Relatrio de EstgioHospital de Santo Andr Leiria

Estgio em Microbiologia

Orientador de estgio Interno:Prof. Paula Sanches

Orientador de estgio externo:Tcnico Orlando Figueira

Discente:Ana Rita Moreira P. B. de Macedo, n500165

Escola Superior de Sade Ribeiro Sanches

Relatrio de Estgio

Hospital de Santo Andr Leiria

Estgio em Microbiologia

Orientador de estgio Interno:Prof. Paula Sanches

Orientador de estgio externo:Tcnico Orlando Figueira

Discente:Ana Rita Moreira P. B. de Macedo, n500165

ndice1.Cronograma de Actividades..................................................... 4 2.Colheitas ..................................................................................... 5 3. Coloraes ................................................................................. 7 4. Meios de Cultura ...................................................................... 8 5. Produtos biolgicos ................................................................ 15 6. Identificao e Teste de sensibilidade aos antibiticos ....... 20 7. Pesquisa de Bacilos de Koch ................................................. 23 8. Pesquisa de Parasitas nas fezes ............................................. 24 9. Caso clnico ............................................................................. 25 10.Concluso ............................................................................... 27

3

1.Cronograma de ActividadesSemana

ActividadesColheitas Explicao sobre o funcionamento do aparelho Vitek 2 Explicao sobre os meios de cultura utilizados para cada tipo de amostra Colorao de Gram Marcha de anlise dos vrios produtos biolgicos (Exsudados Genitais, Purulentos, Nasofaringeos, Expectoraes, Aspirados Traqueais, Aspirados Brnquicos, Liquido Asctico, Lquidos Pleurais, Fezes, Hemoculturas e Urina Assptica) Exame parasitolgico das fezes Colheitas Colorao de Gram Marcha de anlise dos vrios produtos biolgicos (Exsudados Genitais, Purulentos, Nasofaringeos, Expectoraes,

26 a 31 de Janeiro

2 a 6 de Fevereiro

Aspirados Traqueais, Aspirados Brnquicos, Lquidos Pleurais, Fezes, Hemoculturas e Urina Assptica) 4 Visualizao da execuo da colorao de Ziehl-Neelsen. Visualizao da descontaminao

de amostras para a pesquisa de Bacilos de Koch Colheitas Colorao de Gram Marcha de anlise dos vrios produtos biolgicos (Exsudados Genitais, Purulentos, 9 a 13 de Fevereiro Nasofaringeos, Expectoraes, Aspirados Traqueais, Aspirados Brnquicos, Liquido Asctico, Lquidos Pleurais, Fezes, Hemoculturas, Urina Assptica e Placentas) Exame parasitolgico das fezes

2.Colheitas2.1.1 SangueNo laboratrio de patologia clnica as colheitas de sangue so feitas com sistemas de vcuo, apenas e casos particulares se recorre ao mtodo tradicional da agulha e seringa. O sistema de vcuo consiste na aplicao dos tubos a colher, nunca cavidade especial, semelhante a uma seringa, e como os tubos tm vcuo, so os prprios a aspirar a quantidade de sangue necessrio. Este sistema evita mais a hemlise do que o sistema agulha, seringa, pois o sangue puxado a uma velocidade constante. Para a desinfeco da zona a picar, do brao do doente utiliza-se um spray a base de betadine. Os tubos utilizados para a colheita de sangue so: 5

Tubo que contem EDTA K3,como anticoagulante para determinao da hemoglobina glicada e hemograma; Tubo que contem Citrato de Sdio (na proporo de 1/5), como anticoagulante, para determinar a velocidade de sedimentao; Tubo contendo Citrato de Sdio (na proporo de 1/10), como anticoagulante para monitorizao da coagulao sangunea; Tubo sem qualquer tipo de anticoagulante para ensaios bioqumicos e imunolgicos.

Prova de tolerncia glicose Teste OSullivan: Esta prova realizada para despiste da Diabetes Mellitus em grvidas. A prova consiste em colher um tubo de sangue (sem anticoagulante) quando esta se encontra em jejum, de seguida a grvida beber uma soluo com 50g de sacarose em 200mL de gua, passados 60min volta a colher sangue. No caso de o valor da glicemia dar um valor superior a 140mg/dL, conveniente fazer a prova de tolerncia oral glicose. Prova de Tolerncia: No caso das grvidas a prova semelhante ao teste OSullivan, com a diferena de que a grvida aps fazer a colheita em jejum, ingere uma soluo de sacarose, desta vez com 100g de sacarose, e far nova colheita aos 60min, depois aos 120min e aos 180min. A grvida ter diabetes gestacional se: aos 0min o valor da glicemia for igual ou superior a 105mg/dL, aos 60min for igual ou superior a 190mg/dL, aos 120min for igual ou superior a 165mg/dL e aos 180min for igual ou superior a 145mg/dL. No caso de o doente ser uma pessoa que no esteja grvida, o procedimento semelhante, contudo o doente ir fazer a primeira colheita em jejum, de seguida ingere uma soluo contendo 75g de sacarose e far nova colheita passados 120min.

