ROGÉRIO TOLARDO AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS … · DA Hedyosmum brasiliense Miq. SOBRE O...

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

ROGÉRIO TOLARDO

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS EFEITOS

DA Hedyosmum brasiliense Miq. SOBRE O SISTEMA NERVOSO

CENTRAL

Itajaí - 2008

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

ROGÉRIO TOLARDO



CENTRAL

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Drª. Márcia Maria de Souza

Itajaí, agosto de 2008

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CENTRAL

ROGÉRIO TOLARDO

‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Fitoquímica e atividade biológica e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’

____________________________________ , Dra

__________________________________________________________ , Dra

Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________ Dra

Presidente

______________________________________ Dra

Membro

______________________________________ Dr

Membro

____________________________________ Dr

Membro Externo

Itajaí (SC), 27 de agosto de 2008.

Dedico esta dissertação a todos que me apoiaram, principalmente aos

meus pais, Pedro Tolardo e Nair Tolardo, minha irmã Raquel Tolardo,

irmão Roberto C. Tolardo e minha namorada,

Ivanete Teleski, que com apoio incansável

me ajudaram alcançar mais

essa importante vitória.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas que de uma forma ou outra contribuíram para a

realização deste trabalho, especialmente:

À minha orientadora, Dra Márcia Maria de Souza, pela conduta moral e

profissional, com sua exemplar capacidade científica, ajudou-me a superar inúmeras

dificuldades, seus ensinamentos serão inestimáveis para toda minha vida.

À professora Dra Maique W. Biavatti, pelas orientações quanto à obtenção do

extrato.

Às minhas amigas do laboratório, Ticiana C. Mora e Maria A. T. de Azevedo

que prontamente disponibilizaram seu tempo, sua paciência e seu companheirismo

nos momentos mais difíceis, suas amizades levarei comigo para sempre.

Aos alunos do PIPG, Daniel e Lucas por seu comprometimento com o

trabalho e sempre vontade em aprender.

A aluna e colaboradora da Farmácia Angeloni, Crislaine Tilha, sempre com

um sorriso no rosto nunca se opôs a ajudar, tanto profissionalmente, quanto

pessoalmente, foi bom trabalhar com você.

Agradeço as sempre presentes colaboradoras da coordenação do curso de

Ciências Farmacêuticas da UNIVALI, Vania C. M. da Silva e Roselia Koerich.

Agradeço aos professores Dr. Sérgio F. de Andrade e Drª. Cristiani Bürger

que acompanharam o andar dos trabalhos sempre aconselhando os melhores

caminhos a serem seguidos.

A amizade dos professores(as): Drª. Tania M. B. Bresolin, Dr. Rivaldo Niero,

Dr. Alexandre Bella Cruz, Drª. Nara L. M. Quintão, que pelos corredores da

universidade sempre tinham algo bom a dizer.

“Muito melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se a derrota, do que formar fila com os pobres de espírito que nem

gozam muito nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra cinzenta que não conhece vitória nem derrota”

Theodore Roosevelt

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DOS EFEITOS DA Hedyosmum

brasiliense Miq. SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Rogério Tolardo

Agosto/2008 Orientador: Márcia Maria de Souza, Drª. Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de Páginas: 108. A Hedyosmum brasiliense Miq. (Chloranthaceae) é uma planta medicinal de uso popular conhecida como “cidrão”, usada como calmante na medicina popular. No presente estudo, o efeito do extrato etanólico da Hedyosmum brasiliense Miq. (EEHb) foi investigado em diversos modelos farmacológicos “in vivo” sobre o sistema nervoso central (SNC). Para tanto, foram utilizados camundongos Swiss Webster (25 – 30 g), em modelos animais como: modelo de depressão, o nado forçado (MNF) e suspensão pela cauda (MSC); modelo de ansiedade, o labirinto em cruz elevado (LCE); modelos de convulsão, induzida por pentilenotetrazol (MCP) e estricnina (MCE); modelo de indução do sono por barbitúrico (MSB); modelo de deambulação e o teste campo aberto (TCA). Para o teste de memória (teste de esquiva inibitória), foram utilizados ratos Wistar (250 – 300 g). O EEHb não produziu efeito sobre o sistema motor dos animais no TCA. O efeito antidepressivo do EEHb foi observado quando administrado de forma aguda e sub-crônica, sendo mais eficaz no segundo caso. No LCE o efeito do EEHb (100 mg/Kg, i.p.) foi semelhante ao resultado obtido pelo tratamento com o diazepam (0,75 mg/Kg, i.p.). Também foi investigado o mecanismo de ação das propriedades antidepressiva e ansiolítica do EEHb. O efeito antidepressivo do EEHb foi revertido pelo pré-tratamento com prazosin (1 mg/kg, i.p, antagonista α1) e ioimbina (1 mg/kg, i.p, antagonista α2). Tanto o pré–tratamento com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p., antagonista dopaminérgico não seletivo) quanto pimozide (0,2 mg/kg, i.p. antagonista D2) reverteram o efeito antidepressivo do EEHb. O pré-tratamento com PCPA (inibidor da síntese de serotonina administrado por 4 dias consecutivos) e NAN-190 (0,5mg/kg, i.p., antagonista 5-HT1A) reverteram o efeito antidepressivo do extrato, mas o pré-tratamento com quetanserina (antagonista dos receptores 5-HT2A) não alterou tal efeito. O pré-tratamento com reserpina também promoveu a reversão do efeito antidepressivo. A podoandina (10 mg/Kg, i.p.), uma lactona obtida a partir do EEHb, também produziu efeito antidepressivo. O flumazenil (2 mg/kg, i.v., antagonista GABAA específico) e a reserpina reverteram o efeito ansiolítico do EEHb. O EEHb, em todas as doses utilizadas, não só promoveu a diminuição da latência para o sono, bem como o aumento do tempo total do sono. O EEHb não promoveu um efeito protetor contra as crises convulsivas, induzidas por PTZ e estricnina. Sobre as etapas da memória no modelo de esquiva inibitória, o EEHb apresentou efeito amnésico nos animais no processo de consolidação da memória somente com a dose de 10 mg/Kg. Os resultados em conjunto nos permitem sugerir que a planta apresenta efeitos hipnótico, amnésico, antidepressivo e ansiolítico. Com relação aos mecanismos envolvidos na ação antidepressiva pode-se citar a participação dos sistemas adrenérgico, via receptor α1, do sistema dopaminérgico via receptor D2, além do sistema serotonérgico via receptores 5-HT1A. E, a podoandina pode ser um dos princípios ativos presentes no EEHb responsável pelo efeito antidepressivo no MNF. Já com relação ao efeito ansiolítico, parece ser essa propriedade mediada pelo sistema GABAérgico e ter envolvimento do sistema monoaminérgico. Os resultados obtidos também validam parcialmente a planta como agente terapêutico nos processos de depressão e ansiedade. Palavras-chave: SNC; Modelos farmacológicos sobre o SNC; Hedyosmum brasiliense Miq..

PHARMACOLOGICAL EVALUATION OF THE EFFECTS OF

Hedyosmum brasiliense Miq. ON THE CENTRAL NERVOUS

SYSTEM

Rogério Tolardo

August/2008 Supervisor: Márcia Maria de Souza, Dr. Area of Concentration: National products and bioactive synthetic substances. Number of Pages: 108. Hedyosmum brasiliense Miq. (Chloranthaceae) is a popularly used medicinal plant known as “cidrão”, which is used as a calmant in popular medicine. In the present study, the effect of ethanol extract of Hedyosmum brasiliense Miq. (EEHb) was investigated in various pharmacological models “in vivo” on the central nervous system (CNS). For this experiment, Swiss Webster mice (25 – 30 g) were used, in animal models such as: the depression model, the forced swimming test (FST), the tail-suspension test (TST), the anxiety model, the elevated cross maze test (ECM), the pentylenotetrazol- (PIS) and strychnine- (SIS) induced seizure models, the barbituric-induced sleep test (BIS), the deambulation model, and the open field test (OFT). For the memory test (inhibitory avoidance test), Wistar rates were used (250-300 g). EEHb did not produce any effects on the motor system of the animals in the OFT. The anti-depressive effect of EEHb was observed when administered in acute and sub-chronic forms, being more effective in the latter case. In the ECM the effect of the EEHb (100 mg/Kg, i.p.) was similar to the result obtained for the treatment with diazepam (0.75 mg/Kg, i.p.). The mechanism of action of the anti-depressive and anxiolytics properties of EEHb was also investigated. The anti-depressive effect of EEHb was reversed by pre-treatment with prazosin (1 mg/kg, i.p, antagonist α1) and yoimbine (1 mg/kg, i.p, antagonist α2). Both pre-treatment with haloperidol (0.2 mg/kg, i.p., non-selective dopaminergic antagonist) and pimozide (0.2 mg/kg, i.p. antagonist D2) reversed the antidepressive effect of EEHb. Pre-treatment with PCPA (inhibitor of the synthesis of serotonin administered for 4 consecutive days) and NAN-190 (0.5 mg/kg, i.p., antagonist 5-HT1A) reversed the antidepressive effect of the extract, but pre-treatment with ketanserin (antagonist of the 5-HT2A

receptors) did not alter this effect. Pre-treatment with reserpin also promoted reversal of the antidepressive effect. Podoandin (10 mg/Kg, i.p.), a lactone obtained from EEHb, also produced an antidepressive effect. Flumazenil (2 mg/kg, i.v., specific GABAA antagonist) and reserpin reversed the anxiolytic effect of EEHb. The EEHb, at all the doses used, promoted a decrease in sleep latency, as well as an increase in total sleep time. The EEHb did not promote a protective effect against the convulsive crises induced by PTZ and strychnine. Concerning the stages of the memory in the inhibitory avoidance model, the EEHb presented amnesic effect in the animals in the process of memory consolidation only at a dose of 10 mg/Kg. The results in conjunction do not enable us to suggest that the plant presents hypnotic, amnesic, anti-depressive or anxiolytic effects. In relation to the mechanisms involved in the antidepressive action, the participation was observed of the adrenergic systems, via receptor α1, the dopaminergic system, via receptor D2, and the serotonergic system, via receptors 5-HT1A. also, podoandina may be one of the main active ingredients present in EEHb responsible for the antidepressive effect in MNF. In relation to the anxiolytic effect, it appears that this property is mediated by the GABAergic system and is involved in the monoaminergic system. The results obtained also partially validated the plant as a therapeutic agent in processes of depression and anxiety. Key words: CNS; Pharmaceutical models on the CNS; Hedyosmum brasiliense Miq..

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Hedyosmum brasiliense Miq. 32

Figura 2 Etapas de purificação da fração diclorometano de Hedyosmum brasiliense Miq..

37

Figura 3 Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a deambulação dos animais através do TCA.

40

Figura 4 Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a ansiedade através do LCE.

41

Figura 5 Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade ansiolítica do EEHb (Sistema Monoaminérgico).

42

Figura 6 Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade ansiolítica do EEHb (Sistema GABAérgico).

43

Figura 7 Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre o MSB

44

Figura 8 Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a depressão através do MNF.

45

Figura 9 Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a depressão através do MSC.

46

Figura 10 Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do EEHb, avaliação do sistema serotonérgico - PCPA.

48

Figura 11 Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do EEHb, avaliação do sistema monoaminérgico.

49

Figura 12 Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a convulsão induzida por PTZ e estricnina.

51

Figura 13 Esquiva inibitória. 52 Figura 14 Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de

haloperidol (2,5 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de rearings (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p<0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001).

55

Figura 15 Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de diazepam (0,75 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças

58

significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05 e ** p < 0,01).

Figura 16 Efeito do pré-tratamento dos animais com flumazenil (FLU) (2 mg/kg, i.v.) administração aguda do EEHb (100 mg/Kg) e de diazepam (DPZ) (0,75 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001). # p < 0,05, ## p < 0,01 e ### p < 0,001 denotam significância estatística quando comparado com extrato e DPZ na ausência dos antagonistas.

61

Figura 17 Efeito do pré-tratamento dos animais com reserpina (2 mg/kg) administração aguda do EEHb (100 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05 e *** p < 0,001). ### p < 0,001 denotam significância estatística quando comparado com extrato na ausência da reserina.

62

Figura 18 Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de diazepam (1 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no MSB. Tempo de latência para o sono (A) e o tempo total do sono (B).Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05 e ** p < 0,01).

66

Figura 19 Efeito da administração aguda e sub-crônica do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg, i.p.) e da imipramina (50 mg/Kg, i.p.). MNF administrado de forma aguda (A), MNF administrado de forma sub-cônica (B), MSC administrado de forma aguda (C) e MSC administrado de forma sub-crônica (D). Os modelos indicam o tempo total de imobilidade. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001).

70

Figura 20 Efeito de pré-tratamento de animais com reserpina (2 mg/kg, i.p.), 73

10 minutos antes da aplicação do EEHb (100 mg/kg, i.p.), na redução do tempo de imobilidade no MNF em camundongos. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01). ## p < 0,01 quando comparado com o extrato na ausência de reserpina.

Figura 21 Efeito de pré-tratamento de animais com PCPA (100 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 4 dias sucessivos) (A), NAN-190 (0,5 mg/kg, i.p.) (B), Quetanserina (5 mg/kg, i.p.) (C), na redução do tempo de imobilidade causada pela administração do EEHb (100 mg/kg, i.p.) no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05). # p < 0,05 indicam diferenças estatísticas quando comparado com o extrato na ausência dos antagonistas.

74

Figura 22 Efeito do pré-tratamento dos animais com prazosin (1 mg/kg, i.p.) (A) e ioimbina (1 mg/kg, i.p.) (B) na redução do tempo de imobilidade causada pela administração do EEHb (100 mg/kg, i.p.) no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01). #p < 0,05 e ### p < 0,001 denotam significância estatística quando comparado com extrato na ausência dos antagonistas.

75

Figura 23 Efeito do pré-tratamento dos animais com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p.) (A) e pimozide (0,2 mg/kg, i.p.) (B) na redução do tempo de imobilidade causada pela administração do EEHb (100 mg/kg, i.p.) no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01). ## p < 0,01 denotam significância estatística quando comparado com extrato na ausência dos antagonistas.

76

Figura 24 Efeito da administração aguda do EEHb (100 mg/Kg, i.p.), podoandina (10 mg/Kg, i.p.) e 13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide (10 mg/Kg, i.p.) na redução do tempo de imobilidade no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (** p < 0,01 e *** p < 0,001).

77

Figura 25 Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de fenobarbital (50 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo de convulsão induzida por PTZ e estricnina. Figura A indica

85

o tempo de latência para primeira crise convulsiva com PTZ, Figura B tempo de latência para primeira crise convulsiva com estricnina. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01).

Figura 26 Resumo esquemático das propriedades farmacológicas estudadas com o EEHb e possíveis mecanismo de ação.

92

LISTA DE ABREVIATURAS ACTH – Hormônio adenocorticotrófico

ACh – Acetilcolina

AMPA – Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico

ATCs – Antidepressivos tricíclicos

BDZs – Benzodiazepínicos

CC – Cromatografia em coluna

CCD – Cromatografia em camada delgada

Cl- – Cloreto

DA – Doença de Alzheimer

DO – Dopamina

DPZ – Diazepam

EEHb – Extrato etanólico de Hedyosmum brasiliense Miq.

