, 2005; GURIB-FAKIM, 2006; LIU; WANG, 2008). A história também

evidencia o uso de plantas medicinais, em diversas épocas, pelos chineses,

indianos, tibetanos, astecas, maias, dentre outros (HALBERSTEIN, 2005).

Já na história mais recente, o uso de plantas medicinais tornou-se mais

avançado, envolvendo o isolamento de princípios ativos como potenciais

fitofármacos (LARSSON; BACKLUND; BOHLIN, 2008; RISHTON, 2008). Esta

tendência foi iniciada em 1804 pelo farmacêutico Friedrich Wilhelm Adam com o

isolamento da morfina do ópio obtido de Papaver somniferum, inspirando a obtenção

de uma série de análogos e não-análogos, os quais vieram a fazer parte da classe

de hipnoanalgésicos (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LIU; WANG, 2008; BARREIRO;

BOLZANI, 2009). De fato, a farmacologia contemporânea encontra suas bases

firmadas no conhecimento adquirido em diversos estudos com plantas medicinais

(LIU; WANG, 2008), inclusive auxiliando na descoberta de novos mecanismos de

ação (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; HARVEY, 2008).

Durante algum tempo, diversos fármacos puramente sintéticos foram

lançados no mercado (GANESAN, 2008). Pesquisas envolvendo o desenvolvimento

de fitofármacos acabaram dividindo espaço com estudos guiados por relação

estrutura-atividade, química combinatória, desenvolvimento de fármacos in silico,

dentre outras técnicas (SCHMIDT et al., 2008). Isto acabou fazendo com que

diversas indústrias farmacêuticas reduzissem o investimento na pesquisa de

produtos naturais, apesar de seu sucesso já evidenciado (BALUNAS; KINGHORN,

2005; LAM, 2007; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; HARVEY, 2008;

SCHMIDT et al., 2008).

Porém, nos últimos anos, a importância dos estudos envolvendo plantas

medicinais foi reavivada, especialmente por seus avanços na atividade

anticacerígena, voltando a despertar o interesse social e econômico sobre os

produtos naturais, permanecendo estes como uma importante fonte de novas

moléculas bioativas (BALUNAS; KINGHORN, 2005; LAM, 2007; SCHMIDT et al.,

2008; SHINDE; DHALWAL; MAHADIK, 2008; BRAZ-FILHO, 2010). A maioria dos

30

fármacos atualmente disponíveis ou são de origem natural ou foram inspirados em

produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007; MCCHESNEY; VENKATARAMAN;

HENRI, 2007). De 1994 até 2007, aproximadamente metade dos fármacos

aprovados e liberados para uso foram baseados em fitoconstituintes, sendo que de

2005 a 2007, dos 30 fitomedicamentos lançados, cinco representaram os primeiros

membros de novas classes terapêuticas. Mais de cem compostos de origem natural

estão em estudos clínicos e aproximadamente a mesma quantidade, em estudos

pré-clínicos (HARVEY, 2008).

Cerca de 50% dos fitofármacos hoje disponíveis foram obtidos de plantas

superiores. Estima-se que existam no mundo aproximadamente 300,000 espécies

de plantas, sendo que em torno da metade localizam-se em florestas tropicais

(GURIB-FAKIM, 2006; MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). De fato, as

florestas tropicais são grandes fontes de novas moléculas potencialmente bioativas,

visto que apenas 1% das espécies foi estudada do ponto de vista farmacêutico,

sendo esta uma justificativa importante a ser considerada para a preservação da

biodiversidade (GURIB-FAKIM, 2006; BARREIRO; BOLZANI, 2009).

Muitas das moléculas bioativas são geradas pelo metabolismo secundário dos

organismos vegetais (BARREIRO; BOLZANI, 2009). O metabolismo secundário é

responsável pela sobrevivência da espécie no meio em que se encontra

(HARTMANN, 2007), adotando um perfil adaptativo frente ao progresso evolutivo do

ambiente, conhecido como “efeito rainha vermelha”, o que justifica serem fontes de

moléculas potencialmente ativas (SCHUFFENHAUER; BROWN, 2006; ROLLINGER,

2009). Assim sendo, a composição química das plantas depende de uma série de

fatores, como espécie vegetal, exposição solar, umidade, constituição do solo,

localização geográfica, período do ano, dentre outros (FIRENZUOLI; GORI, 2007;

GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Considerando isto, a variedade de moléculas

geradas pelos organismos vegetais é enorme, constituindo uma fonte quase que

inesgotável de estruturas químicas (LAM, 2007; ROLLINGER, 2009).

Além da diversidade molecular, outro aspecto que justifica o interesse por

metabólitos secundários é sua complexidade estrutural. Muitas vezes tais estruturas

são desafiadoras para a síntese orgânica (BALUNAS; KINGHORN, 2005;

MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007; PHILLIPSON, 2007), uma vez que

envolvem diversos centros estereogênicos, muitos anéis aromáticos, alto grau de

insaturações, grande número de heteroátomos, dentre outros (BALUNAS;

31

KINGHORN, 2005). Porém, mesmo com este abismo molecular entre fitofármacos e

fármacos sintéticos, muitos deles seguem de forma semelhante às regras de Lipinski

(GANESAN, 2008; HARVEY, 2008). Tais regras relacionam a estrutura do fármaco

com a sua potencial farmacocinética, estabelecendo que não deve haver mais de 5

grupos doadores de ligações hidrogênio, massa molecular inferior a 500 Da, log P

inferior a 5 e menos de 10 grupos aceptores de ligações de hidrogênio para que se

tenha uma absorção e permeabilidade adequadas (ZHANG; WILKINSON, 2007).

Contudo, eventualmente algumas modificações moleculares se fazem necessárias,

tanto por motivos farmacocinéticos quanto farmacodinâmicos. Dentre as estratégias

utilizadas, destacam-se homologação linear e ramificada e introdução de grupos

vinílogos, fenílogos e benzílogos (BARREIRO; BOLZANI, 2009).

Porém, o desenvolvimento de fármacos a partir de produtos naturais enfrenta

grandes desafios. Talvez o maior deles esteja relacionado ao baixo rendimento que

geralmente é obtido de produtos isolados, inviabilizando, inclusive, seus estudos

clínicos (BALUNAS; KINGHORN, 2005). Além disto, quando comercializado, a

demanda é variável, podendo atingir centenas a milhares de quilogramas por ano do

composto isolado (MCCHESNEY; VENKATARAMAN; HENRI, 2007). Ainda, há uma

grande necessidade de colaboração interdisciplinar, uma vez que os estudos ligados

a plantas medicinais envolvem diversas áreas, como a botânica, a bioquímica, a

farmacognosia, a farmacologia, a fitoquímica, a medicina, a toxicologia, a

biotecnologia, dentre outras (PHILLIPSON, 2007).

3.2 Família Polygalaceae

Polygala é uma união das palavras gregas poly (muito) e gala (leite),

referenciando suas propriedades lactantes quando em infusão. Porém, as espécies

atualmente pertencentes à família Polygalaceae não apresentam tal característica,

visto que este nome foi primeiramente utilizado para designar a espécie atualmente

conhecida como Gallega officinalis (Fabaceae) e, equivocadamente, foi empregado

por botânicos do século XVI em uma espécie diferente, tendo este erro originado a

família Polygalaceae (PASTORE, 2006).

A família é constituída de ervas, arbustos, pequenas árvores, trepadeiras e

algumas saprófitas (FURNESS; STAFFORD, 1995), dividida em três tribos:

Polygaleae, Moutabeae e Xanthophylleae (ERIKSEN, 1993). Engloba em torno de

32

17 gêneros e mais de 1000 espécies, sendo aproximadamente metade destas

pertencentes ao gênero Polygala. É uma família quase cosmopolita, estando

ausente apenas na Nova Zelândia e no Círculo Ártico, encontrando-se presente

principalmente em regiões de clima temperado e tropical. A maior parte das

espécies européias está restrita à região sul e mediterrânea, com apenas 10

espécies do gênero Polygala na região norte do continente (FURNESS; STAFFORD,

1995). No Brasil, a família é representada por sete gêneros envolvendo 240

espécies em todas as formações vegetais (AGUIAR; ARANHA-FILHO, 2008).

Além das espécies pertencentes ao gênero Polygala, diversas outras já

demonstraram potencial farmacológico. Raízes de Securidaca longepedunculata

foram avaliadas, demonstrando atividades antinociceptivas, antidepressivas

(ADEBIYI et al., 2006), antimicrobianas (JUNAID et al., 2008) e relaxante da

musculatura lisa dos corpos cavernosos (MEYER; RAKUAMBO; HUSSEIN, 2008). O

extrato alcoólico das folhas de Carpolobia lutea inibiu significativamente diarréia e

úlcera experimentalmente induzidas em roedores (NWAFOR; BASSEY, 2007).

Raízes de Securidaca inappendiculata demonstraram possuir atividade citotóxica em

macrófagos (YUI et al., 2001).

Assim sendo, destaca-se o grande interesse na família Polygalaceae, visto

que sua importância medicinal ainda é economicamente pouco explorada, além do

interesse taxonômico, com espécies de ocorrência em praticamente todas as

formações vegetais, ideal para estudos comparativos (AGUIAR; ARANHA-FILHO,

2008).

3.3 Gênero Polygala

O gênero Polygala possui aproximadamente 350 espécies, com ampla

distribuição, especialmente nas áreas neotrópicas. Estima-se que este gênero seja

aquele que tenha maior representatividade da família Polygalaceae no Brasil, com

aproximadamente 110 espécies e 30 variedades. Geralmente apresentam-se como

ervas ou arbustos, sendo árvores extremamente raras (WURDACK; SMITH, 1971;

COELHO; AGRA; BARACHO, 2008).

Diversos estudos destacam as propriedades farmacológicas de espécies do

gênero Polygala, especialmente relacionados às suas potencias atividades sobre o

sistema nervoso central (SNC). Todavia, existem estudos também demonstrando

33

suas atividades anti-nociceptivas e gastroprotetoras. Meotti et al. (2006) verificaram

que as frações diclorometano, acetato de etila e butanol, além de três dihidroestiril-2-

pironas, α-espinasterol, escopoletina, acetilescopoletina e benzoilescopoletina

obtidas de P. sabulosa foram capazes de inibir as contorções provocadas por ácido

acético em camundongos. O extrato hidroalcoólico também foi capaz de inibir a

nocicepção induzida por glutamato, N-metil-D-aspartato (NMDA), ácido α-amino-3-

hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPA), fator de necrose tumoral α (TNF-α) e

interleucina 1β (IL-1β) (RIBAS et al., 2008).

Lapa et al. (2009) demonstraram que o extrato hidroalcoólico de P. paniculata

teve ação inibitória sobre contorções abdominais induzidas por ácido acético, sobre

as duas fases do teste da formalina, bem como nocicepção induzida por capsaicina,

glutamato, NMDA, IL-1β, TNF-α e cinamaldeído. Para a mesma espécie, foi

evidenciado seu potencial gastroprotetor em modelos de úlcera induzida por etanol e

por AINEs, sem alterar o volume e acidez da secreção gástrica (LAPA et al., 2007).

Além das espécies já citadas, diversas outras demonstram atividade biológica,

destacando-se a espécie Polygala cyparissias (COELHO; AGRA; BARACHO, 2008).

3.4 Espécie Polygala cyparissias

Popularmente conhecida como pinheiro da praia, avenca da praia e gelol, a

espécie Polygala cyparissias Saint-Hilaire & Moquin é encontrada no Brasil, da

Paraíba ao Rio Grande do Sul, na Argentina e no Uruguai (WURDACK; SMITH,

1971; COELHO; AGRA; BARACHO, 2008). É uma erva glabra, de 12-50 cm de

comprimento, com folhas numerosas e alternas e com flores que variam da cor

branca à roxa (Figuras 1-3). Também é uma planta muito ramifica, estando seus

ramos geralmente sobre a superfície da areia, crescendo em zonas planas ou

pequenas depressões, próximas ao lençol de água. É característica da restinga

litorânea do sul do Brasil (WURDACK; SMITH, 1971).

34

Figura 1: Representação do ramo de Polygala cyparissias.

(Fonte: COELHO; AGRA; BARACHO, 2008)

Figura 2: Foto de Polygala cyparissias.

(Fonte: AUTOR)

Figura 3: Foto da flor de Polygala cyparissias.

(Fonte: STEFANI, 2010)

A espécie P. cyparissias é popularmente utilizada como anestésico local,

especialmente de aplicação tópica. Considerando isto, Campos et al. (1997)

avaliaram o efeito do extrato hidroalcoólico de P. cyparissias, demonstrando sua

ação antinociceptiva pronunciada contra nocicepção inflamatória e neurogênica,

além de prevenir a hiperalgesia induzida por bradicinina e substância P. Seguindo a

mesma linha, Sayah et al. (1999) verificaram que o mesmo extrato e o composto

isolado 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona antagonizaram, por mecanismo de ação

não-competitivo, mas de modo reversível, a contração de traquéia promovida por

diversos mediadores da inflamação, como bradicinina, substância P, prostaglandina

E2, tromboxano A2, análogo estável da prostaglandina H2 U 46619, histamina e

acetilcolina em cobaias ex vivo. Também, tanto o extrato quando a xantona

demonstraram atividade antagônica às contrações promovidas por ovalbumina.

35

A espécie também já foi estudada quimicamente. Do extrato hexânico, foram

isolados o α-spinasterol (1) e altas concentrações de salicilato de metila (2). Do

extrato obtido com acetato de etila foram isoladas seis xantonas: 1,3-dihidroxi-7-

metoxixantona (3), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6-trihidroxi-2,7-

dimetoxixantona (5), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-

2,7-dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8) (Figura 4) (PINHEIRO

et al., 1998).

(2)

O

O

OHCH3

(3) O

O

CH3 O OH

OH

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

(1)

(4)

O

OH

O OH

O

O

CH3

CH3

(5) O

O

O OH

OH

OCH3

CH3

OH

(6) O

OH

O OH

O

O (7) O

O

O OH

O

OH

CH3

OHCH3

OH

(8) O

OH

O OH

O

OH

CH3

Figura 4: Estrutura química dos compostos isolados de Polygala cyparissias: espinasterol (1), salicilato de metila (2), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (3), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (4), 1,3,6-trihidroxi-2,7-dimetoxixantona (5), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (6), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (7) e 1,3,7-trihidroxi-2-metoxixantona (8).

Além disto, conforme demonstrado por Weinhold et al. (2008), o óleo-resina

extraído por CO2 de P. cyparissias apresentou ser constituído por p-benzoquinona,

acetileugenol, éster metílico do ácido 11,14-octadecanóico, cadineno, óxido de β-

36

cariofileno, N,N-bis(2-hidroxietil)dodecanamida, α-spinasterol, ácido hexadecanóico,

dodecano, n-tridecano, tetradecano, pentadecano, hexadecano, heptadecano,

octadecano e nonadecano. Em outro estudo, Pizzolatti et al. (2009) demonstraram

que o principal constituinte dos compostos voláteis presentes nas raízes de P.

cyparissias é o salicilato de metila (97,8%), enquanto que para as flores são acetato

de bornila (19,2%) e 1,8-cineol (7,2%).

Visto que apenas o extrato hexânico e o extrato com acetato de etila foram

estudados para fins de isolamento, percebe-se quão promissora pode ser a

investigação química do vegetal por outros métodos extrativos. Da mesma forma,

considerando que poucas atividades farmacológicas foram avaliadas, especialmente

dos compostos isolados, cabe vislumbrar outros estudos na área da farmacologia.

Assim, considerando o exposto, o presente trabalho visa isolar por métodos

cromatográficos os compostos já relatados na literatura, dando ênfase às xantonas,

além de buscar metabólitos secundários ainda não descritos para a espécie.

Ademais, objetiva-se a obtenção de um perfil cromatográfico por CLAE para futuros

fins de quantificação. Finalizando, o estudo propõe-se a avançar em testes

farmacológicos relacionados a duas atividades: anti-hipernociceptiva, considerando

seu uso popular e os estudos já apresentados; e atividade gastroprotetora, por

existir espécie do gênero com tal potencial e pela presença significativa de xantonas,

metabólitos secundários estes com atividade anti-úlcera já descrita (BANERJI et al.,

1994; BO; LIU, 2004).

3.5 Aspectos gerais relacionados à úlcera

A úlcera é causada por um desequilíbrio entre os fatores agressivos e de

proteção da mucosa gástrica. Tem sido, por mais de um século, uma importante

causa de morbidade e mortalidade. Também, avalia-se que os gastos com o

tratamento desta doença alcancem mais de cinco bilhões de dólares por ano nos

Estados Unidos, além dos custos de medicamentos, não computados neste valor

(CHAN; LEUNG, 2002; LU; GRAHAM, 2006; RODRIGUES et al., 2008). Em países

industrializados, estima-se que aproximadamente 10% da população seja afetada

por esta patologia, sendo que apenas no continente americano mais de dois milhões

de adultos sofrem desta doença em alguma fase de sua vida. Em termos de

37

prevalência, verifica-se que a úlcera afeta mais homens (11 a 20%) do que mulheres

(8 a 11%) (KLOPELL et al., 2007).

De modo geral, na úlcera gástrica, a lesão é provocada por uma redução da

capacidade protetora da mucosa, diminuindo a secreção de bicarbonato e de muco,

além de reduzir a reepitelização. Com isto, a mucosa fica mais suscetível à

permeação do ácido gástrico, sendo assim lesionada e permitindo, também, a lesão

da submucosa. Os mastócitos presentes nesta submucosa, bem como na lâmina

própria, degranulam e liberam a histamina, um dos agentes responsáveis por

estimular a secreção de ácido clorídrico e promover a inflamação local. O ácido

ainda pode atingir vasos sanguíneos e estimular nervos presentes na parede

gástrica, gerando contrações exacerbadas (RODRIGUES et al., 2008).

A reepitelização também serve como mecanismo de defesa na garantia de

funcionamento da barreira mucosa. Fatores que reduzem a proliferação celular,

como radicais livres, citocinas inflamatórias e estresse fisiológico, acabam por

propiciar o desenvolvimento de lesão. Também, o rompimento desta barreira,

especialmente por AINEs, facilita a entrada de íons H+, aumentando a acidose

tecidual, o que contribui para a formação da úlcera (RODRIGUES et al., 2008).

Assim, diversos fatores são responsáveis por sua formação, destacando-se a

infecção por Helicobacter pylori, AINEs e estresse (LU; GRAHAM, 2006).

3.5.1 Úlcera relacionada à infecção por Helicobacter pylori

Durante a maior parte do século 20, acreditava-se que a principal causa da

úlcera estomacal estava relacionada com a hiperestimulação estomacal, ou seja, o

estômago, quando hiperestimulado, secretava ácido clorídrico de modo excessivo,

gerando assim as lesões (HOBSLEY; TOVEY; HOLTON, 2008). Porém, mais

recentemente, após o isolamento de H. pylori a partir de fragmentos de biópsia

gástrica de pacientes com gastrite crônica e úlcera péptica por Warren e Marshall

(Prêmio Nobel de Medicina 2005), vem se admitindo a interação deste microganismo

na formação de úlceras (SIQUEIRA et al., 2007).

Helicobacter pylori é uma bactéria Gram negativa, microaerófila e espiralada,

em forma de S ou de bastonete curvo, com parede celular externa lisa, possuindo

quatro a seis flagelos unipolares embainhados e com bulbo terminal. Provavelmente

é o agente de infecção crônica mais comum em seres humanos, colonizando

38

especificamente a mucosa gástrica e microvilosidades gástricas das células

epiteliais (SIQUEIRA et al., 2007). Geralmente o indivíduo é infectado na infância,

porém H. pylori permanece latente por um longo período (LU; GRAHAM, 2008).