2.2 Fezes e urina6

Quando o produto para anlise so fezes ou urina, o mdico que prescreve a anlise instrui o doente para ele prprio fazer a colheita e entregar no laboratrio de patologia clnica. No caso de o produto ser urina, o mdico deve avisar o doente qual o tipo de urina necessria anlise, pois poder ser uma urina 24h em que o doente dever rejeitar a primeira urina da manh, recolhendo todas as outras para um recipiente, sem perder qualquer quantidade de urina, at primeira da manh do dia seguinte, inclusive. Poder ser tambm uma tipoII, que deve ser a primeira urina da manh, ou urina assptica para exame bacteriolgico, em que o doente deve desinfectar-se antes de fazer a colheita.

2.1.3 Outras amostrasQuando os produtos para anlise so exsudados, expectoraes, aspirados brnquicos ou outros, so colhidos nas enfermarias ou urgncias pelos mdicos ou enfermeiros e mandados posteriormente para o laboratrio.

3. Coloraes3.1 Colorao de GramA colorao de Gram utilizada para classificar microrganismos com base nas suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular. Podemos distinguir bactrias Gram- positivas e bactrias Gram- negativas com esta colorao, sendo que se a bactria for Gram- negativa adquire uma colorao rosa e se, pelo contrrio, for Gram- positiva adquire uma colorao roxa. Para se proceder a esta tcnica necessrio executar o esfregao na lmina, deixar secar ao ar, para posterior colorao. Os esfregaos no devem ser muito densos para facilitar a visualizao ao microscpio, por outro lado, se forem muito fracos, tambm dificulta a visualizao. No fim de as lminas secarem ao ar, so fixadas 2 a 3 vezes chama, seguindo-se colorao propriamente dita: 7

1- Cobre-se toda a lmina com Violeta de Cristal, durante dois minutos; 2- Escorre-se o corante, lava-se com Lugol e cobre-se a lmina com o mesmo deixando actuar durante dois minutos; 3- Passa-se por gua e depois descora-se com lcool-acetona (uma parte de acetona para partes de lcool); 4- Cobre-se toda a lmina com fucsina fenecolada diluda durante 60 segundos (95cc de gua destilada em 5cc de fucsina) 5- Passa-se por gua e deixa-se secar.

3.2 Colorao de Ziehl-NeelsenEsta colorao permite identificar bacilo lcool- cido resistentes, pois apenas as bactrias com estas caractersticas adquirem uma colorao vermelha em fundo azul. Fixao das amostras 1- Distribuir uma camada fina da amostra a examinar numa lmina; 2- Deixar secar; 3- Fixar com metanol (cobrir a lmina com lcool e esperar pelo menos 15minitos, at evaporao completa). Colorao Mtodo de Tan-Thian-Hok 1- Cobrir o esfregao com a soluo de Kinioun (BKK-F); 2- Deixar em contacto durante 3 minutos; 3- Lavar suavemente com gua; 4- Cobrir com a soluo de Gabett (BKG-F); 5- Deixar em contacto durante 1minuto; 6- Lavar suavemente com gua; 7- Secar.

4. Meios de Cultura4.1 Gelose de Sangue8

A Gelose de Sangue um meio de isolamento que se destina ao desenvolvimento de todos os microrganismos, normalmente encontrados nas amostras de origem clnica. um meio que permite a expresso de hemlise, sendo este um dos critrios de base de orientao para identificao bacteriana. Este meio constitudo por uma mistura de peptonas especialmente adaptadas cultura dos microrganismos exigentes. A Gelose de Sangue pode ser utilizada singularmente para o isolamento dos microrganismos correntes, ou enriquecida para isolamento de microrganismos mais exigentes. Leitura e interpretao de resultados: aps incubao, observar o crescimento bacteriano; pode-se observar a presena de alfa hemlise (colorao esverdeada a contornar a colnia) e beta hemlise (zona clara volta da colnia). Limites do teste: o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo, por isso possvel que algumas estirpes que tenham exigncias especficas no se desenvolvam. Os Streptococcus, Pneumococcus e a Listeria apresentam hemlise, alfa ou beta, caractersticas em 24h de incubao.

4.2 Gelose de Chocolate/ PolyvitexA Gelose de Chocolate um meio de isolamento destinado s particularmente ao crescimento das estirpes exigentes que pertencem aos gneros Neisseria, Haemophilus, Streptococcus pneumoniae. Este meio de cultura composto por uma base nutritiva enriquecida em factores X (hemina) e V (NAD) fornecidos pela hemoglobina e pelo Polyvitex. Leitura e interpretao dos resultados: aps incubao, observar o crescimento bacteriano; a identificao dos microrganismos isolados deve ser seguida de testes bioqumicos e imunolgicos.