E.P.M – Erro Padrão Médio

FEA – Freqüência de entrada do braço aberto

FEF – Freqüência de entrada no braço fechado

FLU – Flumazenil

GABA – Ácido γ-aminobutírico

EEHb100 – Extrato etanólico de Hedyosmum brasiliense Miq., 100 mg/Kg

i.p. – Intraperitoneal

iMAO – Inibidores da monoamino-oxidase

ISRS – Inibidores seletivos da recaptação de serotonina

i.v. – Intravenosa

LCE – Labirinto em cruz elevado

LTP – Long-Term Potential

MAO – Monoamino-oxidase

MCE – Modelo de convulsão induzido por estricnina

MCP – Modelo de convulsão induzido por pentilenotetrazol

MEI – Modelo de esquiva inibitória

MNF – Modelo de natação forçada

MSB – Modelo de indução do sono por barbitúrico

MSC – Modelo de suspensão pela cauda

NAN-190 – 1-(2-metoxifenil)-4-[2-ftalimido)butil]piperazina

NMDAR – N-metil-D-aspartato receptor

NOR – Noradrenalina

OMS – Organização Mundial da Saúde

PCPA – Cloridrato de p-clorofenilalanina

PTZ – Pentilenotetrazol

%FEA – Percentagem da freqüência de entrada no braço aberto

%TPA – Percentagem do tempo de permanência no braço aberto

RNM – Ressonância Magnética Nuclear

SIB – Sono induzido por barbitúrico

SNC – Sistema Nervoso Central

TCA – Teste campo aberto

TPA – Tempo de permanência no braço aberto

TPF – Tempo de permanência no braço fechado

5-HT – Serotonina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 17

2 OBJETIVOS ...................................................................................... 19

2.1 Objetivo geral: ............................... ........................................................... 19

2.2 Objetivos específicos:......................... .................................................... 19

3 REVISÃO DA LITERATURA............................ ................................. 21

3.1 Uso de plantas medicinais como fonte de medicam entos: ................ 21

3.2 Plantas medicinais com atividade central: ..... ...................................... 22

3.2.1 Plantas medicinais com atividade ansiolítica: ............................................. 22

3.2.2 Plantas medicinais com atividade hipnótica: . ............................................. 23

3.2.3 Plantas medicinais com atividade antidepressi va: ..................................... 25

3.2.4 Plantas medicinais com atividade anticonvulsi vante: ................................ 28

3.2.5 Efeito de plantas medicinais sobre o aprendiz ado e a memória: .............. 29

3.3 Da planta em estudo Hedyosmum brasiliense Miq.: ...................................... 31

4 MATERIAL E MÉTODOS .............................. .................................... 35

4.1 Coleta e preparo dos extratos: ................ ............................................... 35

4.2 Separação dos compostos e análise cromatográfic a: ........................ 35

4.2.1 Caracterização das substâncias isoladas : ................................................... 38

4.3 Ensaios farmacológicos: ....................... ................................................. 38

4.3.1 Animais: .................................... ...................................................................... 38

4.3.2 Reagentes e vias utilizadas: ................ .......................................................... 38

4.3.3 Ensaios farmacológicos: ..................... .......................................................... 39

4.3.3.1 Avaliação do efeito do EEHb sobre a deambul ação dos animais através

do teste campo aberto (TCA) : ................................................................................ 39

4.3.3.2 Avaliação do efeito do EEHb sobre a ansieda de dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado (LCE): ......................................................... 40

4.3.3.3 Determinação do mecanismo de ação da propri edade ansiolítica do

EEHb: ....................................................................................................................... 42

a) Avaliação do efeito da reserpina sobre o efeito ansiolítico do EEHb: ........... 42

b) Avaliação do efeito do sistema GABAérgico sobre o efeito ansiolítico do

EEHb: ............................................. .......................................................................... 42

4.3.3.4 Avaliação do efeito do EEHb sobre o sono in duzido por barbitúrico

(MSB): . ...................................................................................................................... 43

4.3.3.5 Avaliação do efeito do EEHb sobre a depress ão através do modelo da

natação forçada (MNF): .......................................................................................... 44

4.3.3.6 Avaliação do efeito do EEHb sobre a depress ão através do modelo de

suspensão pela cauda (MSC): ................................................................................ 45

4.3.3.7 Determinação do mecanismo de ação da ativid ade antidepressiva do

EEHb: ....................................................................................................................... 47

a) Avaliação do efeito da reserpina sobre o efeito antidepressivo do EEHb: .... 47

b) Avaliação do sistema serotonérgico: ................................................................ 47

c) Avaliação do sistema noradrenérgico: ............................................................. 48

d) Avaliação do sistema dopaminérgico: ............ .................................................. 49

4.3.3.8 Avaliação do efeito antidepressivo de dois compostos obtidos do

EEHb: ....................................................................................................................... 50

4.3.3.9 Avaliação do efeito do EEHb sobre a convuls ão induzida por

pentilenotetrazol (MCP) e estricnina (MCE) : .................................................... 50

4.3.3.10 Avaliação do efeito do EEHb sobre a memóri a através do modelo da

esquiva inibitória (MEI) : ................................................................................... 51

4.4 Análise estatística: .......................... ........................................................ 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................... .............................. 54

5.1 Efeito do EEHb sobre a deambulação dos animais através do TCA: 54

5.2 Efeito do EEHb sobre a ansiedade dos animais at ravés do modelo

LCE: .............................................. .................................................................. 57

5.3 Determinação do mecanismo de ação da propriedad e ansiolítica do

EEHb: ............................................. ................................................................. 59

5.4 Efeito do EEHb sobre o sono induzido por barbit úrico (MSB): .......... 65

5.5 Efeito do EEHb sobre a depressão através do MNF e do MSC

administrado de forma aguda e sub-crônica: ........ ..................................... 68

5.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedad e antidepressiva

do EEHb: .......................................... ............................................................... 71

5.7 Avaliação dos efeitos dos compostos obtidos do EEHb: ................... 72

5.8 Avaliação do efeito do EEHb sobre a convulsão i nduzida por PTZ e

estricnina: ....................................... ................................................................ 83

5.9 Avaliação do efeito do EEHb sobre a memória atr avés do modelo de

esquiva inibitória (MEI): ......................................................................... 87

6 CONCLUSÕES ................................................................................. 93

REFERÊNCIAS .................................................................................... 94

ANEXO ...............................................................................................108

17

1 INTRODUÇÃO

Durante milhares de anos as plantas têm sido a base da medicina tradicional,

e quando utilizadas para esse fim, são denominadas de plantas medicinais. Os

primeiros registros do uso de plantas medicinais provêm da Mesopotâmia e datam

de 2.600 a.C. Muitas espécies conhecidas desde a antiguidade, ainda hoje, são

utilizadas para tratamento de doenças como: infecções, inflamações, processos

dolorosos diversos, distúrbios dos sistemas digestório, respiratório, urinário,

circulatório e também distúrbios do Sistema Nervoso Central (SNC) (GURIB-FAKIM,

2006).

Aproximadamente 75% dos compostos puros de origem natural empregados

na indústria farmacêutica foram isolados de plantas, mas, apenas cerca de 25 a 30%

de todos fármacos disponíveis no mercado são derivados de produtos naturais.

Apesar da importância de suas aplicabilidades na terapêutica, poucas plantas são

cientificamente estudadas, considerando-se a quantidade existente no mundo, esse

fato representa um grande leque de alternativas visando a avaliação da qualidade,

segurança e eficácia das substâncias ativas oriundas das mesmas. Muitas destas

plantas encontram-se distribuídas em áreas tropicais e, estima-se que apenas 1%

das espécies foram estudadas. Portanto, um grande potencial farmacêutico continua

disponível para estudos farmacológicos e/ou fitoquímicos (CALIXTO, 2005).

Ainda, conforme autores citados acima, as recentes tentativas de descobertas

de produtos com baixos efeitos adversos para a terapêutica de novas patologias ou

terapêutica daquelas de difícil tratamento com fármacos ditos sintéticos, induziram a

indústria farmacêutica à utilização de plantas, as quais possuem compostos

distintos, selecionados por mecanismos evolutivos ao longo de milhões de anos.

Com relação às patologias referentes ao SNC, a terapêutica com plantas

medicinais tem crescido nos últimos anos. Já são conhecidos mundialmente os

efeitos antidepressivos da hipericina, obtida da espécie Hipericum perforatum; os

efeitos ansiolíticos, de espécies como a Pfaffia glomerata conhecido como “Ginseng-

brasileiro” (DE-PARIS et al., 2000), e da Passiflora incarnata (maracujá),

(CAPASSO; SORRENTINO, 2005); os efeitos sedativos e hipnóticos da Matricaria

chamomilla (camomila) (ZANOLI; AVALLONE; BARALDI, 2000); os efeitos

analgésicos e antitussígenos da Papaver somniferum (papoula) (PAGE, 2005); os

18

efeitos antieméticos e analgésicos da Cannabis sativa (RESSTEL et al., 2006),

assim como os efeitos anti-Alzheimer das plantas da família Amarillidaceae

(ELGORASHI et al., 2006), da qual se obtém a galantamina atualmente

comercializada como Remipril®. Entretanto, há ainda outras patologias centrais

como, por exemplo, a epilepsia e a doença de Parkinson, onde pode-se estudar o

emprego de extratos de plantas e/ou compostos obtidos das mesmas na sua

terapêutica.

A família Chlorantaceae, considerada uma das mais velhas famílias das

angiospermas existentes, possui 4 gêneros e aproximadamente 75 espécies.

(ENDRESS P. K., 1980; YI-BO; ZHEN-YU, 1999). Hedyosmum brasiliense Miq., é

uma planta desta família conhecida por vários nomes no nosso país dentre os quais

destacamos: “cidrão”, “cidreira”, “erva-cidreira”, “âmbar-vegetal”, “canela-cânfora”,

“chá ou erva-de-bugre”, “chá-de-indio”, “chá ou erva-de-soldado”, “erva-almíscar”,

“hortelã-do-brejo” e “hortelã-silvestre”. Na medicina popular a planta é amplamente

utilizada como calmante.

Apesar da abundância e uso na medicina popular para distúrbios centrais,

como por exemplo a ansiedade, seu potencial farmacológico permanece

inexplorado, uma vez que, somente as propriedades analgésicas e antiinflamatórias

foram cientificamente confirmadas (TRENTIN et al.,1999).

Considerando os aspectos citados acima pretendeu-se neste trabalho avaliar

os efeitos centrais da planta através de modelos farmacológicos específicos,

utilizados no screening de substâncias psicotrópicas confirmando ou não seu uso na

medicina popular.

19

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

O presente trabalho teve como objetivo estudar possíveis propriedades

farmacológicas centrais do extrato etanólico da Hedyosmum brasiliense Miq. (EEHb)

(Chloranthaceae), em diversos modelos farmacológicos “in vivo”, utilizados no

screening de substâncias psicoativas.

2.2 Objetivos Específicos:

a) Avaliar os efeitos do EEHb sobre a deambulação dos animais através do

teste campo aberto.

b) Avaliar os efeitos do EEHb sobre a ansiedade dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado.

c) Investigar o mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do EEHb.

d) Avaliar os efeitos do EEHb sobre o sono através do modelo de sono

induzido por barbitúrico.

e) Avaliar os efeitos do EEHb, administrado de forma aguda e sub-crônica

sobre a depressão através dos modelos de natação forçada e suspensão pela

cauda.

f) Investigar o mecanismo de ação da propriedade antidepressiva do EEHb,

avaliando o sistema monoaminérgico (serotonina, dopamina e noradrenalina).

g) Avaliar o efeito antidepressivo de dois compostos químicos obtidos de

EEHb.

20

h) Avaliar os efeitos do EEHb sobre a convulsão induzida por pentilenotetrazol

(PTZ) e estricnina.

i) Avaliar os efeitos do EEHb sobre a memória através do teste da esquiva

inibitória.

21

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Uso de plantas medicinais como fonte de medicam entos:

Ao longo dos tempos, os seres humanos confiaram na natureza para as suas

necessidades básicas, para a produção de comida, matérias-primas, abrigos, roupa,

meios de transporte, fertilizantes e fragrâncias, e, não menos, foram usados como

fonte de produtos medicinais. Por milhares de anos as plantas formaram a base da

medicina tradicional e continuam proporcionando para gênero humano novos

remédios. Embora algumas propriedades terapêuticas atribuídas a plantas provaram

ser errôneas, a terapia medicinal com o uso de planta está baseado nos resultados

empíricos de centenas e milhares de anos (GURIB-FAKIM, 2006).

Estudos realizados pela Organização Mundial da Saúde (OMS), constataram

que aproximadamente 65 a 80% da população mundial de países em

desenvolvimento, devido à pobreza e ao não acesso a tratamento alopático,

dependem essencialmente de plantas medicinais para a terapêutica de suas

enfermidades (GURIB-FAKIM, 2006).

Sendo a flora brasileira rica em biodiversidade, o povo brasileiro possui

acesso facilitado a vários tipos de plantas medicinais. Alinhando essa facilidade com

a cultura vigente e com a falta de recursos financeiros, o uso de plantas para

tratamento de enfermidades é uma prática constante na população. Desta forma, a

etnofarmacologia (estudo e validação de plantas com propriedades terapêuticas

utilizadas popularmente) fornece os subsídios necessários para que a indústria

farmacêutica e/ou pesquisadores acadêmicos, utilizando conhecimento de áreas

como a farmacologia, bioquímica, toxicologia e biologia molecular, investiguem,

através de técnicas específicas, compostos responsáveis pelas propriedades

farmacológicas de plantas usadas terapeuticamente (CALIXTO et al., 2000).

22

3.2 Plantas medicinais com atividade central:

3.2.1 Plantas medicinais com atividade ansiolítica:

As desordens de ansiedade estão entre os mais prevalecentes de todos os

problemas psicológicos no mundo (LIEBA; BECKERB; ALTAMURAC, 2005).

Estimativas feitas pela OMS indicam que 0,1 a 16,9% das pessoas no mundo sofrem

com algum tipo de distúrbio de ansiedade e/ou depressão (ADAMS; GMÜNDER;

HAMBURGUER, 2007).

A ansiedade causa sofrimento clinicamente significativo com prejuízo social e

ocupacional para o indivíduo. Pacientes com ansiedade generalizada estão

associados com três ou mais dos seguintes sintomas presentes na maioria dos dias

nos últimos 6 meses. Inquietação ou sensação de estar com os nervos à flor da

pele, fatigabilidade, dificuldade em concentrar-se ou sensações de "branco" na

mente, irritabilidade, tensão muscular, perturbação do sono (dificuldades em

conciliar ou manter o sono ou sono insatisfatório e inquieto). A ansiedade não se

deve aos efeitos fisiológicos diretos de uma substância, como droga de abuso ou

medicamento, ou ainda, de uma condição médica geral, como hipertiroidismo

(AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION, 1994).

Com a introdução de benzodiazepínicos (BDZs) nos anos 60, houve uma

melhora na terapêutica, e esse tratamento se mantém até hoje. Embora o uso

desses medicamentos mostre-se muito eficiente, terapeuticamente os BDZs

possuem muitos efeitos colaterais, como: sedação, miorelaxamento, ataxia,

tolerância, amnésia anterógrada, e a dependência química e psicológica (LADER,

1995). Fatores esses que contribuem para a não adesão ao tratamento ou a

restrição do uso por períodos prolongados.

Em geral, os BDZs atuam como depressores do SNC. Acredita-se que os

BDZs estimulam ou facilitam a ação inibitória do ácido γ-aminobutírico (GABA)

(BATESON, 2006). O GABA é o principal inibidor da neurotransmissão no cérebro e

medeia a inibição pré e pós-sináptica em quase todas as regiões do SNC. A ativação

do receptor do GABAA resulta em uma abertura do canal de cloro, permitindo o fluxo

de íons cloreto (Cl-) pela membrana neuronal (LADER, 1995; BATESON, 2006). Tal

evento leva a hiperpolarização das células neuronais e inibe a transmissão do

23

impulso nervoso. Esta inibição diminui a excitabilidade neuronal, atenuando a

despolarização subseqüente dos transmissores excitatórios (LADER, 1995;

BATESON, 2006).

Na intenção de buscar a minimização de efeitos colaterais, e melhorar a

eficácia farmacológica na terapêutica de muitas doenças, muitas plantas estão

sendo testadas como ansiolíticas. Dessas, o gênero Passiflora, exibe fundamental

importância. Esse gênero inclui aproximadamente 500 espécies, distribuídas em

regiões temperadas e tropicais. No Brasil, o fruto da Passiflora caerulea (Flor de

Paixão Azul), planta nativa brasileira e introduzida na Inglaterra no século XVII, é

utilizado tradicionalmente, possuindo efeito ansiolítico, sedativo, diurético e

analgésico (DHAWAN; DHAWAN; SHARMA, 2004). Alcalóides, fenóis e flavonóides

são os principais fitoconstituintes presentes no gênero.

A Gastrodia elata, popularmente conhecida por “Tien ma” pelos índios, da

qual foi isolado o composto álcool 4-hidroxibenzílico, mostrou efeito ansiolítico

quando avaliada através do modelo labirinto em cruz elevado, tendo o envolvimento

dos sistemas serotoninérgico (5-HT1A) e GABAérgico no seu mecanismo de ação

(JUNG et al., 2006). A Salvia reuterana utilizada pela população do Irã, Coriandrum

sativum, popularmente conhecida como Coentro (RABBANI et al., 2005;

EMAMGHOREISHI; KHASAKI; AAZAM, 2005), Cannabis sativa (RESSTEL et al.,

2006) e Cymbopogon citratus (CARLINI et al., 1986), também tiveram confirmadas

suas propriedades ansiolíticas.

3.2.2 Plantas medicinais com atividade hipnótica:

A insônia é um distúrbio do sono que pode ser sintomas de várias condições

patológicas dentre as quais destacam-se o estresse, a depressão, processos

dolorosos intensos, e, também pode ser desencadeada por condições externas

como os ruídos intensos, excesso de luminosidade, inadequação postural, troca

constante de ciclo claro-escuro (ASPLUND, 2003).

Atualmente os medicamentos mais utilizados para os distúrbios do sono,

pertencem a classe dos BDZs, porém, estes fármacos podem produzir muitos efeitos

indesejáveis, como já apontados anteriormente (LADER, 1995; BATESON, 2006).

24

Na medicina popular muitas plantas são utilizadas como agentes hipnóticos e

algumas delas tem seu uso registrado em referências bastante antigas. O uso de

chás, para facilitar o sono é uma prática constante em muitas populações, embora

nem todas as espécies utilizadas tenham sido validadas farmacologicamente como

agente hipnótico. Valeriana officinalis, pertencente à família Valerianaceae, exibe

propriedades hipnóticas e seus princípios ativos encontrados na análise fitoquímica,

são monoterpenos e sesquiterpenos (GUTIERREZ et al., 2004). Yuan e

colaboradores (2004), mostraram que o ácido valerênico, presente também na

planta poderia induzir efeitos hipnóticos através da interação com receptores

GABAA.

Freitas e Costa (2002), confirmaram efeito hipnótico da planta Citrus

aurantium L. (Rutaceae). Ela é conhecida popularmente como “laranja-azeda” e é

usada na medicina popular no Brasil para tratar insônia. O estudo sugere uma ação

depressora do SNC, facilitando não só a latência do sono, como também

aumentando o tempo total do mesmo quando o extrato foi avaliado em modelos

animais.

