MODULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE ......2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Thalita Beatriz...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Thalita Beatriz Carrara da Encarnação

MODULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE

GALACTOMANANO POR SUA PRÓPRIA

ESTRUTURA FINA

São Paulo

2012

2

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Thalita Beatriz Carrara da Encarnação

MODULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE

GALACTOMANANO POR SUA PRÓPRIA ESTRUTURA FINA

MODULATION OF ENZYMATIC DEGRADATION OF

GALACTOMANNAN BY ITS FINE STRUCTURE

Orientador: Prof. Dr. Marcos Silveira Buckeridge

São Paulo

2012

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Mestre em

Ciências Biológicas, na área de Botânica.

3

FICHA CATALOGRÁFICA

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Encarnação, Thalita Beatriz Carrara

Modulação da degradação enzimática de galactomanano por sua própria

estrutura.

Orientador: Marcos Silveira Buckeridge

Dissertação (Mestrado) – Instituto de Biociências da Universidade de São

Paulo. Departamento de Botânica. 211p.

1. Galactomanano 2. α-galactosidase 3. Estrutura fina de polissacarídeos

4. Mobilização de reserva 5. Parede celular 6. Purificação enzimática

7. Sesbania virgata (CAV.) Pers. Universidade de São Paulo. Instituto de

Biociências. Departamento de Botânica.

4

Comissão Julgadora

_______________________ ______________________

Prof(a). Dr(a) Prof(a). Dr(a)

_____________________________

Prof. Dr. Marcos Silveira Buckeridge

Orientador

5

Aos meus pais, Milton e Sandra, por todo amor, carinho, dedicação e muito

apoio em todos os momentos da minha vida;

Ao meu anjo Augusto por existir em minha vida.

Dedico

6

" Voici mon secret. Il est très simple: on ne voit bien qu'avec le coeur.

L'essentiel est invisible pour les yeux."

Le Petit Prince, Antoine de Saint-Exupéry (1946).

7

Agradecimentos

Ao Instituto de Biociências da USP, principalmente ao Departamento de

Botânica;

À CAPES pela bolsa de estudo concedida;

À todo o corpo docente e aos funcionários do Departamento de Botânica por

tornarem o ambiente de trabalho muito favorável ao desenvolvimento da pós-

graduação;

Ao Professor Dr. Marcos Silveira Buckeridge pelo acolhimento em seu grupo de

pesquisa, sua orientação durante todo o desenvolvimento do Mestrado e sua

amizade;

À Dra. Sonia Dietrich agradeço pelo tempo que estive ao seu lado, aprendendo

com o seu conhecimento, me inspirando para desenvolver este trabalho, que

faz parte do seu legado, e principalmente me inspirando a ser Pesquisadora,

como ela simplesmente foi e sempre será (In memoriam);

À Professora Dra. Magdalena Rossi pela ajuda e paciência nas análises

moleculares presentes no trabalho;

Ao Professor Dr. Luis Netto e a toda equipe pela abertura do laboratório à

realização da purificação da α-galactosidase, em especial, à técnica Simone

Vidigal pela paciência, ajuda no uso do FPLC e respostas rápidas aos e-mails

de reserva do equipamento sempre feito de última hora;

À Pesquisadora Adriana Franco Paes Leme e as técnicas Romênia e Bianca

pela abertura do Laboratório de Espectrometria de Massas para a realização

do sequenciamento interno da α-galactosidase de Sesbania virgata e a grande

ajuda nesta empreitada!

8

Ao Clóvis Oliveira da Silva ou C1 ou Clovitos, como eu o chamava todo dia de

manhã, por ter aparecido do céu e me ensinado e me acompanhado durante

toda a parte experimental do meu projeto. Saiba Clovitos que sem você talvez

não tivesse chego até a metade, meu super obrigado!

À todas as meninas do Laboratório: Amanda, Dri Grandis, Bru, Dé, Egleezita,

Vivi, Gi, Cris, Eveline, por toda a ajuda em todos os quesitos, por estarem

comigo e confiarem em mim mesmo quando nem eu acreditava mais em mim!

Obrigada por absolutamente tudo!!! Aos meninos do lab também, não que eles

sejam muitos, Ivan, Maraba, Luis, Vinícius pelas ótimas risadas que demos

juntos, pelos desabafos, pelo dia-a-dia;

Ao Dr. Eduardo Aratangy, à minha terapeuta Vanessa Batista e à minha

nutricionista Fernanda Psicolaro, anjos que após muita luta apareceram em

minha vida e me ajudaram a sair da anorexia. A vocês nada do que disser será

suficiente, então só direi o meu muito obrigada por TUDO!

A todos da Academia Arena, principalmente ao Prof. José Ricardo, que

cuidaram de mim desde o primeiro dia, pegavam no meu pé e me ajudaram a

ser a Thalita novamente!

À você, Augusto, amor da minha vida, por estar ao meu lado em absolutamente

todos os momentos, por me fazer feliz, sonhar, por me fazer uma pessoa

melhor a cada dia, por me amar incondicionalmente! Obrigada pela ajuda direta

e indireta neste trabalho, obrigada por todos dias nestes últimos 7 anos e

alguns meses!

Aos meus pais, Sandra e Milton, por todo investimento em mim, por

acreditarem e me apoiarem em todas as decisões, por me amarem e estarem

absolutamente sempre ao meu lado! Saibam que este Mestrado é muito mais

de vocês do que meu, sem cada ensinamento, apoio, carinho, recebido de

vocês nada disso teria sido possível. Muito Obrigada por tudo. Amo vocês!

9

Sumário

ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................................. 12

ÍNDICE DE TABELAS .............................................................................................................................. 22

RESUMO .............................................................................................................................................. 23

ABSTRACT ............................................................................................................................................ 26

INTRODUÇÃO....................................................................................................................................... 28

1.1. SEMENTES ........................................................................................................................ 28 1.2. GERMINAÇÃO E PÓS-GERMINAÇÃO........................................................................................ 29 1.3. RESERVAS DE SEMENTES ...................................................................................................... 30 1.4. PAREDE CELULAR DE RESERVA DE SEMENTES ............................................................................. 31 1.5. POLISSACARÍDEOS DE RESERVA DE PAREDE CELULAR ................................................................... 32 1.5.1. (ARABINO)GALACTANOS ..................................................................................................... 33 1.5.2. XILOGLUCANOS ................................................................................................................. 35 1.5.3. MANANOS ....................................................................................................................... 38 1.6. GALACTOMANANOS ........................................................................................................... 39 1.6.1. ESTRUTURA QUÍMICA DOS GALACTOMANANOS ......................................................................... 40 1.6.2. PROPRIEDADES DOS GALACTOMANANOS ................................................................................. 41 1.6.3. MOBILIZAÇÃO DOS GALACTOMANANOS .................................................................................. 42 1.6.4. REGULAÇÃO DA MOBILIZAÇÃO DE RESERVA DE GALACTOMANANO ............................................... 46 1.7. CARACTERIZAÇÃO DE Α-GALACTOSIDASE .................................................................................. 47 1.8. CARACTERIZAÇÃO DA ENDO-Β-MANANASE ............................................................................... 49 1.9. ESPÉCIE SESBANIA VIRGATA .................................................................................................. 51 1.9.1. JUSTIFICATIVA PARA O USO DA ESPÉCIE.................................................................................... 51

OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 53

CAPÍTULO 1 .......................................................................................................................................... 55

SEMIPURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DA ENZIMA Α-GALACTOSIDASE PRESENTE EM SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. .................................................................................. 55

I. RESUMO ..................................................................................................................................... 56

II. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 58

III. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................... 61

3.1. COLETA DO MATERIAL VEGETAL ............................................................................................ 61 3.2. DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE GERMINAÇÃO E PICO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA ..................... 61 3.2.1. GERMINAÇÃO DAS SEMENTES QUIESCENTES ............................................................................. 62 3.2.2. DETERMINAÇÃO DO PESO FRESCO DO ENDOSPERMA E TEGUMENTO ............................................... 62 3.2.3. EXTRAÇÃO PROTÉICA, DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS, DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

DA Α-GALACTOSIDASE E ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) .............................................. 63 3.3. PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE DE SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ..................... 65 3.3.1. INCUBAÇÃO DAS SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA PARA PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE .............. 65 3.3.2. CARACTERIZAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA E PH ÓTIMO DA Α-GALACTOSIDASE EM EXTRATO BRUTO

ENZIMÁTICO 66 3.3.2.1. TEMPERATURA ÓTIMA ........................................................................................................ 66 3.3.2.2. PH ÓTIMO ....................................................................................................................... 66 3.3.3. PRIMEIRA ETAPA DE PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE: PRECIPITAÇÃO COM SULFATO DE AMÔNIO ... 66 3.3.4. SEGUNDA ETAPA DE PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE: CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA COM