Estima-se que metade da população esteja infectada por H. pylori, apesar de

80% destes não apresentarem evidências clínicas da doença. Porém, mesmo assim,

a bactéria está relacionada à maioria das úlceras duodenais (90-95%) e gástricas

(60-70%) (SIQUEIRA et al., 2007).

H. pylori contribui diretamente na lesão das células gástricas através da

liberação de citotoxinas vacuolizantes, bem como de enzimas tóxicas, como lipase,

urease e protease, propiciando a formação da úlcera (SIQUEIRA et al., 2007). Além

disto, a bactéria reduz a secreção de bicarbonato pelo duodeno, permitindo uma

penetração substancial de íons H+ e de outros agentes lesivos na mucosa,

destruindo as células presentes. Também, a infecção por H. pylori parece estimular

o reflexo vago-vagal que, somado com o dano direto à mucosa, inibição das células

D e estimulação das células G, resulta em uma hipergastrinemia e aumenta a

secreção de H+, contribuindo para a ulcerogênese (KONTUREK; KONTUREK;

OCHMAŃSKI, 2004).

3.5.2 Úlcera relacionada ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides

Apesar de na década de 1950 as internações hospitalares por úlceras em

países desenvolvidos terem começado a diminuir, foi observado um aumento

significativo em internações por úlceras hemorrágicas e perfurações especificamente

entre idosos. Este aumento foi justificado pelo maior uso de AINEs por estes

indivíduos (CHAN; LEUNG, 2002). O uso destes anti-inflamatórios aumenta o risco

de desenvolvimento de úlcera em quase vinte vezes. Dentre os fatores de risco

associados estão o histórico de úlcera, idade avançada, altas doses de AINEs, uso

de diferentes medicamentos desta classe e uso concomitante de corticosteróides e

anticoagulantes (LU; GRAHAM, 2006).

Os AINEs inibem a enzima ciclooxigenase (COX), importante na conversão

de ácido araquidônico em prostaglandinas. Existem três isoformas desta enzima:

COX-1, COX-2 e COX-3. Acredita-se que a última esteja de alguma forma

relacionada à inflamação crônica, bem como ao Alzheimer e ao câncer (KAM; SO,

2009). Já a COX-2 está ligada ao processo inflamatório, enquanto que a COX-1 está

39

relacionada à manutenção da mucosa gástrica e à agregação plaquetária (LU;

GRAHAM, 2006). Assim, com a inibição da COX-1, há um enfraquecimento na

defesa da mucosa contra agentes agressores luminais (CHAN; LEUNG, 2002).

Além da atuação sobre a COX, acredita-se que os AINEs estejam de alguma

forma relacionados à diminuição da secreção de óxido nítrico (NO). Com isto há uma

redução no fluxo sanguíneo local e na secreção de muco, além de estimular a

adesão de neutrófilos através da promoção de síntese de TNF-α e leucotrienos. De

fato, a adesão de neutrófilos à mucosa provoca a produção de espécies reativas de

oxigênio, liberando proteases e obstruindo o fluxo sanguíneo capilar, sendo todos

estes fatores relacionados à ulcerogênese (CHAN; LEUNG, 2002).

3.5.3 Úlcera relacionada ao estresse

Apesar de H. pylori e AINEs estarem presentes em muitos pacientes com

úlcera, uma substancial porção destes (5-20%) apresenta a doença sem etiologia

definida. Além disto, diversos indivíduos estão infectados pela bactéria ou usam um

anti-inflamatório do tipo não-esteróide e não desenvolveram úlcera. Isto deixa claro

que a ulcerogênese está atrelada, também, a fatores psicossomáticos. Apesar de

não existirem estudos que indiquem uma relação direta entre o estresse psicológico

e a úlcera, acredita-se que este seja um fator importante e passível desencadear a

lesão (JONES, 2006).

Sabe-se que o estresse fisiológico pode provocar úlcera de diversas formas.

Uma delas envolve a peroxidação lipídica, que acaba por gerar espécies reativas de

oxigênio, ocasionando comumente dano oxidativo na mucosa gástrica

(RODRIGUES et al., 2008). Além disto, há um aumento na secreção de ácido

clorídrico, redução no fluxo sanguíneo local e de produção de mucina (JONES,

2006). As lesões provocadas geralmente apresentam perda do epitélio superficial e

necrose, porém raramente geram perfurações ou sangramento (STOLLMAN; METZ,

2005).

3.6 Algumas plantas estudadas com potencial gastroprotetor

O tratamento da úlcera evoluiu da vagotomia aos inibidores da bomba de

prótons. Porém, mesmo com tamanho avanço, o interesse por terapias alternativas e

o uso de plantas medicinais vem crescendo. De fato, os extratos de plantas são

40

promissoras fontes de novos fitofármacos, inclusive para o tratamento da úlcera

(FALCÃO et al., 2008). Existem diversos estudos de produtos obtidos de fontes

naturais que demonstram sua atividade gastroprotetora (SCHMEDA-HIRSCHMANN;

YESILADA, 2005; ZAYACHKIVSKA et al., 2005).

O Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da

Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) já estudou uma série de plantas com

atividade gastroprotetora pronunciada. Através de uma abordagem

quimiossistemática, Andrade et al. (2007; 2008) avaliaram o efeito do extrato

hidroalcoólico, frações e de 3,15-dioxo-21-α-hidroxifriedelano obtidos de Maytenus

robusta. O extrato foi testado frente a três diferentes modelos de indução de úlcera:

por etanol, por AINEs e por estresse. Em todos eles, M. robusta demonstrou

potencial gastroprotetor, além de ter sido capaz de diminuir o volume de secreção e

a acidez do suco gástrico. Ademais, as frações hexano, clorofórmio e acetato de

etila, bem como o terpeno isolado, foram capazes de prevenir a formação de úlcera

pelo modelo de etanol/HCl em camundongos.

Em outro estudo do grupo, foi evidenciado o potencial gastroprotetor de

Eugenia umbelliflora, sendo esta atividade justificada parcialmente pela presença de

diversos terpenos já descritos na literatura com atividade anti-úlcera

(BITTENCOURT et al., 2009). Zanatta et al. (2009) avaliaram a atividade protetora

sobre a mucosa gástrica do extrato alcaloídico de Galipea longiflora. Este foi capaz

de inibir significativamente as lesões provocadas por etanol, AINEs e estresse, além

de reduzir o volume e acidez de secreção gástrica. Verificando seu possível

mecanismo de ação, foi evidenciado que essa atividade parece estar relacionada à

via oxinitrérgica. Também, o alcalóide 2-fenilquinolina, isolado da planta, demonstrou

prevenir a úlcera induzida por etanol.

Santin et al. (2010), em um estudo de abordagem etnofarmacológica,

validaram o potencial gastroprotetor de Achyrocline satureoides. O extrato

hidroalcoólico da planta foi capaz de promover a proteção gástrica contra etanol e

AINEs, além de produzir um aumento na secreção de muco, essencial para a

proteção da parede gástrica. Também, Santin et al. (2011) demonstraram que o óleo

essencial de Syzygium aromaticum e o seu constituinte majoritário, eugenol, inibiram

a úlcera induzida por etanol e AINEs, estando este potencial gastroprotetor

relacionado ao aumento de produção de muco, não sendo dependente da via

oxinitrérgica nem dos grupamentos SHs.

41

3.7 Aspectos gerais relacionados à dor

No ano de 1996, a Associação Internacional para o Estudo da Dor definiu

como dor “uma experiência sensorial e emocional desagradável, associada a dano

presente ou potencial, ou descrita como tal” (STEEDS, 2009). Assim, a dor pode ser

influenciada por diversos fatores intrínsecos à existência humana, tal como emoção

e cognição (FARQUHAR-SMITH, 2007).

Todavia, ao descrever dor como uma “experiência”, faz-se necessária uma

distinção em relação à nocicepção. Esta se refere ao processo neuronal envolvendo

a transdução e transmissão de um estímulo doloroso ao cérebro, enquanto que a

dor já envolve uma relação com diversos outros sistemas sinalizadores e

moduladores do SNC, além de abranger a percepção única de cada indivíduo ao

estímulo (STEEDS, 2009). Este é o motivo pelo qual, ao estudarmos a dor em

modelos animais, a referenciamos como nocicepção, visto que a percepção

emocional do animal ao estímulo doloroso ainda não pode ser medida ou

quantificada.

3.7.1 Fisiologia da nocicepção aguda

Quando o estímulo nociceptivo (seja ele mecânico, químico ou térmico) ativa

os nociceptores periféricos, o sinal é conduzido através dos neurônios primários até

o corno dorsal da medula espinhal. No corno dorsal, o neurônio primário realiza

sinapse com o neurônio secundário que, cruzando a medula espinhal, envia a

informação até o SNC. Suas aferências realizam uma segunda sinapse com

neurônios terciários no núcleo lateral e medial do tálamo. Por fim, estes neurônios

enviam sinais ao córtex somatossensorial primário e secundário, envolvidos com

localização, duração e intensidade do estímulo nociceptivo (FARQUHAR-SMITH,

2007; VANDERAH, 2007; MARCHAND, 2008).

Conforme mencionado, os estímulos nociceptivos podem ser diversos, porém,

dependendo do tipo, a ativação dos nociceptores se dará de forma distinta. O

estímulo mecânico é causado por um estiramento físico da terminação nervosa,

ativando canais transmembranares. Estes canais, geralmente fechados, quando

estimulados permitem o influxo de íons, resultando na despolarização da célula. Os

42

nociceptores térmicos respondem tanto ao estímulo frio (através de receptores

TRAAK, TRPM8 e TREK-1) quanto quente (através de receptores TRPV1). Já os

nociceptores químicos são ativados por íons e citocinas específicas, sendo estas

substâncias pertencentes ao meio ou liberadas por células danificadas. Elas incluem

íons (H+ e K+), espécies reativas de oxigênio, histamina, serotonina, cininas,

prostaglandinas, substância P, dentre outras (MEYR; STEINBERG, 2008;

BASBAUM et al., 2009).

A ativação dos nociceptores por estes diferentes estímulos acarretará em

uma cascata de eventos. Moléculas inflamatórias pró-nociceptivas são liberadas na

periferia produzindo hiperalgesia (resposta aumentada a um estímulo já doloroso).

Estes mediadores estimulam os nociceptores diretamente ou os sensibilizam para

estímulos subsequentes, ambos por meio de receptores ligados a segundos

mensageiros (FAQUHAR-SMITH, 2007).

Os nociceptores, que também são responsáveis pela transmissão do sinal,

são divididos em três grupos: fibras Aβ, fibras Aδ e fibras C. As fibras Aβ estão

principalmente ligadas à condução de estímulos não-nociceptivos, como vibração e

movimento. São mais mielinizadas com uma velocidade de condução rápida (35-75

m/s), estando relacionadas à modulação da nocicepção, ativando interneurônios

inibitórios para a redução do estímulo nociceptivo. As fibras Aδ são relativamente

mielinizadas, com uma velocidade de condução menor que das fibras Aβ (5-30 m/s).

São divididas em mecanonociceptores (sensíveis a estímulos mecânicos intensos e

potencialmente danosos) e em polimodais (sensíveis a estímulos mecânicos,

térmicos e químicos), sendo responsáveis pela primeira sensação dolorosa. Por fim,

as fibras C são de pequeno calibre e amielinizadas, tendo uma velocidade de

condução bem inferior às demais fibras (0,5-2 m/s). Possuem caráter polimodal,

sendo responsáveis pela sensação dolorosa tardia (FARQUHAR-SMITH, 2007;

VANDERAH, 2007; MARCHAND, 2008).

Considerando a diferença de velocidade de transmissão do estímulo entre as

fibras Aδ e C, a nocicepção se apresenta de uma forma característica.

Primeiramente, as fibras Aδ transmitem rapidamente uma sensação nociceptiva

breve e aguda, percebida exatamente no ponto de estímulo. Em seguida, as fibras C

transmitem a sua informação com um pequeno retardo, resultando em uma

sensação dolorosa mais profunda e difusa (MARCHAND, 2008).

43

Em seguida, o sinal nociceptivo é transmitido pelas fibras Aδ e C até a medula

espinhal, onde ocorre a primeira sinapse com os neurônios secundários,

principalmente localizados nas regiões superficiais do corno dorsal (lâminas I e II) e

lâmina V. Estes neurônios podem ser divididos em neurônios nociceptores

específicos e em neurônios de faixa ampla (wide dynamic range – WDR). Os

primeiros, como pode ser deduzido pelo nome, respondem exclusivamente ao

estímulo nociceptivo. Já os do tipo WDR, respondem a estímulos que variam desde

inofensivos até nociceptivos, visto que recebem informação tanto das fibras Aδ e C

quanto da Aβ (MARCHAND, 2008).

Posteriormente, estes neurônios alcançam o tálamo por dois caminhos

principais: trato espinatalâmico e trato espinoreticular. No tálamo, ocorre a segunda

sinapse: os neurônios terciários do núcleo ventrobasal se conectam ao córtex

primário e secundário, responsáveis pela sensação nociceptiva, enquanto que os do

núcleo centromediano se conectam ao sistema límbico, responsável pelo caráter

emocional da dor (MARCHAND, 2008).

3.7.2 Cronificação da dor

A dor aguda geralmente é descrita como sendo uma resposta normal e

fisiológica a alguma forma de estímulo nociceptivo. Muitas vezes é, inclusive,

descrita como uma reação saudável do organismo, permitindo identificar um

desequilíbrio homeostátitco, indicando que alguma atitude deve ser tomada em

relação à fonte geradora do estímulo (MEYR; STEINBERG, 2008). Porém, apesar

de muitas vias de sinalização serem as mesmas já descritas para a dor aguda, a dor

crônica passa a ser considerada um processo patológico (MEYR; SAFFRAN, 2008).

A dor crônica pode ser definida como uma dor sem estímulo contínuo ou

patologia definida que dura mais que o período normal de cura e recuperação

(MEYR; SAFFRAN, 2008). Ela tipicamente é de origem inflamatória ou neuropática,

sendo caracterizada pelo aumento da percepção dolorosa a um estímulo nociceptivo

(hiperalgesia) e pela percepção alterada de estímulos táteis e térmicos (alodínia)

(VANDERAH, 2007).

A cronificação da dor é resultante de um processo de sensibilização periférica

e central, processo este possível devido ao caráter dinâmico da dor e das vias

44

envolvidas, através de mecanismos excitatórios e inibitórios (MARCHAND, 2008;

MEYR; SAFFRAN, 2008). A sensibilização periférica é resultante de mudanças no

ambiente químico dos nociceptores associadas à inflamação. Assim, com o dano

tecidual, há um acúmulo de fatores liberados tanto pelos próprios nociceptores

quanto por células não-neurais, tais como mastócitos, basófilos, plaquetas,

macrófagos, neutrófilos, células endoteliais, queratinócitos e fibroblastos. Dentre tais

fatores encontram-se neurotransmissores, peptídeos, eicosanóides, neurotrofinas,

citocinas, quimiocinas, proteases extracelulares e íons H+. Toda esta “sopa

inflamatória” ativa os nociceptores, sensibilizando-os (FARQUHAR-SMITH, 2007;

BASBAUM et al., 2009).

Já a sensibilização central está associada a uma alta frequência de

estimulação de fibras C, que pode acabar provocando um somatório de seus

potenciais, visto a condução relativamente lenta destas fibras. Isto gera um aumento

na percepção ao segundo estímulo, promovendo uma excitabilidade dos neurônios

secundários, podendo levar à sensibilização central. Além disto, a estimulação de

uma área maior irá ativar mais nociceptores que em uma área menor, resultando em

uma percepção dolorosa mais intensa. Ainda, a ativação intensiva das fibras C, tanto

por estímulo repetido, quanto por um estímulo tônico, leva à sensibilização central

mudando a resposta dos neurônios secundários. A ativação prolongada de

receptores NMDA leva à transcrição de genes de expressão imediata (c-fos, c-jun),

resultando na expressão aumentada destes receptores e sensibilizando as fibras

secundárias (MARCHAND, 2008) (Figura 5).

45

Figura 5: Esquema demonstrando a sensibilização dos neurônios secundários. Esta sensibilização ocorre quando há um estímulo sustentado emitido pelos nociceptores periféricos. Na fase aguda há a liberação de glutamato e substância P, ligando-se a receptores NMDA, AMPA e NK-1 (A). Todavia, com uma estimulação sustentada, há uma expressão exagerada de receptores, especialmente NMDA através de c-fos e c-jun, levando à sensibilização do neurônio secundário (B). (Fonte: adaptado de MARCHAND, 2008).

46

Epidemiologicamente, a dor crônica causa um grande impacto à saúde dos

indivíduos, aos serviços de saúde e à sociedade de uma forma geral, podendo ser

considerada uma síndrome mundial (SMITH; MACFARLANE; TORRANCE, 2007).

Tomando como exemplo a dor lombar, nos Estados Unidos, estima-se que ela seja

responsável pela perda de mil e quatrocentos dias de trabalho por mil habitantes por

ano. Na Europa, é a causa mais frequente de limitação em pessoas com menos de

45 anos e a segunda causa mais frequente de consulta médica (KRELING; CRUZ;

PIMENTA, 2006).

No Brasil, em estudo realizado por Kreling, Cruz e Pimenta (2006) com 505

servidores da Universidade Estadual de Londrina (Paraná), com idade variando

entre 22 e 69 anos, demonstrou uma prevalência de 61,4% de dor crônica. Também

observaram que houve uma maior frequência de dor crônica em mulheres e que a

maior prevalência de local da dor foi face e boca (26,7%), seguido de região lombar,

sacro e cóccix (19,4%).

O estudo citado corroborou com dados já consistentes na literatura, visto que

as mulheres apresentam maiores riscos de desenvolverem dor crônica ao longo de

sua vida. Além disto, estima-se que com o aumento da idade do indivíduo, há

também um aumento na prevalência de dor crônica, sendo este risco potencializado

pela predisposição genética. Dentre os fatores ambientais, pode-se destacar como

potencialmente predisponentes o estresse, a ansiedade, depressão, estilo de vida e

aspectos ocupacionais (SMITH; MACFARLANE; TORRANCE, 2007; MARCHAND,

2008).

Conforme apontado recentemente por Grubb (2010), ainda há uma grande

carência no diagnóstico e métodos de prevenção da dor crônica. Tão preocupante

quanto, há uma falta de alternativas terapêuticas efetivas. Esta é uma informação

inquietante, visto que dados recentes evidenciam que 44% de indivíduos com dor

crônica em tratamento com opióides fizeram o uso de alguma terapia complementar

e alternativa nos últimos 12 meses, sendo que a prevalência de usuários deste tipo

de terapia varia, conforme o estudo, de 35 a 63%. Se considerarmos que

pouquíssimas terapias alternativas têm comprovação científica e são consideradas

efetivas, temos uma informação realmente alarmante (LEE; RAJA, 2010).

Porém, apesar da complexidade fisiopatológica da dor crônica, existem

diversos alvos potenciais para o desenvolvimento de novos fármacos, destacando-

se: agonistas dos receptores canabinóides, bloqueadores dos canais de K+ e dos

47

canais de Na+ e Ca2+ voltagem dependentes, inibidores do fator de crescimento

neural, de quimiocinas e de citocinas pró-inflamatórias, além de antagonistas dos

receptores de glutamato, neurocininas e cininas. Assim, estes dados reforçam a

necessidade de maiores investigações quanto a novos fármacos potencialmente

ativos (GRUBB, 2010).

3.8 Algumas plantas estudadas com potencial antinociceptivo

O tratamento da dor, especialmente crônica, é bastante limitado, geralmente

envolvendo o uso de AINEs e, algumas vezes, de fármacos de ação central, como

opióides, anticonvulsivantes ou antidepressivos (MARCHAND, 2008). Porém, o uso

de tais medicamentos acarreta em uma série de efeitos adversos, além de sua baixa

eficácia, o que muitas vezes acaba por reduzir a adesão ao tratamento. Assim,

diversas plantas já foram estudadas como potenciais fontes de fitomedicamentos

para o tratamento da dor (CALIXTO et al., 2000).