Aloysia polystachya, popularmente conhecida como “burrito” contém:

monoterpenos como carvacol, carvona, eucarvona e limoneno, todos com ação

hipnótica comprovada farmacologicamente (HELLIÓN-IBARROLA et al., 2006).

Usada na medicina popular, principalmente na região norte do Brasil, a tintura

preparada com as flores de Erythrina mulungu (Papilionaceae), popularmente

conhecida como Mulungu é conhecida e utilizada para acalmar a agitação ou

diminuir a insônia. Preparações comerciais do extrato da planta estão disponíveis no

Brasil, e, estudos fitoquímicos motraram a presença de vários alcalóides dentre os

quais destaca-se a 11α-hidroxi-eritravina (FLAUSINO et al., 2007).

Emamghoreishi; Khasaki e Aazam (2005), testaram o extrato obtido da

semente da planta Coriandrum sativum (Umbelliferae) popularmente conhecida

como coentro. Os resultados sugerem que seu efeito hipnótico deva-se a interação

com receptores GABA, porém, não estão claros os constituintes químicos

responsáveis pelo efeito.

25

3.2.3 Plantas medicinais com atividade antidepressi va:

A depressão é um grande problema de saúde pública mundial, caracterizada

por alteração no humor contínua e falta de interesse em atividades prazerosas

(anedonia), acarretando prejuízo das funções psicológicas, motoras e sociais. A

depressão pode ocorrer na infância, adolescência e maioridade, com maior

prevalência em mulheres (5 a 20%), que em homens (3 a 12%) (BEBBINGTON,

2004; PRYCE et al., 2005; BURCUSA; IACONO, 2007).

Os sintomas de pacientes com depressão podem incluir a anedonia, aumento

ou diminuição do sono, aumento ou diminuição do apetite ou peso, falta de energia,

falta de concentração, baixa da auto-estima, sentimento de culpa, idéia de morte ou

suicídio. Pelo menos cinco dos sintomas relacionados devem ocorrer

concomitantemente por um período de tempo superior a 3 meses para se obter o

diagnóstico da depressão maior ou unipolar. Os sintomas devem estar presentes na

maior parte do dia, quase diariamente (AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION,

1994).

A maioria das pessoas com depressão recusam-se a procurar orientação

médica e/ou são tratadas através de diagnósticos imprecisos. 10 a 30% dos

pacientes não são diagnosticados de forma precisa por seus médicos (HEGEL, et

al., 2002; VINK; AARTSEN; SCHOEVERS, 2008), sendo este um dos fatores que

influenciam na recidiva. Mais de 50% dos pacientes que se recuperam de um

primeiro episódio de depressão terão um ou mais episódios depressivos durante a

vida (SKOLNICK, 2002). O custo econômico da depressão é extensamente

relevante, com estimativas que chegam a vários bilhões de dólares por ano, muito

deste fardo econômico acarreta em absenteísmo de trabalho e desempenho na

produtividade diminuída (HEGEL et al., 2002; WANG; SIMON; KESSLER, 2003).

A patogênese da depressão parece envolver um desequilíbrio bioquímico na

neurotransmissão central no sistema monoaminérgico. Sugere-se que regiões do

cérebro como o córtex pré-frontal, amígdala, partes relacionadas do estriado, córtex

cingulado e hipocampo estão envolvidos na neuroanatomia funcional da depressão

(DREVETS et al., 1992; WALSH et al., 2007; PEDRAZZA et al., 2008).

Durante várias décadas, a teoria mais aceita para a patogênese da depressão

envolve a deficiência orgânica de neurotransmissores como a serotonina (5-HT), a

26

noradrenalina (NOR) e a dopamina (DO), chamada hipótese ou teoria

monoaminérgica. A teoria é aceita até os dias de hoje, pois pacientes deprimidos ao

usarem substâncias que aumentam esses neurotransmissores nas fendas sinápticas

apresentam melhoras no quadro clínico (BOMHOLT; MIKKELSEN; MUNRO, 2005;

PAE et al., 2008).

No entanto, a hipótese monoaminérgica é de certa forma simplista ao não

explicar a ação de alguns antidepressivos que não agem sobre o sistema

monoaminérgico. Além disso, nem todas as substâncias que aumentam as

monoaminas na fenda sináptica agem como antidepressivos, como as anfetaminas e

a cocaína (BALDESSARINI, 1996). Desta forma, embora já esteja bem evidenciado

o envolvimento do sistema monoaminérgico na patogênese da depressão, acredita-

se que vários outros sistemas de neurotransmissores e mecanismos de transdução

estejam envolvidos na patogênese da depressão (ROBINSON; AMSTERDAM,

2008).

Fármacos antidepressivos com mecanismos baseados na teoria

monoaminérgica prevaleceram em prática clínica desde o meio do século XX, e a

maior parte deles demonstrou eficácia no tratamento de depressão. Porém, tais

fármacos são associados com limitações principais. Por exemplo, só ⅓ de pacientes

que utilizam apenas um tipo de tratamento com antidepressivo poderão ter a

completa melhora dos sintomas da depressão (BOMHOLT; MIKKELSEN; MUNRO,

2005; PAE et al., 2008; ROBINSON; AMSTERDAM, 2008).

Na farmacoterapia da depressão estão incluídos os antidepressivos tricíclicos

(ATCs), como: a imipramina, a amitriptilina, a nortriptilina e inibidores da monoamina

oxidase (MAOs) como: a fenelzina e a iproniazida, além disso, há os inibidores

seletivos da captação de 5-HT como, por exemplo, a fluoxetina, fluvoxamina e

paroxetina. Embora estes fármacos sejam eficazes para o tratamento da depressão,

os mesmos possuem efeitos adversos e/ou colaterais, os quais dificultam a adesão

do paciente ao tratamento e na sua manutenção. Além disso, muitos processos

depressivos são refratários ao tratamento ficando o paciente sem opções

terapêuticas farmacológicas (HEGEL et al., 2002; ROBINSON; AMSTERDAM,

2008).

Neste sentido, a busca por agentes antidepressivos com maior eficácia e

menores efeitos colaterais, aqui também é constatado. O interesse por substâncias

antidepressivas oriundas de plantas com potencial terapêutico aumentou

27

consideravelmente após os estudos com o Hypericum perforatum, sendo seu

fitoterápico empregado em todo o mundo no tratamento da depressão endógena.

Hypericum perforatum é uma planta perene herbácea, também conhecida

como “Erva de São João“ e rica em flavonóides e glicosídeos (PAULKE;

ZSILAVECZ; WURGLICS, 2006). Estudos clínicos e experimentais demonstraram

que o medicamento exibe propriedades semelhantes aos antidepressivos

convencionais. O mecanismo de ação sugerido é o bloqueio não seletivo da

recaptação das monoaminas (RODRÍGUEZ-LANDA; CONTRERAS, 2003).

Novas espécies como o Hypericum catarinense L. e Hypericum glandulosum,

estão sendo estudadas para o tratamento de depressões leves a moderadas

(RODRIGUES et al., 2002; SÁNCHEZ-MATEO et al., 2005).

Outras espécies de plantas encontradas em nossa flora também exibem

propriedade antidepressiva. A Cecropia glaziovii (Cecropiaceae), popularmente

conhecida como Embaúba e encontrada facilmente na costa de sudeste brasileira,

contém como fitoconstituintes catequinas, procianidinas e flavonóides, compostos

estes possivelmente responsáveis pelo efeito antidepressivo (TANAE et al., 2007).

Silva et al. (2006), demonstraram através do modelo de natação forçada

(MNF) a ação antidepressiva da espécie Hippeastrum vittatum (Amarillidaceae), uma

planta ornamental popularmente conhecida por “Açucena”. Espécies do gênero de

Hippeastrum são fonte de alcalóides, sugerindo que a ação antidepressiva

observada no modelo pode ser relacionada à esses fitoconstituintes.

Kielmeyera coriacea (Guttiferae) popularmente conhecida como “pau-santo”,

é uma planta medicinal usada pela população brasileira no tratamento de várias

doenças tropicais como a malária, leishmaniose e infecções fúngicas e bacterianas.

Essa planta também é efetiva e empregada na medicina popular como um fármaco

antidepressivo. Sua ação se deve possivelmente em função das xantonas as quais

constituem os compostos majoritários (ZAGOTO et al., 2006).

Herrera-Ruiz et al. (2006), constataram que o extrato metanólico da planta

Galphimia glauca, planta utilizada pela população do México, exibe ação

antidepressiva através do MNF, e o efeito é atribuído ao composto isolado

norsecotriterpeno, chamado de Galfinina-B.

28

3.2.4 Plantas medicinais com atividade anticonvulsi vante:

As convulsões são caracterizadas por espasmos musculares, podendo ou

não apresentar perda da consciência. Ao que tudo indica, os ataques juntamente

com a sintomatologia apresentada, estão relacionados com descargas de alta

freqüência de um grupo de neurônios, começando localmente e espalhando-se por

outras partes do cérebro. As convulsões podem ser consideradas como um dos

sintomas da epilepsia (KALUEFF, 2007).

As convulsões podem ser causadas por uma variedade de condições

patológicas, tais como doenças infecciosas com processos febris, traumatismo

craniano, doenças metabólicas, neoplasias, traumatismos, entre outros. Em outras

ocasiões as convulsões podem ser causadas por determinados medicamentos,

intoxicação pelo álcool e drogas ilícitas (KITANO et al., 2005).

A epilepsia é uma desordem neurológica comum, afetando mais de 50

milhões de pessoas em todo o mundo (SU et al., 2004). A maioria das epilepsias é

idiopática, com uma incidência mais alta entre as crianças, jovens e idosos. A

definição atual de estados de epilepsia envolve uma desordem crônica no cérebro e

é caracterizada por uma espontânea e periódica atividade de ataque apoplético

imprevisível ativada por uma descarga anormal de determinados neurônios

(MORTARI et al., 2007). Sabe-se que a modulação de canais de íon (voltagem

dependente), Na+, K+ e Ca++ e receptores do tipo GABA, N-metil-D-aspartato

(NMDA) e acetilcolina (ACh) estão envolvidos em episódios convulsivos e a

concentração de glutamato e aspartato é aumentada durante a iniciação e expansão

da crise (SU et al., 2004; MORTARI et al., 2007; KALUEFF, 2007).

Os fármacos que estão disponíveis no mercado farmacêutico para o

tratamento da epilepsia, como a carbamazepina, os benzodiazepínicos, o valproato

de sódio, a fenitoína, o fenobarbital e outros, muitas vezes não conseguem controlar

de forma eficiente as crises. Além disso, muitos destes fármacos podem provocar

neurotoxicidade, limitando seu uso na terapêutica. Novos medicamentos têm sido

lançados no mercado com a finalidade de diminuir os efeitos colaterais e/ou

adversos e exibir eficácia terapêutica maior e mais segura, como por exemplo

oxacarbamazepina, vigabatrina e lamotrigina. Porém, os problemas de efeitos

adversos não têm sido contornados completamente (KASTURE; CHOPDE;

DESHMUKH, 2002).

29

A procura por medicamentos anticonvulsivantes e/ou antiepiléticos oriundos

de plantas medicinais representa uma vasta alternativa ainda a ser explorada. Em

modelos animais de convulsão e epilepsia, várias plantas têm apresentado

resultados promissores. Dentre elas destacamos: Lippia alba (ZÉTOLA et al., 2002),

Hypericum perforatum (HOSSEINZADEH; KARIMI; RAKHSHANIZADEH, 2005),

Eugenia caryophyllata (POURGHOLAMI et al., 1999), Albizzia lebbeck e Hibiscus

rosa sinensis (KASTURE; CHOPDE; DESHMUKH, 2002). Tais plantas foram

testadas em modelos animais apresentando atividade anticonvulsivante.

Gaspi et al. (2006), comprovaram através do modelo de convulsão induzida

por pentilenotetrazol (PTZ) efeito anticonvulssivo da planta Qualea grandiflora

(Vochisiaceae), árvore símbolo do cerrado brasileiro, popularmente conhecida como

Pau-terra da folha larga. A Bacopa monniera, encontrada na Índia, pertencente à

família Escrofulariacea, contém o ácido betúlico, D-manitol, alcalóides e β-sitosterol.

Tais substâncias também encontradas em espécies brasileiras, possivelmente são

os agentes responsáveis pelo aumento da atividade cognitiva, nootrópica e atividade

anticonvulsivante, tornando-se uma importante opção para pessoas que sofrem de

epilepsia com perda cognitiva (VOHORA; PAL; PILLAI, 2000).

Sutherlandia frutescens (Fabaceae) é extensivamente usada pela

comunidade rural da região sul da África para tratar convulsões de infância e

epilepsia. Sugere-se que a ação da planta seja devido ao aumento da

neurotransmissão GABAérgica (OJEWOLE, 2008).

3.2.5 Efeito de plantas medicinais sobre o aprendiz ado e a memória:

A perda da capacidade intelectual é normalmente relacionada com a idade.

Trata-se de um processo natural. Contudo, quando o indivíduo apresenta uma perda

da capacidade intelectual sem causa aparente, derrame ou trauma cerebral, pode

ser caracterizado um quadro de demência, como a doença de Alzheimer (DA),

descrita em 1906, pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer (WOSTYN;

AUDENAERT; DENYN, 2008).

Um número crescente de pessoas é acometido pela DA em todo o mundo. A

doença se manifesta em 30 milhões de pessoas em todo o mundo, 5% são

acometidas, com idade entre 65-69 anos, 21% entre 85-86 anos e 39% acima dos

30

90 anos. Relatos em pacientes com idade inferior a 65 anos são raros (VIEGAS

JUNIOR et al., 2004; BOJARSKI; HERMS; KUZNICKI, 2008).

A DA é uma desordem neurodegenerativa crônica. Atualmente, sabe-se que a

neuropatologia da doença é caracterizada pela deterioração do tecido cerebral

fundamentalmente pela redução no número de neurônios (morte de células

neuronais), o que dificulta a função dos neurônios ainda existentes, como resultado,

há uma diminuição da síntese dos neurotransmissores e condução do impulso

nervoso, o paciente é acometido por inaptidão cognitiva séria (BOJARSKI; HERMS;

KUZNICKI, 2008).

O agravamento da DA está correlacionado a fosforilação anormal da

proteína Tau. Existem indícios que a deposição de β-amilóide pode ser o evento

inicial da fosforilação anormal da Tau, com isso, a Tau é menos capaz de polimerizar

tubulina, como conseqüência, há uma ruptura do citoesqueleto da célula que pode

levar a morte de células neuronais (WOSTYN; AUDENAERT; DENYN, 2008;

BOJARSKI; HERMS; KUZNICKI, 2008; FORD et al., 2008; MOREIRA et al., 2008).

Particularmente, na DA, os níveis de ACh são diminuídos nas áreas do

cérebro relacionadas com o aprendizado e a memória, como por exemplo, o

hipocampo. Essa perda resulta em um defeito no sistema colinérgico, e uma

estratégia farmacológica é aumentar os níveis de ACh, por inibição da enzima

acetilcolinesterase. Fármacos que atuam nesta enzima, inibindo-a, como por

exemplo, a tacrina, a rivastigmina e a galantanina, são utilizados no tratamento da

doença. Entretanto, os resultados do tratamento são paliativos e o processo de

degeneração do SNC não é impedido por eles (TREVISAN; MACEDO, 2003;

ADSERSEN et al., 2006; CHANG; GOLD, 2008).

Pesquisas com uso de plantas medicinais com a função de melhorar a

memória dos pacientes com a DA e produzir menos efeitos colaterais, podendo ser

utilizados por maior período de tempo, são alvos de pesquisas atuais. Plantas como

Bacopa monniera (Brahmi), Ginkgo biloba (Ginkgoaceae); Acorus calamus, Acorus

gramineus (Acoraceae), Bupleurum facaltum (Apiaceae), Epimedium koreanum

(Berberidaceae), Ziziphus jujuba (Ramnaceae) (OH et al., 2004) e Panax ginseng

exibem eficientes ações anticolinesterásica (TREVISAN; MACEDO, 2003; THAKUR;

MENGI, 2005; MUKHERJEE et al., 2007).

Kraus et al. (2007), observaram a diminuição dos sintomas

neurodegenerativos da DA, utilizando em modelos in vitro, dois compostos isolados

31

do extrato da planta Hypericum perforatum a catequina e a epicatequina, dois tipos

de flavonóides. Estes, melhoraram a viabilidade microglial, atenuando os efeitos

prejudiciais da β-amilóide.

A Bacopa monniera pertencente à família Escrofulariacea (planta popular da

Índia), é utilizada há mais de 3.000 anos para melhorar a memória. Sua ação

provém de saponinas e do D-manitol (RUSSO; BORRELLI, 2005). A Eclipta alba

(Asteraceae), constitui outro exemplo de planta com atividade nootrópica. Sua

atividade deve-se possivelmente a presença de saponinas, taninos e combinações

fenólicas (THAKUR; MENGI, 2005). A Butea frondosa (Leguminosae), também

originária da Índia, além de promover a melhoria da memória, possui atividade

hepatoprotetora e antioxidante (SOMAN; MENGI; KASTURE, 2004).

3.3 Da planta em estudo Hedyosmum brasiliense Miq.:

A planta em estudo no presente trabalho é denominada de Hedyosmum

brasiliense Miq. (Figura 1) e pertence à família Chlorantaceae. A família

Chloranthaceae é constituída por 75 espécies distribuídas em quatro gêneros:

Hedyosmum, Ascarina, Chloranthus e Sarcandra. Entre os gêneros existentes, o

Hedyosmum é o maior deles, único com ocorrência nas Américas, compreendendo

46 espécies essencialmente tropicais e subtropicais americanas (OCCHIONI, 1954).