COLUNA ANIÔNICA (MONO-Q) .............................................................................................................. 68 3.3.5. TERCEIRA ETAPA DE PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE: CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRAÇÃO

(SUPEROSE) 69 3.3.6. TABELA DE PURIFICAÇÃO ..................................................................................................... 70

10

3.3.7. CARACTERIZAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS E DA Α-GALACTOSIDASE DE CYAMOPSIS TETRAGONOLOBA (GUAR) (MEGAZYME

®) QUANTO A TEMPERATURA ÓTIMA, PH ÓTIMO

E ASPECTOS CINÉTICOS ........................................................................................................................... 71 3.3.7.1. TEMPERATURA ÓTIMA ........................................................................................................ 71 3.3.7.2. PH ÓTIMO ........................................................................................................................ 71 3.3.7.3. ASPECTOS CINÉTICOS – KM E VMÁX .......................................................................................... 72 3.3.8. SEQUENCIAMENTO INTERNO DA Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS

72 3.4. ANÁLISES DAS SEQUÊNCIAS DE Α-GALACTOSIDASE PREVIAMENTE IDENTIFICADAS EM PLANTAS .............. 74

IV. RESULTADOS............................................................................................................................... 75

4.1. DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE GERMINAÇÃO E PICO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA ..................... 75 4.2. PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE DE SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ..................... 77 4.2.1. CARACTERIZAÇÃO DA TEMPERATURA ÓTIMA E PH ÓTIMO DA Α-GALACTOSIDASE EM EXTRATO BRUTO

ENZIMÁTICO 77 4.2.1.1. TEMPERATURA ÓTIMA ........................................................................................................ 77 4.2.1.2. PH ÓTIMO ........................................................................................................................ 78 4.2.2. PRIMEIRA ETAPA DE PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE: PRECIPITAÇÃO COM SULFATO DE AMÔNIO .... 79 4.2.3. SEGUNDA ETAPA DE PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE: CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA COM

COLUNA ANIÔNICA (MONO-Q) ............................................................................................................... 82 4.2.4. TERCEIRA ETAPA DE PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE: CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRAÇÃO

(SUPEROSE) 85 4.2.5. TABELA DE PURIFICAÇÃO ...................................................................................................... 89 4.2.6. CARACTERIZAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. E DA Α-GALACTOSIDASE DE CYAMOPSIS TETRAGONOLOBA (GUAR) (MEGAZYME

®) QUANTO A TEMPERATURA ÓTIMA, PH ÓTIMO

E ASPECTOS CINÉTICOS ........................................................................................................................... 90 4.2.6.1. TEMPERATURA ÓTIMA ........................................................................................................ 90 4.2.6.2. PH ÓTIMO ........................................................................................................................ 92 4.2.6.3. ASPECTOS CINÉTICOS – KM E VMÁX .......................................................................................... 93 4.2.6.4. ANÁLISE DO PERFIL PROTEICO EM GEL DE POLIACRILAMIDA SOB CONDIÇÕES DESNATURANTES DE TODAS AS

ETAPAS DE PURIFICAÇÃO ........................................................................................................................ 95 4.2.7. SEQUENCIAMENTO INTERNO DA Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. 96 4.3. ANÁLISES DAS SEQUÊNCIAS DE Α-GALACTOSIDASES PREVIAMENTE IDENTIFICADAS EM PLANTAS ............. 98

V. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 100

5.1. DETERMINAÇÃO DA PORCENTAGEM DE GERMINAÇÃO E PICO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA .................. 100 5.2. PURIFICAÇÃO DA Α-GALACTOSIDASE DE SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ................... 101 5.3. ANÁLISES DAS SEQUÊNCIAS DE Α-GALACTOSIDASE PREVIAMENTE IDENTIFICADAS EM PLANTAS ............ 110

VI. CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 113

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 115

CAPÍTULO 2 ........................................................................................................................................ 120

ESTRUTURA FINA DO GALACTOMANANO E A MODULAÇÃO DA MOBILIZAÇÃO DE RESERVA EM SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ................................................................................ 120

I. RESUMO ................................................................................................................................... 121

II. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 122

III. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................. 126

3.1. MATERIAL VEGETAL ......................................................................................................... 126 3.2. EXTRAÇÃO DO MANANO E GALACTOMANANO ......................................................................... 126 3.2.1. EXTRAÇÃO DO MANANO DE RESERVA DAS SEMENTES DE COFFEA ARABICA E EUTERPE EDULIS ............. 127 3.2.2. EXTRAÇÃO DO GALACTOMANANO DE RESERVA DAS SEMENTES DE SESBANIA VIRGATA, SENNA ALATA, DIMORPHANDRA MOLLIS, CYAMOPSIS TETRAGONOLOBA ............................................................................. 127 3.3. ANÁLISE DE MONOSSACARÍDEOS .......................................................................................... 128

11

3.4. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA COM ENDO-Β-MANANASE E Α-GALACTOSIDASES...................................... 128 3.5. ANÁLISE DOS OLIGOSSACARÍDEOS DE (GALACTO)MANANO ........................................................ 130 3.5.1. ANÁLISE DOS OLIGOSSACARÍDEOS DE (GALACTO)MANANO POR HPAEC-PAD (HIGH PERFORMANCE

ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY WITH PULSED AMPEROMETRIC DETECTION) .......................................... 130 3.5.2. ANÁLISE DOS OLIGOSSACARÍDEOS DE (GALACTO)MANANO POR TLC (THIN LAYER CROMATOGRAPHY) 131 3.6. ANÁLISE DA ESTRUTURA FINA DO GALACTOMANANO DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ATRAVÉS DE

HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS COM ENDO-Β-MANASE DE ASPERGILUS NÍGER (MEGAZYME), Α-GALACTOSIDASE DE

CYAMOPSIS TETRAGONOLOBA (MEGAZYME) E Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. 131 3.6.1. EXPERIMENTO I ............................................................................................................... 132 3.6.2. EXPERIMENTO II .............................................................................................................. 133 3.6.3. EXPERIMENTO III ............................................................................................................. 134 3.6.4. EXPERIMENTO IV ............................................................................................................. 135 3.6.5. EXPERIMENTO V .............................................................................................................. 136 3.7. ANÁLISE DA ESTRUTURA FINA DO (GALACTO)MANANO DE 6 ESPÉCIES COM DIFERENTES PROPORÇÕES DE

RAMIFICAÇÕES COM GALACTOSE ............................................................................................................ 137

IV. RESULTADOS............................................................................................................................. 138

4.1. ANÁLISE DA ESTRUTURA FINA DO GALACTOMANANO DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ATRAVÉS DE

HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS COM ENDO-Β-MANASE DE ASPERGILUS NIGER (MEGAZYME), Α-GALACTOSIDASE DE

CYAMOPSIS TETRAGONOLOBA (MEGAZYME) E Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. 138 4.1.1. EXPERIMENTO I ............................................................................................................... 138 4.1.2. EXPERIMENTO II .............................................................................................................. 145 4.1.3. EXPERIMENTO III ............................................................................................................. 151 4.1.4. EXPERIMENTO IV ............................................................................................................. 154 4.1.5. EXPERIMENTO V .............................................................................................................. 156 4.2. ANÁLISE DA ESTRUTURA FINA DO (GALACTO)MANANO DE 6 ESPÉCIES COM DIFERENTES PROPORÇÕES DE


V. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 165

5.1. ANÁLISE DA ESTRUTURA FINA DO GALACTOMANANO DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS. ATRAVÉS DE

HIDRÓLISES ENZIMÁTICAS COM ENDO-Β-MANASE DE ASPERGILLUS NIGER (MEGAZYME®), Α-GALACTOSIDASE DE

CYAMOPSIS TETRAGONOLOBA (MEGAZYME®) E Α-GALACTOSIDASE SEMIPURIFICADA DE SESBANIA VIRGATA (CAV.) PERS.