O NIQFAR/UNIVALI já estudou uma série de plantas com potencial

antinociceptivo, tendo publicado diversos artigos científicos na área. Algumas

plantas merecem especial destaque, como Marrubium vulgare. Foi demonstrado que

o extrato hidroalcoólico desta planta promoveu efeito antinociceptivo em modelos de

dor aguda em camundongos, estando sua ação atrelada à inibição de diferentes

agentes pró-inflamatórios (DE SOUZA et al., 1998). Seu constituinte majoritário,

marrubiina, foi eficaz enquanto inibindo a nocicepção induzida por diferentes

agentes em modelos clássicos de dor em camundongos (DE JESUS et al., 2000)

De grande importância também foram os estudos realizados com espécies do

gênero Rubus. Niero et al. (2002) evidenciaram o potencial antinociceptivo do

extrato metanólico dos ramos e das raízes de R. imperialis, bem como das frações

obtidas por particionamento com hexano, clorofórmio e acetato de etila. Também

demonstraram o efeito do niga-ichigosídeo F1, isolado da fração acetato de etila das

partes aéreas de R. imperialis nos modelos de dor induzida por ácido acético e por

formalina (NIERO et al., 1999). Posteriormente, Ardenghi et al. (2006) verificaram

que a atividade do niga-ichigosídeo F1 está relacionada aos sistemas

dopaminérgico, colinérgico, glutamatérgico, taquicinérgico e oxinitrérgico. Em

estudos realizados com a espécie R. rosaefolius, pôde-se constatar a ação

48

antinociceptiva dose-dependente de seu extrato hidroalcoólico das partes aéreas,

bem como do composto isolado ácido 28-metoxitormentico (KANEGUSUKU et al.,

2000).

Outra planta que vem sendo estudada exaustivamente pelo grupo é a

Aleurites moluccana. Demonstrou-se que o extrato bruto e, especialmente, a fração

hexânica da planta apresentaram significativa atividade antinociceptiva no modelo

de contorções abdominais induzidas por ácido acético. A via de ação parece não

envolver o sistema opióide, tampouco a liberação de glicocorticóides endógenos

(MEYRE-SILVA, 2003). Um dos metabólitos isolados que explica, em parte, a ação

do extrato de A. moluccana é o flavonóide 2”-O-ramnosil-swertisina, que foi cerca de

16 vezes mais potente do que a aspirina no modelo de contorções abdominais

(MEYRE-SILVA, 1999). Estes promissores resultados viabilizaram uma parceria

entre a UNIVALI e a indústria Eurofarma, propiciando o desenvolvimento de um

novo fitoterápico de ação analgésica e anti-inflamatória de uso oral que já conta com

patente depositada nacional e internacionalmente (CECHINEL-FILHO, 2009).

Mais recentemente, De Souza et al. (2009) descreveram a atividade

antinociceptiva de filiceno, um triterpeno isolado das folhas de Adiantum cuneatum.

O composto foi capaz de inibir de forma dose-dependente as contorções abdominais

induzidas por ácido acético. Através do estudo de mecanismo de ação, foi

evidenciado que parece envolver uma interação entre os sistemas colinérgico,

dopaminérgico, glutamatérgico, GABAérgico e taquicinérgico. Também, Da Silva et

al. (2010) demonstraram a capacidade inibitória de contorções abdominais induzidas

por ácido acético e de nocicepção induzida por capsaicina e carragenina do

composto orientina, isolado de Piper solmsianum.

Hess et al. (2010) averiguaram o potencial antinociceptivo do ácido mirsinóico

B, isolado de espécies do gênero Rapanea, constatando que ele possui capacidade

inibitória sobre diferentes modelos de avaliação, envolvendo principalmente vias

relacionadas ao NO, aos α-adrenoceptores, bem como os sistemas serotoninérgico

e colinérgico. Quintão et al. (2010) demonstraram a atividade anti-hipernociceptiva

do óleo essencial obtido das folhas de Ugni myricoides. Sua atividade, bem como de

seu constituinte majoritário α-pireno, foi evidenciada em modelos de hipernocicepção

mecânica induzida por carragenina e CFA. Também, o óleo essencial inibiu a

hipernocicepção neuropática após constrição parcial do nervo ciático.

49

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais e equipamentos

Os seguintes solventes e drogas foram utilizados: hexano, clorofórmio,

acetato de etila, acetona, etanol, metanol, ácido clorídrico, ácido acético e hidróxido

de sódio (Dinâmica®); acetonitrila e metanol grau CLAE (Tedia®); piridina, metanol

e clorofórmio deuterados (CIL.Inc); éter etílico (Isofar®); indometacina, omeprazol,

cimetidina, carragenina, adjuvante completo de Freund, L-NAME, NEM e betanecol

(Sigma®); hidrado de cloral (Vetec®). Além disto, foram utilizadas placas de sílica

gel 60 F254 e sílica gel 60 (0,063-0,200 para cromatografia em coluna aberta e

0,040-0,063 para cromatografia flash) fornecidas pela Merck®; coluna

cromatográfica para CLAE C18 (Phenomenex®). Os principais equipamentos

utilizados foram os seguintes: espectrômetro de RMN AC-300 (Bruker®),

cromatógrafo líquido de alta eficiência (Shimadzu®) e von Frey eletrônico (Insight®)

4.2 Análise fitoquímica

4.2.1 Material vegetal

Polygala cyparissias foi primeiramente coletada em novembro de 2007 na

Praia da Esplanada, em Santa Catarina, sendo esta utilizada para fitoquímica inicial

e ensaios gastroprotetores. Posteriormente foi coletada em março de 2009 e em

janeiro de 2010 na praia de Navegantes, também em Santa Catarina. Com o extrato

oriundo da coleta de 2009 foram realizados os ensaios anti-hipernociceptivos e os

experimentos por CLAE. Já o obtido da coleta de 2010 foi utilizado para isolar

novamente metabólitos já isolados, objetivando obter maior quantidade dos

mesmos. Um exemplar foi submetido para análise botânica no Herbário FLOR da

Universidade Federal de Santa Catarina, sendo este identificado pela Professora

Leila da Graça Amaral, sob o número de depósito 22.744. Após a secagem a

temperatura ambiente em sala com controle de umidade por um tempo médio de

três semanas, o material vegetal foi triturado e acondicionado para posterior

preparação dos extratos.

50

4.2.2 Obtenção dos extratos

O material obtido em 2007 (1,3 kg de material fresco) e, posteriormente, o de

2010 (1,55 kg de material seco), foram triturados e submetidos a um processo de

extração com acetona por sete dias, objetivando a extração direcionada das

xantonas já descritas (PINHEIRO et al., 1998), obtendo-se os extratos denominados

PCTL-1 (2007) e PCTL-15 (2010). Em seguida, os materiais vegetais foram

submetidos à extração com metanol pelo mesmo período, visando a extração dos

compostos mais polares não obtidos no primeiro processo. Por fim, os extratos

metanólicos foram particionados com clorofórmio para extrair compostos mais

apolares do extrato que não foram totalmente extraídos pela acetona, gerando as

frações clorofórmicas PCTL-2A e PCTL-16A e as frações metanólicas PCTL-2B e

PCTL-16B, de 2007 e 2010, respectivamente. Após filtragem dos extratos, o

solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório sob pressão reduzida,

para obtenção dos respectivos extrato e frações. Já o material coletado em 2010

(13,57 g) sofreu o mesmo procedimento descrito acima, porém a extração foi

realizada direta e unicamente com metanol.

4.2.3 Purificação e identificação dos compostos isolados

Em um primeiro momento, 23,5 g do extrato acetônico (PCTL-1) obtido da

planta coletada em 2007 foi submetido à cromatografia em coluna aberta (CC1),

utilizando 290g de sílica, coluna de Ø de 6 cm e frações coletadas com volume de

aproximadamente 20 ml. O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na

Tabela 1. Tal gradiente foi escolhido baseado na observação prévia do

comportamento do extrato frente a diferentes eluições do mesmo em cromatografia

em camada delgada (CCD). As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e,

posteriormente, agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 2.

51

Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato acetônico (23,5g) de P.

cyparissias.

Eluente % Volume eluído (ml) Frações obtidas

Hexano/AcOEt 95:5 500 1-14

Hexano/AcOEt 90:10 500 15-55

Hexano/AcOEt 80:20 500 56-93

Hexano/AcOEt 50:50 250 94-118

AcOEt 100 250 119-141

AcOEt/MeOH 80:20 250 142-166

AcOEt/MeOH 50:50 150 167-181

MeOH 100 200 182-193

Tabela 2: Junção das frações obtidas na CC1.

Frações Rendimento (mg) Rendimento (%)

PCTL-3A (1-16) 212 0,90

PCTL-3B (17-54) 205 0,87

PCTL-3C (55-78) 189 0,80

PCTL-3D (79-95) 192 0,81

PCTL-3E (96-139) 242 1,03

PCTL-3F (140-158) 513 2,18

PCTL-3G (159-191) 5910 25,15

As frações estudadas, considerando seu perfil cromatográfico em CCD,

foram: PCTL-3C, -3D e -3E. A fração PCTL-3C foi submetida à cromatografia em

coluna flash (CC flash 1) (Ø = 2 cm) com 19 g de sílica. A eluição foi realizada de

modo isocrático com hexano/AcOEt (80:20), levando à obtenção de 60 frações de

aproximadamente 8 ml cada, sendo que a fração PCTL-4A (61 mg) apresentou perfil

cromatográfico promissor em CCD. A esta fração foi adicionado metanol e levado a

aquecimento brando. Em seguida, após solubilização do material obtido na fração,

este foi levado à refrigeração, promovendo a recristalização de um material amorfo e

de coloração branca. O material foi filtrado e o retido (PCTL-5) (32,3 mg) demonstrou

apenas uma banda quando eluído com diferentes fases móveis em CCDs e

reveladas com anisaldeído sulfúrico, sendo denominado como PC1.

52

A fração PCTL-3D foi cromatograda em CC flash (CC flash 2) (Ø = 2 cm), com

20 g de sílica e eluída isocraticamente com hexano/AcOEt (60:40). Foram obtidas 18

frações de aproximadamente 8 ml cada, sendo que PCTL-6B (18 mg) formou cristais

de coloração amarelada e, quando eluído em CCDs com diferentes fases móveis,

obteve-se apenas uma banda quando reveladas com cloreto férrico ou anisaldeído

sulfúrico. Foi denominado PC2 e enviado para elucidação estrutural por RMN.

A fração PCTL-3E foi submetida à cromatografia flash (CC flash 3) (Ø = 2

cm), com 22 g de sílica. A eluição foi isocrática com hexano/AcOEt (60:40), obtendo-

se 66 frações de aproximadamente 8 ml cada. A fração PCTL-7B (9,5 mg) formou

cristais amarelados e, em CCDs eluída com diferentes fase móveis e reveladas com

cloreto férrico ou anisaldeído sulfúrico, apresentou apenas uma banda, denominado

como PC3. O material foi encaminhado para RMN para elucidação estrutural.

Todas as CC flash que seguem foram eluídas com hexano/AcOEt (60:40). A

fração PCTL-7C (73 mg) foi cromatografada novamente (CC flash 4) (Ø = 1 cm; 5,5

g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se 66 frações. PCTL-8A (54 mg) foi novamente

cromatografada (CC flash 5) (Ø = 1 cm; 6,4 g de sílica; frações de 5 ml), sendo

isolado mais 3,5 mg do composto PC3 (PCTL-9A). A fração PCTL-9B (23 mg) foi

recromatografada (CC flash 6) (Ø = 1 cm; 7,1 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-

se a fração PCTL-10A (1,2 mg), identificada como PC3, PCTL-10C (5,7 mg),

identificada como PC4 e PCTL-10B (16 mg), uma mistura de ambos. Assim, PCTL-

10B foi novamente submetida à CC flash (CC flash 7) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica;

frações de 5 ml), obtendo-se fração PCTL-11A (3,2 mg) como PC3, PCTL-11B (5

mg) como mistura de PC3 e 4 e PCTL-11C (6,1 mg) como PC4.

A fração PCTL-9C (15 mg) da CC flash 5 foi recromatografada (CC flash 8) (Ø

= 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se as frações PCTL-12A (2,1 mg),

identificada como PC3, PCTL-12B (3 mg), como mistura de PC3 e 4 e PCTL-12C

(5,1 mg) como PC4. A fração PCTL-7D (18 mg) da CC flash 3 foi submetida a nova

cromatografia (CC flash 9) (Ø = 1 cm; 8,6g de sílica; frações de 5 ml), obtendo-se a

fração PCTL-13B (0,9 mg) de PC4 e a fração PCTL-13C (7 mg), como mistura de

PC3 e 4. Esta foi cromatografada (CC flash 10) (Ø = 1 cm; 8,7 g de sílica; frações de

5 ml), obtendo-se as frações PCTL-14A (1,0 mg), identificada como PC3, PCTL-14B

(0,4 mg), uma mistura de PC3 e 4 e PCTL-14C (0,1 mg) como PC4. Na figura 6

encontra-se um organograma da sequência de isolamento.

53

Figur

CC1

CC flash 1 CC flash 2 CC flash 3

CC flash 4

CC flash 5

CC flash 6

CC flash 7

CC flash 8

CC flash 10

CC flash 9 Recristalização

54

a 6: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-1). Em cinza destacado os compostos isolados.

55

Posteriormente foram realizados novos procedimentos de purificação com

parte do extrato obtido a partir da coleta de janeiro de 2010. Todavia, visando a

obtenção direcionada dos compostos já isolados (PC1-4), adotou-se nova

metodologia para o isolamento destes. Assim, 20 g do extrato acetônico (PCTL-15)

foi submetido à coluna aberta (CC2), utilizando 397 g de sílica, coluna de Ø de 6 cm

e frações coletadas com volume de aproximadamente 250 ml (exceto quando

observada alteração de coloração da fração). O esquema de eluição utilizado

apresenta-se descrito na Tabela 3.

Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento do extrato acetônico de P. cyparissias.


Hexano/Acetona 85:15 1200 1-4




Acetona 100 800 16-19

MeOH 100 500 20

As frações obtidas foram acompanhadas por CCD e, posteriormente,

agrupadas por semelhança química, conforme Tabela 4.



PCTL-17A (1-2) 2450 12,25

PCTL-17B (3) 313 1,56

PCTL-17C (4-5) 421 2,10

PCTL-17D (6-7) 1523 7,62

PCTL-17E (8-9) 170 0,85

PCTL-17F (8’-9’+10-11) 958 4,79

PCTL-17G (12-13) 342 1,71

PCTL-17H (14-20) 7999 40,00

56

As frações 8 e 9 foram reunidas e lavadas repetidas vezes com clorofórmio,

originando a fração 8’-9’ (solúvel em clorofórmio) que foi reunida às frações 10 e 11

por semelhança química. Objetivando o reisolamento das xantonas PC2-4, optou-se

por seguir a purificação com a fração PCTL-17E, visto que esta se encontrava

enriquecida nas mesmas. Assim, realizou-se cromatografia flash (CC flash 11) (Ø =

2 cm; 21 g de sílica; 3 ml por fração), eluída com DCM/AcOEt (80:20), levando a

obtenção de 80 frações. Estas foram reunidas por semelhança química conforme a

tabela 5.

Tabela 5: Junção das frações obtidas na CC flash 11.

As frações PCTL-18B e -18C foram submetidas, separadamente, a repetidas

CCDs preparativas (CCDPs). Em cada placa (20 x 20 cm) não foram aplicados mais

que 10 mg de amostra, sendo a altura de eluição de 16 cm, com fase móvel

constituída de benzeno/AcOEt (8:2). Cada placa foi eluída por três vezes objetivando

uma melhor separação dos constituintes. Ao fim das repetidas CCDPs, obteve-se

22,6 mg de PC3, além de ter sido possível isolar outro composto ainda não isolado

até então, denominado PC5 (12,3 mg). Um organograma para o adequado

entendimento encontra-se ilustrado na figura 7.


PCTL-18A (1-22) 18 0,09

PCTL-18B (23-31) 45 0,22

PCTL-18C (32-40) 35 0,17

57

Figura 7: Organograma de isolamento dos compostos do extrato acetônico de Polygala cyparissias (PCTL-15). Em cinza destacado os compostos isolados.

CC2

CC flash 11

CCDPs

58

Além do extrato acetônico, a fração metanólica (14,2 g) obtida da coleta de

2007 (PCTL-2B) também foi estudada fitoquimicamente. Esta foi submetida à

cromatografia aberta (CC3), utilizando 246 g de sílica e uma coluna de Ø = 5 cm. As

frações foram coletadas com volume de aproximadamente 250 ml (exceto quando

observada alteração de coloração da fração). O esquema de eluição utilizado

apresenta-se descrito na Tabela 6. Da mesma forma que na CC1, o gradiente foi

escolhido baseado na observação prévia do comportamento do extrato frente a

diferentes eluições do mesmo em CCD.

Tabela 6: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da fração metanólica de P. cyparissias.


DCM 100 500 1

DCM/MeOH 95:05 1300 2-9

DCM/MeOH 90:10 400 10

DCM/MeOH 80:20 700 11-13

DCM/MeOH 50:50 800 14-16

MeOH 100 400 17





PCTL-20A (1-3) 93 0,46

PCTL-20B (4-9) 407 2,04

PCTL-20C (10-12) 524 2,62

PCTL-20D (13-15) 4429 22,14

PCTL-20E (16) 3034 15,17

PCTL-20F (17) 1253 6,26

Considerando os perfis cromatográficos e os rendimentos, a fração PCTL-20D

foi recromatografada em coluna aberta (CC4) (226 g de sílica; Ø = 4,5 cm; 10 ml por

fração). O esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 8.

59

Tabela 8: Gradiente de eluição da CC4 na purificação da fração 13-15 da CC3.


DCM/AcOEt/MeOH 60:20:20 800 1-45

DCM/AcOEt/MeOH 50:30:20 400 46-77

DCM/AcOEt/MeOH 30:40:30 300 78-100

MeOH 100 300 101





PCTL-21A (1-7) 32 0,22

PCTL-21B (8-26) 38 0,27

PCTL-21C (27-82) 577 4,06

PCTL-21D (83-100) 734 5,17

PCTL-21E (101) 1012 7,13

A fração PCTL-21B foi submetida a repetidas CCDPs. Em cada placa (20 x 20

cm) não foram aplicados mais que 10 mg de amostra, sendo a altura de eluição de

16 cm, com fase móvel constituída de AcOEt/Acetona/MeOH/H2O/MeCOOH

(25:8:3:1:1). Cada placa foi eluída por três vezes objetivando uma melhor separação

dos constituintes. Ao fim das repetidas CCDPs, obteve-se 16,8 mg de PC6. Um

organograma para o adequado entendimento encontra-se ilustrado na figura 8.

60

Figura 8: Organograma de isolamento dos compostos da fração metanólica de Polygala cyparissias (PCTL-2B). Em cinza destacado os compostos isolados.

CC3

CC4

CCDPs

61

4.2.4 Perfil cromatográfico do extrato de P. cyparissias

Para a obtenção de perfil cromatográfico do extrato metanólico de P.

cyparissias foi utilizada CLAE acoplada a detector de arranjo de diodos. Este método

foi escolhido pelas características químicas dos compostos obtidos, especialmente

das xantonas. Estes metabólitos são caracterizados pela presença de quatro bandas

de intensidade decrescente de absorção em espectros de ultravioleta. As bandas

situam-se nos respectivos comprimentos de onda: 225 a 245 nm (banda I), 245-270

nm (banda II), 300 a 345 nm (banda III) e 335 a 410 (banda IV) (KUSTER; ROCHA,

2007).