9

Limites do teste: o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo, sendo possvel que algumas estirpes que tenham exigncias especficas no se desenvolvam; recomendado usar esta gelose com meios complementares.

4.3 Gelose CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient)A Gelose CLED recomendada para o isolamento de microrganismos urinrios, permitindo tambm diferenciar os germes que fermentam lactose dos que no fermentam. Neste meio de cultura os microrganismos lactose positivos originam colnias amarelas-plidas e amarelas por acidificao do meio e os microrganismos no fermentadores da lactose originam colnias verdes, azuis ou incolores. A composio deste meio permite limitar a invaso da Gelose pelos Proteus, pois inibe o seu movimento. Leitura e interpretao de resultados: aps incubao observar o crescimento bacteriano e o aspecto das colnias (colnias lactose + so amarelas plidas e amarelas, colnias lactose so verdes, azuis ou incolores); a identificao dos microrganismos isolados deve ser seguida de testes bioqumicos ou imunolgicos. Limites do teste: o tempo de incubao superior a 24h pode levar a uma realcalinizao do meio que modifica a colorao das colnias; o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo, por isso pode acontecer que certas estirpes que tenham exigncias especficas no se desenvolvam.

4.4 Caldo Selenito FO Caldo Selenito F um meio lquido, destinado ao crescimento das Salmonella a partir das fezes.

10

A composio deste meio favorece o crescimento das Salmonella, a partir de uma flora polimicrobiana. Aps a etapa de enriquecimento, o Caldo Selenito F deve ser repicado para meios destinados deteco das Salmonella. Limites do teste: o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo, sendo possvel que certas estirpes de Salmonella, que tenham exigncias especficas no se desenvolvam.

4.5 Gelose SSA Gelose SS um meio de isolamento selectivo e diferencial, destinado pesquisa das espcies de Salmonella e Shigella a partir de fezes. Este um meio de cultura que permite evidenciar colnias que fermentam a lactose e que reduzem o tiosulfato (produo de H2S). Neste meio os microrganismos que fermentam a lactose originam colnias rosas, os que no fermentam a lactose originam colnias incolores. Os microrganismos que produzem H2S originam colnias com centro negro. A presena de colnias incolores ou pouco coloridas com ou sem centro negro representa uma forte presuno de Salmonella ou de Shigella. A inibio dos germes Gram +, obtida por uma mistura de sais biliares e de corantes. A pesquisa de Salmonella e Shigella nas fezes, pode ser feita semeando a Gelose SS directamente a partir das fezes e aps enriquecimento (com o meio Selenito); seguidamente incubar na estufa a 37C em aerobiose. Leitura e interpretao de resultados: aps incubao, observar o crescimento bacteriano; as colnias de Salmonella so incolores ou amarelas plidas com ou sem centro negro; as colnias de Shigella so incolores, rosa plidas ou alaranjadas sem centro negro; a identificao das colnias caractersticas deve ser complementada por testes bioqumicos e imunolgicos. Limites do teste: algumas Salmonella arizonae e algumas Shigella sonnei podem originar colnias no caractersticas (espcies que podem fermentar a 11

lactose); as enterobactrias podem apresentar colnias caractersticas, sendo necessrio efectuar uma identificao completa por testes complementares; o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo, possvel que certas estirpes de Salmonella ou de Shigella tendo exigncias especficas no se desenvolvam.

4.5 Gelose Hektoen (HEKT)A Gelose Hektoen destinada ao isolamento selectivo e de diferenciao que se destina deteco das Salmonella e Shigella a partir de amostras de fezes (nota: este meio pode ser utilizado para amostras de origem alimentar). Os microrganismos que fermentam um dos trs acares contidos neste meio do colnias verdes a azuis-esverdeadas. Por outro lado os microrganismos que produzem H2S originam colnias com centro negro. A presena de colnias verdes e azuis-esverdeadas com ou sem centro negro (colnias caractersticas) significa grande presuno de Salmonella ou de Shigella. A inibio de microrganismos Gram positivos obtida por uma mistura de sais biliares e de corantes. Este um meio que pode ser utilizado em microbiologia clnica e alimentar. Leitura e interpretao de resultados: aps a incubao, observar o crescimento bacteriano; anotar a presena de colnias caractersticas (as colnias de Salmonella so verdes ou azuis esverdeadas com ou sem centro negro, as colnias de Shigella so verdes a azuis-esverdeadas sem centro negro; porm, a identificao de colnias caractersticas, deve ser seguia de testes bioqumicos ou mesmo imunolgicos. Limites do teste: algumas Salmonella arizone e algumas Shigella sonnei podem originar colnias no caractersticas (espcies que podem fermentar a lactose); as enterobactrias podem apresentar colnias caractersticas, sendo necessrio efectuar uma identificao mais completa com testes

complementares; o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo ( possvel que algumas estirpes de Salmonella ou de Shigella no se desenvolvam.