165 5.2. ANÁLISE DA ESTRUTURA FINA DO (GALACTO)MANANO DE 6 ESPÉCIES COM DIFERENTES PROPORÇÕES DE


VI. CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 181

VII. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 183

DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................................................. 185

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................................... 190

ANEXO ............................................................................................................................................... 198

12

Índice de Figuras Figura 1: Estrutura e mobilização do galactano. (A) Estrutura do galactano mais

frequente composto por ligações β-(1,4) com ramificações de L-arabinofuranose a cada

16-21 resíduos da cadeia principal (não mostrada). Ainda existe um segundo tipo de

galactano formado por ligações β-(1,3)(1,6). (B) Reações envolvendo a mobilização do

polissacarídeo de reseva em Lupinus sp. β-(1,4)-D-galactano é o polímero dominante,

sendo descrito como uma ramificação do rhamnogalacturanano, por vezes ramificado

por ligações α-(1,5)-arabinano. Uma molécula de α-(1,3), (1,6)-D-galactano também

está representado embora ocorre em quantidades menores. Neste sistema de degradação,

apenas exoenzimas foram detectadas, uma das quais (exo-α-(1,4)-galactanase a partir de

Lupinus angustifolius) é capaz de libertar a maior parte (cerca 60%) das paredes

celulares intactadas da mesma espécie. In vivo, outras galactosidases e arabinosidases

parecem agir no ramos deixando apenas ramnogalacturonano. O destino dos produtos é

meramente hipotético neste esquema. Figura retirada e adaptada de Buckeridge et al.

(2000b) e Buckeridge et al. (2000c). ........................................................................... 34

Figura 2: Estrutura e mobilização de xiloglucano de reserva de sementes. (A) Estrutura

molecular do xiloglucano de reserva contendo cadeia principal de glucose unida por

ligações β-(1,4), onde ocorrem ramificações regulares com xilose ligada α-(1,6).

Algumas destas xiloses ainda podem apresentar ramificações por galactose ligadas α-

(1,2). (B) Representação esquemática da degradação de reserva de xiloglucano em

sementes. Uma sequência de XLXGXLLGXXXGXXLG é usada como um exemplo de

um segmento de um polímero de xiloglucano com a extremidade não-redutora voltada

para a esquerda. O primeiro ataque é feita por xiloglucano-endo-β-transglicosilase

(XET) e β-galactosidase (β-gal proveniente de Nasturtium apenas). Os oligossacáridos

produzidos pela ação endo da XET são atacados por β-galactosidases (Nβ-

gal=Nasturtium β-galactosidase; Cβ-gal= Copaifera β-galactosidase, o último sendo

capaz de atacar oligossacarídeos apenas em certas posições (galactoses colocadas na

ponta não-redutora). A α- xilosidase e a β-glucosidase agem em hidrólises alternadas do

final não-redutor. (*) Em leguminosas (Copaifera langsdorffii e Hymenaea courbaril),

após uma rodada de ação destas duas enzimas, a galactose estará novamente próximo do

terminal não-redutor. Desata forma, a β-galactosidase pode agora agir sobre o

oligossacarídeo XLG, libertando assim a galactose e permitindo a continuidade da ação

das outras duas exo-glicosidases. Nestas duas espécies, a galactose retirada dos

oligossacarídeos é possivelmente limitadora da degradação, pois a enzima possui um

pH ótimo de 3,2, enquanto as demais enzimas possuem um pH ótimo de 4,5. Figura

retirada e adaptada de Buckeridge et al. (2000c) e Buckeridge et al. (2000b). ............. 37

Figura 3: Estrutura molecular do polissacarídeo galactomanano e explicação para a

leitura das “abreviações” dos oligossacarídeos GalXManY. (A) Cadeia principal linear de

resíduos de D-manose unidas por ligações glicosídicas β-(1,4), na qual resíduos de D-

galactose estão unidos por ligações α-(1,6), formando ramificações simples. Figura

retirada e adaptada de Buckeridge et al. (2000a). (B) A cadeia principal de manose é

numerada a partir da extremidade redutora (à direita). O número subscrito ligado à

manose indica a quantidade de resíduos de manose que a cadeia principal do

oligossacarídeo possui, enquanto o número sobrescrito ligado a galactose indica a

posição do resíduo de galactose relativo ao resíduo de manose a partir da extremidade

redutora (McCleary et al., 1983). ................................................................................. 40

13

Figura 4: Rotas bioquímicas envolvidas no catabolismo do galactomanano somado ao

metabolismo pelo embrião dos monossacarídeos liberados na degradação da reserva.

Quando a camada de aleurona não está presente, aparentemente as hidrolases são

produzidas dentro das células endospermáticas e secretadas para fora da parede celular

onde as mesmas vias metabólicas ocorrem. Man = manose; Gal = galactose; SPS =

sacarose fostato sintase; Man-6-P = manose-6-fosfato; Fru-6-P = frutose-6-fosfato;

UDP-gal = uridina difosfatada de galactose; Suc-6-P = sacarose-6-fosfato. Figura

retirada e adaptada de Buckeridge et al. (2000b). ........................................................ 44

Figura 5: Representação esquemática dos subsítios de reconhecimento (α – ε) e ligação

da endo-β-mananase ao oligossacarídeo hipotético com 5 resíduos de manose (A-E)

ligados β-(1,4). Figura retirada de McCleary & Matheson, 1983. ................................ 50

Figura 6: Porcentagem de germinação das sementes de Sesbania virgata (cav.) Pers. ao

longo de 7 dias (168 horas) após a embebição. ............................................................ 76

Figura 7: Atividade enzimática específica da enzima α-galactosidase presente em

sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. ao longo de 7 dias (168 horas) após a

embebição. .................................................................................................................. 77

Figura 8: Determinação da temperatura ótima de atividade enzimática da α-

galactosidase em extrato bruto enzimático de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

após 4 dias de incubação em BOD. ............................................................................. 78

Figura 9: Determinação do pH ótimo de atividade enzimática da α-galactosidase em

extrato bruto enzimático de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. após 4 dias de

incubação em BOD. .................................................................................................... 79

Figura 10: Padronização da etapa de purificação da Precipitação com Sulfato de

Amônio. Determinação da saturação de sulfato de amônio responsável pela precipitação

da enzima α-galactosidase através quantificação da atividade enzimática específica da

α-galactosidase em extrato bruto e em cada precipitado ressuspendido referente à

utilização de uma porcentagem de saturação de sulfato de amônio. ............................. 80

Figura 11: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% do extrato bruto enzimático;

precipitados ressuspendidos de 20%, 40%, 60% e 80% de saturação de sulfato de

amônio e o descarte resultante da precipitação com sulfato de amônio, com cerca de

50µg de proteína nas amostras aplicadas. .................................................................... 81

Figura 12: Comparação da atividade enzimática da enzima α-galactosidase no: extrato

bruto (Ext.Bruto); ressuspendido do precipitado com 40% de saturação de Sulfato de

Amônio (40%); ressuspendido do precipitado com 80% de saturação de Sulfato de

Amônio (80%); sobrenadante resultante da precipitação com 80% de saturação de

Sulfato de Amônio (Descarte), após Primeira etapa de purificação: Precipitação com

Sulfato de Amônio em 40% e 80% de saturação. ......................................................... 82

Figura 13: Perfil cromatográfico da purificação em FPLC Äkta do extrato bruto

enzimático submetido à coluna aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech).

Identificação com letras (A-C) das frações coletadas que apresentaram atividade

enzimática de α-galactosidase, onde: (A) Frações 47 a 51; (B) Frações 63 a 65; (C)

14

Frações 66 a 69. (―) Perfil proteico quantificado por UV; (―) Gradiente de NaCl

variando de 0-0.5M em 12 volumes de coluna (‖) Frações coletadas com seus

respectivos números. ................................................................................................... 83

Figura 14: Atividade enzimática da α-galactosidase expressa em absorbância a 405nm

das frações coletadas durante a purificação em FPLC Äkta do extrato bruto enzimático

submetido à coluna aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). (a) Frações 47 a

51; (b) Frações 63 a 65; (c) Frações 66 a 69. ............................................................... 84

Figura 15: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% corado com Coomassie Blue

R250 das frações reunidas 47 a 51 (pico A) após purificação em FPLC Äkta utilizando

coluna aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). (→) Banda proteica

concentrada de tamanho esperado para α-galactosidase. .............................................. 85

Figura 16: Perfil cromatográfico da purificação em FPLC Äkta utilizando coluna de gel

filtração Superose 6 (GE Healthcare) das frações previamente semipurificadas (frações

47 a 51) em coluna aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). Identificação com

letra (D) das frações coletadas que apresentaram atividade enzimática de α-

galactosidase, onde: (D) Frações 30-33. (―) Perfil proteico por quantificação por UV;

(―) Gradiente de NaCl variando de 0-0.5M em 12 volumes de coluna; (‖) Frações

coletadas com seus respectivos números. .................................................................... 86

Figura 17: Atividade enzimática da α-galactosidase expressa em absorbância a 405nm

das frações coletadas durante a purificação em FPLC Äkta, utilizando coluna de gel

filtração Superose 6 (GE Healthcare), da amostra semipurificada em coluna aniônica

Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). (D) Frações 30 a 33. ................................... 87


R250 das frações reunidas 30 a 33 (pico D) após purificação em FPLC Äkta utilizando

coluna de gel filtração Superose 6 (Pharmacia Biotech). (→) Banda proteica

concentrada de tamanho esperado para α-galactosidase. .............................................. 88

Figura 19: Determinação da temperatura ótima da α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. ...................................................................................... 91

Figura 20: Determinação da temperatura ótima da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®). ...................................................................................... 92

Figura 21: Determinação do pH ótimo da α-galactosidase semipurificada de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. ..................................................................................................... 93

Figura 22: Determinação do pH ótimo da α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme). ............................................................................................................... 93

Figura 23: Curva de saturação do substrato 4-Nitrofenil-D-Galactopiranosídeo na

presença da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Os ensaios

enzimáticos foram conduzidos com o PNP-α-Gal nas seguintes concentrações (mM):

0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.8; 1.0; 2.0; 3.0; 5.0; 8.0; 10; 13; 15; 17; 20; 25; 30. A partir dos

dados coletados foi calculado o Km e o Vmáx da α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. ...................................................................................... 94

15

Figura 24: Curva de saturação do substrato 4-Nitrofenil-D-Galactopiranosídeo na

presença da α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®). Os ensaios

enzimáticos foram conduzidos com o PNP-α-Gal nas seguintes concentrações (mM):

0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.8; 1.0; 2.0; 3.0; 5.0; 8.0; 10; 13; 15; 17; 20; 25. A partir dos dados

coletados foi calculado o Km e o Vmáx da α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®

). ............................................................................................................. 95


R250 de todas as etapas de purificação. (A) Extrato bruto enzimático; (B) Precipitado de

80% de Sulfato de Amônio (ressuspendido em tampão Tris-HCl 20mM ph 7,8); (C)

Alíquota das frações reunidas após purificação em FPLC Äkta utilizando coluna de

troca-iônica aniônica (Mono-Q); (D) Alíquota das frações reunidas após purificação em

FPLC Äkta utilizando coluna de gel filtração Superose 6 (GE Healthcare). ................. 96

Figura 26: Identificação com números, de 1 a 8, das bandas recortadas do gel de

poliacrilamida 12% submetidas ao sequenciamento interno para identificação das

proteínas, principalmente da α-galactosidase, juntamente com a determinação da

sequência interna da α-galactosidase semipurificada de sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. ................................................................................................................. 97

Figura 27: Análise das sequências de aminoácidos 35 de α-galactosidase de plantas

conjuntamente com a sequência dos fragmentos de α-galactosidase de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. semipurificada determinados por Espectrometria de Massas (MALDI-

TOF). Grupos identificados por letras estão de acordo com a filogenia: (A – vermelho)

Fabaceae; (B - rosa) Fabaceae; (C – azul escuro) Fabaceae; (D - verde) Rubiaceae; (E –

roxo) Poaceae; (F – azul claro) Pinaceae. A coloração dos ramos é a mesma da árvore

de relação das 35 sequências de aminoácidos somente localizada na figura 46 do anexo,

no entanto, a identificação pelas letras é diferente, ou seja, os ramos coloridos por cada

cor são os mesmos em ambas as árvores, mas a letra que o identifica não é a mesma. (•)

Bootstrap ˃ 95, ou seja, em 95% ou mais das 1000 árvores de relação geradas os ramos

marcados com (•) ficaram agrupados como mostrado nesta árvore de relação. ............. 99

Figura 28: Análise em HPAEC-PAD (Dionex) com coluna PA-100 dos

oligossacarídeos formados após hidrólise enzimática exaustiva com Endo-β-mannanase

do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers., visando verificar perfil dos

oligossacarídeos produto da hidrólise enzimática do galactomanano com endo-β-

mananase. (F1) dissacarídeos a decassacarídeos galactosilados ou não base do

polissacarídeo; (F2) combinação aos pares dos oligossacarídeos de F1; (F3) combinação

aos trios dos oligossacarídeos de F1. ......................................................................... 139

Figura 29: Cromatogramas gerados por HPAEC-PAD, utilizando coluna PA- 100, da

análise dos oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do galactomanano de

Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e

1U. (I) Controle (galactomanano sem endo-B-mananase); (II) perfil de oligossacarídeos

formados após hidrólise com endo-β-mananase na concentração de 0,005U; (III) perfil

de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase na concentração de

0,05U; (IV) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase

na concentração de 1U; (V) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após

hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de 0,005U e 0,05U; (VI)

comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-

16

mananase nas concentrações de 0,005U e 1U; (VII) comparação dos perfis de

oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de

0,05U e 1U. (A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3) e/ou trissacarídeo (G1M2); (C)

tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D) pentassacarídeos (manopentose –

M5 e/ou G1M3 e/ou G

3M4); (E) hexassacarídeos (manohexose – M6 e/ou G

1,3M4 e/ou

G4M5 e/ou G

3M5); (F) heptassacarídeos (manoheptose – M7 e/ou G

3,4M5); (G-I)

oligossacarídeos >8 resíduos (G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou

G4,5

M7). Os oligossacarídeos identificados A-I são denominados oligossacarídeos F1; os

oligossacarídeos restantes são identificados como F2, quanto combinação aos pares, e

F3, quando combinação aos trios. .............................................................................. 141

Figura 30: Cromatogramas gerados por HPAEC-PAD, utilizando coluna PA-100, da

análise dos oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do manano comercial

(Megazyme®

) com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U. (I) Controle

(manano sem endo-B-mananase); (II) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise

com endo-β-mananase na concentração de 0,005U; (III) perfil de oligossacarídeos

formados após hidrólise com endo-β-mananase na concentração de 0,05U; (IV) perfil de

oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase na concentração de 1U;

(V) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-

mananase nas concentrações de 0,005U e 0,05U; (VI) comparação dos perfis de

oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de

0,005U e 1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após hidrólise

com endo-β-mananase nas concentrações de 0,05U e 1U. (A) manobiose (M2); (B)

manotriose (M3); (D) pentassacarídeos (manopentose – M5 e/ou G1M3 e/ou G

3M4); (E)

hexassacarídeos (manohexose – M6 e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F)

heptassacarídeos (manoheptose – M7 e/ou G3,4

M5). Os oligossacarídeos identificados A-

F são denominados oligossacarídeos F1. ................................................................... 144


análise dos oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática com α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. dos oligossacarídeos produto da

hidrólise do galactomanano a 1% de Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-

mananase (Megazyme®

) a 0,005U, 0,05U e 1U (Experimento I). (I) Controle

(galactomanano a 1% sem enzima); (II) Controle (galactomanano a 1% com α-

galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.; (III) Controle

(galactomanano a 1% com celulase de Trichoderma longibrachiatum (Megazyme®

));

(IV) perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia

hidrólise com endo-β-mananase a 0,005U; (V) perfil de oligossacarídeos formados após

ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise com endo-β-mananase a 0,05U; (VI)

perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise

com endo-β-mananase a 1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados

no Experimento I e Experimento II na concentração de 0,005U de endo-β-mannanase;

(VIII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados no Experimento I e

Experimento II na concentração de 0,05U de endo-β-mannanase; (IX) comparação dos

perfis de oligossacarídeos formados no Experimento I e Experimento II na concentração

de 1U de endo-β-mannanase. (A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3); (C)

tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D) pentassacarídeos (manopentose –

M5 e/ou G1M3 e/ou G


1,3M4 e/ou

G4M5 e/ou G


3,4M5); (G-I)

oligossacarídeos >8 resíduos (possíveis oligossacarídeos presentes: G1,3,4

M5; G4,5

M6,

17

G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7); (K-L) octassacarídeos e

nonassacarídeos sem ramificação; (M) oligossacarídeos >10 resíduos de manose

(possivelmente resultado da desramificação do pico I). Os oligossacarídeos

identificados A-M são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes

são identificados como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos

trios........................................................................................................................... 149



Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-mananase (Megazyme®) a 1U com acréscimo

ou não da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (I) perfil de

oligossacarídeos formados na hidrólise do galactomanano a 1% somente com endo-β-

mananase a 1U; (II) perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do galactomanano

a 1% com endo-β-mananase a 1U/mL e α-galactosidase de semipurificada Sesbania

virgata (Cav.) Pers. a 0,5U/mL; (III) perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do

galactomanano a 1% somente com α-galactosidase semipurificada Sesbania virgata

(Cav.) Pers. a 0,5U/mL; (IV) Controle (galactomanano sem enzima). (Gal) Galactose;

(A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3); (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou

G1M3); (D) pentassacarídeos (manopentose – M5 e/ou G

1M3 e/ou G

3M4); (E)


M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F)


M5); (G-I) oligossacarídeos >8 resíduos

(G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7). Os oligossacarídeos

identificados A-I são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes


trios........................................................................................................................... 154



Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U e 1U e α-

galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. a 0,5U/mL. (I)

Galactomanano a 1%, 0,005U de endo-β-mananase e α-galactosidase semipurificada a

0,5U/mL; (II) Galactomanano a 0,1%, 0,005U de endo-β-mananase e α-galactosidase

semipurificada a 0,5U/mL; (III) Galactomanano a 1%, 1U de endo-β-mananase e α-

galactosidase semipurificada a 0,5U/mL; (IV Galactomanano a 0,1%, 1U de endo-β-

mananase e α-galactosidase semipurificada a 0,5U/mL. (A) manobiose (M2); (B)

manotriose(M3); (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D)

pentassacarídeos (manopentose – M5 e/ou G1M3 e/ou G

3M4); (E) hexassacarídeos

(manohexose – M6 e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F) heptassacarídeos

(manoheptose – M7 e/ou G3,4

M5); (G-I) oligossacarídeos >8 resíduos (G1,3,4

M5; G4,5

M6,

G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7). Os oligossacarídeos identificados A-I

são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes são identificados

como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos trios. ............ 155


análise dos oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do manano comercial

(Megazyme®

) com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U e α-

galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba comercial (Megazyme®) a 0,5U/mL. (I)

perfil de oligossacarídeos formados na concentração de 0,005U de endo-β-mananase;

(II) perfil de oligossacarídeos formados na concentração de 0,05U de endo-β-mananase;

(III) perfil de oligossacarídeos formados na concentração de 1U de endo-β-mananase;

18

(IV) injeção com padrão de manose; (V) injeção com padrão de galactose. (A)

manobiose (M2); (B) manotriose (M3); (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou


1M3 e/ou G

3M4); (E)


M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F)


M5). Os oligossacarídeos identificados A-

F são denominados oligossacarídeos F1. ................................................................... 158

Figura 35: Análise por Thin Layer Chromatography (TLC) dos oligossacarídeos

obtidos após hidrólise enzimática exaustiva com endo-β-mannanase (Megazyme®) das 6

espécies estudadas. (A) Euterpe edulis (150:1); (B) Coffea arabica (40:1); (C)

Dimorphandra mollis (2:1); (D) Senna alata (2:1); (E) Sesbania virgata (Cav.) Pers.

(1:1); (F) Cyamopsis tetragonoloba (1:1). (→) Oligossacarídeos exclusivo de 1 ou mais

espécies: (→1, 2) exclusivo de Cyamopsis tetragonoloba; (→3) exclusivo de Sesbania

virgata e Cyamopsis tetragonoloba; (→) Comparação dos oligossacarídeos formados

entre as espécies (A e B) com reserva de manano: (→1, 2, 3) exclusivo de Euterpe

edulis; (→4) exclusivo de Coffea arabica. (*→) Oligossacarídeos exclusivos das

espécies com reserva de manano. (Chave vermelha) Oligossacarídeos e suas

combinações em pares (F2) e em trios (F3) exclusivos de espécies com reserva de

galactomanano. ......................................................................................................... 162


análise dos oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática exaustiva com endo-β-

mannanase (Megazyme®

), das 6 espécies estudadas. (A) Euterpe edulis (150:1); (B)

Coffea arabica (40:1); (C) Dimorphandra mollis (2:1); (D) Senna alata (2:1); (E)

Sesbania virgata (1:1); (F) Cyamopsis tetragonoloba (1:1). (a) manose; (b) galactose;

(c) manobiose; (d) manotriose; (f-h, j-m) oligossacarídeos ainda não-identificados; (i)

combinações aos pares e aos trios dos oligossacarídeos identificados (c-h, j-m). Os

oligossacarídeos identificados a-h e j-m são denominados oligossacarídeos F1; os

oligossacarídeos identificados por i são denominados F2, quanto combinação aos pares,

e F3, quando combinação aos trios. ........................................................................... 164

Figura 37: Explicação para a leitura das “abreviações” dos oligossacarídeos GalXMany.

A cadeia principal de manose é numerada a partir da extremidade redutora (à direita). O

número subscrito ligado à manose indica a quantidade de resíduos de manose que a

cadeia principal do oligossacarídeo possui, enquanto o número sobrescrito ligado a

galactose indica a posição do resíduo de galactose relativo ao resíduo de manose a partir

da extremidade redutora (McCleary et al., 1983). ...................................................... 177

Figura 38: Comparação dos fragmentos gerados por espectrometria de massas

(MALDI-TOF) da BANDA 1 (gel de poliacrilamida 12% após purificação em coluna de

Gel Filtração Superose 6 utilizando FPLC) com banco de dados do NCBi. As proteínas

estão organizadas quanto ao Score, ou seja, quanto maior o Score maior a probabilidade

dos fragmentos gerados serem pertencentes àquela proteína ou similares. As proteínas

realssadas pelo retângulo preto fazem referência a α-galactosidases. ......................... 198





19

dos fragmentos gerados serem pertencentes àquela proteína ou similares. As proteínas

realssadas pelo retângulo preto fazem referência a α-galactosidases. ......................... 199





dos fragmentos gerados serem pertencentes àquela proteína ou similares. A proteína

realssada pelo retângulo preto faz referência a α-galactosidase. ................................. 200































Figura 46: Análise de 35 sequências de aminoácidos de α-galactosidase de plantas.

Grupos identificados por letras estão de acordo com a filogenia: (A – azul escuro)

Fabaceae; (B - verde) Rubiceae; (C - amarelo) Solanaceae; (D - vermelho) Fabaceae; (E

– azul claro) Pinaceae; (F – roxo) Poaceae. (•) Bootstrap ˃ 95, ou seja, em 95% ou mais

20

das 1000 árvores de relação geradas os ramos marcados com (•) ficaram agrupados

como mostrado nesta árvore de relação. .................................................................... 206


análise dos oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática com α-galactosidase

comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) dos oligossacarídeos produto da

hidrólise do galactomanano a 1% de Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-

mananase (Megazyme®

) a 0,005U, 0,05U e 1U (Experimento I). (I) Controle

(galactomanano a 1% sem enzima); (II) Controle (galactomanano a 1% com α-

galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®); (III) Controle

(galactomanano a 1% com celulase de Trichoderma longibrachiatum (Megazyme®

));

(IV) perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia

hidrólise com endo-β-mananase a 0,005U; (V) perfil de oligossacarídeos formados após

ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise com endo-β-mananase a 0,05U; (VI)

perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise

com endo-β-mananase a 1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados

no Experimento I e Experimento II na concentração de 0,005U de endo-β-mananase;

(VIII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados no Experimento I e

Experimento II na concentração de 0,05U de endo-β-mananase; (IX) comparação dos

perfis de oligossacarídeos formados no Experimento I e Experimento II na concentração

de 1U de endo-β-mananase. (A) Manobiose (M2); (B) Manotriose (M3) e/ou

trissacarídeo G1M2; (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G

1M3); (D)


3M4); (E) hexassacarídeos

(manohexose – M6 e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F) heptassacarídeos

(manoheptose – M7 e/ou G3,4

M5); (G-I) oligossacarídeos >8 resíduos (possíveis

oloigossacarídeos presentes: G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou

G4,5

M7); (K-L) octassacarídeos e nonassacarídeos sem ramificação; (M)

oligossacarídeos >10 resíduos de manose (possivelmente resultado da desramificação

do pico I). Os oligossacarídeos identificados A-M são denominados oligossacarídeos

F1; os oligossacarídeos restantes são identificados como F2, quanto combinação aos

pares, e F3, quando combinação aos trios. ................................................................. 208



Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-mananase (Megazyme®) a 1U com acréscimo

ou não da α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®). (I)

perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do galactomanano a 1% somente com

endo-β-mananase a 1U; (II) perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do

galactomanano a 1% com endo-β-mananase a 1U/mL e α-galactosidase comercial de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (III) perfil de oligossacarídeos

formados na hidrólise do galactomanano a 1% somente com α-galactosidase comercial

de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (IV) Controle (galactomanano

sem enzima). (Gal) Galactose; (A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3) e/ou G1M2;

(C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D) pentassacarídeos

(manopentose – M5 e/ou G1M3 e/ou G

3M4); (E) hexassacarídeos (manohexose – M6

e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F) heptassacarídeos (manoheptose – M7 e/ou

G3,4


M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6;