4.2.4.1 Preparo das amostras

Foram pesados exatamente cerca de 20 mg de extrato metanólico de P.

cyparissias (coleta de 2009), sendo este solubilizado por sonicação em metanol e o

volume ajustado em balão volumétrico para 10 ml. A solução foi filtrada em filtro de

celulose regenerada (Ø do poro = 0,45 µm), sendo posteriormente disponibilizada

para as análises. Já como padrão, foi eleita a xantona PC3 visto a quantidade de

material disponível. Para verificar seu grau de pureza, foi preparada uma solução

0,55 mg/ml, solubilizada em uma mistura de ACN/MeOH (1:1), com auxílio de

sonicação. Esta solução também foi filtrada conforme já descrito e analizada.

4.2.4.2 Desenvolvimento do método cromatográfico

Objetivando uma adequada separação dos compostos presentes no extrato

de P. cyparissias, vários métodos cromatográficos foram testados. Em todos eles a

temperatura do forno foi de 30 °C, o volume de injeção de 20 µl, o monitoramento

em 254 nm e a coluna utilizada foi uma C18 (250 mm). O único método isocrático

utilizado (método 3) empregou como fase móvel uma mistura de ACN, MeOH e água

acidificada (TFA 0,0125%, pH = 2,9) em uma proporção de 10:10:80. Os métodos

com gradiente encontram-se descritos nas Tabelas 10 a 16.

62

Tabela 10: Descrição do método 1. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%)

0 95 5

60 0 100

Tabela 11: Descrição do método 2. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN. Fluxo de 1 ml/min.


0 80 20

5 70 30

6 60 40

60 0 100

65 0 100

70 80 20



0 98 2

10 80 20

11 70 30

31 50 50

41 30 70

46 30 70

48 98 2

53 98 2



0 98 2

60 0 100

63

Tabela 14: Descrição do método 6. A = H2O (TFA 0,0125%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) C (%)

0 97 1 2

60 0 30 70

Para os dois últimos métodos empregados, optou-se por acidificar a água

com ácido acético a uma concentração de 2%, a fim de verificar o potencial impacto

da mudança do agente acidificante sobre o perfil cromatográfico. Apesar desta

mudança, o pH foi mantido (pH = 2,9).

Tabela 15: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 1 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) C (%)

0 97 1 2

5 97 1 2

10 80 10 10

15 80 10 10

18 70 15 15

23 70 15 15

33 60 20 20

36 60 20 20

41 50 20 30

46 50 20 30

51 30 20 50

54 30 20 50

59 20 25 55

62 20 25 55

67 10 30 60

70 10 30 60

75 0 30 70

80 0 30 70

85 97 1 2

64

O método 8, descrito na tabela 16, foi considerado adequado para obtenção

do perfil cromatográfico do extrato metanólico. Levando isto em consideração, o

padrão (PC3) também foi analisado conforme o mesmo método.

Tabela 16: Descrição do método 7. A = H2O (ácido acético 2%, pH = 2,9); B = ACN; C = MeOH. Fluxo de 0,8 ml/min.

Tempo (min) A (%) B (%) C (%)

0 90 5 5

5 80 10 10

7 80 10 10

10 75 10 15

15 75 10 15

20 70 15 15

25 70 15 15

30 65 15 20

35 65 15 20

40 60 20 20

45 60 20 20

47 55 20 25

50 55 20 25

55 50 20 30

60 40 20 40

65 30 20 50

70 30 20 50

75 20 25 55

80 10 35 55

85 0 60 40

90 90 5 5

65

4.3 Testes farmacológicos

4.3.1 Animais

Nos testes farmacológicos foram utilizados camundongos Swiss machos e

fêmeos, pesando entre 25-40 g provenientes do Biotério Central da UNIVALI. Os

animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com temperatura

mantida a aproximadamente 25 °C e ciclo claro/escuro controlado, com ração e

água ad libitum. Para os experimentos de atividade gastroprotetora, os animais

foram mantidos em jejum por doze horas antes da realização dos experimentos,

sendo adicionada à caixa uma grade para inibir a coprofagia e tiveram livre acesso à

água. Os protocolos experimentais foram submetidos ao Comitê de Ética em

Pesquisa da UNIVALI, sendo aprovado sob o número 414/09 (Anexo C).

4.3.2 Avaliação da atividade gastroprotetora

Na avaliação da atividade anti-úlcera foram realizados experimentos

embasados nos fatores etiológicos da doença no homem, como o aumento da

acidez e da secreção do suco gástrico, uso de AINEs e abuso de álcool etílico. Cada

experimento constituiu-se dos grupos testes, controle positivo e negativo (veículo),

dependendo da necessidade de cada modelo. Todos os experimentos foram

realizados com o auxílio da equipe do Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade.

4.3.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl

A metodologia que foi utilizada foi descrita por Mizui e Doteuchi (1983), com

modificações. Após jejum de 12 horas, os camundongos foram divididos em

diferentes grupos (n=6). O controle positivo foi tratado com omeprazol 30 mg/kg

(0,08 mmol/kg), o controle negativo recebeu o veículo e os grupos tratados

receberam o extrato/frações nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg. Quando utilizado os

compostos isolados, as doses foram de 0,12 mmol/kg (PC1), 0,19 mmol/kg (PC2) e

0,18 mmol/kg (PC3).

Transcorrido uma hora e meia, foram administrados aos animais 0,5 ml de

solução etanol/HCl (60%/0,3 M) (agente lesivo) por via oral e, após mais uma hora e

66

meia, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os

estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior e, após serem

esticados, foram colocados entre placas de vidro para que as imagens pudessem

ser captadas através de scanner e analisadas pelo software EARP, a fim de

determinar-se o número de lesões e seus tamanhos. Posteriormente, realizou-se a

determinação da área total de lesão (mm²), o percentual de área lesada, o índice de

gastroproteção (IG) em porcentagem e o índice de lesões ulcerativas (ULI) calculado

através da severidade das lesões da mucosa gástrica. Para tanto, as úlceras foram

classificadas em tipo 1 (área de úlcera menor que 1mm²), tipo 2 (área de úlcera

entre 1 e 3 mm²) e tipo 3 (área de úlcera maior que 3 mm²). Em seguida, o ULI foi

calculado com base na seguinte fórmula:

ULI = 1 x (T1) + 2 x (T2) + 3 x (T3)

onde T1, T2 e T3 são, respectivamente, o número de úlceras do tipo 1, do tipo 2 e

do tipo 3. O IG foi calculado através da seguinte fórmula:

IG = 100 – (ULItratado x 100 / ULIcontrole)

4.3.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não-esteróide

associada à estimulação parassimpaticomimética

A metodologia utilizada foi adaptada daquela descrita por Rainsford (1980).

Após o jejum de 12 horas, os camundongos foram divididos em diferentes grupos

(n=6). O controle positivo foi tratado com cimetidina 100 mg/kg, o controle negativo

com o veículo e os grupos tratados com o extrato/fração nas doses de 50, 125 e 250

mg/kg. Após uma hora e meia da administração, os animais receberam 100 mg/kg

de indometacina por via oral, associada à betanecol via intraperitonial na dose de 5

mg/kg em solução fisiológica.

Após cinco horas da administração de indometacina os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo

da curvatura maior. Após serem esticados, os estômagos foram colocados entre

placas de vidro para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e

analisadas pelo software EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e seus

67

tamanhos. Posteriormente realizou-se a determinação da área total de lesão,

percentual de área lesada, IG e ULI, conforme descrito anteriormente.

4.3.2.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético

A metodologia utilizada foi adaptada daquela descrita por Takagi, Okabe e

Saziki (1969). Antes da indução da úlcera, os animais sofreram uma adaptação

contra o estresse causado durante a administração das doses, sendo necessária a

restrição alimentar por 2 horas diárias (9:00 às 10:00 e 17:00 às 18:00). O acesso à

água foi mantido livre e duas vezes ao dia (10:30 e 18:30) foi administrado 0,5 ml de

água, por três dias.

Passado este período, os animais foram deixados em jejum de 12 horas nas

condições já descritas. Após anestesia com tiopental sódico, foram e submetidos a

uma incisão longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide. Com a exposição do

estômago, foi injetado na camada subserosa da parede externa do órgão 50 µl de

solução de ácido acético 20% na face posterior e 50 µl de solução salina na face

anterior.

O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do

líquido injetado. O estômago foi lavado com salina e a parede abdominal suturada.

Após a recuperação dos animais, iniciou-se o tratamento (2x/dia). Por 7 dias o

controle positivo foi tratado com cimetidina 100 mg/kg, o controle negativo com o

veículo e os grupos tratados com o extrato/fração na dose de 125 mg/kg.

Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical, e os estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura

maior. Após serem esticados, os estômagos foram colocados entre placas de vidro

para que as imagens pudessem ser captadas através de scanner e analisadas pelo

software EARP, a fim de determinar-se se houve regressão da lesão nos

tratamentos quando comparados com o controle, onde realizou-se a determinação

da área total de lesão e o percentual de área lesada.

68

4.3.3 Estudo do mecanismo de ação gastroprotetor

4.3.3.1 Participação do óxido nítrico

Para a realização deste experimento, foi utilizado o método descrito por

Arrieta et al. (2003), com algumas modificações. Os camundongos foram separados

em oito grupos (n=6), sendo que quatro grupos receberam o pré-tratamento com L-

NAME (N-nitro-L-Arginina metil éster), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase, na

dose de 70 mg/kg, i.p. e os quatro grupos restantes foram pré-tratados com salina,

i.p. Após 30 minutos dos pré-tratamentos, aplicou-se o teste de indução de úlcera

por etanol, utilizando como tratamento o extrato acetônico e a fração metanólica de

P. cyparissiass, na dose de 125 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg)

e controle negativo (veículo). Passado o tempo do teste (3h), os animais foram

sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura,

esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por

software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o % de área lesada.

4.3.3.2 Participação dos grupamentos sulfidrilas

Para a avaliação dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção foi adotado o

modelo de Matsuda e Yoshikawa (1999). Os animais foram separados em oito

grupos (n=6), sendo que quatro grupos receberam o pré-tratamento com NEM (N-

etilmaleimida), um quelante de grupamentos sulfidrila, na dose de 10 mg/kg, i.p. e os

quatro grupos restante foram pré-tratados com salina, i.p. Após 30 minutos dos pré-

tratamentos, foi aplicado o teste de indução de úlcera por etanol, utilizando como

tratamento o extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias, na dose de

125 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg) e controle negativo

(veículo). Passado o tempo do teste (3h), os animais foram sacrificados e os

estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de

Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de

imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada.

69

4.3.4 Avaliação da atividade anti-Helicobater pilory

4.3.4.1 Cepa de Helicobater pilory

A cepa de Helicobater pilory ATCC 43504 utilizada foi cedida pelo laboratório

de micro-organismos de referência da Fiocruz-RJ. Foi mantida congelada a – 70⁰C

no laboratório de imunologia da Universidade Regional de Blumenau. Para ativação,

foi semeada em caldo Brucella e incubada a 35⁰C por 24-48 horas. Após esse

período, foi inoculada em ágar Brucella acrescido de 10% de sangue de carneiro e

incubada 48-72 horas a 35⁰C em condições de microaerofilia (85% N2, 10% CO2 e

5% O2) e alta umidade. A identificação bacteriana foi realizada através da morfologia

característica na coloração de Gram e testes bioquímicos de catalase, oxidase e

urease positivos.

4.3.4.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

O teste foi realizado pelo aluno de mestrado Alessandro Conrado de Oliveira

Silveira, sob a orientação do Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz. A CIM foi determinada

pelo método de diluição em ágar sólido, de acordo com as recomendações do

Clinical Laboratory Standards Institute (2007). A partir de soluções estoque dos

extratos de 40 mg/ml, foram realizadas diluições seriadas. Em vidros individuais, 50

70

µl de cada diluição foi adicionado à 950 µl de ágar Brucella acrescido de 10 % de

sangue carneiro, líquido a 45-50⁰C, atingindo concentrações de 2.000, 1.000, 500,

250, 125, 62,5, 31,25 e 15,625 µg/ml. O inóculo bacteriano foi preparado baseado na

escala turbidimétrica 0,5 de MacFarland. Após solidificação do meio de cultura, foi

semeado 1 µl da suspensão bacteriana em cada vidro com os extratos diluídos em

ágar. Foram incubados em condições ideais de microaerofilia e umidade, a 35⁰C por

48-72 horas. A CIM foi definida como a menor concentração do extrato capaz de

inibir completamente o crescimento bacteriano. Todos os experimentos foram

realizados em triplicata.

4.3.5 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva

4.3.5.1 Análise do limiar mecânico através do von Frey eletrônico e monofilamento

de Von Frey

Todos os experimentos foram realizados pela aluna de mestrado Nicole

Anzanello Meira, sob a orientação da Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão. Para

avaliar a hipernocicepção mecânica, os animais submetidos aos modelos de

hipernocicepção mecânica induzida por diferentes agentes ou por procedimento

cirúrgico foram colocados individualmente em compartimentos de acrílico

transparentes (9 x 7 x 11 cm), localizados em uma plataforma de arame elevada

para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os animais foram

aclimatados por, pelo menos, 1 hora antes dos testes comportamentais para

determinar o limiar mecânico basal. Após determinado esse parâmetro, os animais

71

foram tratados com o extrato, compostos isolados ou veículo e posteriormente,

receberam uma injeção intraplantar do agente irritante.

A hipernocicepção mecânica dos animais que receberam carragenina por via

i.pl. foi avaliada através de um anestesiômetro eletrônico, que consiste em um

transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em

gramas. O contato do transdutor de pressão à pata dos animais é realizado por meio

de uma ponteira descartável de polipropileno com 0.5 mm de diâmetro adaptada a

este, que entre as malhas da rede de arame, é exercida uma pressão linearmente

crescente no centro da planta da pata do camundongo até que o animal produza

uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata estimulada. Os

estímulos são repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar três

medidas similares com uma clara resposta de “flinch” após a retirada da pata. A

intensidade de hipernocicepção é quantificada como a variação na pressão obtida

subtraindo-se a média de três valores expressos em gramas (força) observada antes

do procedimento experimental (limiar basal dos animais) da média de três valores

em gramas (força) após a administração do agente em diferentes intervalos de

tempo (CUNHA et al., 2004).

Nos demais modelo, foi utilizado o monofilamento de von Frey 0,6 g, que

consiste em um filamento de nylon de 0.6 mm de diâmetro. Com este aparato foi

exercida uma pressão no centro da planta da pata do camundongo até que o animal

produzisse o “flinch” da pata estimulada. Os estímulos foram repetidos dez vezes

com a finalidade de se obter a freqüência de resposta em porcentagem de cada

animal.

4.3.5.2 Hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina

A indução da hipernocicepção de origem inflamatória em camundongos foi

realizada através da injeção i.pl. de 50 µl de carragenina (300 µg/pata) na superfície

plantar da pata direita traseira. De acordo com dados descritos na literatura, esta

dose é capaz de produzir edema, hipernocicepção e aumento significativo do

tamanho da pata injetada, porém os animais continuam apresentando

comportamento normal (DE CAMPOS et al., 1996; BORTOLANZA et al., 2002;

QUINTÃO et al., 2005). Inicialmente, os animais foram pré-tratados com o extrato

72

metanólico de P. cyparissias (3, 10 e 30 mg/kg, i.p.) ou compostos obtidos, nas

doses de 0,02, 0,07 e 0,24 µmol/kg para PC1, 0,04, 0,12 e 0,39 µmol/kg para PC2,

0,04, 0,11 e 0,37 µmol/kg para PC3 e 0,03, 0,09 e 0,31 µmol/kg para PC4, todos via

i.p.. Após 30 minutos, os animais foram levemente sedados com éter para receber

uma injeção i.pl. de carragenina, sendo posteriormente avaliados quanto à

hipernocicepção mecânica através von Frey eletrônico, nos intervalos de 1, 3, 4, 6,

24 e 48 horas após a injeção de carragenina.

4.3.5.3 Hipernocicepção mecânica induzida por lipopolissacarídeo (LPS)

Na indução da hipernocicepção mecânica por LPS bacteriano, a medida basal

de todos os camundongos foi avaliada e em seguida, os animais foram pré-tratados

com o extrato metanólico de P. cyparissias nas mesmas doses já citadas. Após 30

minutos, os animais foram levemente anestesiados e receberam uma injeção

intraplantar de LPS (100 ng/pata, 20 µl) na pata direita traseira. Posteriormente, foi

avaliada a hipernocicepção mecânica através do monofilamento de von Frey nos

intervalos de tempo de 1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas (SAFIEH-GARABEDIAN et al., 2000)

após a injeção do agente irritante.

4.3.5.4 Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de Freund

(CFA)

Para induzir a resposta inflamatória persistente, os animais receberam injeção

i.pl. de 20µl de CFA (1 mg/ml de bacilo de Mycobacterium tuberculosis inativado por

calor; cada mililitro de veículo contém 0,85ml de óleo de parafina + 0,15ml de

monooleato de manida) na superfície plantar da pata direita traseira, sendo que a

hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey.

Para avaliar o efeito preventivo sobre a hipernocicepção mecânica, os

animais foram previamente tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias nas

doses de 0,3, 1 e 3 mg/kg. Após 30 minutos, os animais receberam uma injeção i.pl.

de CFA, e a hipernocicepção mecânica foi avaliada em diferentes intervalos de

tempos (1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas) com o monofilamento de Von Frey (CAO et al.,

1998).

73

4.3.5.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela prostaglandina E2 (PGE2)

Na indução da hipernocicepção mecânica pela PGE2, a medida basal dos

animais foi previamente avaliada através do von Frey eletrônico antes de serem pré-

tratados. Os animais do grupo tratado receberam o extrato metanólico de P.

cyparissias nas mesmas doses já citadas e, após 30 minutos, os animais foram

anestesiados levemente com éter para receber injeção intraplantar de 20 µl de PGE2

(0,1 nmol/pata) na pata direita traseira. Em seguida, a hipernocicepção mecânica foi

avaliada através do monofilamento de von Frey, nos intervalos de tempo de 1, 2, 4 e

6 horas após a injeção i.pl. de PGE2 (INCEOGLU et al., 2006).

4.3.5.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina

Primeiramente foi avaliada a medida basal dos animais através do von Frey

eletrônico antes de serem tratados. Nos camundongos dos grupos tratados foi

administrado o extrato metanólico de P. cyparissias nas doses já citadas e, 30

minutos após, os animais foram levemente anestesiados e receberam injeção

intraplantar de 20 µl de epinefrina (100 ng/pata) na pata direita traseira. Em seguida,

a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do monofilamento de von Frey nos

intervalos de tempo de 10, 30 minutos, 1, 2, 4 e 6 horas após a injeção de epinefrina

(KHASAR et al., 2005).

4.3.5.7 Hipernocicepção mecânica induzida por constrição parcial do nervo ciático

(CPNC)

Antes da cirurgia, foi avaliada a medida basal do limiar dos animais para

posterior comparação e confirmação do desenvolvimento da neuropatia.

Inicialmente, os camundongos foram anestesiados com hidrato de cloral 7% (8

ml/kg, i.p.) e a CPNC foi realizada amarrando 1/3 a ½ da porção dorsal do nervo

ciático com fio de seda 8.0. Um grupo de animais teve o nervo ciático exposto, no

74

entanto não foi efetuada a amarração (grupo falso-operado). No 7º dia pós-

operatório os animais foram avaliados quanto à hipernocicepção mecânica através

do monofilamento de von Frey. Depois de confirmado o desenvolvimento de

neuropatia, foi iniciado o tratamento com o extrato metanólico de P. cyparissias nas

doses de 3 e 10 mg/kg. O tratamento foi realizado 2 vezes ao dia (no início da

manhã e no final da tarde) por 4 dias consecutivos, e a hipernocicepção mecânica

foi avaliada 6 horas após a primeira administração do dia (SELTZER; DUBNER;

SHIR, 1990; MALMBERG; BASBAUM, 1998).