32

Figura 1: Hedyosmum brasiliense Miq. Fonte: http://www.ib.unicamp.br/plant-aq-P/img/plantas/Hedyosmum_brasiliense.html, acesso em 13/05/2008.

A planta é popularmente conhecida como Cidrão nos estados de Santa

Catarina e Paraná. Morfologicamente falando, a Hedyosmum brasiliense Miq. mede

de 4 a 7 metros de altura, apresenta frutos tipo drupa, não podendo as sementes

serem liberadas do endocarpo. Suas folhas são opostas simples, pinadas e com

margens serreadas, pecioladas, com estípulas livres no ápice e soldadas na base

entre si com o pecíolo, formando uma bainha amplexicaule. Suas folhas são

utilizadas na terapêutica popular para tratar enxaquecas, doenças do ovário, frieiras

e afecções estomacais. Como relatado anteriormente o Cidrão é também utilizado

como calmante, sendo bastante usado pela população (REITZ, 1965; TRENTIN et

al.,1999).

A espécie é encontrada no Distrito Federal, Rio de Janeiro, Minas Gerais,

Mato Grosso, São Paulo, Paraná e Santa Catarina, podendo chegar até a Bolívia.

Na região dos estados de Santa Catarina e Paraná, a planta é encontrada em

33

abundância na Mata Atlântica (OCCHIONI, 1954). Possui um bom desenvolvimento

em ambientes com pouca ou grande disponibilidade de água. Suas folhas produzem

óleo essencial com características organolépticas com aroma herbal, lembrando a

cidreira (BERKENBROCK; PAULILO, 1999; TRENTIN et al.,1999).

Trentin et al. (1999), isolaram a partir do extrato hidroalcoólico da planta

Hedyosmum brasiliense Miq., uma lactona sesquiterpênica, a 13-hidroxi-8,9-

dihydroshizukanoide (I). Bercion et al. (2005), isolaram de outra espécie de

Hedyosmum, a Hedyosmum arborescens, a mesma lactona sesquiterpênica (I).

Kubo et al. (1992) isolaram da planta Podocarpus andina o composto denominado

podoandina (II). Ambos os compostos foram novamente isolados da planta

Hedyosmum brasiliense Miq. no laboratório de fitoquímica da UNIVALI e testados

farmacologicamente.

(I) 13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide

(II) Podoandina

Acredita-se que os efeitos farmacológicos da Hedyosmum brasiliense Miq.,

deve-se a presença de metabólitos secundários, tais como flavonóides, terpenos,

sesquiterpenos, esteróides, lignina e fenóis (TRENTIN et al.,1999).

O O

(II)

HH

OO

OH

HCH3

CH2(I)

34

Levando-se em consideração que na medicina popular, a planta é utilizada

para patologias do SNC, sendo recomendada como calmante. Ser amplamente

distribuída no estado de Santa Catarina, não tendo sido efetuados estudos

científicos para avaliar os possíveis efeitos centrais da mesma, no presente estudo

pretendeu-se não só estudar farmacologicamente os possíveis efeitos centrais da

planta, como também validar parcialmente, seu uso popular.

35

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Coleta e preparo dos extratos:

Hedyosmum brasiliense Miq. foi coletada no morro do Baú, em Luís Alves em

junho de 2006, no estado de Santa Catarina, em local previamente determinado e

identificado pela Drª. Ana Claudia Araújo, sendo comparada com as exsicatas

tombadas no Herbário Lyman Bradford Smith (UNIVALI, Itajaí - SC), sob número

2031.

O EEHb foi obtido das folhas frescas e limpas, trituradas em liquidificador com

etanol bidestilado e durante 15 dias na ausência de luz. Foram utilizados 18 litros de

etanol para 5 kg da planta.

Posteriormente, foi realizada a filtração deste material vegetal com auxílio de

um funil. O EEHb foi concentrado em rota vapor até total eliminação do etanol

(Figura 2). O extrato concentrado foi levado à secura com auxílio de secador de

cabelo. Considerando que 70% de 5 Kg das folhas frescas são água, ficamos com

cerca de 1,5 kg de material que pôde ser extraível. Deste, cerca de 70% é insolúvel

em etanol (parede celular), ficamos então com cerca de 0,5 kg de extrato, ou um

rendimento de 0,1%.

A separação dos compostos foi realizada em parceria com o mestrando Fabio

Lazzarotto de Oliveira*. Ao extrato bruto previamente preparado foi adicionado água

destilada para então ser submetido a uma partição líquido-líquido através de um funil

de separação, com solventes de polaridade crescente: hexano, diclorometano e

acetato de etila, com o propósito de obter uma semi-purificação dos compostos de

acordo com suas polaridades. As frações obtidas foram reduzidas à secura em

temperatura ambiente.

4.2 Separação dos compostos e análise cromatográfic a:

As frações obtidas da partição líquido-líquido hexano e diclorometano foram

submetidas à cromatografia em coluna (CC), sendo utilizada sílica Gel 60 (70-230

mesh) como fase estacionária. Como eluentes os solventes: hexano e acetato de

* OLIVEIRA, F. L. ANALISE FITOQUÍMICA de Hedyosmum brasiliense Miq., Chloranthaceae. Santa Catarina: Universidade do Vale do Itajaí, UNIVALI, Dissertação Não Concluída (Dissertação de Mestrado).

36

etila variando o tipo e a proporção de acordo com a fração utilizada (FALKENBERG

et al., 2001).

Os eluentes com o produto carreado foram recolhidos por gotejamento em

frascos numerados sequencialmente. Depois de analisado seu perfil cromatográfico,

através de cromatografia em camada delgada (CCD), foram reunidos os conteúdos

com características semelhantes formando as sub-frações. Neste procedimento

foram utilizadas placas de sílica Gel 60 F254 como fase estacionária e eluentes já

citados anteriormente, variando o tipo e a proporção conforme o comportamento da

fração analisada.

Para revelar as classes de compostos foram utilizados reveladores, entre eles

o Ultra-Violeta como revelador não destrutivo, identificando compostos que possuem

duplas conjugadas, e como revelador específico o anisaldeído sulfúrico para

terpenóides e esteróides que se apresentam em manchas de coloração rosa ou

roxo.

Os compostos isolados foram submetidos a análises espectrométricas de

Ressonância Magnética Nuclear (RNM) de 1H e 13C no Laboratório de RMN

(UNIVALI, Itajaí - SC) em equipamento Bruker modelo AC200F, 300 MHz.

37

Folhas Frescas (5 kg)

Hedyosmum brasiliense foi macerada e acondicionada em etanol bidestilado por 15 dias / Concentrado em rotavapor até remoção do etanol

DCM 44-48 Lactona sesquiterpenica

13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide

Partição líquido-líquido, extrato diluído em ⅓ H2O

DCM 17-21 Lactona sesquiterpenica

Podoandina

Fração Diclorometano (DCM)

(4 g)

Cromatografia em coluna (sílica gel 60 230-400 mesh), hexano:acetato de etila – em polaridade

crescente

Fração Aquosa (3,05 g)

Fração Acetato de etila (AE)

(6,2738 g)

Concentrado o EEHb à secura de uma alíquota para testes farmacológicos

Fração Hexano (H)

(5,4750 g)

Figura 2: Etapas de purificação da fração diclorometano e hexano de Hedyosmum brasiliense Miq..

H 29 Lactona sesquiterpenica

Podoandina

38

4.2.1 Caracterização das substâncias isoladas:

Conforme visualizado na Figura 2, uma série de procedimentos

cromatográficos em sílica gel flash levou ao isolamento das 2 substâncias: DCM 17-

21, DCM 44-48, da fração diclorometano e H 29, da fração hexano. Através de CCD

e revelação com anisaldeído sulfúrico foi possível observar a presença de

compostos terponódes permitindo uma exata separação.

4.3 Ensaios farmacológicos:

4.3.1 Animais:

Para os experimentos foram utilizados camundongos Swiss machos (25 a

35g) e ratos Wistar machos (250 a 300g). Os animais foram obtidos do Biotério

Central da UNIVALI e, foram mantidos no biotério de farmacologia experimental,

com ciclo claro/escuro de 12 horas e aclimatados a temperatura de 22 ± 2 °C. Os

animais foram divididos em grupos de 8 a 10 animais e tratados com água e ração

ad libitum, exceto durante os experimentos. Para o processo de adaptação, os

animais permaneceram no ambiente de teste 1h antes da realização dos

experimentos. Os protocolos experimentais foram apresentados ao Comitê de Ética

em Pesquisa da UNIVALI, os quais, foram aprovados e receberam o parecer número

436/06 (Anexo).

4.3.2 Reagentes e vias utilizadas:

Durante os ensaios farmacológicos as seguintes drogas e solventes foram

utilizados: cloridrato de p-clorofenilalanina (PCPA) (Sigma, EUA), diazepam

(Cristália, Brasil); estricnina (Sigma, EUA), flumazenil (Cristália), haloperidol (Sigma,

EUA), imipramina (Sigma, EUA), ioimbina (Sigma, EUA), quetanserina (Sigma,

EUA), pentilenotetrazol (PTZ) (Sigma, EUA), pentobarbital (Sigma, EUA), prazosin

39

(Sigma, EUA), 1-(2-metoxifenil)-4-[2-ftalimido)butil]piperazina (NAN-190) (Tocris,

EUA), pimozide (Tocris, EUA), reserpina (Sigma, EUA). Os compostos foram

dissolvidos em solução salina a 0,9 % com exceção de NAN-190, que foi diluída em

salina e 2 % de DMSO. Os animais controles receberam os veículos apropriados. Na

maioria dos ensaios farmacológicos a via de administração utilizada foi a via

intraperitoneal (i.p.).

4.3.3 Ensaios farmacológicos:

4.3.3.1 Avaliação do efeito do EEHb sobre a deambul ação dos animais através

do teste campo aberto (TCA):

O aparato utilizado para os experimentos com camundongos foi

confeccionado em madeira (30 x 30 x 15 cm) com a frente de vidro para melhor

visualizar os animais. O interior do aparato era subdividido em 9 quadrantes. As

dimenssões podem variar conforme o tamanho do animal estudado. Neste modelo,

dois grupos foram testados como controle: positivo (haloperidol 2,5 mg/kg), e

negativo (veículo). O EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) bem como os controles foram

administrados pela via i.p. 30 minutos antes do experimento (Figura 3). Os animais

foram colocados individualmente no campo aberto e foram observados os seguintes

parâmetros: número de cruzamentos dos quadrantes (crossing) e o número de

tentativas de levantar o corpo sobre as patas traseiras (rearing). O tempo de

observação dos parâmetros comportamentais foi de 6 minutos (RODRIGUES et al.,

2002; QUINTANS-JÚNIOR; ALMEIDA; ANTONIOLLI, 2005; OLIVEIRA et al., 2006).

40

Figura 3: Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a deambulação dos animais através do TCA.

4.3.3.2 Avaliação do efeito do EEHb sobre a ansieda de dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado (LCE):

Os modelos de ansiedade utilizando o LCE foram feitos conforme descrito por

Pellow et al. (1985), com pequenas modificações. O aparato utilizado é constituído

de madeira, em forma de cruz grega, com dois braços abertos (30 x 5 x 2,5 cm), e

dois fechados (30 x 5 x 15 cm), os braços são conectados por uma área central

aberta (5 x 5 cm). O aparato foi elevado a uma altura de 50 cm sobre o chão

(EMAMGHOREISHI; KHASAKI; AAZAM, 2005).

Dois grupos foram testados como controle: positivo (diazepam 0,75 mg/kg,

i.p.) e o controle negativo (veículo, i.p.). O EEHb, foi administrado pela via i.p., em

três concentrações diferentes 10, 50 e 100 mg/Kg. Decorridos 30 minutos após a

aplicação dos compostos, os animais foram colocados individualmente no centro do

aparato com a cabeça voltada ao braço fechado e observados durante 5 minutos

Campo Aberto

6´

30´

Grupos de animais (tratamento)

EEHb

(10, 50 e 100 mg/Kg), i.p. Controle Positivo

(Haloperidol 2,5 mg/Kg), i.p.

Controle Negativo (Veículo), i.p.

41

(Figura 4). Durante esse tempo, foi registrado a freqüência de entrada e o tempo de

permanência nos braços abertos (FEA e TPA, respectivamente), e nos fechados

(FEF e TPF, respectivamente). As entradas foram definidas quando o animal esteve

com todas as quatro patas no braço visitado. Para análise estatística, as

percentagens das freqüências de entradas nos braços abertos (%FEA) e tempo

permanência nesses braços (%TPA) foram calculados de acordo com as fórmulas:

%FEA = FEA / FEA + FEF X 100 e %TPA = TPA / TPA + TPF X 100, para a análise

estatística nos braços fechados foram seguidas da mesma maneira (DE SOUZA et

al., 2003).

Figura 4: Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a ansiedade através do LCE.


5´

30´

EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg), i.p.

Controle Positivo (Diazepam

0,75 mg/Kg), i.p.


Labirinto em Cruz Elevado

42

4.3.3.3 Determinação do mecanismo de ação da propri edade ansiolítica do

EEHb:

a) Avaliação do efeito da reserpina sobre o efeito ansiolítico do EEHb:

Para a avaliação do possível envolvimento do sistema monoaminérgico no

mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do EEHb, os animais foram pré-

tratados com reserpina (2 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos, os animais receberam o

EEHb na concentração de 100 mg/kg, i.p. e/ou veículo e analisados no modelo LCE

60 minutos após o início do experimento (Figura 5) (ARAGÃO et al., 2006).

Figura 5: Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade ansiolítica do EEHb (Sistema Monoaminérgico).

b) Avaliação do efeito do sistema GABAérgico sobre o efeito ansiolítico do

EEHb:

Para a avaliação do possível envolvimento do receptor GABAA no mecanismo

de ação da propriedade ansiolítica do EEHb, os animais foram pré-tratados com

flumazenil (2 mg/Kg, i.v., antagonista GABAA específico). Após 5 minutos, os animais

receberam o EEHb na concentração de 100 mg/kg, i.p., diazepam e/ou veículo e


5´

EEHb (100 mg/Kg), i.p.

30´

30´

Reserpina (2 mg/Kg), i.p.

EEHb (100/Veículo), i.p.

30´

43

analisados no modelo LCE 30 minutos após o início do experimento (Figura 6)

(ARAGÃO et al., 2006).

Figura 6: Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade ansiolítica do EEHb (Sistema GABAérgico).

4.3.3.4 Avaliação do efeito do EEHb sobre o sono in duzido por barbitúrico

(MSB):

Para investigação de um possível efeito hipnótico do extrato da planta em

estudo, foi utilizado o MSB conforme descrito por Devi et al. (2003) com pequenas

modificações. Como controle positivo foi utilizado o diazepam (1 mg/Kg, i.p.) e como

negativo, o veículo (i.p.). Os animais receberam os tratamentos com o EEHb nas

concentrações de 10, 50 e 100 mg/Kg (i.p.), bem como os controles. Após 30

minutos, foi administrado pentobarbital (50 mg/Kg, i.p.). Imediatamente os animais

foram colocados individualmente sob funis de vidro (Figura 7). A latência para o sono

e o tempo total de sono foram cronometrados representado respectivamente pela

perda e recuperação do reflexo postural (DEVI et al., 2003; QUINTANS-JÚNIOR;

ALMEIDA; ANTONIOLLI, 2005).


5´

30´

Animais tratados flumazenil 2 mg/Kg, i.v.

DPZ (0,75 mg/Kg), i.p.

5´

5´

Controle negativo (Veículo), i.p.


44

Figura 7: Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre o MSB.

4.3.3.5 Avaliação do efeito do EEHb sobre a depress ão através do modelo da

natação forçada (MNF):

Os experimentos realizados para a investigação do efeito antidepressivo

utilizando o MNF também foram realizados conforme descrito por Rodrigues et al.

(2002). Dois grupos foram testados como controle: o positivo (Imipramina 50 mg/kg),

e o negativo (veículo). O EEHb bem como os controles (negativo e positivo) foram

administrados intraperitonealmente, 30 minutos antes dos testes. Após esse tempo,

os animais foram colocados individualmente num tanque de vidro (25 cm de altura e

10 cm de diâmetro), cheio com água a uma temperatura de 24 a 25°C. Durante 6

minutos os animais não puderam sair (Figura 8). O tempo de imobilidade dos

animais foi usado como parâmetro, comportamento este, que indica o estado de

desesperança do animal após perceber que a fuga do recipiente não será possível

30´

180´


Controle positivo (Diazepam, 1 mg/Kg),i.p.

Pentobarbital (50 mg/Kg), i.p .


EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg), i.p.

Indução do Sono por Barbitúrico

45

(PORSOLT; BERTIN; JALFRE, 1977; YAN et al., 2004; SÁNCHEZ-MATEO et al.,

2005).

Um outro experimento foi conduzido, sendo que o extrato foi administrado de

forma sub-crônica por um período de 15 dias. Decorridas 24 horas após o último dia

de tratamento, os animais foram submetidos ao MNF.

Figura 8: Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a depressão através do MNF.