12

4.6 Gelose MacConkeyA Gelose MacConkey com cristal violeta, um meio de isolamento selectivo e diferencial para a pesquisa de enterobactrias, a partir das colheitas de origem diversa. Este meio de cultura, com o cristal violeta permite evidenciar a fermentao da lactose pela viragem do vermelho neutro. Os microrganismos que fermentam a lactose originam colnias rosas ou vermelhas. Por outro lado os microrganismos que no fermentam a lactose, originam colnias incolores ou ligeiramente bege. A selectividade em relao s bactrias Gram positivas proporcionada pelos sais biliares e o cristal violeta. Leitura e interpretao de resultados: aps incubao, observar o crescimento bacteriano e o aspecto das colnias (colnias lactose positiva - rosa ou vermelhas; colnias lactose negativa incolores ou ligeiramente bege); a identificao dos microrganismos isolados deve ser seguida de testes bioqumicos ou imunolgicos.

Limites do teste: o desenvolvimento depende das exigncias especficas de cada microrganismo, por isso possvel que algumas estirpes que tenham exigncias especficas no se desenvolvam.

4.7 Gelose Mueller Hinton 2A Gelose Mueller Hinton 2 pode ser usada para a realizao de antibiogramas por difuso. A composio deste meio permite o crescimento das bactrias no exigentes encontradas em patologia, garantindo sempre um mnimo de interferncia dos componentes da frmula no resultado do antibiograma.

13

A concentrao da Gelose Mueller Hinton 2, em ies bivalentes ajustada para assegurar uma preciso mais correcta na determinao da sensibilidade das Pseudomonas aos aminosdos e tetraciclinas. O baixo teor deste meio em timina-timidina (elementos inibidores da actividade das sulfamidas) diminui os fenmenos de crescimento volta destes discos e permite uma determinao precisa dos dimetros de inibio. Leitura e interpretao de resultados: aps incubao, medir o dimetro de inibio do crescimento volta do disco de antibitico; os valores obtidos permitem definir a sensibilidade dos antibiticos testados; para interpretao, deve-se consultar os procedimentos e normas em vigor no laboratrio. Limites do teste: a Gelose MH2 um meio pouco nutritivo que permite padronizar as zonas de inibio obtidas volta dos discos de antibiticos, por isso algumas estirpes exigentes no se desenvolvem neste meio.

4.8 Meio ChromagarO meio Chromagar um meio cromognico de cultivo, fundamentado na cor desenvolvida pelas colnias atravs de indicadores de pH e fermentao de compostos especficos ou substratos cromognicos. So utilizados para diferenciar Candida albicans e outras leveduras de interesse clnico. Este meio de cultura usado para isolar e identificar presuntivamente Candida albicans, Candida krusei e Candida tropicalis, atravs da cor que apresenta cada espcie. O meio Chromagar baseia-se na utilizao do substrato - glicosaminidase e diferencia as leveduras de acordo com a morfologia e a cor das colnias. A utilizao deste meio facilita a deteco e a identificao destas leveduras e, tambm, fornece resultados presuntivos em menor tempo que os obtidos pelos mtodos j padronizados.

14

Neste meio as C. albicans apresentam a colorao verde-escura brilhante prpria desta espcie no meio cromognico; as C. tropicalis apresentam a colorao azul caracterstica desta espcie; as C. krusei apresentam colorao rosa rugosa.

4.9Meio lquido Brain-HeartO Meio lquido Brain-Heart no selectivo, mas um meio de enriquecimento, que permite o crescimento de microrganismos mais exigentes. A adio de cateteres a este meio, permite que possveis bactrias contidas no seu interior sejam libertas para o lquido, de modo a obter-se uma amostra significativa dos microrganismos existente no cateter, havendo tambm uma maior segurana nos negativos, ou seja, usando apenas uma Gelose comum (como GS), a probabilidade de termos falsos negativos superior.

4.10 Frascos de HemoculturaExistem trs tipos de frascos de Hemocultura, os amarelos para bebs ou crianas, que contm carvo activado para inibir possveis antibiticos que tenham sido administrados. Existem ainda os frascos verdes e os laranja, ambos para adultos, sendo que os verdes contm um meio propicio ao crescimento de bactrias aerbias e os laranja contm um meio propicio ao crescimento de bactrias anaerbias.

5. Produtos biolgicos

5.1 SangueNo caso do produto biolgico ser sangue coloca-se a amostra em frascos de hemocultura e de seguida vo a incubar num aparelho prprio. 15