4.3.6 Análise estatística

Os resultados estão apresentados como a média ± erro padrão da média

(EPM, 95%). Para os dados referentes à gastroproteção, utilizou-se a análise de

variância (ANOVA) com pós-teste de Dunnett ou de Tukey. Para os dados referentes

à atividade anti-hipernociceptiva, as porcentagens de inibição são citadas como a

média ± EPM da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas obtidas

para cada experimento individual em relação ao grupo controle correspondente. A

análise estatística dos dados foi realizada por meio de ANOVA de duas vias,

seguido do teste de Bonferroni. Para ambas as atividades, valores de p menores

que 0,05 (p<0,05) são considerados como valores significantes. Todas as análises

citadas acima foram realizadas utilizando o programa Graphpad PRISM 4.0® ou

Graphpad Instat®.

75

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise fitoquímica

5.1.1 Extratos obtidos

Os rendimentos dos extratos e frações encontram-se na Tabela 17.

Tabela 17: Rendimentos dos extratos e frações obtidos de P. cyparissias.

Material Coleta Solvente Massa (g) Rendimento (g) Rendimento (%)

Extrato 2007 Acetona 1300* 43,50 3,35

Fração 2007 Clorofórmio 1300* 4,70 0,36

Fração 2007 Metanol 1300* 24,30 1,87

Extrato 2009 Metanol 13,57 3,98 29,33

Extrato 2010 Acetona 1550 83,81 5,41

Fração 2010 Clorofórmio 1550 15,04 0,97

Fração 2010 Metanol 1550 46,66 3,01

76

* Material fresco

Através da comparação por CCD dos extratos e frações obtidos em 2007 e

em 2010, observou-se que não houve variação dos seus perfis químicos qualitativos.

5.1.2 Identificação dos compostos obtidos

5.1.2.1 PC1

Obteve-se 32,3 mg do composto PC1. Este foi identificado através de co-CCD

com padrão conhecido, RMN ¹H (figuras 10-12) e RMN ¹³C (figura 13). Assim,

considerando todas as informações obtidas, foi confirmado a estrutura de (24 S)-24-

etil-5α-colesta-7,E-22-dien-3β-ol (PM = 412), também conhecido como espinasterol

(Figura 9).

OH

19

18

25

29

27

26

21

H

H H

1

2

3

45

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

20

22

23 24

28

Figura 9: Espinasterol.

Os simpletos em 0,55 e 0,80 ppm correspondem aos hidrogênios das metilas

C-18 e C-19, respectivamente. Os sinais dos prótons das metilas C-21, C-26, C-27 e

C-29 encontram-se centrados em: 1,03 ppm (d, J = 6Hz), 0,82 ppm (d, J = 6 Hz),

0,85 ppm (d, J = 6Hz) e 0,80 ppm (dd, J indeterminado). Os hidrogênios olefínicos

de C-22 e C-23 foram detectados pelos dupletos de dupletos centrados em 5,16

ppm (J = 15 e 9 Hz) e em 5,02 (J = 15 e 9 Hz). Já o próton de C-7 foi identificado

pelo sinal em 5,15 ppm. Por fim, o tripleto de tripleto centrado em 3,60 ppm refere-se

ao hidrogênio de C-3.

77

Figura 10: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado.

Figura 11: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterado expandido na região de 0,70 a 2,10 ppm.

78

Figura 12: Espectro de RMN ¹H do composto PC1 em clorofórmio deuterada expandido na região de 3,45 a 3,80 ppm e 4,90 a 5,30 ppm.

79

Figura 13: Espectro de RMN ¹³C do composto PC1 em CDCl3.

Os sinais referentes aos carbonos estão apresentados na tabela 18, bem

como os de hidrogênio, sendo esses comparados à literatura (GAZONI, 2009).

Tabela 18: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC1 em comparação com dados da literatura para o espinasterol, ambos em CDCl3.

80

Carbono

RMN ¹H

δ (ppm); mult; J (Hz)

PC1

RMN ¹H


Literatura

RMN ¹³C

δ (ppm)

PC 1

RMN ¹³C

δ (ppm)

Literatura

1 - - 37,2 37,1

2 3,60; tt 3,61; tt 31,5 31,5

3 - - 71,1 71,0

4 - - 38,0 38,0

5 - - 40,3 40,2

6 - - 29,7 29,6

7 5,15 5,16 117,5 117,4

8 - - 139,6 139,5

9 - - 49,5 49,4

10 - - 34,3 34,2

11 - - 21,6 21,5

12 - - 39,5 39,4

13 - - 43,3 43,3

14 - - 55,2 55,1

15 - - 23,0 23,0

16 - - 28,5 28,5

17 - - 55,9 55,8

18 0,55 0,55 12,1 12,0

19 0,80 0,80 13,1 13,0

20 - - 40,8 40,8

21 1,03; d; 6 1,03; d; 6,5 21,4 21,4

22 5,16; dd; 15,0/9,0 5,16; dd; 15,5/8,5 138,2 138,2

23 5,02; dd; 15,0/9,0 5,03; dd; 15,5/8,5 129,5 129,4

24 - - 51,3 51,2

25 - - 31,9 31,9

26 0,82; d; 6,0 0,80; d; 6,0 19,0 19,0

27 0,85; d; 6,0 0,85; d; 6,5 21,1 21,1

28 - - 25,4 25,4

29 0,80; t; indeterminado 0,81; t; 7,5 12,2 12,2

81

Diversos estudos farmacológicos já foram realizados com o espinasterol.

Através de um estudo bioguiado, Villaseñor et al. (1996) verificaram a atividade

antigenotóxica do esteróide frente ao teste do micronúcleo e, posteriormente, sua

atividade antimutagênica, visto que foi capaz de diminuir a incidência de tumor de

pele em ratos na ordem de 55,6 % (VILLASEÑOR; DOMINGO, 2000). Jeon et al.

(2005) demonstraram a eficácia do espinasterol contra células cancerosas de seio e

ovário. Mais recentemente, Ravikumar et al. (2010) evidenciaram que o esterol foi

capaz de inibir a proliferação celular contra linhagem CACO-2, além de proteger

contra a mutação induzida por metil metano sulfonado. Jeong et al. (2010)

verificaram que espinasterol aumentou a resistência de células hipocampais HT22

ao dano oxidativo causado por glutamato, além de suprimir a expressão de enzimas

e mediadores pró-inflamatórios induzida por LPS, inibindo, também, a produção de

NO, PGE2, TNF-α e IL-1β.

Em outro estudo, Jeong et al. (2004) demonstraram a capacidade do

espinasterol em inibir a proliferação de células mesangiais glomerulares induzida

pela alta concentração de glicose, sendo em torno de mil vezes mais potente que a

sinvastatina, além de reduzir o aumento nos níveis séricos de triglicérides, bem

como a excreção de proteínas na urina de ratos diabéticos induzidos por

estreptozotocina.

Meotti et al. (2006) e Boller et al. (2010) demonstraram a atividade

antinociceptiva do esterol no modelo de contorções induzidas por ácido acético e,

posteriormente, contra a nocicepção induzida por glutamato (RIBAS et al., 2008),

enquanto que Mata et al. (1997) demonstraram sua capacidade espasmolítica sobre

íleo de rato.

5.1.2.2 PC2

Através de CCDs eluídas com diferentes fases móveis e reveladas com

diferentes reveladores, confirmou-se o isolamento de 18 mg de um composto

fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 15 e 16), obtido com piridina deuterada,

confirmou a estrutura já descrita por Pinheiro et al. (1998), 1,3-dihidroxi-7-

metoxixantona (PM = 258) (Figura 14).

82

O

O

CH3 O OH

OH

123456

7 8

Figura 14: 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona.

O simpleto presente em 13,61 ppm indica um próton do grupo hidroxila

quelado na posição C-1. Outro simpleto em 3,71 ppm refere-se aos três hidrogênios

do grupo metoxila em C-7. O dupleto centrado em 6,73 ppm com constante de

acoplamento meta J = 1,8 Hz é referente ao H-4, enquanto que o centrado em 6,76

ppm com acoplamento meta J = 1,8 Hz refere-se ao H-2. Observa-se que estes

dados encontram-se descritos na literatura (PINHEIRO et al., 1998), todavia, pela

pequena diferença de deslocamento químico, eles podem ser intercambiáveis. H-8 é

definido pelo dupleto centrado em 7,81 ppm com constante de acoplamento meta J

= 2,7 Hz. Os sinais em 7,40 ppm referem-se a H-5 e H-6. Todos estes dados

confirmam a estrutura de 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona.

Também chamada de isogentisina, 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona já foi

isolada anteriormente de Gentiana lutea (ABERHAM et al., 2007) e Polygala

alpestris (DALL’ACQUA et al., 2004), tendo sido estudada farmacologicamente

frente a diferentes potenciais atividades. Savikin et al. (2009) demonstraram sua

atividade antimicrobiana contra várias bactérias gram-positivas e gram-negativas,

bem como contra Candida albicans. Já em outro estudo, Capettini et al. (2009)

evidenciaram o efeito vaso relaxante da xantona em anéis de aorta de forma dose

dependente, não estando esta atividade atrelada a propriedade antioxidante do

metabólito. Schmieder et al. (2007) verificaram que isogentisina foi capaz de

proteger o dano no epitélio vascular causado pelo cigarro, estando esta propriedade

relacionada à ativação das funções de reparo celular, não interferindo diretamente

com os componentes químicos do cigarro.

83

Figura 15: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada.

Figura 16: Espectro de RMN ¹H do composto PC2 em piridina deuterada expandido na região de 6,5 a 8,0 ppm.

84

5.1.2.3 PC3

O isolamento de um composto fenólico foi determinado por revelação de

diferentes CCDs, utilizando eluentes distintos, com cloreto férrico. O espectro de

RMN ¹H (Figuras 18 e 19) demonstrou o isolamento de 43,1 mg de 1,7-dihidroxi-2,3-

metilenodioxixantona (PM = 272) (Figura 17).

O

OH

O OH

O

O

123456

7 8

Figura 17: 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona.

Em 13,50 ppm há um sinal referente ao hidrogênio de uma hidroxila quelada

em C-1. O simpleto em 6,15 ppm caracteriza os dois prótons refrente a um grupo

metilenodioxi, encontrado em C-2 e C-3. O simpleto em 6,70 ppm refere-se ao H-4,

estabelecendo a substituição do anel A. H-8 é definido pelo dupleto centrado em

8,04 ppm (J = 3,0 Hz) com constante de acoplamento meta. O dupleto centrado em

7,48 ppm (J = 9,0 Hz) é atribuído a H-5 orto relacionado. Assim, há a confirmação da

estrutura de 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona. O metabólito já foi isolado

também de Polygala fallax (MA et al, 2003), sendo que ainda não investigado

farmacologicamente.

85


86


5.1.2.4 PC4

Por diferentes CCDs com revelação por cloreto férrico e anisaldeído sulfúrico,

foi possível detectar o isolamento de 17,9 mg de um composto fenólico. O espectro

de RMN ¹H (Figura 21) confirmou se tratar do composto 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-

dimetoxixantona (PM = 320) (Figura 20).

O

O

O OH

O

OH

CH3

OH

OH

CH31

23456

7 8

Figura 20: 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona.

Pelo RMN ¹H pôde-se deduzir uma estrutura simétrica, visto que o espectro

apresentou apenas três sinais. O simpleto em 3,96 ppm é atribuído aos seis prótons

87

de dois grupos metoxílicos (C-2 e C-7). O simpleto em 12,56 ppm indica a presença

de dois hidrogênios de hidroxilas queladas em C-1 e C-8. O simpleto em 6,74 ppm

refere-se aos dois prótons CH aromáticos. Assim, tem-se a estrutura de 1,3,6,8-

tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona, uma xantona não estudada do ponto de vista

farmacológico e até então só descrita para P. cyparissias.


5.1.2.5 PC 5

Através de CCDs com posterior revelação com cloreto férrico, detectou-se o

isolamento de 12,3 mg de um composto fenólico. O espectro de RMN ¹H (Figuras 23

e 24), obtido com piridina deuterada, confirmou a estrutura já descrita por Pinheiro et

al. (1998), 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona (PM = 288) (Figura 22).

88

O

OH

O OH

O

O

CH3

CH3

123456

7 8

Figura 22: 1,7-dihidroxi-2,3-dimetoxixantona.

O simpleto presente em aproximadamente 13,47 ppm indica um próton de

grupo hidroxila quelado na posição C-1. Já os simpletos em 3,87 ppm e 3,98 ppm

são referentes aos três hidrogênios de grupos metoxílicos da posição C-2 e C-3.

Juntamente com o simpleto em 6,62 ppm, referente a H-4, tem-se a estrutura do

primeiro anel. No segundo anel há um dupleto em 8,05 ppm (J = 2,6 Hz), indicando

acoplamento meta, referente a H-8. Os demais sinais encontram-se encobertos pelo

sinal da piridina. Porém, conforme a literatura (PINHEIRO et al., 1998), deveria-se

observar um dupleto em aproximadamente 7,54 ppm com J próximo a 8,5 Hz,

referente a H-5 acoplando em orto com H-6. Ainda, um duplo dupleto centrado em

aproximadamente 7,60 ppm (J aproximadamente 9,0 e 2,9 Hz), atribuído a H-6, orto-

e meta-acomplando com H-5 e H-8.

89



90

Até o momento, PC5 já foi isolado também de Polygala tenuifolia (FUJITA et

al., 1991) e de Polygala alpestris (DALL’ACQUA et al., 2004), existindo apenas dois

estudos farmacológicos realizados. Sayah et al. (1999), verificaram que a xantona foi

capaz de antagonizar, por mecanismo de ação não-competitivo, mas de modo

reversível, a contração promovida por diversos mediadores em traquéia de cobaias

in vitro. Ademais, de Campos et al. (1997) demonstraram sua atividade anti-

nociceptiva no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.

5.1.2.6 PC 6

Por meio de CCD eluída com diferentes fases móveis, revelada com

anisaldeído sulfúrico e cloreto férrico, foi possível detectar o isolamento de 16,8 mg

de um composto fenólico. Através do espectro de RMN ¹H (Figuras 26 e 27) e de ¹³C

(Figura 28) em CD3OD, confirmou-se a estrutura de kaempferol 3-O-β-D-glicosilado,

também conhecido como astragalina (PM = 448) (Figura 25).

12345

67 8

OOH

OH

O

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

1'2' 3' 4'

5'6'

1"

2"3"

4"

5"

6"

Figura 25: Kaempferol 3-O-β-D-glicosilado.

91

Figura 26: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD.

Figura 27: Espectro de RMN ¹H do composto PC6 em CD3OD expandido na região de 5,0 a 9,0 ppm.

92

Figura 28: Espectro de RMN ¹³C do composto PC6 em CD3OD.

No espectro de RMN ¹H, centrado em 8,05 ppm, há um dupleto (J = 7,8 Hz)

referente a dois hidrogênios da genina: H-2’ e H-6’. O sinal referente a H-3’ e H-5’ é

visualizado no dupleto (J = 7,8 Hz) centrado em 6,89 ppm. Em 6,38 ppm há um

dupleto (J não identificável) indicativo do H-8, enquanto que em 6,19 ppm há outro

dupleto (J não identificável), indicando H-6. Ademais, o dupleto referente ao

hidrogênio anomérico encontra-se em aproximadamente 5,14 ppm, com um J de 6,0

Hz, indicativo de acoplamento axial-axial.

Já no espectro de RMN ¹³C pode-se observar os seguintes sinais para a

genina e seus carbonos atribuídos: 179,5 ppm (C-4), 167,9 ppm (C-7), 163,0 ppm

(C-5), 161,8 ppm (C-4’), 159,2 ppm (C-2), 158,8 ppm (C-9), 135,6 ppm (C-3), 132,5

ppm (C-2’, 6’), 122,8 ppm (C-1’), 116,3 ppm (C-3’, 5’), 105,3 ppm (C-10), 100,7 ppm

93

(C-6) e 95,4 ppm (C-8). Os demais sinais são referentes à porção glicosídica da

molécula: 104,5 ppm (C-1”), 78,5 ppm (C-5”), 78,1 ppm (C-3”), 75,7 ppm (C-2”), 71,4

ppm (C-4”) e 62,6 ppm (C-6”).

Tomados os dados em conjunto e os comparando à literatura (FENG et al.,

2007), conforme Tabela 19, é possível determinar a estrutura como sendo

astragalina. Destaca-se que esta é a primeira vez que este composto é isolado da

espécie em estudo.

Farmacologicamente, a astragalina já foi bastante estudada. Lee et al. (1981)

demonstraram sua atividade anti-leucêmica, enquanto que Kameda et al. (1987)

verificaram seu potencial inibitório sobre a enzima conversora de angiotensina. Mais

recentemente, demonstrou-se sua capacidade inibitória sobre o desenvolvimento de

dermatites, envolvendo a redução de liberação de histamina e de IgE (KOTANI et

al., 2000). Ni et al. (1999) evidenciaram sua propriedade inibitória de proliferação de

células humanas mesangiais, indicando sua potencial aplicabilidade para prevenção

de doenças crônicas renais. Seu potencial antioxidante também já foi demonstrado

pelo método ABTS (HAN et al., 2004), bem como sua atividade lipolítica (OHKOSHI

et al., 2007). Ademais, Inaba et al. (2008) demonstraram sua atividade inibitória

sobre a produção de PGE2 em células epiteliais da gengiva.

94

Tabela 19: Valores de deslocamento químico (δ) de RMN ¹H e RMN ¹³C obtidos para PC6 e comparação com dados da literatura para a astragalina, ambos em CD3OD.

Carbono

RMN ¹H


PC6

RMN ¹H


Literatura

RMN ¹³C

δ (ppm)

PC 6

RMN ¹³C

δ (ppm)

Literatura

2 - - 159,2 159,1

3 - - 135,6 135,4

4 - - 179,5 179,5

5 - - 163,0 163,3

6 6,19; d; indeterminado 6,19; d; 1,3 100,7 99,9

7 - - 167,9 166,2

8 6,38; d; indeterminado 6,39; d; 1,3 95,4 94,8

9 - - 158,8 158,5

10 - - 105,3 105,7

1’ - - 122,8 122,8

2’ 8,05; d; 8,4 8,04; d; 8,8 132,5 132,3

3’ 6,89; d; 7,8 6,87; d; 8,8 116,3 116,1

4’ - - 161,8 161,6

5’ 6,89; d; 7,8 6,87; d; 8,8 116,3 116,1

6’ 8,05; d; 8,4 8,04; d; 8,8 132,5 132,3

1’’ 5,14; d; 6,0 5,24; d; 7,2 104,5 104,1

2’’ - - 75,7 75,7

3’’ - - 78,1 78,0

4’’ - - 71,4 71,4

5’’ - - 78,5 78,4

6’’ - - 62,6 62,6

5.1.3 Perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias

Como metodologia inicial, foi utilizado o sistema gradiente apresentado na

Tabela 10 (gradiente linear H2O/MeOH). A partir desta, obteve-se o cromatograma

demonstrado na Figura 29.

95

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

mA

U

010

2030

4050

mA

U

0

10

20

30

40

50

Figura 29: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 1 descrito na Tabela 10.

Neste cromatograma foi possível observar que a maioria dos compostos

foram eluídos ao fim da corrida. Além disto, provavelmente pela presença de

metanol no método, a linha base não ficou estável após os 25 minutos. Assim,

partiu-se para o método 2, descrito na Tabela 11 (gradiente linear H2O/ACN). Com a

mudança do metanol pela acetonitrila, esperou-se obter uma eluição menos tardia

dos compostos presentes no extrato, visto o aumento de força (hidrofobicidade) do

solvente, bem como uma melhor estabilização da linha base. O cromatograma

obtido está apresentado na Figura 30.