4.3.3.6 Avaliação do efeito do EEHb sobre a depress ão através do modelo de

suspensão pela cauda (MSC):

Os experimentos para investigação do efeito antidepressivo utilizando o

MSC foram feitos conforme descrito por Rodrigues et al. (2002), com pequenas

modificações.

Dois grupos foram testados como controle, positivo (imipramina 50 mg/kg),

e/ou negativo (veículo). O modelo consiste em administrar o EEHb nas

concentrações de 10, 50 e 100 mg/Kg, bem como os controles (positivo e negativo)

por via i.p., 30 minutos antes dos testes. Após esse tempo, os animais foram

Modelo Nado Forçado

30´

Controle Positivo (Imipramina 50 mg/kg),

i.p.

6´

Grupos de animais (tratamento) Controle Negativo

(Veículo), i.p.

EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg), i.p

46

suspensos individualmente pela cauda a 80 cm do chão (Figura 9). Durante 5

minutos os animais não puderam fugir. Inicialmente os animais desenvolvem

movimentos desordenados numa tentativa de fuga, quando aprendem que a fuga

não é alcançada tendem a permanecerem imóveis e este parâmetro indica um

comportamento depressivo (RODRIGUES et al., 2002; SÁNCHEZ-MATEO et al.,

2005).

Em outro experimento foi verificado o efeito do EEHb administrado de forma

sub-crônica, durante 15 dias. Decorridas 24 horas após o último dia de tratamento,

os animais foram submetidos ao MSC.

Figura 9: Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a depressão através do

MSC.

5´

30´


EEHb

(10, 50 E 100 mg/Kg),i.p. Controle Positivo

(Imipramina 50 mg/kg), i.p.


Modelo de Suspensão pela Cauda

47

4.3.3.7 Determinação do mecanismo de ação da ativid ade antidepressiva do

EEHb:

O mecanismo de ação da propriedade antidepressiva do extrato da planta foi

avaliado investigando-se o sistema monoaminérgico (serotonina, noradrenalina e

dopamina) (Figuras 10 e 11).

a) Avaliação do efeito da reserpina sobre o efeito antidepressivo do EEHb:

Para a avaliação do envolvimento do sistema monoaminérgico no mecanismo

de ação da propriedade antidepressiva do extrato foi primeiramente verificado a

influência da reserpina sobre o efeito do EEHb. Os animais foram pré-tratados com

reserpina (2 mg/kg) agente que causa depleção de catecolaminas das vesículas

sinápticas) pela via intraperitoneal. Após 30 minutos, os animais receberam o EEHb

na concentração de 100 mg/kg, i.p. e/ou veículo e analisados no MNF 60 minutos

após o início do experimento (Figura 11) (ARAGÃO et al., 2006).

b) Avaliação do sistema serotonérgico:

Nos experimentos referentes ao sistema serotonérgico, os animais foram pré-

tratados durante 4 dias consecutivos com PCPA (100 mg/Kg, i.p., inibidor da enzima

triptofano-hidroxilase responsável pela síntese de 5-HT, bem como depletador dos

estoques de 5-HT no SNC). Decorridas 24 horas após a última injeção de PCPA

e/ou veículo os animais receberam o extrato da planta (100 mg/Kg, i.p.) e foram

submetidos ao MNF (Figura 10).

48

Figura 10: Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do EEHb, avaliação do sistema serotonérgico - PCPA.

Para avaliação do envolvimento de receptores serotonérgico, adrenérgico e

dopaminérgico o protocolo experimental utilizado foi o mesmo proposto na Figura 11,

modificando somente o antagonista específico conforme o sistema a ser estudado.

Para investigar o possível envolvimento de subtipos de receptores

serotonérgicos, no efeito antidepressivo do EEHb os animais foram pré-tratados com

NAN-190 (0,5 mg/kg, i.p., antagonista dos receptores 5-HT1A), quetanserina (5

mg/kg, i.p., antagonista seletivo dos receptores 5-HT2A), e veículo, 30 minutos antes

de receberem o EEHb (100 mg/kg, i.p.) e/ou veículo. Transcorridos 30 min. do

tratamento, os animais foram testados no MNF.

c) Avaliação do sistema noradrenérgico:

Para a avaliação do possível envolvimento do sistema noradrenérgico no

mecanismo de ação da propriedade antidepressiva do EEHb, os animais foram pré-

tratados com prazosin (1 mg/Kg, i.p., antagonista α1), ioimbina (1 mg/kg, i.p.,

4 dias consecutivos

4 dias consecutivos

24hs após última injeção


6´

PCPA (100 mg/kg), i.p.

EEHb (100/Veículo), i.p.

30´


49

antagonista α2), e controle veículo. 30 minutos antes de receberem o EEHb na

concentração de 100 mg/kg, i.p. e/ou veículo. Decorridos 30 min. do tratamento os

animais foram analisados no MNF.

d) Avaliação do sistema dopaminérgico:

Para a avaliação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico no

mecanismo de ação da propriedade antidepressiva, os animais foram pré-tratados

com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p., antagonista dopaminérgico não seletivo), pimozide

(0,2 mg/kg, i.p., antagonista D2), e veículo. Após 30 minutos, os animais receberam

o EEHb na concentração de 100 mg/kg, i.p. e/ou veículo e analisados no MNF 60

minutos após o início do experimento (RODRIGUES et al., 2002; NENCINI et al.,

2006).

Figura 11: Esquema representativo da determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do EEHb, avaliação do sistema monoaminérgico.


HHEb (100 mg/Kg), i.p.

30´

30´

Antagonistas e/ou reserpina (i.p.)

6´

30´

HHEb (100/Veículo), i.p.

30´

50

4.3.3.8 Avaliação do efeito antidepressivo de dois compostos obtidos do

EEHb:

Também as lactonas isoladas da planta, 13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide e

podoandina foram avaliadas (10 mg/Kg, i.p.) através do modelo de natação forçada

conforme protocolado anteriormente adotado.

4.3.3.9 Avaliação do efeito do EEHb sobre a convuls ão induzida por

pentilenotetrazol (MCP) e estricnina (MCE):

O efeito anticonvulsivante do EEHb foi avaliado através do antagonismo das

convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) e estricnina conforme descrito

respectivamente por Kasture; Kasture; Chopde (2002) e Nguelefack et al. (2006). Os

animais receberam os tratamentos com o EEHb nas concentrações de 10, 50 e 100

mg/Kg (i.p.), bem como os controles: positivo (fenobarbital 0,5 mg/Kg, i.p.) e negativo

(veículo, i.p.). Transcorridos 30 minutos após os tratamentos, os animais receberam

PTZ (100 mg/Kg, i.p.). Imediatamente após a aplicação do PTZ, os animais foram

colocados sob funis de vidro (Figura 12) e observados num período de 60 minutos

subseqüentes, para verificação do tempo de latência para primeira crise convulsiva

(KASTURE; KASTURE; CHOPDE, 2002; NGUELEFACK et al., 2006).

Para indução da convulsão com estricnina (4 mg/kg, i.p.), foi seguida a

mesma metodologia do teste com PTZ (NGUELEFACK et al., 2006).

51

Figura 12: Esquema representativo da investigação do efeito do EEHb sobre a convulsão induzida por PTZ e estricnina.

4.3.3.10 Avaliação do efeito do EEHb sobre a memóri a através do modelo da

esquiva inibitória (MEI):

Para a avaliação dos efeitos do EEHb sobre a memória de longa duração dos

animais foi utilizado o modelo da esquiva inibitória conforme procedimento descrito

por De Souza (2003).

O aparato consiste de uma caixa automatizada (ALBARSCH), medindo 50 cm

de comprimento, 25 cm de largura e 25 cm de altura, com a fase frontal de vidro

(Figura 13). Parte do assoalho a esquerda da caixa consiste de uma plataforma de

madeira com 5 cm de altura. O restante do assoalho é constituído de uma grade de

barras de bronze, com 1 cm de diâmetro espaçadas 1 cm uma das outras, através

das quais é possível aplicar uma diferença de potencial regulável de 0 a 1 mÅ.

Durante a sessão de treino o animal é colocado sobre a plataforma e aciona-se o

cronômetro. Cronometra-se a latência de descida completa do animal da plataforma.

Convulsão induzida por PTZ e Estricnina

60´

30´



EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg),i.p.

(Fenobarbital, 0,5 mg/Kg), i.p.

PTZ (100 mg/Kg), i.p. ou Estricnina (4 mg/Kg), i.p.

52

Imediatamente aciona-se o dispositivo para os choques (0,4 mÅ). Por 2 segundos de

cada vez até que o animal retorne para a plataforma. Na sessão de teste repete-se o

procedimento, mas com omissão dos choques. Foi estudado o efeito do EEHb sobre

aquisição, consolidação e evocação da memória. Para tanto, os tratamentos foram

realizados: 15 minutos antes do treino, imediatamente após o treino e 15 minutos

antes do teste respectivamente. 24 horas após o treino os animais foram testados.

Na sessão de teste seguiu-se o mesmo procedimento do treino, mas, com omissão

do choque. A diferença da latência de descida entre treino e o teste foi considerado

índice de memória (IZQUIERDO, 2002).

Figura 13: Esquiva inibitória. Fonte: Lab. de farmacologia da Universidade do Vale de Itajaí (UNIVALI) (2004).

4.4 Análise estatística:

Para os experimentos nos modelos labirinto em cruz elevado, convulsão

induzida por pentilenotetrazol e estricnina, campo aberto, nado forçado, suspensão

pela cauda e indução do sono com barbitúrico, os dados obtidos foram apresentados

com médias seguidas pelos respectivos erro padrão médio (E.P.M.), os dados foram

submetidos à análises de variância (ANOVA), quando necessários, os resultados

foram seguidos de teste de múltipla comparação a partir dos modelos pos hoc de

Dunnett ou Tukey, utilizando o software GraphPad INSTAT®. Para os modelos não

paramétricos como o modelo da esquiva inibitória, foi utilizado o teste pos hoc de

Mann-Whitney. Os resultados são apresentados como medianas seguidas dos

intervalos interquadil (25 – 75). São considerados estatisticamente significantes os

53

valores de p < 0,05 (KITANO et al., 2005; HERRERA-RUIZ et al., 2006;

VASCONCELOS et al., 2007).

54

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Efeito do EEHb sobre a deambulação dos animais através do TCA:

A Figura 14 mostra o efeito do tratamento dos animais com o EEHb (10, 50 e

100 mg/Kg), administrados pela via i.p. em animais testados no teste campo aberto.

Observa-se que o tratamento com o EEHb não produziu modificação do número de

cruzamentos (crossing), quando comparados com o grupo controle negativo

(veículo) (Figura 14 A). Entretanto, com relação ao número de rearings, o tratamento

promoveu um efeito significativo reduzindo esse parâmetro com as doses de 50

mg/Kg (F (10,792) = 2,823, p < 0,05) e 100 mg/Kg (F(10,792) = 3,406, p < 0,01) (Figura

14 B).

No mesmo experimento observa-se que o tratamento dos animais com

haloperidol promoveu significativa redução de ambos os parâmetros (número de

cruzamentos e número de rearings) observados. Tal efeito já era esperado uma vez

que o fármaco promove redução da resposta exploratória além de comprometer o

sistema motor quando utilizado clinicamente.

55

Figura 14: Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de haloperidol (2,5 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de rearings (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (* p<0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001).

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56

O TCA é um modelo utilizado para analisar comportamentos baseados em

situações de conflito natural. Normalmente, o conflito provocado no animal é a

exploração e a aversão a ambientes abertos e claros. O número total de

cruzamentos (crossings) durante o teste, é considerado um índice de atividade

locomotora enquanto que o número de levantadas (rearing) é considerado índice de

atividade exploratória (LOTUFO et al., 2004). Desta forma o modelo pode discriminar

(dependendo do protocolo e do parâmetro observado) se a substância-teste exibe

efeito ansiolítico ou efeito depressor inespecífico atuando em regiões cerebrais

envolvidas também com o sistema motor do animal (SILVA et al., 2006). Os

resultados apresentados demonstraram que o EEHb não produziu efeito sobre o

sistema motor dos animais, uma vez que o número de cruzamentos não foi alterado

quando comparado com o grupo controle. Entretanto, a atividade exploratória foi

significativamente reduzida com o aumento da dose, o que indica que o extrato pode

causar um efeito depressor inespecífico sobre o SNC.

O fato de não produzir alteração significativa no número de cruzamentos é de

fundamental importância, uma vez que, em outros modelos animais como o labirinto

em cruz elevado, o modelo nado forçado e esquiva inibitória, poderíamos obter

resultados “falso-positivos” se a função motora dos animais fosse comprometida com

o tratamento.

Os resultados também demonstraram que o tratamento com o haloperidol

produziu diminuição dos dois parâmetros observados no teste campo aberto

(crossing e rearings). Tal resultado é de fato esperado uma vez que o fármaco

realmente causa disfunção motora. O haloperidol é um medicamento neuroléptico da

classe das butirofenonas utilizados no tratamento da esquizofrenia. O medicamento

age como antagonista inespecífico dos receptores dopaminérgicos causando efeito

neuroléptico ao atuar nos receptores D2 (DHIR; KULKARNI, 2007). Um dos efeitos

colaterias observados em tratamentos longos é a chamada discinesia tardia, um

comprometimento do sistema motor que afeta os movimentos do usuário (DHIR;

KULKARNI, 2007). Agudamente, o haloperidol também atua no sistema motor e é

utilizado como controle positivo em modelos de deambulação e de esquizofrenia

(LOTUFO et al., 2004).

57

5.2 Efeito do EEHb sobre a ansiedade dos animais at ravés do modelo

LCE:

Os resultados representados neste modelo (Figura 15 A) demonstram que o

EEHb, na concentração de 100 mg/Kg, promoveu um aumento significativo (F (14,655)

= 2,538, p < 0,05) na freqüência de entradas nos braços abertos, quando

comparados ao grupo controle veículo.

Também foi observado neste modelo, que o tempo de permanência nos

braços abertos (Figura 15 B), é alterado pelo tratamento com EEHb na concentração

de 100 mg/Kg. De fato, o EEHb promove um aumento significativo no tempo de

permanência nos braços abertos (F (7,230) = 3,350, p < 0,01).

Na Figura 15 C, os experimentos demonstraram que o EEHb nas

concentrações de 10 e 50 mg/Kg, promoveram um aumento significativo na

freqüência de entradas nos braços fechados (F (23,682) = 6,177, p < 0,01; F (23,682) =

5,441, p < 0,01).

Com relação ao tempo de permanência nos braços fechados (Figura 15 D), o

EEHb na concentração de 100 mg/Kg, promoveu uma diminuição significativa desse

parâmetro comportamental (F (23,144) = 2,833, p < 0,05).

Também foi observado nesse experimento o clássico efeito ansiolítico do

diazepam. O fármaco produziu respectivamente aumento da freqüência e do tempo

de permanência nos braços abertos do aparato (Figura 15 A e B) (F (14,655) = 4,079, p

< 0,01; F (7,230) = 4,026, p < 0,01).

58

Figura 15: Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de diazepam (0,75 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05 e ** p < 0,01).

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59

5.3 Determinação do mecanismo de ação da propriedad e ansiolítica do

EEHb:

Uma vez que o EEHb no modelo LCE, apresentou efeito ansiolítico, procurou-

se investigar o possível mecanismo de ação envolvido na ação ansiolítica. Para

tanto, conforme adotado em protocolo anterior para determinação de mecanismo de

ação, a dose de 100 mg/Kg foi utilizada por ser esta a que apresentou melhores

resultados no modelo LCE.

O EEHb (Figura 16 A) promoveu um aumento na freqüência de entrada dos

animais nos braços abertos (F (27,032) = 10,053, p < 0,001) e um aumento no tempo

de permanência dos animais nesses mesmos braços (F (10,004) = 5,813, p < 0,05)

(Figura 16 B), quando comparado ao grupo controle (veículo). O pré-tratamento com

flumazenil, um antagonista específico dos receptores GABAA, promoveu a reversão

do efeito ansiolítico do EEHb, diminuindo de forma significativa não só a freqüência

de entradas dos animais nos braços abertos (F (27,032) = 8,861, p < 0,001) bem como

o tempo de permanência dos animais nesses braços (F (10,004) = 5,939, p < 0,05)

quando compara-se com o efeito do extrato na ausência do flumazenil.

Também observa-se que o diazepam na concentração de 0,75 mg/kg, i.p.,

promoveu um aumento na freqüência de entrada dos animais nos braços abertos (F

(27,032) = 12,933, p < 0,001) e aumento no tempo de permanência dos animais nos

braços abertos (F (10,004) = 5,333, p < 0,05) quando comparado ao grupo controle

(veículo). Da mesma forma que ocorreu com o extrato, o pré-tratamento com

flumazenil promoveu a reversão do efeito ansiolítico do diazepam, que diz respeito

ao tempo de permanência dos animais nos braços abertos (F (10,004) = 4,826, p <

0,05) e na freqüência de entrada nesses braços (F (27,032) = 6,630, p < 0,001).

Os outros parâmetros observados durante o experimento (freqüência de

entrada e tempo de permanência nos braços fechados) foram reduzidos com o

tratamento do extrato (F (21,852) = 8,596, p. < 0.001), (F (9,000) = 5,805, p < 0,01) e do

diazepam (F (21,852) = 10,431, p < 0,001), (F (9,000) = 5,836, p < 0,05), bem como esse

efeito revertido pelo pré-tratamento de flumazenil antes da administração de ambas

as substâncias respectivamente (F (21,852) = 9,330, p < 0,001; F (9,000) = 4,857, p <

0,01) (F (21,852) = 6,626, p < 0,001; F (9,000) = 4,567, p < 0,05).