G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7). Os oligossacarídeos identificados A-I são denominados

oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes são identificados como F2, quanto

combinação aos pares, e F3, quando combinação aos trios ........................................ 209

21



Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U e 1U e α-

galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL. (I)

Galactomanano a 1%, 0,005U de endo-β-mananase e α-galactosidase comercial de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (II) Galactomanano a 0,1%,

0,005U de endo-β-mananase e α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®

) a 0,5U/mL; (III) Galactomanano a 1%, 1U de endo-β-mananase e α-

galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (IV

Galactomanano a 0,1%, 1U de endo-β-mananase e α-galactosidase comercial de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL. (A) manobiose (M2); (B)

manotriose (M3) e/ou trissacarídeo G1M2; (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou


1M3 e/ou G

3M4); (E)


M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F)


M5); (G-I) oligossacarídeos >8 resíduos

(G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5


identificados A-I são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes


trios........................................................................................................................... 210

22

Índice de Tabelas

Tabela 1: Tabela de purificação da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

desenvolvida após a realização das três etapas de purificação: precipitação com Sulfato

de Amônio 80%, Cromatografia de troca-iônica aniônica (Mono-Q) e Cromatografia de

gel filtração (Superose). .............................................................................................. 90

Tabela 2: Comparação da razão F1/F2 do Experimento I (hidrólise do galactomanano a

1% somente com endo-β-mananase) com a razão do Experimento II (hidrólise dos

oligossacarídeos do Experimento I somente com α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers.). .................................................................................. 147

Tabela 3: Comparação das razões Manobiose (M2)/Trissacarídeo (M3 e/ou G1M2)

(M2/M3) e Trissacarídeo (M3 e/ou G1M2)/Tetrassacarídeo (M4 e/ou G

1M3) (M3/C) dos

Experimentos I e II. ................................................................................................... 150

Tabela 4: Razão manose:galactose das 6 espécies estudadas determinada pela análise

de monossacarídeos em HPAEC-PAD (Dionex). Apresentado por ordem crescente na

quantidade de substituições de galactose: Manano (Euterpe edulis; Coffea arábica);

Galactomanano de proporção 2:1, ou seja, a cada 2 manose existe a ramificação por 1

galactose (Dimorphandra mollis; Senna alata); Galactomanano de proporção 1:1, ou

seja, teoricamente todo o polissacarídeo é substituído por galactose (Cyamopsis

tetragonoloba; Sesbania virgata) . ............................................................................ 160

Tabela 5: Oligossacarídeos produzidos na hidrólise do galactomanano de goma caroba,

razão manose:galactose 4:1 pelas endo-β-mananase de Aspergillus niger e de sementes

de Medicago sativa (alfafa). O final redutor da molécula está sempre a esquerda,

manose denominada de 1. (#) O subscrito indica a quantidade de resíduos de manose o

oligossacarídeo possui em sua cadeia principal, enquanto o sobrescrito indica a posição

da substituição da galactose na cadeia relativa ao final redutor da molécula; (*) As

estruturas dos oligossacarídeos >7 resíduos produzidos pela hidrólise da endo-β-

mananase de M.sativa não foram caracterizadas. Estes oligossacarídeos representam

26,9% do total de oligossacarídeos produzidos. (-) Oligossacarídeos não produzidos

pela hidrólise da endo-β-mananase de Aspergillus niger por esta ser mais inespecífica

em sua ação, conseguindo “triblar” a presença de ramificação com galactose diminuindo

o tamanho do oligossacarídeo. Tabela retirada e adapatada de McCleary et al. (1983)

................................................................................................................................. 168

Tabela 6: Identificação das possíveis estruturas dos oligossacarídeos de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. componentes dos picos A-F de acordo com a comparação do tempo

de retenção real e o tempo de retenção teórico e os oligossacarídeos caracterizados e

identificados por McCleary et al. (1983) (Tabela 5). ................................................. 176

23

RESUMO

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de

carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o

galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma

cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas β-1,4, ramificada por

resíduos de D-galactose α-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a

germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (α-galactosidase, endo-β-

mananase e exo-β-manosidase). A α-galactosidase é a primeira enzima atuar

sobre o galactomanano hidrolisando as ligações α-1,6 das galactoses

ramificadas a cadeia principal de manano (ligados β-1,4), permitindo a ação da

endo-β-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a

β-manosidase atuará (ligações β-1,4), transformando oligossacarídeos a

monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião.

Buscando a compreensão das características da α-galactosidase e modo de

ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e

caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos)

da α-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso,

visando evidenciar a modulação da enzima endo-β-mananase pela distribuição

de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do

galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-β-mananase de

Aspergillus niger (Megazyme®) somente ou em conjunto com a α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a α-

galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®), seguido

de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion

Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também

procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com

razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-β-mananase de

Aspergillus niger (Megazyme®) e análise dos oligossacarídeos produzidos por

HPAEC-PAD. A α-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42

kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72

kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma

24

estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de

50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade

máxima de 0,5024 µmolGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou

os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-

TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-

VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à

mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da α-

galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da α-

galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se

que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam

relacionadas com outras funções da α-galactosidase, enquanto as isoformas

encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por

espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da

α-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados

gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise

sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o

reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-β-mananase: (1) existe a

produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do

galactomanano com endo-β-mananase, como demonstrado para xiloglucanos;

(2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise

do galactomanano com endo-β-mananase em diferentes concentrações (ExP I

e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de

galactosilação; (3) a presença da α-galactosidase diminui a produção dos

oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência

intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda

existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com

estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são

digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando

que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-β-mananase. Dessa

forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também

contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio

metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida

na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim,

sugere-se que as diferentes isoformas da α-galactosidase relacionadas à

25

degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de

melhorar a afinidade da α-galactosidase ao substrato durante o processo de

mobilização de reserva. O aumento da afinidade da α-galactosidase ao

substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das

ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a

eficiência da ação da enzima endo-β-mananase aos sítios de clivagem,

garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma

regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose

livre que inibem a ação das enzimas endo-β-mananase e α-galactosidase,

respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao

embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento,

aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula.

26

ABSTRACT

The seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which

accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls.

Galactomannans are composed of a linear backbone of β-(1,4)-linked D-

mannose residues with D-galactose α-(1,6)-linkages substitutions. The

galactomannans are hydrolysed after protrusion of the radicle. This process is

perfomed by three enzymes (α-galactosidase, endo-β-mannanase and exo-β-

manosidase). The α-galactosidase is the first enzyme to cleave the

polysaccharides, removing the D-galactose residues, allowing the performance

of the endo-β-mannanase, which hydrolyses the mannan backbone to mannan

oligosaccharides. The last part of the process includes exo-β-manoside, that

cleaves the mannan oligosaccharides to mannose residues, which could be

used by the embryo during growth. Aiming at understanding the function of α-

galactosidase in the process of galatomanannan degradation, we studied its

mode of action on mannans and galactomannans. The α-galactosidase of

Sesbania virgata (Cav.) Pers. was purified and characterized (pH and

temperature optimum and the enzyme kinetics). We found that the semipurified

α-galactosidase molecular weight was 42kDa at denaturating conditions, but in

native conditions was 72kDa, suggesting that the enzyme has a quaternary

structure. The enzyme optimum pH was between 4,4-5,4, optimum temperature

between 50°C-55°C, Km= 1,8276 mM and Vmáx= 0,5024 µmolGal.min-

1.mgprot-1. Mass spectrometry measures resulted the following fragments:

ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSMTSIADS-NDKW-

ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR,

being the protein from this sequence related with storage mobilization. Possible

α-galactosidase isoforms were detected during the purification, suggesting other

functions for the enzyme. The α-galactosidase isoforms detected after all

purification steps and with measured mass spectrometry (from 42kDa to 20kDa)

should be related to the storage mobilization. We suggest that the α-

galactosidase isoforms in Sesbania virgata (Cav.) Pers. seeds represents

products of the enzyme self-digestion, this process being correlated with the

enzyme/polysaccharide affinity and at last, correlated to the galactomannan

mobilization. An extract semipurified from Sesbania virgata (Cav.) Pers. and

27

enriched with α-galactosidase activity, was used along with endo-β-mannanase

from Aspergillus niger (Megazyme®) or both endo-β-mannanase and α-

galactosidase (semipurified from Sesbania virgata seeds – Chapter 1- or

commercial enzyme from Cyamopsis tetragonoloba – Megazyme®) were used

to study the fine structure of galactomannans. Hydrolysis of galactomannans

from six species with different mannose:galactose (1:1 to 150:1) ratio were

performed with endo-β-mananase from Aspergillus niger. The oligosaccharides

from all hydrolysis were analyzed by HPAEC-PAD (High Performance Anion

Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). The

hydrolysis fragments data (HPAEC-PAD) suggest that the side-chains of the

polysaccharides can modulate the hydrolytic sites recognition on the

galactomannan by the endo-β-mannanase. This conclusion is supported by: (1)

the presence of limited digest oligosaccharides F1 and dimmers (F2) and

trimers (F3) of the F1 oligosaccharides; (2) the presence of different F1

oligosaccharides proportions after hydrolysis with endo-β-mannanase at

different concentrations, showing preference on less-branched hydrolytic sites;