96

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

mA

U

010

2030

4050

6070

mA

U

0

10

20

30

40

50

60

70


Com o método 2, ao contrário do que ocorreu com o primeiro método, os

compostos eluíram muito precipitadamente, obtendo-se uma baixa separação entre

eles. Na sequência, objetivando facilitar o método, partiu-se para uma eluição

isocrática de H2O/ACN/MeOH 80:10:10 (método 3 já descrito). O cromatograma está

apresentado na Figura 31.

Minutes

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0

mA

U

020

4060

8010

0

mA

U

0

20

40

60

80

100

Figura 31: Cromatograma obtido para o extrato metanólico de P. cyparissias da coleta de 2009, conforme método 3 já descrito.

97

Observa-se uma piora na resolução dos picos, já que praticamente todos os

compostos eluíram de forma conjunta no início da corrida. Com isto, descartou-se

metodologias isocráticas, partindo para novo gradiente no método 4, descrito na

Tabela 12 (gradiente com steps H2O/ACN). O cromatograma está disposto na Figura

32.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

mA

U

010

2030

4050

mA

U

0

10

20

30

40

50


No cromatograma observa-se que muitos compostos eluíram conjuntamente

após 10 minutos de corrida. Assim, testou-se o método 5, descrito na Tabela 13

(gradiente linear H2O/ACN), diminuindo a força de eluição, obtendo-se o

cromatograma apresentado na Figura 33.

98

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

mA

U

020

4060

8010

0

mA

U

0

20

40

60

80

100


Observou-se uma melhora na separação dos compostos, porém demonstrou-

se a necessidade de diminuir ainda mais a força do solvente orgânico. Assim,

tentou-se o método 6 com metanol, descrito na Tabela 14 (gradiente linear

H2O/ACN/MeOH). O uso de 2 solventes orgânicos diferentes (metanol e acetonitrila)

foi escolhido para propiciar diferentes interações entre o extrato, a coluna e a fase

móvel, objetivando uma melhor separação entre os picos. O cromatogroma é


99

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

mA

U

-50

510

1520

2530

3540

mA

U

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40


Através do cromatograma obtido, observa-se uma melhor separação entre os

compostos. Porém, também, é demonstrada a necessidade de trabalhar com steps

visando aumentar a resolução entre picos. Assim, o método 7, descrito na Tabela 15

(gradiente com steps H2O/ACN/MeOH), foi empregando, obtendo-se o

cromatograma da Figura 35.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85

mA

U

010

2030

4050

6070

mA

U

0

10

20

30

40

50

60

70


100

Observa-se uma significativa melhora na resolução dos picos. Todavia,

mesmo assim, optou-se por evoluir mais na separação. Além de mudar o método,

optou-se por mudar o fluxo para aumentar a interação entre a fase móvel, fase

estacionária e o extrato. Com isto o método 8, descrito na Tabela 16 (gradiente com

steps H2O/ACN/MeOH, fluxo 0,8 ml/min), foi testado. O cromatograma obtido está


Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

mA

U

05

1015

2025

mA

U

0

5

10

15

20

25


Conforme pode ser observado, a resolução dos picos melhorou

significativamente. Assim, optou-se por injetar o padrão de PC3 para verificar sua

pureza e identificá-la no extrato em estudo. Com isto, obteve-se o cromatograma

apresentado na figura 37 e sua representação em três dimensões na figura 38.

101

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

mA

U

020

040

060

080

010

00

mA

U

0

200

400

600

800

1000

2: 254 nm, 8 nm161110 Metilenodioxixantona em 091209161110 Metilenodioxixantona em 091209-Rep2

Figura 37: Cromatograma obtido para PC2 isolado de P. cyparissias, conforme método 8 descrito na Tabela 16.

Figura 38: Cromatograma em três dimensões obtido para PC3 isolado de P. cyparissias, conforme método 8 descrito na Tabela 16.

102

Objetivando verificar a presença de pequenas impurezas, foi injetado apenas

o solvente e eluído também conforme método 8, obtendo-se o cromatograma da

figura 39.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

mA

U

-100

010

020

030

040

050

0

mA

U

-100

0

100

200

300

400

500

Figura 39: Cromatograma obtido para o solvente utilizado para a solubilização de PC2, conforme método 8 descrito na Tabela 16.

Descontando as áreas dos picos presentes no cromatograma do solvente,

pôde-se determinar a pureza de PC3, sento esta estimada em 90%. Conforme o

cromatograma do extrato é possível detectar a presença da xantona PC3 (aos 70

minutos de eluição), porém, para futuros fins de quantificação de PC3, faz-se

necessário ajustes no método para aumentar a resolução entre os picos próximos à

xantona.

5.2 Testes farmacológicos

5.2.1 Avaliação da atividade gastroprotetora

Os resultados referentes à gastroproteção demonstrada pelo extrato e frações

obtidos de P. cyparissias coletada em 2007 no modelo de úlcera induzida por

etanol/HCl encontram-se resumidos na Tabela 20. Os grupos tratados com 50, 125 e

250 mg/kg da fração clorofórmica não demonstraram uma redução significativa no

índice de lesão e percentual de lesão, apesar de ter demonstrado uma redução

significativa na área total de lesão quando comparado ao grupo controle (p<0,05). O

percentual de inibição para as três doses foi de 50,9 ± 9,3 %, 54,6 ± 7,3 % e 60,3 ±

5,5 %, respectivamente. Também, o índice de lesão não foi reduzido de forma

103

significativa na dose de 50 mg/kg do extrato acetônico e fração metanólica. Por outro

lado, as doses de 125 e 250 mg/kg reduziram significativamente este índice

(p<0,05). O extrato acetônico também reduziu de forma significativa a área total de

lesão e o percentual de lesão em todas as doses (p<0,05). Um efeito semelhante foi

observado para a fração metanólica (p<0,05). Os percentuais de inibição de úlcera

foram 45,2 ± 12,9 %, 63,0 ± 3,5 % e 67,4 ± 4,8 % para o extrato acetônico (Figura

40) e 43,7 ± 5,1 %, 64,6 ± 5,6 % e 74,5 ± 6,1 % para a fração metanólica (Figura 41).

Tabela 20: Efeito do extrato acetônico e frações clorofórmica e metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001.

Tratamento

(v.o.)

Dose

(mg/kg)

Área total

de lesão

(mm²)

% de área

lesada

Índice de

lesão

ulcerativa

Índice de

gastroproteção

(%)

Controle - 71,1 ± 12,7 5,8 ± 2,8 30,3 ± 3,1 -

Omeprazol 30 18,3 ± 5,2*** 3,4 ± 0,8*** 13,6 ± 2,3*** 67,8 ± 5,3

50 23,0 ± 4,5* 4,4 ± 0,7* 23,2 ± 5,5 45,2 ± 12,9

125 5,0 ± 1,0*** 1,3 ± 0,3*** 15,7 ± 1,5* 63,0 ± 3,5 Extrato

acetônico 250 4,8 ± 1,7*** 1,0 ± 0,3*** 13,8 ± 2,0* 67,4 ± 4,8

50 26,1 ± 7,9* 6,0 ± 1,9 20,8 ± 3,9 50,9 ± 9,3

125 23,1 ± 5,7* 5,8 ± 1,8 10,2 ± 3,1 54,6 ± 7,3 Fração

clorofórmica 250 26,1 ± 7,9* 11,1 ± 4,8 16,8 ± 2,3 60,3 ± 5,5

50 26,0 ± 4,2* 4,6 ± 0,7* 23,8 ± 2,2 43,7 ± 5,1

125 18,2 ± 2,7** 3,7 ± 0,5** 15,0 ± 2,4** 64,6 ± 5,6 Fração

metanólica 250 11,9 ± 4,5** 2,1 ± 0,6** 10,8 ± 2,6** 74,5 ± 6,1

104

Controle 30 50 125 2500

25

50

75

100

Extrato acetônico (mg/kg; v.o.)

Omeprazol (mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.)

Índ

ice

de g

astr

opr

oteç

ão

(%)

Figura 40: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.

Controle 30 50 125 2500

25

50

75

100

Fração Metanólica (mg/kg; v.o.)

Omeprazol (mg/kg; v.o.)


Índ

ice

de g

astr

opr

oteç

ão

(%)

Figura 41: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (30 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.

A formação de lesões na mucosa gástrica por agentes necrosantes, como o

etanol, é reportada por envolver a redução de mecanismos de defesa gástricos

105

(KINOSHITA et al., 1995). A formação destas lesões que seguem à administração

de etanol envolve diversos mecanismos: (1) uma redução no fluxo sanguíneo

gástrico, contribuindo no desenvolvimento de hemorragia e necrose; (2)

solubilização do muco presente no estômago, resultando em uma redução da

diferença de potencial transmucosa, aumentando o fluxo de íons Na+ e K+ ao lúmen,

secreção de pepsina e perda de íons H+ e histamina no lúmen; (3) indução do

estresse oxidativo; (4) aumento da atividade de xantina oxidase e níveis de

malondialdeído; e (5) redução nos níveis totais de glutationa nas células da mucosa

gástrica (SZABO; VATTAY, 1990; MAROTTA et al., 1999). O HCl presente no

modelo acelera o processo de ulcerogênese gástrica e intensifica as lesões,

reduzindo a proteção da mucosa contra agentes químicos (SUN; MATSUMOTO;

YAMATA, 1991).

Sabe-se que a úlcera gástrica é causada por um desequilíbrio entre os fatores

agressivos (HCl, pepsina) e a habilidade da mucosa gástrica de se proteger e curar

a si própria (muco e secreção de HCO3-, prostaglandinas, fluxo de sangue e óxido

nítrico) (LU; GRAHAM, 2006). Diversos fatores podem aumentar o risco de

incidência de úlcera, tais como o estresse, o fumo, deficiências nutricionais, uso de

AINEs, predisposição hereditária e infecção por H. pilory (BARROS et al., 2008).

Considerando o exposto, optou-se por prosseguir os experimentos avaliando

o comportamento do extrato e fração frente ao modelo de úlcera induzida por

indometacina/betanecol. Todavia, visto que a fração clorofórmica demonstrou

apenas uma atividade superficial, este modelo foi realizado apenas com o extrato

acetônico e a fração metanólica. Os resultados são apresentados na Tabela 21. Os

percentuais de inibição de úlcera foram 28,1 ± 12,4 %, 60,2 ± 6,6 % e 77,9 ± 7,2 %

para os grupos tratados com 50, 125 e 250 mg/kg do extrato acetônico de P.

cyparissias (Figura 42). Para os grupos tratados com a fração metanólica, o

percentual de inibição de úlcera foram 46,1 ± 6,9 %, 67,4 ± 4,4 % e 75,0 ± 2,9 %,

respectivamente (Figura 43).

Tabela 21: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e veículo em úlcera induzida por indometacina (100 mg/kg; v.o.)/betanecol (5 mg/kg; i.p.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001.

106

Tratamento

(v.o.)

Dose

(mg/kg)

Área total

de lesão

(mm²)

% de área

lesada

Índice de

lesão

ulcerativa

Índice de

gastroproteção

(%)

Controle - 6,4 ± 0,6 1,4 ± 0,2 25.,6 ± 4,4 -

Cimetidina 100 1,8 ± 0,6*** 0,4 ± 0,2*** 6,5 ± 1,0*** 74,4 ± 4,0

50 1,3 ± 0,4*** 0,4 ± 0,1** 18,4 ± 3,2 28,1 ± 12,4

125 0,9 ± 0,1*** 0,4 ± 0,1** 10,2 ± 1,7** 60,2 ± 6,6 Extrato

acetônico 250 0,4 ± 0,1*** 0,2 ± 0,1*** 5,7 ± 1,8*** 77,9 ± 7,2

50 6,0 ± 0,9 1,2 ± 0,2 13,8 ± 1,8 46,1 ± 6,9

125 3,2 ± 0,6** 0,5 ± 0,1* 8,3 ± 1,1*** 67,4 ± 4,4 Fração

metanólica 250 2,7 ± 0,3** 0,6 ± 0,1* 6,4 ± 0,8*** 75,0 ± 2,9

Controle 100 50 125 2500

25

50

75

100


Cimetidina (mg/kg; v.o.)

Indometacina (100 mg/kg; v.o.)

Índ

ice

de g

astr

opr

oteç

ão

(%)

Figura 42: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pelo extrato acetônico de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.

107

Controle 100 50 125 2500

25

50

75

100

Fração metanólica (mg/kg; v.o.)

Cimetidina (mg/kg; v.o.)

Indometacina (100 mg/kg; v.o.)

Índ

ice

de g

astr

opr

oteç

ão

(%)

Figura 43: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (50-250 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por indometacina (100 mg/kg; v.o.) em camundongos (n = 6). Os resultados estão expressos em média ± EPM.

Os AINEs, como é o caso da indometacina, têm capacidade de bloquear a

COX, demonstrando fortes evidências que o efeito ulcerogênico destes está

amplamente correlacionado à sua capacidade de suprimir a síntese das

prostaglandinas (PGs). PGs endógenas regulam o fluxo sanguíneo da mucosa,

proliferação de células epiteliais, regeneração epitelial, atividade imune da mucosa,

secreção de muco e de HCO3- e secreção basal de ácido. Assim, com a inibição da

síntese de prostaglandinas, há um enfraquecimento nas defesas da mucosa,

diminuindo a sua capacidade de resistir a agressores (CHAN; LEUNG, 2002).

Porém, a diminuição na síntese de PGs não é a única via responsável pela formação

de úlcera por AINEs. Paralelamente, os AINEs levam a um aumento dos níveis de

mieloperoxidase e malondialdeído, ambos responsáveis pelo dano oxidativo, além

de reduzir a síntese de NO, relacionado à secreção de muco, regulação do fluxo

sanguíneo e prevenção da peroxidação lipídica (SULEYMAN et al., 2010).

Mesmo não sendo um modelo específico, pode-se inferir que a

gastroproteção gerada por P. cyparissias provavelmente relaciona-se com as PGs.

O extrato acetônico e a fração metanólica podem tanto estar aumentando a síntese

de PGs, especialmente através da COX-1, constitutiva e relacionada à

108

gastroproteção, quanto possuir um efeito antagônico à indometacina, impedindo sua

ação. Outra possibilidade é que os consituintes presentes no extrato e fração

tenham um efeito que mimetiza os efeitos das PGs, como é o caso do misoprostol,

um análogo da PGE2 que atua inibindo a secreção gástrica e estimulando a

produção de muco (ARONSSON et al., 2007).

Considerando que o modelo de úlcera induzida por etanol é bastante geral e

inespecífico e que o modelo de úlcera induzida por indometacina, apesar de

evidenciar uma forte relação com as PGs, não é adequado para o estabelecimento

de um possível mecanismo de ação, realizaram-se experimentos para verificar o

potencial envolvimento do NO e de SHs.

Para a avaliação da participação do NO no mecanismo de gastroproteção

induzida por P. cyparissias, realizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol

associada ao L-NAME, um bloqueador da óxido nítrico sintase (NOS). O L-NAME é

um análogo da L-arginina e é hidrolisado em L-nitroarginina, gerando a inibição da

NOS (GRANGER et al., 1994). Portanto, conforme se pode observar na figura 44, os

tratamentos com o extrato acetônico e a fração metanólica nos animais que

receberam L-NAME, não foram capazes de diminuir significativamente o percentual

de área lesada quando comparados com o controle. Já os animais que receberam o

extrato e a fração e foram pré-tratados com solução salina exibiram uma redução

significativa (p<0,01) no percentual de área lesada quando comparado ao controle

(0,95 ± 0,30% e 2,12 ± 0,64%, respectivamente), também sendo estes resultados

significativamente diferentes aos observados nos grupos que receberam o L-NAME

(p<0,01). Consequentemente, demonstra-se a participação importante do NO no

mecanismo de gastroproteção induzido pelo extrato acetônico e pela fração

metanólica de P. cyparissias.

109

Controle Controle 125 125 125 125 200 2000

10

20

30

L-NAME (70 mg/kg; i.p.) - + + +- -- +

Solução salina + + + +- - - -

Veículo (v.o.) Ext. acetônico(mg/kg; v.o.)

Fr. metanólica(mg/kg; v.o.)

Carbenoxolona(mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M)

**** **

#

#

#%

de

área

lesa

da

Figura 44: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou L-NAME (70 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle. # mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p<0,01).

O NO é um transmissor endógeno que possue diversas funções no sistema

gastrointestinal. Ele é principalmente associado à proteção da mucosa contra

agentes vasoconstritores e com a inibição da secreção ácida das células parietais

(GRANGER et al., 1994). Também, diminui a degranulação de mastócitos, a

liberação de TNF-α por macrófagos e o recrutamento de neutrófilos, além de

aumentar a produção de muco (WALLACE, MA, 2001).

Para avaliar a participação de SHs no mecanismo gastroprotetor de P.

cyparissias, utilizou-se o modelo de úlcera induzida por etanol associada ao NEM,

um quelante destes grupamentos. Observando a figura 45, pode-se verificar que

tanto o extrato acetônico quanto a fração metanólica, quando associados ao pré-

tratamento com NEM, não foram eficazes na diminuição do percentual de área

lesada quando comparados ao controle. Porém, os animais que receberam apenas

o tratamento com o extrato ou a fração, demonstraram uma redução significativa

110

(p<0,01) no percentual de área lesada quando comparado ao controle (0,95 ± 0,30%

e 2,12 ± 0,64%, respectivamente). Além disto, estes resultados foram

significativamente diferentes àqueles observados para os grupos que receberam

NEM (p>0,01). Com isto, demonstra-se a participação dos grupamentos sulfidrila no

mecanismo de gastroproteção induzido pelo extrato acetônico e pela fração

metanólica de P. cyparissias.

Controle Controle 125 125 125 125 200 2000

10

20

30

40

NEM (10 mg/kg; i.p.) - + + +- -- +

Solução salina + + + +- - - -

Veículo (v.o.) Ext. acetônico(mg/kg; v.o.)

Fr. metanólica(mg/kg; v.o.)

Carbenoxolona(mg/kg; v.o.)

Etanol/HCl (60%/0,3M)

**** **

#

# #

% d

e ár

ea le

sad

a

Figura 45: Efeito do extrato acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg, v.o.) e carbenoxolona (200 mg/kg, v.o.) em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos pré-tratados com solução salina ou NEM (10 mg/kg, i.p.). Os resultados são expressos em média ± EPM para seis animais. A estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle. # mostra diferença estatística entre os grupos pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p<0,01).

Os SHs são importantes protetores da mucosa gástrica, principalmente

quando espécies reativas de oxigênio estão envolvidas no processo de lesão

gástrica. Estudos afirmam que as lesões causadas pelo etanol estão fortemente

associadas com uma redução nos níveis de SHs na mucosa (BARBASTEFANO et

al. 2007).

111

Os modelos empregados até o momento objetivaram a determinação do

potencial gastroprotetor do extrato. Porém, sabe-se que a úlcera gástrica é

comumente uma doença crônica, podendo persistir por 10 a 20 anos (OKABE;

PFEIFFER, 1972). Levando isto em consideração, foi realizado o modelo de úlcera

crônica induzida por ácido acético. Este modelo foi escolhido pois produz lesão

gástrica de forma similar à úlcera crônica humana, sendo os extratos utilizados de

uma forma curativa, com o tratamento após a ulcerogênese, mimetizando o uso

clínico. Neste modelo, o ácido acético promove dano à mucosa principalmente pela

liberação de histamina, que aumenta a permeabilidade capilar e a difusão de HCl

(TAKAGI et al., 1969), confinado ao estômago glandular (DHARMANI et al., 2004). O

tratamento com 125 mg/kg do extrato acetônico e da fração metanólica reduziram de

forma significativa a área total de lesão (p<0,01) e o percentual de área lesada

(p<0,05). Ambos os tratamentos induziram um índice de cura de 67,5 ± 5,5% e 58,4

± 4,4%, respectivamente (Tabela 22 e Figura 46). Os fatores presentes na

cicatrização da úlcera crônica estão relacionados particularmente a fatores de

crescimento, propiciando a angiogênese, re-epitelização, migração e proliferação

celular (SZABO; VINCZE, 2000).