60

Dando continuidade a investigação do mecanismo de ação da propriedade

ansiolítica do extrato, na figura 17 (A, B, C, e D) estão representados os resultados

obtidos sobre a influência do sistema monoaminérgico. Para tanto, no modelo LCE

os animais tratados com o extrato da planta receberam previamente um tratamento

com reserpina. O pré-tratamento com reserpina promoveu significativamente a

redução da freqüência de entradas nos braços abertos do aparato (F (15,403) = 9,304,

p < 0,001), bem como, promoveu a redução de permanência dos animais nesses

braços (F (15,763) = 8,793, p < 0,001) parâmetros esses, aumentados no grupo de

animais tratados somente com o extrato da planta, indicando seu efeito ansiolítico.

61

Figura 16: Efeito do pré-tratamento dos animais com flumazenil (FLU) (2 mg/kg, i.v.) administração aguda do EEHb (100 mg/Kg) e de diazepam (DPZ) (0,75 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001). # p < 0,05, ## p < 0,01 e ### p < 0,001 denotam significância estatística quando comparado com extrato e DPZ na ausência dos antagonistas.

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62

Figura 17: Efeito do pré-tratamento dos animais com reserpina (2 mg/kg) administração aguda do EEHb (100 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05 e *** p < 0,001). ### p < 0,001 denotam significância estatística quando comparado com extrato na ausência da reserina.

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63

O modelo LCE é um dos modelos animais de ansiedade mais populares

atualmente em uso. Sua utilização não requer altos custos, o teste é realizado de

forma rápida e o pesquisador não necessita de treinamento prolongado para

executá-lo (EMAMGHOREISHI; KHASAKI, AAZAM, 2005; CAROBREZ;

BERTOGLIO, 2005).

O modelo representa uma tarefa aversiva aos roedores. Quando os animais

permanecem nos braços abertos, manifestam comportamentos de medo

espontâneo, tais como: congelamento, defecação e micção. Nestas mesmas

superfícies altas e estreitas apresentam posturas de estiramento e imersão da

cabeça abaixo do piso na lateral da superfície (head-diping). Para evitar essa

situação ansiogênica, os animais permanecem maior tempo nos braços fechados

(BELZUNG; GRIEBEL, 2001; CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005). O comportamento

animal natural é caracterizado por evitar a entrada nos braços abertos do aparato.

Essa tendência é diminuída quando administra-se fármacos ansiolíticos, como por

exemplo o diazepam, com o tratamento há tendências em aumentar a freqüência e o

tempo de permanência dos animais nos braços abertos, enquanto que substâncias

ansiogênicas, como a ioimbina, tende a um aumento da freqüência de entrada e o

tempo de permanência dos animais nos braços fechados (PELLOW et al., 1985;

ARAGÃO et al., 2006).

Justifica-se o uso do diazepam como controle positivo, por aumentar a

percentagem de entradas e tempo de permanência dos animais nos braços abertos,

diminuindo esses parâmetros comportamentais nos braços fechados (BELZUNG;

GRIEBEL, 2001; EMAMGHOREISHI; KHASAKI, AAZAM, 2005).

O efeito do EEHb no modelo LCE na concentração de 100 mg/Kg foi

semelhante ao resultado obtido pelo tratamento com o diazepam na concentração

de 0,75 mg/Kg. Esse resultado foi observado quando os animais aumentaram a

freqüência de entrada nos braços abertos permanecendo maior tempo nesses

braços, bem como, diminuíram a freqüência de entrada e o tempo de permanência

nos braços fechados. Tais resultados demonstram que o extrato da planta em

estudo apresenta pelo menos em parte efeito ansiolítico.

Da análise fitoquímica do extrato utilizado, obteve-se duas lactonas

sesquiterpênicas. Uma delas já foi descrita anteriormente nessa mesma planta por

Trentin et al. (1999) sendo denominada de 13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide (I). A

64

seguda lactona denominada de podoandina (II) foi descrita pela primeira vez como

presente em Podocarpus andina por Kubo et al. (1992).

Não foram encontradas na literatura nenhuma referência a possíveis efeitos

ansiolíticos dos compostos isolados da Hedyosmum brasiliense Miq.. Neste sentido,

estudos futuros podem ser realizados a fim de predizer se a atividade ansiolítica se

deve ou não aos compostos isolados da Hedyosmum brasiliense Miq., visto que o

EEHb apresentou atividade ansiolítica.

Tal qual ocorre com a depressão, o sistema monoaminérgico também está

envolvido na patogênese da ansiedade. Esse fato deriva não só dos achados

experimentais realizados com animais de laboratório (ARAGÃO et al., 2006; SOUZA

et al., 2008) como também da terapêutica farmacológica, onde medicamentos que

interferem com os sistemas adrenérgico, dopaminérgico e serotonérgico são

eficazes no tratamento dos distúrbios de ansiedade (NASH; NUTT, 2007). Além

disso, circuitos cerebrais como o sistema límbico (considerado o centro emocional

do SNC) compreende regiões como a amígdala, o núcleo talâmico anterior, o giro

cingulado, o fornix, o hipocampo, corpus mamilaris, entre outros, as quais são ricas

em receptores monoaminérgicos (KIM; GORMAN, 2005). Completando as conexões

com o sistema límbico, temos estruturas cerebrais como a substância cinzenta

periaquedutal, o núcleo dorsal da rafe e o locus coeruleus, também implicadas em

distúrbios de ansiedade e ricas em receptores noradrenérgicos, serotonérgicos e

dopaminérgicos. Além, é claro de receptores GABAérgicos e glutamatérgicos

(LeDOUX, 2003; MARCIN, 2003; BERTOGLIO; JOCA; GUIMARÃES, 2006).

Também são numerosos na literatura trabalhos científicos associando, tais

estruturas com o sistema monoaminérgico e este, com modelos animais de

ansiedade, como por exemplo o labirinto em cruz elevado (BERTOGLIO;

GUIMARÃES; ZANGROSSI JR., 2006). Nash e Nutt (2007) ainda relatam que

drogas reserpina-like pioram os quadros de ansiedade enquanto que drogas que

aumentam os níveis de monoaminas melhoraram tais quadros.

Nossos resultados sugerem que o efeito ansiolítico do extrato, possa estar

sendo também mediado pelo sistema monoaminérgico. Entretanto, os dados obtidos

não nos permitem concluir especificamente qual sistema (NOR, DO ou 5-HT) possa

estar envolvido direta ou indiretamente no efeito ansiolítico do extrato.

Indubitavelmente, o sistema GABAérgico está envolvido na neuroquímica da

ansiedade. A hipótese GABAérgica prediz que durante os estados de ansiedade há

65

uma sobreposição do sistema glutaminérgico (excitatório) ao GABAérgico (inibitório)

(KIM; GORMAN, 2005). É também bastante conhecido e aceito como verdadeiro que

drogas ansiolíticas tipo benzodiazepínicos atuam clinicamente via aumento do efeito

do GABA no receptor GABAA. Agonistas clássicos do receptor GABAA aumentam a

afinidade do neurotransmissor GABA com o receptor, favorecendo então a

neurotransmissão inibitória central (KIM; GORMAN, 2005). Estudos com

antagonistas dos receptores GABAérgicos como o flumazenil, bloqueiam o sítio de

ligação dos benzodiazepínicos no receptor GABAA e antagonizam o receptor,

revertendo por exemplo o efeito ansiolítico do diazepam (KIM; GORMAN, 2005;

BATEMAN, 2007).

Nossos resultados mostraram que o flumazenil, administrado antes do extrato

da planta, reverteu o efeito ansiolítico do mesmo, sugerindo que possa estar

havendo um efeito agonista nos receptores GABAA ou, um aumento na liberação do

mesmo. Entretanto, estudos mais efetivos serão necessários para confirmar tal

hipótese.

5.4 Efeito do EEHb sobre o sono induzido por barbit úrico (MSB):

Os resultados representados na Figura 18 A, demonstram que o EEHb, nas

concentrações de 10, 50 e 100 mg/Kg, promoveram uma diminuição significativa no

tempo de latência para o sono (F (59,106) = 2,622, p < 0,05; 9,940 e 8,507, p < 0,01,

respectivamente), quando comparados ao grupo controle negativo (veículo).

Também observou-se que os animais tratados com o controle positivo

diazepam, 1 mg/Kg, i.p. tiveram diminuição no tempo de latência para o sono (F

(59,106) = 13,383, p < 0,01), quando comparados ao grupo controle negativo (veículo).

No mesmo experimento foi verificado que o tempo total do sono (Figura 18 B),

foi aumentado com todas as doses utilizadas do EEHb (F (26,347) = 2,659, p < 0,05;

3,920 e 4,564, p < 0,01), quando comparadas ao grupo controle.

Da mesma forma, observou-se que o controle positivo aumentou

significativamente o tempo total do sono (F (26,347) = 9,896, p < 0,01), quando

comparado ao grupo controle negativo (veículo), produzindo seu característico efeito

hipnótico.

66

Figura 18: Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de diazepam (1 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no MSB. Tempo de latência para o sono (A) e o tempo total do sono (B).Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05 e ** p < 0,01).

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67

O efeito hipnótico de plantas medicinais é descrito desde a antiguidade

quando se relatam os efeitos da morfina, sendo consagrado Morfeu (figura

mitológica grega) como “Deus do Sono” (JUFE, 2007). Para o estudo de substâncias

com propriedade hipnótica o modelo do sono induzido por barbitúricos é o teste

animal mais utilizado para esse propósito.

Fujimori e Cobb (1995) propõem que o aumento da hipnose barbitúrica é um

bom indicador de atividade depressora do SNC, como exemplo, o pentobarbital que

quando administrado com outro agente com propriedades depressoras promovem

diminuição da latência do sono e também aumento do tempo total do sono dos

animais durante o experimento (WILLIANSON; OKPAKO; EVANS, 1996).

Vários estudos tem relatado que o prolongamento da hipnose barbitúrica pode

estar relacionado com a inibição metabólica do barbitúrio pela substância-teste ou

por uma ação central nos mecanismos de neurotransmissores envolvidos com a

regulação do sono (KAUL; KULKAMI, 1978).

Nossos resultados mostraram que o EEHb, em todas as doses utilizadas,

promoveu a diminuição da latência para o sono, bem como aumentou o tempo total

do sono, os quais possivelmente confirmam a atividade depressora já detectada

através do teste campo aberto, no que diz respeito a diminuição da atividade

exploratória. Outra abordagem que pode ser feita é de que o EEHb possa estar

alterando de alguma forma as neurotransmissões envolvidas na modulação do sono.

No processo de regulação do sono, morfologicamente 3 sub-divisões

hipotalâmicas são importantes no ciclo sono-vigília: o hipotálamo anterior (onde

existem os núcleos GABAérgicos e núcleos supraquiasmático) o hipotálamo

posterior (com o núcleo túbero-mamilar histaminérgico) e o hipotálamo lateral (onde

encontra-se os sistemas das hipocretinas). Durante o ciclo circadiano, o sistema

GABAérgico inibitório do núcleo pré-óptico ventro-lateral do hipotálamo anterior é

responsável pelo início e manutenção do sono, enquanto que os núcleos

aminérgicos (ricos em 5-HT), histaminérgicos, as hipocretinas e núcleos colinérgicos

do prasencéfalo basal apresentam-se ativos durante a vigília, inibindo o núcleo pré-

óptico (NITZ; SIEGEL, 1997; SAPER; CHOU; SCAMMELL, 2001).

Substâncias com atividade GABAérgica, como por exemplo os BDZs, em

doses mais elevadas do que aquelas utilizadas no tratamento da ansiedade,

promovem hipnose por atuarem no sítio de ligação do receptor GABAA, modificando

alostericamente o receptor, o que resulta em uma afinidade do próprio

68

neurotransmissor GABA pelo receptor. De fato, um dos efeitos colaterais dos

fármacos ansiolíticos tipo – BDZs é a hipnose, uma vez que o sistema GABAérgico

também está envolvido na gênese da ansiedade. Nossos resultados corroboram

com essa hipótese pelo menos em parte, uma vez que o extrato da planta em estudo

mostrou-se ansiolítico e hipnótico, sobretudo nas maiores doses empregadas nos

experimentos utilizados, tanto para determinação da atividade ansiolítica quanto a

hipnótica (BATESON, 2006).

5.5 Efeito do EEHb sobre a depressão através do MNF e do MSC

administrado de forma aguda e sub-crônica:

No MNF, apresentado pela Figura 19 A, é demonstrado que animais tratados

agudamente com o EEHb nas doses iniciais, não apresentaram modificação nos

parâmetros comportamentais de imobilidade, quando comparados com o grupo

tratado com veículo. Entretanto, na dose de 100 mg/Kg, observa-se uma diminuição

estatisticamente significativa no tempo de imobilidade (F (14,316) = 5,175, p < 0.01).

Perfil farmacológico semelhante foi observado com o extrato na mesma dose no

MSC quando administrado de forma aguda (F (7,652) = 2,634, p < 0.05, Figura 19 C).

Quando o EEHb foi administrado de forma sub-crônica, observa-se no MNF

uma diminuição significativa de forma dose-dependente no tempo de imobilidade nas

concentrações de 10, 50 e 100 mg/Kg, i.p. (Figura 19 B) (F (25,168) = 4,796, 4,860 e

6,250, p < 0,01, respectivamente). Também observou-se perfil farmacológico

semelhante no MSC (Figura 19 D), quando o tratamento promoveu uma diminuição

significativa no tempo total de imobilidade nas concentrações de 10, 50 e 100

mg/Kg, i.p. (F (47,539) = 4,621, 5,678 e 5,970, p < 0,01, respectivamente).

Em ambos os modelos a imipramina (50 mg/kg, i.p.), administrada aguda e

sub-crônicamente, produziu uma diminuição significativa nos parâmetros

observados, (F (25,168) = 9,924, p < 0,01; F (47,539) = 13,428, p < 0,01; F (14,316) = 5,818,

p < 0.01 e F (7,652) = 4,560, p < 0,001, respectivamente), comprovando seu efeito

antidepressivo reproduzido no modelo como citado várias vezes na literatura (SILVA

et al., 2006, RODRIGUES et al., 2002). Da mesma forma, também como esperado, o

69

efeito anti-imobilidade do fármaco é melhor observado no tratamento subcrônico do

que no tratamento agudo.

70

Figura 19: Efeito da administração aguda e sub-crônica do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg, i.p.) e da imipramina (50 mg/Kg, i.p.). MNF administrado de forma aguda (A), MNF administrado de forma sub-cônica (B), MSC administrado de forma aguda (C) e MSC administrado de forma sub-crônica (D). Os modelos indicam o tempo total de imobilidade. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001).

Veículo 10 50 100 500

50

100

150

200VeículoEEHb

Imipramina

******

**

D


Imob

ilida

de (

seg)

Veículo 10 50 100 500

50

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200

VeículoEEHb

Imipramina

**

****

**

B


Imob

ilida

de (

seg)

Veículo 10 50 100 500

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

Imipramina

**

A

**


Imob

ilida

de (

seg)

Veículo 10 50 100 500

50

100

150

200

250VeículoEEHb

Imipramina

****

C


Imob

ilida

de (

seg)

71

5.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedad e antidepressiva

do EEHb:

Uma vez que o EEHb nos MNF e MSC, apresentou efeito antidepressivo

considerável, procurou-se investigar o possível mecanismo de ação envolvido na

ação antidepressiva. Utilizou-se a dose de 100 mg/Kg por ser esta a que apresentou

maior redução no tempo total de imobilidade dos animais nos dois modelos

referidos. E, para esse estudo o modelo animal adotado foi o MNF.

Os resultados apresentados na Figura 20 demonstram que o efeito

antidepressivo do extrato, representado pela redução do tempo de imobilidade

(F(7,541) = 5,656, p < 0,01) é revertido de forma significativa pelo pré-tratamento dos

animais com reserpina (F (7,541) = 6,075, p<0,01). Conforme já relatado a reserpina é

conhecida como inibidor do transporte vesicular das catecolaminas (5-HT, dopamina

e noradrenalina) o que pode finalmente resultar na depleção dos estoques neuronais

das aminas biogênicas no SNC (DEUSSING, 2006). Num primeiro momento, os

resultados apresentados sugeriram que o sistema monoaminérgico seria importante

para o efeito antidepressivo do EEHb.

A partir do que foi observado, procurou-se investigar a atuação das

monoaminas de maneira mais específica, avaliando o efeito do EEHb sobre cada um

dos sistemas: serotonérgico, dopaminérgico e noradrenérgico. Nesse sentido,

verificou-se que o pré-tratamento com PCPA (Figura 21 A) reverteu o efeito

antidepressivo do EEHb, uma vez que aumentou de forma estatisticamente

significante o tempo de imobilidade dos animais (F (4,698) = 4,572, p < 0,05). Também

observa-se que NAN-190, um antagonista seletivo dos receptores 5-HT1A, promoveu

a reversão do efeito antidepressivo do EEHb de forma estatisticamente significante

(Figura 21 B) (F (4,720) = 3,997, p < 0,05). Entretanto, o uso de um antagonista

seletivo dos receptores 5-HT2A, a quetanserina (0,5 mg/Kg, i.p.), não promoveu a

reversão do efeito antidepressivo do EEHb (Figura 21 C), sugerindo a não

participação desses receptores no mecanismo de ação antidepressiva do extrato.