O aparelho tem como princpio de funcionamento e de monitorizao contnua, uma tecnologia calorimtrica. O fundo do frasco contm uma membrana de silicone impregnada com uma tinta que sensvel a pequenas alteraes de CO2 dissolvido, porque os microrganismos que crescem no meio produzem CO2. Antes de se colocar o produto biolgico no frasco de hemocultura, este apresenta um fundo cinzentoescuro, depois de se colocar o produto biolgico no frasco da hemocultura, e no respectivo aparelho (Bact/Alert) a incubar, quando a hemocultura positiva, o fundo fica mais claro e amarelado. Quando negativa o fundo no muda de cor. A mudana de cor que nos indica a positividade reconhecida por um sensor, e quando estamos perante uma hemocultura positiva, o aparelho muda a cor do fundo do seu monitor (passa de verde a amarelo), para que se possa retirar a hemocultura positiva. As hemoculturas positivas repicam-se para uma Gelose de Sangue, para se observar o crescimento microbiano e isolamento do microrganismo, para posterior identificao, tendo o cuidado de antes de inserir a agulha no frasco de hemocultura, deve-se homogeneizar muito bem (para garantir que estamos a apanhar o microrganismos responsvel) e desinfectar a tampa com lcool (para evitar contaminaes). No fim de repicada, a Gelose de Sangue vai a incubar a 37C, numa atmosfera de aerobiose durante cerca de 24 horas. No caso das hemoculturas peditricas, as positivas tambm se repicam para Gelose de Sangue, mas nesta altura fazem-se dois esfregaos em lminas para colorao de Gram (apenas se cora uma, a outra fica de reserva, caso a primeira fique ilegvel).

5.3 Expectorao, aspirado brnquico e aspirado traquealNestes trs casos faz-se uma sementeira do produto biolgico em gelose de sangue e em gelose de chocolate e coloca-se a incubar 24h na estufa a 37C. Faz-se tambm um esfregao para colorao de Gram. No caso de o produto ser uma expectorao, como normalmente bastante densa recorre-se tcnica do esmagamento para fazer o esfregao, que consiste em colocar um

16

bocado do produto numa lmina e esmagar com outra de modo a ficar uma camada menos densa. Se o produto for um aspirado normalmente no to denso como a expectorao, logo por vezes no se recorre tcnica do esmagamento. O mdico pode pedir ainda para fazermos pesquisa de Bacilo de Koch (BK), logo necessrio fazermos outro esfregao para se proceder colorao de ZiehlNeelsen. necessrio tambm identificar a amostra e guarda-la de modo a prosseguir o resto do procedimento para pesquisa de BK.

5.4 UrinaNo Laboratrio de Microbiologia, no se trabalham as urinas directamente, mas sim os uricultos. Os uricultos so sistemas modernos de processamento das urinas, que apresentam um meio de cultura difsico (de um lado Meio Cled e do outro MacConkey). Insere-se o uriculto no frasco da urina e os meios absorvem-na (no entanto, este processo no feito no Laboratrio de Microbiologia, na urgncia ou nas prprias enfermarias). Depois vo a incubar que 37C, numa atmosfera de aerobiose durante 24 horas. A maioria das bactrias responsveis por infeces urinrias so as Enterobacteriaceae, ou seja, so Gram negativas, por isso crescem no Meio MacConkey, que selectivo para estas. No Meio Cled, crescem tanto Gram negativas, como Gram positivas e at fungos, ou seja, quando no crescem microrganismos no Meio MacConkey, caso haja uma infeco, encontram-se os microrganismos no Meio Cled. Ao fim de 24h de incubao dos uricultos, e antes da identificao, repica-se (do Meio MacConkey quando h crescimento, quando no h repica-se do Meio Cled) para uma Gelose Cled, para se continuar a viabilizar o microrganismo. Depois da sementeira a Gelose Cled vai a incubar a 37C, numa atmosfera de aerobiose, durante 24 horas. 17

5.6 FezesCom uma zaragatoa retirar um pouco da amostra e inocular em meio lquido de selenito, semear tambm em gelose SS e gelose Hektoen. De seguida faz-se um esfregao para colorao de Gram. As placas de SS e Hektoen, e o meio de Selenito, vo estufa a incubar a 37C, numa atmosfera de aerobiose durante 24h.

5.7 Zaragatoas genitaisAs zaragatoas genitais normalmente so feitas para pesquisa de Streptococcus beta hemoltico em grvidas. As zaragatoas genitais consistem numa zaragatoa vaginal e numa zaragatoa rectal e cada uma destas semeada apenas em gelose de sangue, pois o agente bacteriano em estudo tem um bom crescimento nesta gelose. As sementeiras vo a incubar em aerobiose 24h na estufa a 37C. No se efectua esfregao.

5.8 Zaragatoas nasofaringeasTal como as zaragatoas genitais, estas zaragatoas s so semeadas em gelose de sangue, pois tm como fim o despiste de Staphylococcus aureus metilcilina resistente. Tambm no se efectua esfregao nestes casos. As sementeiras vo a incubar em aerobiose 24h na estufa a 37C.

5.9 Zaragatoas de pus

18

Estas zaragatoas so semeadas em gelose de sangue e gelose de chocolate e efectua-se um esfregao para colorao de Gram. As sementeiras vo a incubar 24h na estufa a 37C, em aerobiose ou anaerobiose dependendo da provenincia do pus.