Tabela 22: Efeito do extrato acetônico e fração metanólica de P. cyparissias (coleta de 2007) na dose de 125 mg/kg (v.o.), cimetidina (100 mg/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético 20% (ensaio curativo). Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05 e ** p<0,01.

Tratamento

(vo)

Dose

(mg/kg)

Área total de

lesão (mm²)

% de area

lesada

Índice de cura

(%)

Controle - 9,2 ± 1,2 3,5 ± 0,5 -

Cimetidina 100 4,1 ± 0,8** 1,3 ± 0,4* 61,3 ± 11,9

Extrato

acetônico 125 4,5 ± 1,0** 1,1 ± 0,2* 67,5 ± 5,5

Fração

metanólica 125 4,9 ± 1,0** 1,4 ± 0,2* 58,4 ± 4,4

112

Controle 100 125 1250

25

50

75

100

125Cimetidina (mg/kg; v.o.)

Ácido acético 20% (50 µµµµl)


Fração metanólica (mg/kg; v.o.)

Índi

ce d

e cu

ra (

%)

Figura 46: Índice de gastroproteção promovido pela cimetidina (100 mg/kg; v.o.), pelo extrato acetônico (125 mg/kg; v.o.) e pela fração metanólica de P. cyparissias (125 mg/kg; v.o.) em lesões induzidas por ácido acético 20% (50 µl) em camundongos (n = 6), no modelo de úlcera crônica. Os resultados estão expressos em média ± EPM.

Através do modelo de úlcera crônica, também foi demonstrado o importante

papel de P. cyparissias na via histaminérgica. No sistema gastrointestinal, a

histamina é liberada por células enterocromafins que estão em contato próximo com

as células parietais. Assim, de forma parácrina, a histamina atua em receptores H2

das células parietais e promove o aumento da secreção ácida gástrica através da

elevação dos níveis intracelulrares de AMP cíclico (MERCHANT, 2007). De fato,

antagonistas dos receptores H2 são largamente empregados na terapia antiúlcera

(SUNG, 2006). Corroborando com estes resultados, Sayah et al. (1999) já haviam

demonstrado a capacidade antagônica do extrato hidroalcoólico de P. cyparissias

contra a histamina.

Outra espécie do mesmo gênero também foi estudada quanto a seus efeitos

gastroprotetores, porém as vias envolvidas parecem se diferenciar daquelas

descritas para P. cyparissias. Lapa et al. (2007), avaliaram o potencial gastroprotetor

do extrato hidroalcoólico de Polygala paniculata. A espécie foi estudada

fitoquimicamente, sendo descrita a presença de xantonas, uma cumarina, o flavonol

rutina e os esteróis espinasterol e ∆25-espinasterol (CRISTIANO et al., 2003). No

estudo foi demonstrado que o extrato foi capaz de reduzir significativamente o índice

de úlcera no modelo induzido por etanol nas doses de 100 e 300 mg/kg (v.o.) e de

113

10 e 30 mg/kg (i.p.). Este efeito foi parcialmente explicado pelo aumento de

secreção de muco, que é estimulada principalmente pelo NO e pelas PGs. Todavia,

o extrato de P. paniculata foi incapaz de inibir de forma significativa as lesões

geradas por indometacina, relacionado à síntese de PGs, bem como demonstrou

não ser dependente do NO. O mecanismo de gastroproteção da planta também não

está relacionado à diminuição da acidez do conteúdo gástrico nem ao volume de

secreção, porém pode apresentar relação com seu potencial antioxidante, verificado

também para a rutina, um dos seus compostos isolados.

Objetivando verificar os potenciais compostos responsáveis pela atividade

gastroprotetora, optou-se por realizar procedimentos cromatográficos para o

isolamente de metabólitos secundários, conforme descrito no item 4.2.3. Após o

isolamento dos compostos, três deles foram testados frente a sua atividade

gastroprotetora no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl em camundongos:

PC1, PC2 e PC3.

Os resultados encontram-se sumarizados na Tabela 23 e na Figura 47. PC2

(0,19 mmol/kg; v.o.) reduziu significativamente o percentual de lesão, a área total de

lesão e o ULI (p<0,001, p<0,001 e p<0,01, respectivamente), assim como PC3 (0,18

mmol/kg; v.o.) (p<0,001 para todos os parâmetros). Os percentuais de inibição de

úlcera foram 71,3 ± 9,4 % e 81,1 ± 5,8 %, respectivamente. PC1 (0,12 mmol/kg; v.o.)

também reduziu significativamente o percentual de lesão, área total de lesão e o ULI

(p<0,001 para todos os parâmetros) e demonstrou um percentual de inibição de

úlcera de 86,2 ± 3,4 %.

114

Tabela 23: Efeito do espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.), omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e do veículo no modelo de úlcera induzida por etanol/HCl (60%/0,3M; v.o.) em camundongos. Resultados apresentados como média ± EPM para seis camundongos. Comparação estatística realizada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. * p<0,05, ** p<0,01 and *** p<0,001.

Tratamento

(vo)

Dose

(mmol/

kg)

Área total

de lesão

(mm²)

% de área

lesada

Índice de

lesão

ulcerativa

Índice de

gastroproteção

(%)

Controle - 71,1 ± 12,7 15,8 ± 2,9 30,3 ± 3,1 -

Omeprazol 0,08 18,3 ± 5,2*** 3,4 ± 0,8*** 13,6 ± 2,3*** 67,8 ± 5,3

PC1 0,12 1,6 ± 0,7*** 0,6 ± 0,3*** 5,8 ± 1,4*** 86,2 ± 3,4

PC2 0,19 5,6 ± 1,3*** 1,7 ± 0,4*** 12,2 ± 4,0** 71,3 ± 9,4

PC3 0,18 2,1 ± 0,9*** 0,7 ± 0,3*** 8,0 ± 2,4*** 81,1 ± 5,8

Controle 0,08 0,12 0,19 0,180

50

100

150Omeprazol (mmol/kg; v.o.)


PC1 (mmol/kg; v.o.)

PC2 (mmol/kg; v.o.)

PC3 (mmol/kg; v.o.)

Índ

ice

de g

astr

opro

teçã

o (%

)

Figura 47: Índice de gastroproteção promovido pelo omeprazol (0,08 mmol/kg; v.o.) e pelos compostos isolados de P. cyparissias em lesões induzidas por etanol/HCl (60%/0,3M) em camundongos (n = 6): espinasterol (PC1) (0,12 mmol/kg; v.o.), 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) (0,19 mmol/kg; v.o.) e 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) (0,18 mmol/kg; v.o.). Os resultados estão expressos em média ± EPM.

Com isto, demonstra-se a potencial participação dos compostos ensaiados no

mecanismo de atividade gastroprotetora do extrato acetônico de P. cyparissias,

corroborando com resultados já demonstrados na literatura. Além de estudos que

relatam a atividade antiúlcera de xantonas (SHANKARANARAYAN;

GOPALAKRISHNAN; KAMESWARAN, 1979; BANERJI et al., 1994), já foi descrito o

115

potencial antiulcerogênico de uma série de compostos fenólicos (HAMAUZU et al.,

2008; BARROS et al., 2008; PRIYA, SABU, JOLLY, 2009). Considerando que o

dano oxidativo é um causador comum da ulcerogênese, as propriedades

antioxidantes intrínsecas aos compostos fenólicos podem ser uma das vias

responsáveis pela gastroproteção, atuando também como citoprotetores (BARROS

et al., 2008).

Reyes-Chilpa et al. (2006) também demonstraram a capacidade das xantonas

6-desoxijacareubina, jacareubina, 1,3,5,6-tetrahidroxi-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-

xantona e 1-hidroxi-3,5,6-tri-O-acetil-2(3,3-dimetilalil)-xantona, isoladas de

Calophyllum brasilienses, bloquearem a atividade da bomba H+, K+-ATPase, última

etapa envolvida com a secreção ácida no estômago, com IC50 variando de 47 µM a

1,6 mM. No estudo puderam inferir sobre a relação estrutura-atividade de xantonas,

evidenciando que a presença de hidroxila na posição C-6 parece ser essencial para

a atividade. Além disso, grupamentos volumosos em C-2 poderiam diminuir a

potência do metabólito. Considerando as xantonas PC2 e PC3 isoladas de P.

cyparissias, pode-se observar que nenhuma das duas apresenta a hidroxila em C-6,

o que indicaria que ambas exercem sua atividade gastroprotetora por outras vias

que não o bloqueio da bomba H+, K+-ATPase. Todavia, trata-se apenas de uma

inferência, não podendo ser descartado tal mecanismo de ação gastroprotetor.

Já em outro estudo avaliando a atividade antiúlcera da mangiferina, uma

xantona glicosilada isolada de Mangifera indica, Carvalho et al. (2007)

demonstraram, nos modelos de úlcera induzida por etanol e por indometacina,

índices de gastroproteção variando de 22 a 63%. Seu efeito demonstrou estar

associado à diminuição do volume de secreção ácida, bem como à sua capacidade

antioxidante avaliada pelo modelo de úlcera induzida por etanol associada ao pré-

tratamento com NEM. Assim, reforça-se que as xantonas possam apresentar

atividade gastroprotetora por sua capacidade antioxidante.

O esterol PC1 também apresentou índice de gastroproteção bastante

significativo (86,2 ± 3,4%), muito semelhante ao encontrado para o β-sitoesterol

(85,6 ± 6,3%) por Navarrete, Trejo-Miranda, Reyes-Trejo (2002). Neste estudo

também afirma-se que a hidroxila presente em C-3 é essencial para o potencial

antiulcerogênico de esteróis e triterpenos, também presente em PC1, sendo

sugerido que seu efeito estaria relacionado à restauração dos níveis de PGs, de

uma forma similar à ação da carbenoxolona. Todavia, a classe de fitoesteróis foi

116

pouco estudada quanto ao seu potencial gastroprotetor, não apresentando estudos

que possam delimitar um provável mecanismo de ação.

5.2.2 Avaliação da atividade anti-Helicobacter pilory

Sabe-se que um importante agente etiológico da úlcera é a infecção por H.

pilory. É uma bactéria gram-negativa que tem como habitat específico a mucosa

gástrica, contribuindo diretamente na lesão das células gástricas através da

liberação de citotoxinas vacuolizantes, bem como de enzimas tóxicas, como lipase,

urease e protease, propiciando a formação da úlcera (SIQUEIRA et al., 2007).

Assim, objetivando-se determinar o potencial anti-H. pilory do extrato

acetônico e da fração metanólica de P. cyparissias, realizou-se o seu estudo in vitro

através de diluição destes em ágar sólido. Observou-se que, mesmo na maior

concentração (2000 µg/ml), nem o extrato nem a fração foram capazes de inibir o

crescimento da bactéria.

5.2.3 Avaliação da atividade anti-hipernociceptiva

Os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado pelo

extrato metanólico de P. cyparissias (coleta 2009) no modelo de hipernocicepção

induzida por carragenina encontram-se apresentados na figura 48. Pode-se observar

que o tratamento preventivo (i.p.) com o extrato metanólico de P. cyparissias foi

capaz de reduzir significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado

ao grupo controle (p<0,05), com inibições de 30,7 ± 7,8 %, 46,7 ± 7,1 % e 67,8 ± 3,4

%, para as doses de 3, 10 e 30 mg/kg. O extrato na dose de 30 mg/kg pôde reduzir

significativamente a hipernocicepção inflamatória até as 24h após a administração

do agente irritante.

117

1 3 4 601

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Carragenina (300 µg/pata)Extrato bruto (3 mg/kg, i.p.)Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.)Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.)

24 48

*** ***** *** ****** *** *** ***

***

Tempo (h)

Inte

nsi

dad

e d

e h

iper

no

cice

pçã

o

Controle 3 10 300

10

20

30

40

50

Extrato MeOH bruto (mg/kg, i.p.)

Carragenina (300 µµµµg/pata)

*

**

**

AU

C

Figura 48: Intensidade de hipernocicepção, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

A carragenina é um agente pró-inflamatório muito conhecido e utilizado em

estudos envolvendo a hiperalgesia inflamatória em ratos e camundongos (MORRIS,

2003). Ela promove, inicialmente, a liberação de TNF-α que, por sua vez, poderá

agir por dois caminhos distintos: indução da COX-2 e subsequente síntese de

eicosanóides por IL-1β; e indução da produção de aminas simpaticomiméticas por

IL-8 (RIBEIRO et al., 2000). A resposta induzida pela carragenina é caracterizada

por ser bifásica: até 2,5h após a adminstração do agente, há a liberação

principalmente de histamina, serotonina e bradicinina; em seguida, na segunda fase,

há um aumento na produção de prostaglandinas e radicais livres (PANTHONG et al.,

2004).

Outro modelo utilizado para a avaliação da atividade anti-hipernociceptiva foi

o de hipernocicepção inflamatória induzida por LPS. Na Figura 49 estão

apresentados os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo demonstrado

pelo extrato metanólico de P. cyparissias nesse modelo. Primeiramente, destaca-se

que a injeção i.pl. de LPS foi capaz de reduzir o limiar de sensibilidade mecânica dos

camundongos quando comparado aos valores basais. Além disto, o tratamento

preventivo (i.p.) com o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir

significativamente a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo

controle (p<0,01), com inibições de 52,6 ± 7,4 %, 83,5 ± 5,0 % e 89,0 ± 4,8 % para

as doses de 3, 10 e 30 mg/kg. O extrato pôde reduzir significativamente, em todas

118

as doses, a hipernocicepção inflamatória durante todo o período de

acompanhamento do teste (48h).

B 1 2 4 60

10

20

30

40

50

60

70

80

90

LPS (100 ng/pata)Extrato bruto(3 mg/kg, i.p.)Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.)Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.)

24 48

****** *** *** ***

**

******

*** *** *********

*** *** ******

***

Tempo (h)

Fre

qu

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal Controle 3 10 300

100

200

300

400

500

Extrato MeOH bruto (mg/kg)

LPS (100ng/pata)

**

****

AU

C

Figura 49: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

O LPS é uma endotoxina bacteriana e está envolvido com a produção de

citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α, prostaglandinas e, especialmente, óxido

nítrico (BONATERRA et al., 2010). O óxido nítrico é um radical livre gasoso, sendo

rapidamente metabolizado a nitrato e nitrito. É produzido por uma enzima

denominada NOS, que é dividida em três isoformas: as constitutivas cNOS e eNOS

e a induzida iNOS. Esta última é estimulada por agentes pró-inflamatórios, como é o

caso do LPS (KASSIM et al., 2010). Com a liberação do NO há a ativação direta de

fibras sensoriais cerebrais, levando à liberação do peptídeo relacionado ao gene da

calcitonina (CGRP) e ao aumento das concentrações de cGMP e cAMP. Estes

segundos mensageiros, através de fosforilações, aumentam o fluxo de Na+ e Ca2+,

diminuindo de K+, o que gera a sensibilização das fibras nociceptivas (CODERRE,

2009; DRAY, 2009).

No modelo de úlcera induzida por etanol associada ao L-NAME (bloqueador

da NOS), foi observado que o extrato acetônico e a fração metanólica de P.

cyparissias agiam de forma a induzir a produção de NO, visto que a gastroproteção

demonstrada foi dependente do sistema oxinitrérgico. Já no modelo de

119

hipernocicepção induzida por LPS, causada especialmente pelo aumento da síntese

de NO, o extrato metanólico da planta apresentou capacidade antagônica, seja por

inibir a ação do NO ou por reduzir sua síntese. Porém, conforme já relatado, existem

diferentes isoformas de NOS. As envolvidas com a gastroproteção são as isoformas

constitutivas, enquanto que aquela envolvida com a hipernocicepção inflamatória é a

induzida (WALLACE, MA, 2001). Consequentemente, é possível que os extratos e

fração de P. cyparissias atuem tanto de forma antagônica quanto agônica com NO e

NOS.

Clark et al. (2010) recentemente demonstraram que o LPS também induz a

liberação de IL-1β e a fosforilação do MAPK p38 através de receptores P2X7 (classe

de receptores purinérgicos). A IL-1β ativa os nociceptores diretamente, gerando sua

sensibilização através da ativação de quinases intracelulares, além de indiretamente

poder gerar sensibilização pela indução de produção de cininas e prostanóides. Já a

ativação de MAPK p38, assim como de outras quinases, são importantes

reguladores da excitabilidade das fibras através da alteração de transcrição gênica

(DRAY, 2009). Em comparação com a carragenina, o LPS induz uma resposta

inflamatória mais branda, com o pico de edema atingido após 3h, enquanto que na

carragenina o pico ocorre após 6h de indução (KASSIM et al., 2010).

Investigando ainda a ação do extrato metanólico de P. cyparissias sobre a

hipernocicepção inflamatória, este foi testado frente ao modelo induzido por CFA.

Conforme pode ser observado na figura 50, o pré-tratamento com o extrato

metanólico de P. cyparissias, nas doses de 1 e 3 mg/kg, foi capaz de inibir de forma

significativa a hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle

(p<0,01), com índices de inibição de 42,6 ± 3,4 % e 24,7 ± 9,0 % respectivamente.

Porém, ao se observar a resposta obtida variando conforme o tempo, pode-se

perceber que sua eficácia limitou-se até a quarta hora, perdendo seu potencial anti-

hipernociceptivo após este período.

120

B 1 2 3 4 60

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CFA (20 µL/pata)Extrato bruto (0,3 mg/kg, i.p.)

Extrato bruto (0,1 mg/kg, i.p.) Extrato bruto (1 mg/kg, i.p.)

24 48

***** ***

**

*

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal Controle 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

**

**


CFA (20µµµµl/pata)

AU

C

Figura 50: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (0,3-3 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de CFA (20 µl/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

A administração local de CFA causa extravasamento plasmático, infiltração de

células inflamatórias com um aumento nos níveis de diversos mediadores

inflamatórios, tais como citocinas, neutrofinas e eicosanóites (BURSTEIN et al.,

2004). Todavia, uma das principais vias de ação do CFA é a liberação do fator de

crescimento neuronal (NGF) (WOOLF, C. J., 1997).

O NGF é uma neutrofina especialmente relacionada à sensibilização

neuronal. Ele é capaz de aumentar a expressão de receptores do tipo: TRPV1,

especialmente sensíveis a temperaturas elevadas e a variações de pH; P2X3,

relacionados à dor produzida por ATP; ASIC, associados, juntamente com TRPV1, à

dor causada por acidose tecidual; BK, sensíveis às bradicininas, atuando tanto na

manutenção da hiperalgesia inflamatória persistente, quanto na amplificação da

formação de edema; e canais de Na+ e K+, relacionados à despolarização do

nociceptor (MENDELL, 2009).

Objetivando verificar o papel do extrato diretamente sobre um importante

mediador inflamatório, realizou-se o modelo de hipernocicepção induzida pela

injeção de PGE2. Os resultados referentes ao efeito anti-hipernociceptivo

demonstrado pelo extrato metanólico de P. cyparissias nesse modelo encontram-se

apresentados na figura 51. Pode-se observar que o tratamento preventivo (i. p.) com

121

o extrato metanólico de P. cyparissias foi capaz de reduzir significativamente a

hipernocicepção mecânica quando comparado ao grupo controle (p<0,01), com

inibições de 88,5 ± 11,5 % e 73,6 ± 7,3 % para as doses de 3, 10 mg/kg. Todavia,

para a dose de 30 mg/kg, não foi observado um efeito anti-hipernociceptivo. Este

comportamento contrário ao esperado muitas vezes se deve à saturação de

receptores, o que acaba levando à ação pró-nociceptiva por vias paralelas onde,

normalmente, o extrato não agiria. Além disso, observa-se que o melhor efeito foi

observado após uma hora de injeção do agente lesivo, sendo que após as seis

horas, nenhuma dose do extrato foi capaz de inibir significativamente a

hipernocicepção provocada por PGE2.