Investigando a via adrenérgica os resultados apresentados na Figura 22 A,

demonstram que o pré-tratamento dos animais com prazosin (antagonista α1-

adrenérgico) reverteu de forma estatisticamente significante (F (6,168) = 3,970, p <

0,05) o efeito antidepressivo do extrato, uma vez que produziu um aumento do

72

tempo de imobilidade dos animais. Da mesma forma (Figura 22 B), observou-se que

o pré-tratamento com ioimbina, (antagonista α2-adrenérgico) também reverteu o

efeito antidepressivo do extrato (F (9,361) = 7,175, p < 0,001), de forma

estatisticamente significante, sugerindo que tal efeito possa estar sendo mediado

pelo sistema noradrenérgico via receptores α1 e α2.

Uma vez que foi constatado a participação das vias noradrenérgica e

serotonérgica no efeito antidepressivo do EEHb, a via dopaminérgica também foi

investigada. A Figura 23 A nos mostra que o pré-tratamento com haloperidol

(antagonista dopaminérgico não seletivo) reverteu o efeito antidepressivo do EEHb,

uma vez que aumentou de forma estatisticamente significante o tempo de

imobilidade dos animais (F (9,275) = 4,309, p < 0,01). A participação mais efetiva dos

receptores D2 nesse efeito foi constatada num segundo experimento, onde

pimozide, (antagonista seletivo dos receptores D2) (Figura 23 B), promoveu a

reversão do efeito antidepressivo do EEHb de forma estatisticamente significante (F

(9,275) = 4,526, p < 0,01).

5.7 Avaliação dos efeitos dos compostos obtidos do EEHb:

Na Figura 24 observa-se que os animais pré-tratados com os compostos (10

mg/Kg) isolados do extrato etanólico da planta em estudo, somente o grupo que

recebeu podoandina teve diminuído o tempo de imobilidade de forma

estatisticamente significativa (F (8,459) = 5,893, p < 0.01), quando comparados com o

grupo controle, o qual recebeu veículo.

73

Figura 20: Efeito de pré-tratamento de animais com reserpina (2 mg/kg, i.p.), 10 minutos antes da aplicação do EEHb (100 mg/kg, i.p.), na redução do tempo de imobilidade no MNF em camundongos. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01). ## p < 0,01 quando comparado com o extrato na ausência de reserpina.

0

50

100

VeículoEEHb

Reserpina

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

**

##

Tem

po d

e im

obili

dade

(se

g)

74

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

NAN-190

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

*

#B

Tem

po d

e im

obi

lidad

e (s

eg)

Figura 21: Efeito de pré-tratamento de animais com PCPA (100 mg/kg, i.p., uma vez por dia durante 4 dias sucessivos) (A), NAN-190 (0,5 mg/kg, i.p.) (B), Quetanserina (5 mg/kg, i.p.) (C), na redução do tempo de imobilidade causada pela administração do EEHb (100 mg/kg, i.p.) no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (* p < 0,05). # p < 0,05 indicam diferenças estatísticas quando comparado com o extrato na ausência dos antagonistas.

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

Quetanserina

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

*

C

Tem

po d

e im

obi

lidad

e (s

eg)

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

PCPA

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

*

#

A

Tem

po d

e im

obili

dade

(se

g)

75

Figura 22: Efeito do pré-tratamento dos animais com prazosin (1 mg/kg, i.p.) (A) e ioimbina (1 mg/kg, i.p.) (B) na redução do tempo de imobilidade causada pela administração do EEHb (100 mg/kg, i.p.) no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01). #p < 0,05 e ### p < 0,001 denotam significância estatística quando comparado com extrato na ausência dos antagonistas.

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

Ioimbina

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

**

###B

Tem

po d

e im

obili

dade

(se

g)

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

Prazosin

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

**

A

#T

empo

de

imob

ilida

de (

seg)

76

Figura 23: Efeito do pré-tratamento dos animais com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p.) (A) e pimozide (0,2 mg/kg, i.p.) (B) na redução do tempo de imobilidade causada pela administração do EEHb (100 mg/kg, i.p.) no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01). ## p < 0,01 denotam significância estatística quando comparado com extrato na ausência dos antagonistas.

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

Haloperidol

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

**

##

A

Tem

po d

e im

obili

dade

(se

g)

0

50

100

150

200

250

VeículoEEHb

Pimozide

+ +

- + - -

+ -

- ++ +

**

##

B

Tem

po d

e im

obili

dade

(se

g)

77

Figura 24: Efeito da administração aguda do EEHb (100 mg/Kg, i.p.), podoandina (10 mg/Kg, i.p.) e 13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide (10 mg/Kg, i.p.) na redução do tempo de imobilidade no MNF. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo (** p < 0,01 e *** p < 0,001).

Veículo 100 10 100

50

100

150

200

VeículoEEHbPodoandina13-hidroxi

*** **


Imob

ilida

de (

seg)

78

A depressão é considerada como uma das doenças neuropsiquiátricas mais

incapacitantes do momento, impõe à sociedade uma substancial carga até mesmo

econômica, uma vez que acomete pessoas em plena idade produtiva (NEMEROFF,

2007). Em relação a sua prevalência a o alto impacto sobre a sociedade, a eficácia

dos antidepressivos disponíveis tem se mostrado inconsistente e muitos deles

exercem consideráveis efeitos colaterais e/ou adversos. Com o crescente número de

plantas medicinais sendo introduzidas na prática psiquiátrica, muitas delas tem sido

mostradas como terapias alternativas para depressão severa (THACHIL; MOHAN;

BHUGRA, 2007). Desta forma, o desenvolvimento de agentes antidepressivos

seguros e efetivos oriundos de plantas medicinais pode tornar-se uma via alternativa

para diminuir os efeitos colaterais bem como aumentar a eficácia terapêutica. Nesse

contexto, a boa escolha dos modelos animais de depressão a serem utilizados

durante as experimentações pré-clinicas é tão importante quanto a planta em

questão.

Os MNF e MSC são testes farmacológicos amplamente utilizados na pesquisa

para avaliar compostos com potencial antidepressivo (SILVA et al., 2006). Quando

os animais são colocados em um espaço restrito e/ou adverso ao seu ambiente

natural, como por exemplo, nos modelos de natação forçada ou quando são

suspensos pela cauda, não existindo a possibilidade de fuga, eles tendem, num

primeiro momento a fazerem várias tentativas para fugir. Após perceberem que as

tentativas de fuga são frustradas, os animais permanecem imóveis, num estado de

desespero comportamental (PORSOLT; BERTIN; JALFRE, 1977; STERU et al.,

1985). Assim, fármacos antidepressivos usualmente utilizados na clínica, incluindo

os atípicos, induzem de forma geral, uma redução no tempo total de imobilidade

quando são testados como controles positivos nesses modelos (MACHADO et al.,

2007).

No presente estudo os dois modelos experimentais acima mencionados foram

escolhidos para avaliar o efeito antidepressivo do EEHb. Num primeiro momento foi

observado que em ambos os modelos, o extrato da planta promoveu redução do

tempo de imobilidade sugerindo um efeito antidepressivo quando utilizado de forma

aguda. O objetivo de se fazer experimentos com tratamento sub-crônico após obter-

se o efeito antidepressivo do extrato nos dois modelos animais de depressão

remonta nos dados clínicos, onde, observa-se que o efeito terapêutico dos

antidepressivos só ocorre após 2 a 3 semanas de uso constante (KITAMURA;

79

ARAKI; GOMITA, 2002). Tal fato demonstra que o efeito terapêutico não reside

somente na capacidade de os antidepressivos restituírem os níveis cerebrais de

monoaminas. Se assim o fosse, os resultados terapêuticos seriam observados já

com as primeiras doses administradas. Nos casos de depressão e também de

esquizofrenia, o tratamento farmacológico promove ao longo do tempo processos de

neuroplasticidade próprios, o que ocorre com o passar do tempo de tratamento. A

opção de um tratamento sub-crônico com duração de 15 dias é sustentada por

Kitamura; Araki e Gamita (2002), que demonstraram que compostos com

propriedades antidepressivas administradas em camundongos por 15 dias,

diminuem de forma mais evidente a duração do tempo total de imobilidade.

Além de estudar os efeitos do EEHb, em dois modelos animais de depressão

de forma aguda e sub-crônica o presente trabalho analisou mecanismos neuronais

que poderiam estar relacionados aos efeitos produzidos pela administração do EEHb

em camundongos no MNF.

O sistema monoaminérgico é um dos alvos mais importantes para o

tratamento da depressão, onde a deficiência das aminas biogênicas, particularmente

5-HT, NOR e DO é um fator responsável pelo surgimento dessa doença. Além disso,

fármacos, como a reserpina, que depletam os estoques desses neurotransmissores

são capazes de induzir sintomas de depressão (ARAGÃO et al., 2006). No presente

estudo procurou-se investigar o envolvimento dos sistemas serotoninérgico,

noradrenérgico e dopaminérgico no efeito antidepressivo do EEHb no MNF. Para

tanto, avaliou-se a possível reversão do efeito antiimobilidade do EEHb pelo pré-

tratamento dos camundongos com antagonistas farmacológicos de receptores

serotoninérgicos, noradrenégicos e dopaminérgicos, bem como com substâncias

que pudessem de alguma forma modificar esses sistemas.

O MNF, também conhecido modelo do desespero comportamental é

mundialmente usado como um modelo de depressão animal confiável para o

screening de novos antidepressivos, bem como ferramenta para investigar os

mecanismos envolvidos na propriedade antidepressiva das substâncias (BORSINI,

1995). Uma grande variedade de estudos tem demonstrado que esse teste é

fortemente sensível para a maioria das classes dos antidepressivos eficazes

clinicamente, incluindo os inibidores seletivos da recaptação da serotonina, os

antidepressivos tricíclicos e os inibidores da MAO (DETKE; RICKELS; LUCKI, 1995;

RODRIGUES et al., 2002).

80

Num primeiro momento, a reserpina uma droga conhecida por causar

depleção dos estoques de aminas biogênicas, por inibição do processo de

armazenamento das mesmas, foi utilizada para avaliar a participação dessas aminas

no efeito antidepressivo do extrato da planta. De fato, o pré-tratamento com

reserpina reverteu o efeito antidepressivo do EEHb, sugerindo que o sistema

monoaminérgico participaria do mecanismo de ação do extrato.

O sistema serotoninérgico está relacionado com o mecanismo de ação de

fármacos antidepressivos. Van Praag e Korf (1971) propuseram a hipótese

serotonérgica o que resultou num grande impulso no desenvolvimento da classe de

antidepressivos chamados Inibidores Seletivos de Recaptação da Serotonina.

O envolvimento do sistema serotoninérgico na ação antidepressiva do EEHb

no MNF foi investigado primeiramente através da utilização do inibidor da síntese da

serotonina, PCPA e de antagonistas seletivos serotonérgicos o NAN-190 e a

quetanserina. Em nossos experimentos o efeito antiimobilidade do extrato foi

revertido pelo pré-tratamento com PCPA. O PCPA é um inibidor da enzima triptofano

hidroxilase, que quando administrado por quatro dias sucessivos é capaz de depletar

as reservas endógenas de 5-HT em camundongos sem afetar os níveis de

noradrenalina e dopamina (RODRIGUES et al., 2002).

Em nossos experimentos PCPA sozinho não afetou o tempo de imobilidade

dos camundongos, entretanto, PCPA pôde reverter o efeito antiimobilidade do

extrato. Esses resultados se encontram em conformidade com resultados anteriores

relatados na literatura mostrando que o tratamento com PCPA pode reverter

completamente o efeito antidepressivo da fluoxetina, um inibidor seletivo da

recaptação de 5-HT, e reverte parcialmente o efeito da imipramina, um inibidor da

recaptação de 5-HT e NOR (ECKELI et al., 2000). Assim, nossos resultados

demonstram que o sistema serotonérgico pode estar implicado no efeito

antidepressivo do EEHb no MNF.

Dentre os 17 sub tipos de receptores para a 5-HT, o receptor 5-HT1A tem

recebido maior atenção devido ao seu papel chave na patogênese da doença bem

como na resposta antidepressiva. Dados clínicos reportam baixos níveis de

receptores 5-HT1A na patogênese da depressão (CRYAN; MOMBEREAU;

VASSOUT, 2005). Além disso, receptores 5-HT1A estão localizados pré-

sinapticamente em neurônios do núcleo da rafe e pós-sinapticamente em neurônios

nas regiões corticais e límbicas, destacando-se pelo envolvimento em várias classes

81

de fármacos antidepressivos incluindo os triciclícos, os ISRS e os iMAO (BLIER;

WARD, 2003; MACHADO et al., 2007). O envolvimento dos receptores 5-HT1A na

ação antidepressiva do EEHb foi evidenciado pela reversão do efeito antidepressivo

do extrato etanólico no MNF pelo antagonista seletivo dos receptores 5-HT1A, o

NAN-190.

Também estudos pré-clínicos e clínicos tem apontado um importante papel

dos receptores 5-HT2A na fisiopatogênese da depressão, bem como na ação de

antidepressivos. Muitos antidepressivos são antagonistas de receptores 5-HT2A e

apresentam a habilidade de diminuir a ligação da serotonina aos receptores 5-HT2A

após administração prolongada. Este fato, sugere um “down-regulation” de

receptores 5-HT2A que pode estar envolvido nas ações farmacológicas que ocorrem

em torno de 4 semanas para o início da ação antidepressiva dos fármacos utilizados

na clínica (DEAKIN, 1998). Em nossos experimentos o pré-tratamento dos animais

com quetanserina não reverteu o efeito antidepressivo do EEHb no MNF, sugerindo

a não participação do receptor 5-HT2A no mecanismo de ação da propriedade

antidepressiva.

A falta de NOR no SNC compromete a eficácia farmacológica de fármacos

antidepressivos, inclusive ISRS (CRYAN et al., 2004). A NOR apresenta um

importante papel na fisiopatologia da depressão. Fármacos antidepressivos usados

na clínica elevam a concentração sináptica de NOR e, alguns agem diretamente nos

receptores noradrenérgicos (ELHWUEGI, 2004).

Nosso estudo demonstrou que tanto o prazosin (antagonista α1-adrenérgico)

como a ioimbina (antagonista α2-adrenérgico) foram capazes de reverter o efeito

antidepressivo do EEHb no MNF. Esses resultados indicam que o extrato pode

exercer seu efeito antidepressivo no MNF pela interação com ambos os receptores

α1 e α2 e contribui com as atuais evidências para o papel desses receptores na

ação de agentes antidepressivos (MILLAN, 2004). Além disso, embora a ioimbina

seja altamente seletiva para receptores α2-adrenérgico mais do que a receptores α1-

adrenérgico, este fármaco também tem uma afinidade por receptores 5-HT1A e

aproximadamente o dobro da afinidade aos receptores α2-adrenérgico. Esse dado

reforça também os resultados relacionados ao sistema serotonérgico.

O sistema dopaminérgico também está implicado na regulação do humor

(DAILLY et al., 2004). Algumas evidências bioquímicas originadas de estudos

clínicos mostram que níveis plasmáticos do ácido homovanílico e do ácido 3,4-

82

dihidroxifenilacético, dois metabólitos da dopamina, estão diminuídos em pacientes

deprimidos, indicando uma diminuição no “turnover” da dopamina (MITANI et al.,

2006; SHER et al., 2006).

Tem sido considerado que a potencialização da neurotransmissão

dopaminérgica induzida pelo tratamento crônico com antidepressivos pode contribuir

para sua eficácia terapêutica (D´AQUILA et al., 2000) e há também uma

considerável evidência farmacológica associada a eficácia terapêutica dos

antidepressivos com efeitos dopaminérgicos no tratamento da depressão

(PAPAKOSTAS, 2006)

Em nossos resultados o haloperidol (antagonista não seletivo de dopamina),

reverteu o efeito antidepressivo do EEHb no MNF. O haloperidol é um agente

derivado da butirofenona com efeitos similares aos das fenotiazinas derivados da

piperazina. Produz um efeito sobre o SNC por bloqueio competitivo dos receptores

dopaminérgicos pós-sinápticos além de outros receptores centrais. Por promover

efeito sedativo considerado o haloperidol é freqüentemente utilizado na clínica para

tratamento de pacientes esquizofrênicos, agressivos e agitados (DHIR; KULKARNI,

2007).

Também em nossos estudos pimozide, reverteu o efeito antidepressivo

induzido pelo EEHb no MNF. Pimozide é um fármaco antipsicótico que pertence ao

grupo das difenilbutilpiperidinas. É estruturalmente similar às butirofenonas, as quais

inclui o haloperidol. Pimozide exerce ação antipsicótica por bloquear receptores

dopaminérgicos D2 (pré e pós-sinápticos) de forma seletiva (MUSCAT; SAMPSON;

WILLNER, 1990).

Renard et al. (2001) demonstraram, utilizando o MNF que o agonista do

receptor de dopamina D1, o SKF 38393 aumenta os efeitos antiimobilidade dos

ISRS, sugerindo que o receptor D1 pode estar envolvido para a melhora da eficácia

destes fármacos. Em estudos clínicos, foi demonstrado que pacientes deprimidos

tiveram uma melhora dos sintomas da depressão ao fazerem o uso concomitante de

bromocriptina, um agonista de receptor D2, e imipramina um antidepressivo tricíclico

(WAEHRENS; GERLACH, 1981). Também foi reportado que o efeito antiimobilidade

do antidepressivo tricíclico imipramina foi reduzido pelo uso de antagonistas do

receptor D2 (DZIEDZICKA-WASYLEWSKA et al., 2000). Diante do exposto, nossos

resultados estão de acordo com dados da literatura os quais indicam que receptores

83

dopaminérgicos desempenham um importante papel na modulação dos estados de

humor.