5.10 PlacentasEste produto biolgico e normalmente utilizado na pesquisa de Listeria em caso de morte fetal ou aborto espontneo. Para semear este produto biolgico utiliza-se gelose de sangue e gelose de chocolate e no se efectua esfregao. As sementeiras vo a incubar em aerobiose 24h na estufa a 37C. A amostra deve ser repicada 15 dias depois de ser semeada.

5.11 Liquido Asctico, Liquido Pleural e LCREstes produtos biolgicos podem chegar ao laboratrio em garrafas de hemocultura, sendo que desta forma so tratados da mesma forma das hemoculturas. Podem tambm chegar em frascos esterilizados e nestes casos so semeados em gelose de sangue e gelose de chocolate e faz-se ainda esfregao para colorao de Gram. As sementeiras vo a incubar a 37C, em aerobiose durante 24h. Estas amostras podem tambm trazer pedido de pesquisa de BK, ento desta forma dever fazer-se mais um esfregao para colorao de Ziehl-Neelsen e guardar a amostra no frigorfico para proceder a tratamento da mesma para a pesquisa de BK.

19

6. Identificao e Teste de sensibilidade aos antibiticosDepois de 24 horas de incubao, observa-se presuntivamente as colnias tendo em conta: se so Gram positivas ou negativas (tambm tendo em conta as coloraes de Gram); o tamanho (colnias grandes ou pequenas exemplo: os Streptococcus normalmente so menores que os Staphylococcus); o aspecto (mucide, baas, translcidas, brilhantes exemplo: as estirpes mucides so normalmente capsuladas); se apresentam ou no swarming (exemplo: o Proteus noutro meio que no seja o Cled costuma apresentar swarming); se em Gelose de Sangue fazem alfa ou beta hemlise (exemplo: os Streptococcus podem apresentar alfa ou beta hemlise em Gelose de Sangue); o odor que as colnias apresentam (exemplo: o Haemophilus normalmente tem um odor semelhante a mofo). certo que todas estas caractersticas so em determinado meio, pois as bactrias apresentam caractersticas diferentes consoante o meio em que se desenvolvem. Aps estas e outras caractersticas, que podem ser mais ou menos subjectivas, seguem os testes da oxidase, catalase e coagulase (estes reagentes so guardados do frigorfico, mas algum tempo antes das provas devem estar temperatura ambiente). Usa-se o reagente da catalase (perxido de hidrognio) para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus, pois os primeiros so sempre catalase positiva, e os ltimos so catalase negativos. Para realizar este teste coloca-se uma gota do reagente da catalase, numa lmina e com uma ansa de plstico escolhe-se a colnia e mistura-se na gota do reagente. O teste positivo quando comea a visualizar-se a libertao das bolhas de gs. Para a prova da coagulase, usa-se o reagente da coagulase da bioMrieux. No papel adequado coloca-se uma gota do reagente da coagulase e selecciona-se a colnia com uma ansa de plstico e mistura-se na gota do reagente. O teste positivo quando se observa aglutinao entre o reagente e a colnia bacteriana. O Staphylococcus aureos uma espcie caracterstica de coagulase positiva. A Pseudomonas caracteriza-se por ser oxidase positiva, enquanto as Enterobacteriacceae so oxidase negativas. Para este teste coloca-se uma gota do reagente de oxidase, tambm da bioMrieux, num pedao de papel de filtro, com 20

uma anca de plstico selecciona-se a colnia e mistura-se no local da gota. A positividade do teste faz mudar a cor para rosa ou roxo. Quando se suspeita de Streptococcus pneunoniae, coloca-se um disco de Optoquina, pois esta substncia vai inibir o crescimento do Streptococcus pneumoniae, provocando um halo de inibio volta do disco de Optoquina. Quando em Gelose de Chocolate, se suspeita de Haemophilus, faz-se o teste dos factores, ou seja, repica-se para o meio Mueller-Hinton 2 e coloca-se espaadamente os factores X, V e XV, vai a incubar a 37C, numa atmosfera de aerobiose durante 24 horas. A partir do crescimento volta dos factores, chegamos espcie, no caso do Haemophilus influenzae, como precisa do factor X e do factor V, apenas cresce no local onde se encontram os dois. Depois da identificao presuntiva prossegue-se identificao e realizao dos antibiogramas (TSA) pelo mtodo automatizado VITEK 2, numa incubadora com leitura.