B 1 2 4 60

10

20

30

40

50

60

70

80

90

PGE2 (0,1 nmol/pata)Extrato bruto (3 mg/kg, i.p.)Extrato bruto (10 mg/kg, i.p.)Extrato bruto (30 mg/kg, i.p.)

*** *** ***

** **

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

Extrato MeOH bruto (mg/kg)

PGE2 (0,1 nmol/pata)

****

AU

C

Figura 51: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de PGE2 (0,1 nmol/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

As PGs, de uma forma geral, são consideradas mediadores finais da dor

inflamatória, visto que podem ativar diretamente os nociceptores, independendo da

liberação de outros mediadores, promovendo a sua sensibilização para uma dada

estimulação posterior, não causando dor espontânea (FERREIRA et al., 2009). De

uma forma geral, a PGE2 pode aumentar a permeabilidade vascular e a produção de

IL-6, promover a vasodilatação, além de diminuir o limiar de disparos de potenciais

de ação, facilitando a ativação neuronal, levando à hiperalgesia (CALDER, 2009;

122

FERREIRA et al., 2009). A sensibilização central é decorrente do aumento de

liberação de glutamato, despolarização direta dos neurônios no corno dorsal e

inibição dos receptores de glicina sensíveis à estricnina (ZEILHOFER, 2007).

No modelo de úlcera induzida por AINEs, observou-se que o extrato acetônico

e a fração metanólica de P. cyparissias foram capazes de proteger o estômago

contra os danos causados principalmente pela inibição da COX. Todavia, o extrato

metanólico da planta foi capaz de inibir a ação hipernociceptiva da PGE2, principal

PG envolvida na gastroproteção. De fato, a ação da PGE2 é bastante paradoxal e

complexa, envolvendo efeitos pró- e anti-inflamatórios (HATA, BREYER, 2004),

sendo os extratos e a fração da planta em estudo capazes de inibirem os seus

efeitos nociceptivos e promoverem sua ação gastroprotetiva.

Em outro modelo, objetivou-se verificar o papel dos adrenoceptores α1 e α2,

envolvidos mais diretamente com a dor neuropática (DRAY, 2009). Assim, o efeito

anti-hipernociceptivo do extrato metanólico de P. cyparissias foi avaliado frente ao

modelo de hipernocicepção mecânica induzida por epinefrina. Os resultados

referentes a este modelo estão demonstrados na Figura 52. Como pode-se

observar, o extrato metanólico de P. cyparissias não foi capaz de antagonizar a

hipernocicepção mecânica promovida pela epinefrina, sugerindo que,

provavelmente, o efeito anti-hipernociceptivo do extrato esteja mais envolvido com o

bloqueio de vias envolvidas na hipernocicepção inflamatória, não atuando por meio

dos adrenoceptores.

B 0.25 0.50

25

50

75

100

Epinefrina (100 ng/pata)Extrato bruto (3mg/kg, i.p.)

Extrato bruto (10mg/kg, i.p.)Extrato bruto(30mg/kg, i.p.)

1 2 4 6

********

*

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


50

100

150

200


Epinefrina (100 ng/pata)

AU

C

123

Figura 52: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3-30 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de epinefrina (100 ng/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

A epinefrina é uma catecolamina que, através da ativação de segundos

mensageiros envolvendo cAMP e PKA, promove a redução do limiar dos

nociceptores e aumenta a excitabilidade da membrana neuronal (MANJAVACHI et

al., 2010). A exposição prolongada à epinefrina também gera uma expressão

aumentada de α-adrenoceptores nas fibras, além de promover o brotamento de

terminações nervosas simpáticas no gânglio da raiz dorsal, aumentando o contato

entre estas terminações e as fibras nociceptivas (STEEDS, 2009), o que provoca a

sua sensibilização.

Considerando ainda a possível atuação de P. cyparissias sobre a dor

neuropática, realizou-se o experimento de CPNC. Na figura 53 observa-se o efeito

do extrato metanólico de P. cyparissias neste modelo. Conforme os gráficos

apresentados, o tratamento com o extrato dos animais expostos a este modelo foi

capaz de reverter a sensibilização mecânica induzida, com inibição de 44,4 ± 4,6 %

e 40,0 ± 4,0 % para as doses de 3 e 10 mg/kg, mantendo seu efeito por até 12 dias

após a cirurgia.

B C0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

OperadoExtrato MeOH bruto (3mg/kg, i.p.)Extrato MeOH bruto (10mg/kg, i.p.)Falso-operado

7 8 9 10 11 12 13 14

****** ****** ***

*******

****** ***

***

Dias

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal FOP Controle 3 100

100

200

300

400

500

600

** **

Extrato MeOH(mg/kg, i.p.)

AU

C

Figura 53: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados com o extrato metanólico de P. cyparissias (3 e 10 mg/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a constrição parcial do nervo ciático. Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. FOP = falso operado.

124

Diversos mecanismos estão envolvidos na hiperalgesia provocada pela

CPNC. Após a lesão, ocorre uma ativação constante das fibras lesadas,

promovendo a liberação de mediadores nociceptivos e de citocinas pró-

inflamatórias, como IL-1β e TNF-α, gerando a sensibilização dos nociceptores

periféricos (CUI et al, 2001).

A lesão do nervo ciático promove descargas ectópicas, tanto pelas fibras

lesionadas quanto pelas intactas. Esta característica é explicada, ao menos em

parte, pela liberação periférica de NGF, que acarreta na sensibilização das fibras

não lesionadas. Esta sensibilização se dá pela ativação de receptores trkA pelo NGF

que, por consequência, fosforilam através de cascatas ligadas à PKA, PKC, MEK e

MAPK os receptores TRPV1, gerando a sensibilização. Ademais, o NGF promove a

liberação de fator neurotrófico derivado de células da glia, substância P e de fator

neurotrófico derivado do cérebro. Também, o complexo trkA-NGF é internalizado na

fibra, sendo direcionado ao gânglio da raiz dorsal, onde ativa uma série de cascatas

sinalizadoras, promovendo a expressão aumentada de TRPV1 (OSSIPOV;

PORRECA, 2009).

A lesão das fibras também promove uma expressão aumentada de canais

voltagem-dependentes de sódio, especialmente do tipo Nav1.3, Nav1.8 e Nav1.7.

Estes canais estão amplamente relacionados à geração de potenciais de ação

presentes na excitação neuronal, levando à sensibilização das fibras nociceptivas.

Outros canais importantes são os canais de cálcio do tipo N. Sua expressão e

atividade aumentadas resultam em uma liberação expressiva de substância P,

CGRP e de glutamato (OSSIPOV; PORRECA, 2009).

Grande parte destes eventos são apenas periféricos, sendo o mecanismo

responsável pela manutenção da dor neuropática atrelado à sensibilização central.

Esta ocorre pela diminuição do limiar de despolarização e pelo aumento do número

de fibras responsivas à estimulação nociceptiva (OSSIPOV; PORRECA, 2009). O

aumento de liberação de diversos mediadores nociceptivos (substância P, CGRP e

glutamato) pelas fibras periféricas causa resposta prolongada do corno dorsal,

promovendo o recrutamento de receptores NK1, AMPA e NMDA, sensibilizando os

neurônios secundários, o que causa a hiperalgesia e alodínia (MARCHAND, 2008).

Anteriormente, já foram realizados estudos com P. cyparissias evidenciando

seu potencial anti-nociceptivo. O extrato hidroalcoólico da planta foi capaz de inibir a

125

nocicepção neurogênica induzida pela formalina (primeira fase) e pela capsaicina,

demonstrando sua potencial ação sobre diferentes mediadores químicos, como as

cininas, taquicininas e prostaglandinas. A nocicepção inflamatória, característica da

segunda fase do modelo da formalina, foi inibida de forma mais significativa pelo

extrato, além de inibir o edema causado por este agente. Diferentemente da primeira

fase, na fase inflamatória apenas as cininas e as prostaglandinas parecem estar

envolvidas, mas não o sistema taquicinérgico. O extrato também foi capaz de

antagonizar a hipernocicepção induzida por bradicinina e por substância P. O estudo

também sugere que o efeito anti-nociceptivo de P. cyparissias não parece ter

relação com o sistema opióide (DE CAMPOS et al., 1997).

Em outro estudo, foi evidenciado o efeito inibitório do extrato hidrolacoólico de

P. cyparissias sobre contrações induzidas por diferentes agentes inflamatórios em

traquéias isoladas de cobaias (SAYAH et al., 1999). Dentre tais agentes, destacam-

se bradicinina, substância P, PGH2, análogo estável de tromboxano A2 U46619,

histamina e acetilcolina, todos mediadores envolvidos com a resposta nociceptiva e

inflamatória nas vias aéreas.

Baseado nos estudos prévios e tomando os resultados obtidos para a

atividade anti-hipernociceptiva de P. cyparissias de forma conjunta, verifica-se que

sua ação foi evidenciada principalmente em modelos de hipernocicepção

inflamatória. De fato, os extratos da planta demonstraram antagonismo a diversos

mediadores da inflamação, bem como a agentes pró-inflamatórios, como a

carragenina, CFA e LPS. Em contrapartida, o extrato não apresentou atividade anti-

hipernociceptiva no modelo de nocicepção induzida por epinefrina. Todavia, gerou

resultados promissores no modelo de CPNC. Como descrito, este último modelo

promove a sensibilização periférica e central por diferentes e variados mecanismos,

envolvendo mediadores inflamatórios e mediadores nociceptivos centrais.

Com isto demonstra-se uma atuação potencialmente sinérgica do extrato

metanólico de P. cyparissias, envolvendo uma série de distintos mecanismos para

gerar sua atividade anti-hipernociceptiva. Esta ação sinérgica é bastante comum

para extratos, visto a variabilidade molecular existente em sua constituição,

permitindo que atue por diferentes vias.

Objetivando a verificação do papel dos diferentes compostos isolados de P.

cyparissias, PC1 a PC4 foram avaliados no modelo de hipernocicepção induzida por

carragenina. Os resultados estão apresentados nas figuras 54 a 57. Para PC1,

126

observou-se uma redução significativa na resposta à hipernocicepção mecânica

(p<0,05) em todas as doses, com inibições de 21,2 ± 5,8 %, 37,3 ± 5,8 % e 41,6 ±

6,2 %, respectivamente para 0,02, 0,07 e 0,24 µmol/kg. Todavia, esta atividade foi

observada apenas para os períodos iniciais após o tratamento. Já PC2 não foi capaz

de inibir significativamente a resposta nociceptiva, evidenciando que, provavelmente,

não participe do potencial anti-hipernociceptivo de P. cyparissias. PC3 foi capaz de

inibir a resposta dos animais à estimulação mecânica em todas as doses (p<0,01),

sendo o composto mais efetivo, com inibições de 34,2 ± 3,6 %, 47,8 ± 5,2 % e 22,1 ±

5,0% para as doses de 0,04, 0,11 e 0,37 µmol/kg, respectivamente. Além disto, sua

atividade perdurou durante todas as 48h de avaliação. Porém, não demonstrou

apresentar um perfil dose-resposta. Por fim, PC4 também foi efetivo quanto à

redução da hiperalgesia induzida pela carragenina (p<0,01), porém apenas nas

doses de 0,09 e 0,31 µmol/kg, com inibições de 63,6 ± 4,4 % e 40,4 ± 7,7 %,

respectivamente. Sua atuação limitou-se à 24h após a administração do agente

lesivo.

B 1 3 4 60

15

30

45

60

75

90

Carragenina (300 µg/pata)PC1 (0,02 µmol/kg, i.p.)PC1 (0,07 µmol/kg, i.p.)PC1 (0,24 µmol/kg, i.p.)

24 48

**

**

**

**

*********

**

*

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal Controle 0,02 0,07 0,240

100

200

300

400

500

600

PC1 (µµµµmol/kg, i.p.)Carragenina (300µµµµg/pata)

*** **

AU

C

Figura 54: Frequência de resposta de retirada da pata direita traseira, avaliada no grupo controle e em animais tratados PC1 (0,02 – 0,24 µmol/kg, i.p.) em diferentes intervalos de tempo após a injeção i.pl. de carragenina (300 µg/pata). Os dados são expressos como a média ± EPM de 4-6 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam uma redução significativa do limiar de retirada da pata, onde *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.

127

B 1 3 4 60

15

30

45

60

75

90

Carrageenina (300 µg/pata)PC2 (0,04 µmol/kg, i.p.)PC2 (0,12 µmol/kg, i.p.)PC2 (0,39 µmol/kg, i.p.)

24 48

***

***

***

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

500

600

PC2 (µµµµmol/kg, i.p.)


AU

C


B 1 3 4 60

15

30

45

60

75

90


24 48

***

****

* **

******

******

*****

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

500

600

PC3 (µµµµmol/kg, i.p.)


****

**

AU

C


128

B 1 3 4 60

15

30

45

60

75

90


24 48

****** ***

******

****** ***

*

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

500

600

PC4 (µµµµmol/kg, i.p.)Carragenina (300 µµµµg/pata)

**

**

AU

C


Estes resultados sugerem que os compostos PC1, PC3 e PC4 podem ser

parcialmente responsáveis pela atividade anti-hipernociceptiva de P. cyparissias.

Ademais, considerando apenas as xantonas, pode-se inferir que um maior volume

molecular existente nas suas posições 2 e 3 contribui para a atividade, visto que: em

PC4 há a presença de um substituinte metóxi em C-2 e uma hidroxila em C-3; em

PC3 há um anel metilenodióxi substituindo C-2 e C-3; já em PC2, há apenas uma

hidroxila em C-3. Assim, com o aumento do volume dos substituintes, há um

aumento na atividade. Ademais, a presença de grupos aceptores de prótons

também pode estar relacionado ao aumento da atividade anti-hipernociceptiva. Em

PC2 há um grupo doador e aceptor (hidroxila) em C-3. Já em PC3 há a presença do

mesmo grupo na mesma posição, porém há um grupo aceptor em C-2 (metóxi).

Todavia, em PC3, há apenas grupos aceptores em ambas as posições

(metilenodióxi), podendo este fator ser parcialmente responsável pela melhor

atividade.

Alguns estudos já demonstraram a atividade anti-nociceptiva de xantonas. Em

um estudo com xantonas sintéticas 2-carboxiladas, foi evidenciada a atividade

destas moléculas sobre a nocicepção inflamatória (ECKSTEIN; MARONA; MAZUR,

1983). Já Bianco et al. (1989) sintetizaram 2-hidroxiacetil-7-acetilxantona, que,

quando avaliada frente ao modelo de contorções abdominais e edema de pata em

129

camundongos, foi capaz de gerar respostas anti-nociceptiva e anti-inflamatória

pronunciadas. Ainda, De Campos et al. (1997) verificaram que a 1,7-dihidroxi-2,3-

dimetoxixantona, identificada como PC5 no presente trabalho, foi capaz de reduzir o

número de contorções abdominais induzidas por ácido acético.

Mais recentemente, Dar et al. (2005) objetivaram determinar o mecanismo de

ação da mangiferina, uma xantona glicosilada. Ela foi capaz de inibir as contorções

abdominais induzidas por ácido acético, sendo sugestionado que está ação

envolveria o sistema opióide. Também, diversas xantonas sintéticas foram testadas

por Librowski et al. (2005), demonstrando que várias delas apresentaram atividade

anti-nociceptiva e anti-inflamatória, além de não provocarem efeitos adversos sobre

a mucosa gástrica. Já Cui et al. (2010) evidenciaram que tanto a α-mangostina

quanto a γ-mangostina, ambas xantonas preniladas, apresentaram efeito

antinociceptivo nos modelos da placa quente e de formalina, estando esta ação

relacionada, periféricamente, à inibição da síntese de PGs e ao seu efeito

antioxidante e, centralmente, ao seu efeito antagonista sobre a histamina e a

serotonina.

Quanto ao espinasterol, Jeong et al. (2010) demonstraram seu efeito

supressor sobre mediadores pró-inflamatórios induzidos por LPS, inibindo, também,

a produção de NO, PGE2, TNF-α e IL-1β. Também, Meotti et al. (2006) e Boller et al.

(2010) verificaram a atividade antinociceptiva do esterol no modelo de contorções

induzidas por ácido acético e, posteriormente, contra a nocicepção induzida por

glutamato (RIBAS et al., 2008).

Assim, os resultados farmacológicos obtidos para o extrato e compostos

isolados ensaiados nos modelos propostos, demonstram a potencial atividade

gastroprotetora e anti-hipernociceptiva de P. cyparissias. Cabe salientar que um

extrato ou metabólito isolado que apresente ambas as atividades é de extremo

interesse, visto que os AINEs, comumente utilizados por suas propriedades

analgésicas, podem gerar úlceras gástricas, conforme relatado anteriormente.

Destaca-se que avanços para delineamento de mecanismo de ação para

ambas as atividades farmacológicas são necessários, tanto para o extrato quanto

para os compostos isolados. Em adição, estes metabólitos podem servir como

protótipos para futuros estudos de derivatização de suas estruturas, objetivando

melhoramento farmacocinético e farmacodinâmico, enriquecendo ainda mais as

130

potencias aplicabilidades de produtos de origem natural para o tratamento da úlcera

e da dor.

6 CONCLUSÕES

a) Através de métodos cromatográficos clássicos, foi possível isolar 5 compostos

do extrato acetônico de Polygala cyparissias: α-espinasterol (PC1), 1,3-

dihidroxi-7-metoxixantona (PC2), 1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona

(PC3), 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4) e 1,7dihidroxi-2,3-

dimetoxixantona (PC5). Além disto, da fração metanólica obteve-se, pela

primeira vez para o gênero Polygala, o flavonóide astragalina;

b) Obteve-se um perfil cromatográfico do extrato metanólico de P. cyparissias

que, futuramente, deverá ser aprimorado para fins de quantificação do

marcador PC3 em extratos de coletas sazonais e de diferentes partes da

planta;

131

c) O extrato acetônico e a fração metanólica de P. cyparissias apresentaram

atividade gastroprotetora frente a dois modelos de indução de lesão gástrica:

etanol/HCl e indometacina/betanecol;

d) Tanto o extrato acetônico quanto a fração metanólica demonstraram atividade

curativa das lesões ulcerativas no modelo de úlcera crônica induzida por

ácido acético;

e) Nem o extrato acetônico nem a fração metanólica foram capazes de inibir o

crescimento de H. pilory;

f) O extrato acetônico e a fração metanólica da planta em estudo promovem

gastroproteção de forma dependendete do NO e dos SHs;

g) O espinasterol (PC1) e as xantonas 1,3-dihidroxi-7-metoxixantona (PC2) e

1,7-dihidroxi-2,3-metilenodioxixantona (PC3) demonstraram atividade

gastroprotetora frente ao modelo de úlcera induzida por etanol/HCl;

h) O extrato metanólico bruto de P. cyparissias foi capaz de antagonizar a

hipernocicepção mecânica induzida por carragenina, LPS, CFA e PGE2;

i) Aparentemente o efeito anti-hiperálgico de P. cyparissias não se relaciona às

vias adrenérgicas, visto que foi incapaz de reverter o estado hiperálgico

induzido por epinefrina;

j) O extrato metanólico evidenciou ser capaz de inibir a hipernocicepção

mecânica persistente induzida pela CPNC até o 12° dia;

k) Os compostos isolados espinasterol (PC1), 1,7-dihidroxi-2,3-

metilenodioxixantona (PC3) e 1,3,6,8-tetrahidroxi-2,7-dimetoxixantona (PC4)

apresentaram atividade anti-hipernociceptiva no modelo de nocicepção

inflamatória induzida por carragenina;

132

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ANEXO A – Artigo publicado

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ANEXO B – ARTIGO DE REVISÃO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ LUIZ CARLOS KLEIN … · Sendo Mãe, com letra maiúscula. A...

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