(3) the α-galactosidase digestion avoided the accumulation of oligosaccharides

F2 and F3, showing that these oligosaccharides do not present intrinsic

resistance to hydrolysis and that the reaction reaches an equilibrium even when

sites of hydrolysis are still available; (4) polymers with different fine structure

(ratio mannose:galactose 1:1 to 150:1) were hydrolysed at different rates by the

endo-β-mannanase, showing that galactose branching interferes on the enzyme

action. Considering that, the branching pattern of the polysaccharide seems to

have direct influence on the interaction of the enzyme with substrate; we

suggest that the structure of the galactomannan holds part of information

required for its own degradation. The higher enzyme x substrate affinity, ensure

the galactose branches digestion, improving the endo-β-mannanase action,

ensuring the degradation of the polysaccharides to oligosaccharides. This

highly regulated degradation process prevents microorganisms predation and

increases the plantlet establishement.

28

INTRODUÇÃO

Uma das mais espetaculares inovações que surgiram durante a

evolução das plantas vasculares (Angiospermas e “Gimnospermas”) foi a

semente. Estima-se que o surgimento tenha ocorrido no Devoniano Superior há

pelo menos 365 milhões de anos. A semente é um dos principais fatores

responsáveis pela dominância das plantas na flora atual, e essa dominância

cresceu ao longo de um período de milhões de anos (Raven, 2001). Este

sucesso deve-se ao fato das sementes possuírem uma grande capacidade de

sobrevivência quando comparada com esporos livres, devido à proteção que

esta confere ao embrião, além dos recursos nela armazenados para os

estágios de germinação e estabelecimento (Raven, 2001).

1.1. Sementes

Nas Angiospermas, o surgimento da semente ocorre com a dupla

fecundação, onde uma das duas células espermáticas fecunda o óvulo

(oosfera), dando origem ao zigoto diploide e, consequentemente, o embrião;

enquanto a outra célula espermática se funde com dois núcleos polares do

saco embrionário, originando o endosperma triplóide (Raven, 2001; Beltrati &

Paoli, 2003).

A semente durante o seu desenvolvimento contém: embrião (resultado

da fusão da oosfera com uma célula espermática), endosperma (provém da

fusão de dois núcleos polares e uma célula espermática), perisperma

(resultado do desenvolvimento do nucelo) e tegumento (formado por um ou

ambos integumentos ao redor do óvulo) (Bewley & Black, 1994). Enquanto

todas as sementes maduras contêm o embrião e muitas continuam envolvidas

pelo tegumento, a persistência do endosperma ou perisperma varia de espécie

para espécie. Portanto, a persistência das partes contidas durante o

desenvolvimento da semente não é certa na semente madura (Bewley & Black,

1994; Beltrati & Paoli, 2003).

29

1.2. Germinação e Pós-Germinação

A germinação das sementes se inicia com a entrada de água na

semente, processo denominado embebição, e culmina com o início do

alongamento do eixo embrionário, normalmente a emissão da radícula (Bewley

& Black, 1994).

Durante o período compreendido entre a embebição e a emissão da

radícula, numerosos eventos ocorrem dentro da semente, como a hidratação

de proteínas, mudanças na estrutura subcelular, produção de macromoléculas

entre outros, que conjuntamente promovem a germinação (Bewley & Black,

1994).

Dessa forma, a germinação pode ser dividida em três fases: embebição,

aumento do metabolismo e iniciação do alongamento do eixo embrionário

(Bewley, 1997).

Entretanto, para que a germinação ocorra se faz necessária não só a

presença de água, mas também de outras condições ambientais favoráveis

como: temperatura adequada, presença de oxigênio, ausência de substâncias

inibidoras e algumas vezes até da luminosidade (Bewley & Black, 1994; Raven,

2001, Taiz & Zeiger, 2004).

Embora sejam necessárias condições ambientais favoráveis,

propriedades intrínsecas da semente podem impedir a sua germinação, por

não permitirem a entrada de água na semente. Nesses casos é necessário o

rompimento do tegumento da semente, pela escarificação, por exemplo, para

permitir a entrada de água e, portanto, a germinação (Labouriau, 1983).

Dessa forma, os eventos ocorridos durante esse período de germinação

são responsáveis pela reativação do metabolismo, outrora reduzido,

culminando no crescimento do embrião (Bewley & Black, 1994).

A reativação do metabolismo é suprida de energia, normalmente, por

açúcares solúveis de reserva, como a sacarose ou oligossacarídeos da série

rafinósica, pois esses podem ser rapidamente metabolizados provendo energia

para divisões e alongamentos celulares necessários para a protrusão da

radícula. No entanto, no período pós-germinativo, compreendido pelo

desenvolvimento inicial da plântula até o seu estabelecimento como organismo

autotrófico (estabelecimento da fotossíntese), a energia, bem como as

30

necessidades de carbono e nitrogênio, são supridas pela reserva de

polissacarídeos. Como as necessidades nesta fase são muito grandes a

reserva de polissacarídeos geralmente aparece em maior proporção

(Buckeridge et al., 2000b).

Assim, as sementes possuem dois tipos de reserva: açúcares solúveis e

polissacarídeos, sendo esse último melhor discutido a seguir, pois é parte do

tema principal deste trabalho.

1.3. Reservas de sementes

As Angiospermas apresentam diferentes estratégias de adaptação aos

seus respectivos ambientes, entre as quais se encontram o acúmulo de certos

compostos em suas sementes (Buckeridge et al., 2000c). As reservas das

sementes possuem basicamente duas funções que se relacionam com a

manutenção e o desenvolvimento do embrião até a formação de uma plântula

autotrófica: fonte de energia (manter processos metabólicos em

funcionamento) e fonte de matéria (carbono e nitrogênio para a construção de

tecidos vegetais que irão formar a plântula) (Buckeridge et al., 2004a;

Buckeridge et al., 2000c).

Muitos dos tecidos da semente podem funcionar como armazenadores

de reservas, por exemplo: perisperma e eixo embrionário. Entretanto, os

cotilédones e o endosperma são as principais estruturas de armazenamento

em sementes de Angiospermas (Bewley & Black, 1994). Embora alguns

endospermas contenham, principalmente, reserva de lipídeos e proteínas, a

maioria parece armazenar carboidratos, sendo eles o amido, normalmente

presente em cereais, e polissacarídeos de parede celular (por exemplo,

galactomananos) em Leguminosae (Bewley & Black, 1994).

Por outro lado, os cotilédones são relativamente mais generalistas,

podendo armazenar: proteínas, carboidratos e lipídeos (Bewley & Black, 1994).

Os produtos de degradação de lipídeos e carboidratos são utilizados na

geração de energia e produção de matéria-prima para a construção de novos

tecidos e células. Buckeridge (1993) e Buckeridge et al. (2004a) discutem que

a maioria das sementes que armazena carboidratos em grandes quantidades,

31

não armazena lipídeos, de tal forma que essas substâncias são mutuamente

exclusivas.

Neste contexto, as proteínas possuem como função o armazenamento

de nitrogênio e enxofre, elementos essenciais para a síntese de proteínas,

ácidos nucleicos e compostos secundários da plântula em crescimento

(Buckeridge et al., 2004a).

1.4. Parede celular de reserva de sementes

Os modelos mais recentes de parede celular propõem que esta seja

uma matriz complexa e espessa com diferentes papéis fisiológicos, formada,

normalmente, por três domínios independentes, mas que interagem entre si

(McCann & Roberts, 1991; Carpita & Gilbeaut, 1993; Carpita & McCann, 2000).

O domínio fundamental da parede celular é formado por microfibrilas de

celulose, envolvidas por hemiceluloses, essas últimas podendo estar

fortemente ou fracamente ligadas às fibras de celulose por pontes de

hidrogênio (Buckeridge et al., 2000c).