6.1 Vitek 2Antes de proceder identificao, ou TSA, temos que saber se as bactrias so Gram positivas ou Gram negativas. Dentro das Gram positivas saber se so Staphylococcus ou Streptococcus; e dentro das Gram negativas, saber se so Pseudomonas. Aps esta distino, seleccionam-se as cartas do VITEK 2: GN carta de identificao das bactrias Gram negativas; AST- N22: carta de TSA para Pseudomonas spp; AST-N60: carta de TSA Gram negativas; GP carta de identificao das bactrias Gram positivas; AST-P534: carta de TSA de Streptococcus; AST-P549: carta de TSA de Staphylococcus spp e Enterococcus spp

Para fazer as identificaes e os TSA, coloca-se no suporte as cartas os tubos para as diluies (com 3mL de soluo salina estril) e na posio 1 coloca-se por exemplo a carta de identificao de um Gram positivo (a carta tem que estar identificada com os

21

nmeros bem marcados, no stios adequados), e na posio 2 a carta de TSA correspondente (a carta tem que estar identificada com os nmeros bem marcados, no stios adequados); na posio 3 a carta de identificao de outro Gram positivo, e na posio 4 a carta de TSA correspondente; e assim sucessivamente. Faz-se um inoculo no tubo correspondente carta de identificao da bactria. Estando o inoculo convenientemente feito, homogeneza-se muito bem o inoculo para a identificao e transfere-se 200L (no caso das Gram positivas, se for Gram negativas transfere-se 50L) para o tubo correspondente ao TSA desse microrganismo. Introduzir no local apropriado os pequenos tubos de plstico de transferncia, que vo permitir a passagem do inoculo para o interior da carta. As cartas so seladas automaticamente, mas primeiro, o inoculo padronizado e as cartas contendo os antibiticos diludos so colocadas primeiramente no mdulo de preenchimento do aparelho VITEK 2. Uma vez que o inoculo tenha sido totalmente transferido para a carta por suco a vcuo por meio do tubo plstico, o mesmo selado no mdulo. Depois de a carta ter sido selada, ela verificada para um preenchimento correcto, e ento disposta na incubadora de leitura. Os resultados so determinados por deteco electro-ptica do crescimento microbiano dentro dos poos das cartas de teste. As Concentraes Mnimas Inibitrias (CMI) so determinadas por anlise estatstica das mdias de crescimento bacteriano, na presena de agentes antimicrobianos.

6.2 TSA manualExistem microrganismos que o VITEK 2 no identifica, ou ento o laboratrio (por razes econmicas ou porque no considera de grande importncia) no adquire essas cartas de identificao, ento tem que se identificar e fazer o TSA manual (no mini API), exemplos disso foram o ATB STREP 5, o ATB HAEMO. Ambas as galerias permitem determinar a sensibilidade dos Streptococcus (no primeiro caso) e Haemophillus (no segundo caso), aos antibiticos em meio semi-slido, em condies muito prximas das tcnicas de referncia de diluio em Gelose ou de microdiluio. 22

As galerias contm 16 pares de cpulas. O primeiro par, sem antibitico serve de padro de crescimento. Os 10 seguintes contm antibiticos com uma ou duas concentraes, o ltimo par ou os ltimos cinco (dependendo da galeria) no so utilizados. A bactria a analisar colocada em suspenso e transferida para o meio de cultura e inoculada na galeria. Aps incubao, a leitura do crescimento feita com o sistema mini API. O resultado obtido permite classificar a estirpe como: Sensvel, Intermdia ou Resistente. A leitura automtica na galeria.

7. Pesquisa de Bacilos de Koch

A pesquisa de bacilos lcool- cido resistentes faz-se geralmente em caso de suspeita de infeco por Mycobacterium. Esta pesquisa consiste na visualizao directa do produto biolgico e descontaminao da amostra, seguida de sementeira.

Visualizao directa da amostra:Faz-se um esfregao da amostra e de seguida procede-se colorao de ZiehlNeelsen.

Descontaminao das amostras:Para este fim, utiliza-se o kit BBL MycoPrep. As maiorias das amostras clnicas com suspeita de Mycobacterium esto contaminadas com flora normal de crescimento rpido. Para maximizar a produo micobacteriana, as amostras contaminadas, exigem um tratamento que contenha um processo de digesto e de descontaminao. Costuma usar-se o N-acetil-L-cistenahidrxido de sdio (NALC-NaOH), como agente de descontaminao. O NaOH, pode ser utilizado como digestivo e como descontaminante.

23

O NALC tambm um agente mucoltico. No frasco de reagente, o NALC combinado com NaOH de 2%. Quando o reagente diludo com um volume de igual da amostra, proporciona uma digesto e descontaminao eficazes com concentrao final de NaOH de 1%, que menos txico para as micobactrias. No Kit vm embalagens de tampo fosfato, com pH 6,8, para serem utilizadas na lavagem da amostra digerida e descontaminada. O tampo fosfato, diminui a actividade da soluo de NALC-NaOH e baixa a gravidade especfica da amostra antes de as micobactrias serem detectadas por meio de centrifugao. Este tampo preparado previamente e guardado no frigorfico. O processo de descontaminao tem que ser sempre feita na cmara de fluxo laminar e deve-se utilizar sempre luvas. Procedimento: 1- Utilizando um tubo de centrfuga de 50mL com tampa, adicionar quantidades iguais de amostra e de soluo de NALC-NaOH; 2- Tapar o tubo, e agitar no vrtex at a amostra estar liquefeita; 3- Deixar temperatura ambiente, cerca de 15 minutos; 4- Adicionar o tampo at marca dos 50mL, agitar e centrifugar 15 minutos a 3000 rpm; 5- Decantar com cuidado o sobrenadante; 6- Adicionar uma pequena quantidade de tampo (2mL) e voltar a suspender o sedimento. Utilizar a suspenso para a preparao de esfregaos e para o desempenho de procedimentos micobacteriolgicos.