Completando os estudos sobre a atividade antidepressiva da planta, como

relatado anteriormente duas lactonas foram isoladas e identificadas. O composto 1

conhecido como 13-hidroxi-8,9-dihydroshizukanoide e o composto 2 conhecido como

podoandina. Devido aos excelentes resultados obtidos com o EEHb tanto

administrado agudamente como de forma sub-crônica nos modelos de depressão,

obtou-se pelo MNF para avaliar o efeito dos compostos.

Nossos resultados sugerem que o efeito antidepressivo do extrato pode ser

relacionado ao composto podoandina, uma vez que o mesmo foi efetivo em diminuir

o tempo de imobilidade dos animais no MNF, sugerindo exibir a propriedade

antidepressiva.

5.8 Avaliação do efeito do EEHb sobre a convulsão i nduzida por PTZ e

estricnina:

A Figura 25 A e B, representam os resultados obtidos com animais avaliados

nos modelos de antagonismo da convulsão induzida por PTZ e estricnina, tratados

com EEHb.

No modelo de PTZ, nenhuma das concentrações utilizadas no experimento

produziu o aumento do tempo de latência para convulsão quando comparada com o

grupo controle. Entretanto, o tratamento dos animais com o controle positivo,

fenobarbital produziu aumento da latência para a convulsão (F (491,09) = 35,454, p <

0,01) de forma estatisticamente significativa (Figura 25 A).

O mesmo perfil farmacológico do extrato foi observado no modelo e

convulsão induzida por estricnina (Figura 25 B). Nas concentrações de 10, 50 e 100

mg/Kg (i.p.), o EEHb, não foi eficaz em aumentar o tempo de latência para

convulsão. E também, o controle positivo, fenobarbital, promoveu um aumento

significativo da latência para as crises convulsivas (F (5,205) = 3,842, p < 0,01).

Da mesma forma, o tratamento com o extrato não protegeu os animais

contra a letalidade induzida pelo PTZ e estricnina, uma vez que os mesmos não

84

sobreviveram as crises tônicas induzidas por esses compostos (resultados não

mostrados).

85

Figura 25: Efeito da administração aguda do EEHb (10, 50 e 100 mg/Kg) e de fenobarbital (50 mg/Kg), administrados pela via intraperitonial no modelo de convulsão induzida por PTZ e estricnina. Figura A indica o tempo de latência para primeira crise convulsiva com PTZ, Figura B tempo de latência para primeira crise convulsiva com estricnina. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo) (** p < 0,01).

Veículo 10 50 100 500

1000

2000

3000VeículoEEHbFeno

**A


Tem

po d

e la

tênc

ia p

ara

conv

ulsã

o (s

eg)

Veículo 10 50 100 500

100

200

300 VeículoEEHb

Feno

**

B


Tem

po d

e la

tênc

ia p

ara

conv

ulsã

o (s

eg)

86

Os modelos farmacológicos de convulsão induzida por PTZ e estricnina são

modelos largamente utilizados para avaliar possíveis efeitos anticonvulsivantes de

substâncias estudadas (LÖSCHER, 2002).

Os modelos experimentais de epilepsia são necessários para o estudo do

distúrbio neuroquímico envolvido no fenômeno epiléptico e são indispensáveis para

a seleção de novos agentes anticonvulsivantes. Dois modelos utilizados para

seleção das convulsões foram empregados neste trabalho: o modelo da convulsão

induzida pelo PTZ e o modelo da convulsão induzida por estricnina. Estes modelos

podem mimetizar crises de ausência (Pequeno Mal) e crises tônico-clônicas (Grande

Mal), respectivamente, sendo sua expressão muito semelhante a estes tipos de

epilepsias em humanos (MARESCAUX et al., 1984).

Trabalhos têm demonstrado que a ação convulsivante do PTZ seja por inibir

os canais de cloreto do receptor GABAA, e conseqüentemente a ação do

neurotransmissor GABA (MAHOMED; OJEWOLE, 2006; KALUEFF, 2007).

A estricnina é um alcalóide, extraído das plantas Erythrina velutina e Erythrina

mulungu, e atua sobre a inibição dos reflexos da medula espinhal. É um antagonista

competitivo dos receptores da glicina, bloqueando a resposta inibitória sináptica da

glicina no SNC. Assim, a estricnina proporciona uma forte crise convulsiva tônica

clônica de forma generalizada que geralmente ocasiona a morte do animal

(KASTURE; KASTURE, CHOPDE, 2002; VASCONCELOS et al., 2007).

Para os modelos de indução da convulsão por PTZ e estricnina foram usados

como controle positivo o fenobarbital. Diferentemente dos BDZs, o fenobarbital

possui ação anticonvulsivante por atuar nas sinapses GABAérgicas promovendo a

ativação direta do receptor GABAA sem a necessidade de presença do

neurotransmissor, com isso, ocorre abertura do canal de cloreto, promovendo a

depressão do SNC. Essa ação depressora normaliza gradativamente as descargas

elétricas na área motora do córtex cerebral (QUILICHINI et al., 2006).

Em nossos estudos o EEHb, quando administrado pela via intraperitoneal,

não promoveu um efeito significativamente protetor contra as crises convulsivas

induzidas pelos dois tipos de agente convulsivante, sugerindo que essa propriedade

farmacológica não está presente na planta em estudo ou o efeito só se pronunciaria

com doses maiores do extrato.

Os resultados obtidos nos experimentos onde a indução da crise convulsiva

foi feita pelo PTZ, não foi o esperado, uma vez que o extrato mostrou-se efetivo

87

como ansiolítico e seu mecanismo envolveu a via GABAérgica. Além disso, o extrato

também foi efetivo como agente hipnótico, não só diminuindo a latência de sono dos

animais como também o tempo total de sono. Como já é conhecido, substâncias

com perfil farmacológico benzodiazepínico-like possuem propriedades ansiolíticas,

hipnóticas e anticonvulsivantes (BELZUNG; GRIEBEL, 2001; BATESON, 2006;

KANG et al., 2008).

5.9 Avaliação do efeito do EEHb sobre a memória atr avés do modelo de

esquiva inibitória (MEI):

Na Tabela 1, estão representados respectivamente os resultados obtidos

sobre a aquisição, a consolidação e a evocação da memória no MEI, quando os

animais foram tratados com EEHb respectivamente 15 minutos antes do treino,

imediatamente após o treino e 15 minutos antes do teste.

Comparando-se as sessões de teste com as sessões de treino, para cada

fase da memória estudada (aquisição, consolidação e evocação) observa-se em

todos os tratamentos a aprendizagem da tarefa da esquiva inibitória, uma vez que

ocorre aumento do tempo de permanência dos animais sobre a plataforma de forma

estatisticamente significante (* p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001). Entretanto,

quando nas sessões de teste compara-se o efeito do EEHb com o veículo, verifica-

se que houve efeito amnésico do extrato somente com a dose de 10 mg/Kg no

processo de consolidação da memória (# p < 0,05). Os resultados em conjunto

demonstram que o EEHb em doses superiores a 10 mg/Kg não alteraram a memória

em nenhuma de suas etapas. Entretanto, na consolidação uma interferência é

observada com as doses inferiores.

88

Tabela 1: Efeito do tratamento do EEHb sobre a memória na esquiva inibitória. Tratamento (mg/Kg, i.p.)

Sessão Treino Sessão Teste

Aquisição da memória: Veículo 7,50 (4,25 – 9,00) 180,00 (61,50 – 180,00)***

EEHb 10 3,50 (3,00 – 17,25) 76,50 (57,75 – 159,25) EEHb 50 19,50 (6,50 – 22,00) 180,00 (180,00 – 180,00)***

EEHb 100 6,50 (2,50 – 20,25) 180,00 (25,00 – 180,00)***

Consolidação da memória:

Veículo 5,50 (4,00 – 9,25) 58,00 (31,25 – 92,00)** EEHb 10 5,50 (3,00 – 8,00) 22,00 (16,50 – 41,50) # EEHb 50 10,50 (4,25 – 14,50) 25,00 (15,75 – 57,75)*

EEHb 100 11,00 (7,25 – 17,00) 47,50 (17,75 – 91,50)**

Evocação da memória: Veículo 7,50 (3,00 – 14,50) 35,00 (15,25 – 104,50)**

EEHb 10 3,50 (1,00 – 6,25) 70,00 (20,00 – 180,00)** EEHb 50 4,00 (2,75 – 10,25) 82,00 (14,00 – 180,00)**

EEHb 100 7,50 (3,00 – 14,50) 35,00 (15,25 – 104,50)** Os dados são expressos como mediana seguido dos intervalos interquativos (25 – 75). Kruskal-Wallis. # denotam significância estatística na sessão de teste quando comparado com o controle (veículo). *, **, *** denotam diferenças estatísticas quando compara-se a sessão de treino com a sessão de teste em cada tratamento. N = 8 a 10 animais por grupo.

89

Durante muitos anos o MEI tem sido utilizado para desvendar os mecanismos

farmacológicos e bioquímicos relacionados as três fases do processo da memória a

aquisição, a evocação e a consolidação (IZQUIERDO et al., 1992).

Grande parte do que se conhece atualmente a respeito dos mecanismos

celulares e moleculares envolvidos nos fenômenos de plasticidade neuronal deve-se

à descrição do fenômeno da LTP feito por Bliss e Lomo (1973). A LTP (long term

potentiation) ou potencialização de longa duração, consiste em um aumento na

eficiência da transmissão sináptica em neurônios de estruturas cerebrais como o

hipocampo, em resposta a um estímulo de alta freqüência. Ao longo dos anos

demonstrou-se que a LTP compartilha inúmeras e importantes características do

aprendizado e novas memórias sendo apontado repetidamente pela grande maioria

dos estudiosos do assunto como o mecanismo de memória (BLISS; COLINGRIDGE,

1993; IZQUIERDO, 1993; IZQUIERDO 1994; EICHENBAUM, 1997; RAO;

FINKBEINER, 2007; McLEOD; SUNDRAM; DREAN, 2008; WOSTYN; AUDENAERT;

DE DEYN, 2008). As características que a LTP possui elegendo-a como possível

mecanismo de memória são: Indução rápida (aquisição); grande labilidade durante o

período pós indução (consolidação), em que ocorre seu estabelecimento perdurável

e permite sua manutenção, mantendo-se por longo período na ausência de

estimulação; e, por último, expressão imediata da resposta quando é novamente

aplicado o estímulo original (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993; REYMANN, 1993;

IZQUIERDO, 1994; IZQUIERDO; MEDINA, 1995; RAO; FINKBEINER, 2007;

McLEOD; SUNDRAM; DREAN, 2008).

O processo da LTP ocorre em estruturas cerebrais envolvidas no processo da

memória (MAREN; BAUDRY, 1995; McLEOD; SUNDRAM; DEAN, 2008).

Camundongos mutantes com defeitos enzimáticos com prejuízo no fenômero da LTP

possuem também prejuízo de memória (MANSUY et al., 1992; GRANT; SILVA,

1994). Existem atualmente vários experimentos farmacológicos mostrando uma

grande similaridade entre a LTP e memória, sendo esta, considerado no momento a

melhor evidência em favor da hipótese da LTP como o mecanismo de memória

(BLISS; COLLINGRIDGE, 1993; IZQUIERDO; MEDINA, 1995).

Achados farmacológicos têm sugerido que há três mecanismos modulatórios

do processo de formação de memória. O primeiro é a influência inibitória do GABA, o

qual atua no início do processo de formação da memória no hipocampo e também

em muitas regiões simultaneamente (BRIONI et al., 1990; IZQUIERDO et al., 1992;

90

BRIONI, 1993; IZQUIERDO; MEDINA, 1997). O segundo sistema modulatório

envolve mecanismos neuronais relacionados com a região do núcleo basolateral da

amígdala, a qual é ativada por estímulos relacionados ao estresse (McGAUGH;

CAHILL; PARENT, 1996; CAHILL; McGAUGH, 1998; McGAUGH, 2000) e é muito

importante para a formação de memórias declarativas de longa duração e eventos

emocionalmente desencadeados (McGAUGH; CAHILL; PARENT, 1996). O terceiro

mecanismo modulatório atua simultaneamente na região CA1 do hipocampo, no

córtex parietal e córtex entorrinal (mas não na amigdala) (ARDENGHI et al., 1997;

RAO; FINKBEINER, 2007) durante as primeiras seis horas após o treino. O processo

de modulação é muito importante para as memórias de longa duração. Através da

regulação da atividade de sítios de formação da memória em etapas bioquímicas

específicas (IZQUIERDO et al., 1992; McGAUGH; CAHILL; PARENT, 1996;

IZQUIERDO; MEDINA, 1997; McGAUGH, 2000) a modulação determina qual

memória pode ou não ser formada e quais podem ou não serem lembradas

(McGAUGH; CAHILL; PARENT, 1996; McGAUGH, 2000).

Os sistemas de neurotransmissores que participam em cada uma das etapas

da memória são bastante estudados atualmente. No processo de aquisição vários

sistemas participam, mas o foco principal se dá sobre o sistema glutaminérgico

(MEDINA et al., 2008). O processo de consolidação é regulado pela adrenalina

circulante, hormônio adenocorticotrófico (ACTH), vasopressina, glicocorticóides,

opióides endógenos, GABA, entre outros (QUEVEDO et al., 2003; MEDINA et al.,

2008).

O sistema GABAérgico constitui o maior modulador do processo de

consolidação e isso explica em parte o efeito amnésico de fármacos que ativam tal

sistema como o caso dos BDZs (IZQUIERDO; MEDINA, 1991; RAO; FINKBEINER,

2007). Com relação a evocação do processo de memória, além do importante papel

do sistema glutamatérgico, temos também a participação do sistema serotonérgico

(QUEVEDO et al., 2003; ÖGREN et al., 2008). Em nossos experimentos observou-

se um efeito amnésico do extrato no processo de consolidação da memória,

podendo ter sido esse efeito mediado pelo sistema GABAérgico, entretanto, como o

efeito não se manteve em doses superiores pode-se atribuir a esse resultado uma

falha experimental ou a interferências fisiológicas do grupo de animais não

detectadas diretamente durante a experimentação.

91

De uma forma geral a Figura 26 ilustra as propriedades farmacológicas

estudadas com o EEHb, apontando também os mecanismos de neurotransmissores

envolvidos nesses efeitos.

92

Planta Hedyosmum brasiliense Miq.

EEHb

Convulsão

Ansiedade (efeito ansiolítico)

Hipnóse

Memória

Depressão

Sistema Monoaminérgico

Sistema GABAérgico

Sistema Monoaminérgico

Sistema Serotonérgico

Sistema Dopaminérgico

Sistema Adrenérgico

Amnésico (Consolidação)

Sistema GABAérgico

5-HT1A

5-HT2A

D2

α1 receptor α2 receptor

Figura 26: Resumo esquemático das propriedades farmacológicas estudadas com o EEHb e possíveis mecanismo de ação.

Sistema Motor

Sistema GABAérgico

* Blocos inteiros – mecanismos confirmados experimentalmente. Blocos tracejados – mecanismos supostos. X – ausência de efeito.

93

6 CONCLUSÕES

Os resultados em conjunto sobre a avaliação dos efeitos do EEHb nos

permitem sugerir como conclusões:

a) A planta não produziu efeito sobre a função motora dos animais.

b) A planta apresenta a propriedade ansiolítica, a qual parece ser mediada

pelo sistema GABAérgico e monoaminérgico.

c) A planta apresenta a propriedade antidepressiva, sendo que este efeito

parece ser mediado pela interação com os sistemas serotoninérgico (receptor

5HT1A), noradrenérgico (receptores α1 e α2) e dopaminérgico (receptor D2).

d) A planta apresenta efeitos hipnóticos a amnésicos e não apresenta efeito

protetor contra as crises convulsivas induzidas por PTZ e estricnina.

e) Os efeitos centrais detectados podem estar relacionados com a presença

de lactonas como por exemplo a podoandina.

Os resultados obtidos justificam o uso popular da planta como agente

“calmante” na terapêutica da ansiedade utilizado na medicina popular.

94

REFERÊNCIAS

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108

ANEXO

Certificado comissão de ética em pesquisa

90:10 95:5 100:0 Extrato Bruto

Extrato Hidroalcoolico 4:1

(Etanol:Agua)

Caules e Folhas (8Kg)

Identificacao por RMN C e

H

13-hidroxi-

8,9-dihydroshizukanoide

Concentrado e guardado (-

21 oC)

15 dias (21 +/- 3 oC)

Cromatografia em coluna (2,5 x 45 cm) - (sílica gel 6) “Biomonitora

mento”

0:100 50:50 70:30 80:20 90:10 92:8 96:4 98:2 100:0 Mistura das

Fracoes 90:10 - 80:20

Cromatografia em coluna

(sílica gel 60; 70-230 mesh)

(900g) Coluna 15 x

0:100 50:50 60:40 65:35 70:30 75:25

40

50

60

70 DTe

mpo

de

perm

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cia

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