8. Pesquisa de Parasitas nas fezesPara a pesquisa de parasitas nas fezes, faz-se um teste coprolgico, baseado no mtodo de concentrao por sedimentao em formalina-ter-acetato. 1- No tubo de amostra com colector e soluo formalina a 10% adiciona-se com uma zaragatoa a amostra; 2- Tapa-se o tubo e agita-se muito bem no vrtex; 3- Adiciona-se 1,25mL de acetato de etilo (para libertar as gorduras fecais); 24

4- Agita-se; 5- Deixar 5 minutos em repouso; 6- Centrifugar a cerca de 1200 rpm durante 10 minutos; 7- Aspira-se, com uma pipeta de Pasteur de plstico, as gorduras fecais e o sobrenadante; 8- Guarda-se o sedimento ao qual se adicionam duas ou trs gotas de soro fisiolgico (ficando pronto para visualizao ao microscpio).

9. Caso clnico

Chegou ao laboratrio de microbiologia, proveniente da Medicina I, um a zaragatoa de um pus de um p diabtico de um doente do sexo masculino, com 76 anos de idade. Na requisio que acompanhava o produto biolgico, o mdico pedia um exame bacteriolgico do mesmo, com eventual TSA. Para pesquisar a existncia de eventuais bactrias no pus do p do doente procedeu-se da seguinte forma: 1. Fez-se dois esfregaos da amostra para proceder a colorao de Gram e semeouse a amostra em gelose de sangue e em gelose de chocolate; 2. Colocaram-se as sementeiras na estufa a 37C; 3. Fez-se a colorao de uma lmina e guardou-se a outra para alguma eventualidade; 4. Fez-se a observao da lmina; 5. No dia seguinte amostra ter sido recebida e semeada, observou-se que tinha havido crescimento bacteriano nas duas placas, sendo que existiam colnias Gram positivas e colnias Gram negativas; 6. Isolou-se numa placa as colnias Gram positivas e noutra as Gram negativas;

25

7. Procedeu-se a identificao de cada tipo de colnia no aparelho Vitek 2 e fez-se o respectivo TSA para cada bactria tambm no aparelho; 8. No terceiro dia observaram-se os resultados da identificao e TSA feitos no Vitek 2, que nos permitiram concluir que a amostra continha Enterococcus faecalis e Escherichia coli E observamos ainda o crescimento isolado de ambas as bactrias nas placas repicadas.

Resultados: Gram: Frequentes bacilos Gram negativos Incontveis cocos Gram positivos Cultura de aerbios: Positiva

Antibitico

Enterococcus faecalis

Escherichia coli

Ampicilina Penicilina G Amoxicilina/ AC Ampicilina/ sulbactam Piperacilina/ Tazobactam Cefuroximina Cefuroximina Axe Cefotaxima Ceftazidima Ertapenem Imipenem Meropenem

Sensvel Sensvel

Resistente

Resistente Sensvel

Intermdio

Resistente Resistente

Resistente Resistente

Resistente Resistente Sensvel Sensvel Sensvel Sensvel

26

Teicoplanina Vancomicina Amikacina Gentamicina Gentamicina HC Tobramicina Eritromicina Clindamicina Nitrofurantoina Linizolid Ciprofloxacina Levofloxacina Cotrimoxazol Estreptomicina HC Kanamicina HC

Sensvel Sensvel Intermdio Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Sensvel Sensvel Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Resistente Sensvel Sensvel

Com os resultados obtidos pode concluir-se que o doente est infectado com duas bactrias multirresistentes, sendo que desta forma ter bastantes dificuldades em curar a infeco, o que pode levar mesmo amputao do p do doente.

10.Concluso

O meu estgio na seco de Laboratrio de Patologia Clnica do Hospital de Santo Andr foi bastante proveitoso, na medida em que pode evoluir, desenvolver a minha autonomia, ter conhecimento de realidades que at aqui desconhecia e poder ter contacto com todo o tipo de produtos biolgicos, todo o tipo de material e aparelhos para trabalhar estes produtos.

27

Na parte das colheitas o meu estgio tambm foi muito proveitoso, na medida em me permitiu ganhar uma maior experiencia nesta rea, visto que nas aulas s tnhamos feito colheitas trs vezes. Aprendi tambm a colher com um sistema diferente do que tinha utilizado nas aulas. Os objectivos propostos para este estgio foram todos cumpridos. Em relao aos Tcnicos do Laboratrio de Patologia Clnica do Hospital de Santo Andr, todos me ajudaram quando necessrio, principalmente o Tcnico Orlando Figueira que foi o meu monitor na seco de Microbiologia.

28