A interação celulose-hemicelulose está imersa no segundo domínio da

parede celular, a matriz péctica, composta de polissacarídeos ricos em ácidos

galacturônicos. Esse domínio consiste na região mais hidratada da parede

celular se comparada com o domínio celulose-hemicelulose (Buckeridge et al.,

2000c; Carpita & McCann, 2000).

O último domínio é denominado domínio protéico, este sendo composto

entre outras proteínas, por proteínas estruturais e enzimas, que operam sobre

os polímeros estruturais (Buckeridge et al., 2008). Entre as ações conhecidas,

o domínio protéico age na mobilização dos polissacarídeos de reserva da

parede celular (Carpita & McCann, 2000).

A rede formada por celulose e hemicelulose fornece força tensora,

enquanto que a rede péctica relaciona-se com a resistência a compressão

(Jarvis & McCann, 2000).

O modelo descrito acima, também pode ser aplicado à parede celular de

reserva. Entretanto, o modelo sofre uma variação, onde um domínio, ou

mesmo um de seus polissacarídeos, tenha sido depositado em maior

quantidade em relação aos demais. Aparentemente, a parede celular de

32

reserva constitui uma adaptação evolutiva da parede primária, que

desenvolveu a capacidade de armazenar quantidades apreciáveis de

carboidratos (Buckeridge et al., 2000c).

Os polímeros de reserva armazenados na parede celular podem ser de

origem péctica ou hemicelulósica. Dentre as hemicelulósicas, reconhecem-se:

mananos (mananos puros, galactomananos e glucomananos) e xiloglucanos,

enquanto os de origem péctica os arabinogalactanos (Buckeridge et al., 2000c).

A alta deposição de uma dessas substâncias nas paredes celulares de

reserva é acompanhada de pouca ou nenhuma quantidade de celulose

juntamente com os demais polissacarídeos. Essa baixa proporção de celulose

facilita o processo de mobilização das reservas, o qual seria consideravelmente

mais complexo se proporções normais de celulose estivessem presentes

(Buckeridge et al., 2000c; Buckeridge et al., 2004b).

1.5. Polissacarídeos de reserva de parede celular

Os polissacarídeos de reserva presentes na parede celular das

sementes são denominados PRPC (Buckeridge & Reid, 1996; Buckeridge et

al., 2000b). Esses polissacarídeos são mobilizados após a germinação e os

produtos de sua degradação garantem o desenvolvimento do embrião à

plântula, suprindo-a com energia e matéria-prima para a construção de órgãos

e tecidos até que a plântula se torne autotrófica (Reid, 1985a; Mayer &

Poljakoff-Mayber, 1975; Buckeridge et al., 2004b).

Os PRPC possuem características que os fazem mais convenientes

para o metabolismo celular: serem relativamente inertes ao que concerne a sua

reatividade e possuírem diferentes graus de solubilidade em água. Essas

características conferem alta compactação e baixa reatividade do polímero,

tornando possível a existência de um “compartimento celular”, a parede celular,

que permite um fluxo de água com um grau de liberdade considerável

(Buckeridge et al., 2000c).

Porém, o custo de produção desses polímeros é alto, pois, tais

compostos necessitam de um complexo sistema de biossíntese, secreção e

montagem no meio extracelular (Buckeridge et al., 2000c).

33

Em 1996, Buckeridge e Reid propuseram que os PRPC poderiam ter

passado por etapas de transferência de funções ao longo da evolução, os

quais seriam parte das transformações que levaram à formação de uma parede

de reserva a partir da parede primária. Muitas das funções primordiais da

parede primária ainda se mantêm: dureza (mananos em endospermas de

sementes de palmeiras, tomate e alface), relações hídricas (xiloglucanos em

cotilédones e galactomananos em endospermas de sementes de leguminosas)

e no controle da expansão celular (galactanos nos cotilédones de lupino e, em

menor proporção, em sementes de soja e feijão) (Buckeridge et al., 2000c).

Os polissacarídeos de parede são classificados em três grupos:

mananos, xiloglucanos e os (arabino)galactanos. O grupo dos mananos

engloba os mananos puros, glucomananos e galactomananos (Buckeridge et

al., 2000c), sendo esse último melhor discutido a seguir.

1.5.1. (Arabino)Galactanos

A primeira identificação do galactano como polissacarídeo de reserva de

semente foi realizado por Hirst et al. (1947) em sementes de Lupinus albus

(lupino), onde com base na determinação estrutural, conclui-se que o

polissacarídeo possuía cadeia principal de galactose unidas por ligações β-

(1,4).

Em um estudo mais recente realizado por Al-Kaisey & Wilkie (1992) com

o galactano de quatro espécies de lupino determinou-se a existência de dois de

galactanos: formado por ligações β-(1,3),(1,6) com algumas ligações β-(1,4), e

outro, mais frequente, composto por ligações β-(1,4) com ramificações de L-

arabinofuranose a cada 16 a 21 resíduos da cadeia principal (Figura 1).

A mobilização dos galactanos de reserva de Lupinus angustifolius foi

descrita por Crawshaw & Reid (1984) e as alterações estruturais do galactano

que acompanham o processo foram descritas por Parker (1984), onde após a

mobilização a maior parte das ramificações com galatose e arabinose é

removida da parede celular, permanecendo um material residual enriquecido

em ramnose, ácido urônico e glucose (Figura 1).

Matheson & Saini (1977) reportaram a presença de duas α-

arabinosidases e três β-galactosidases em cotilédones de Lupinus luteus, cujas

34

atividades de ambas as enzimas se mostraram relacionadas à expansão

cotiledonar.

Figura 1: Estrutura e mobilização do galactano. (A) Estrutura do galactano mais frequente

composto por ligações β-(1,4) com ramificações de L-arabinofuranose a cada 16-21 resíduos da

35

cadeia principal (não mostrada). Ainda existe um segundo tipo de galactano formado por ligações

β-(1,3)(1,6). (B) Reações envolvendo a mobilização do polissacarídeo de reseva em Lupinus sp. β-

(1,4)-D-galactano é o polímero dominante, sendo descrito como uma ramificação do

rhamnogalacturanano, por vezes ramificado por ligações α-(1,5)-arabinano. Uma molécula de α-

(1,3), (1,6)-D-galactano também está representado embora ocorre em quantidades menores. Neste

sistema de degradação, apenas exoenzimas foram detectadas, uma das quais (exo-α-(1,4)-

galactanase a partir de Lupinus angustifolius) é capaz de libertar a maior parte (cerca 60%) das

paredes celulares intactadas da mesma espécie. In vivo, outras galactosidases e arabinosidases

parecem agir no ramos deixando apenas ramnogalacturonano. O destino dos produtos é

meramente hipotético neste esquema. Figura retirada e adaptada de Buckeridge et al. (2000b) e

Buckeridge et al. (2000c).

Buckeridge & Reid (1994) isolaram uma exo-β-(1,4)-galactanase dos

cotilédones de Lupinus angustifolius e, em 1996, propuseram um modelo

hipotético de degradação dos galactanos.

Neste modelo de degradação (Buckeridge et al., 2000b), a exo-β-(1,4)-

galactanase é apontada com a enzima chave da mobilização do galactano,

sendo capaz de hidrolisar 82% das unidades de galactose da cadeia principal

do polímero, bem como cerca de 63% das galactoses presentes no polímero

em paredes celulares intactas. Os produtos da degradação, arabinose e

galactose livres podem ser utilizados na produção de sacarose para utilização

pelo embrião em desenvolvimento (Buckeridge et al., 2000b).

O galactano é uma molécula de múltiplas funções, exercendo tanto a

função de reserva de parede celular, como também, sendo um importante

elemento na modulação da expansão cotiledonar durante o desenvolvimento

da plântula.

1.5.2. Xiloglucanos

O xiloglucano é uma das principais hemiceluloses presentes em paredes

celulares de dicotiledôneas, também podendo ser acumulado como reserva de

parede celular de sementes de algumas Leguminosae-Caesalpinoidae.

Estruturalmente os xiloglucanos são compostos de uma cadeia principal

de glucose unida por ligações β-(1,4), onde ocorrem ramificações regulares

com xilose ligada α-(1,6). Algumas destas xiloses ainda podem apresentar

ramificações por galactose ligadas α-(1,2). Em parede celular primária, mas

36

não em parede celular de reserva, as ramificações por galactose ainda podem

ser ramificadas por fucose ligada α-(1,2) (Figura 2A).

O sistema de degradação do xiloglucano de reserva mais estudado foi o

componente da semente de Tropaeolum majus. Edwards et al. (1985)

acompanharam a mobilização do xiloglucano nesta espécie e notaram um

aumento da atividade enzimática da β-glucosidase, β-galactosidase,

α-xilosidase e endo-β-(1,4)-glucosidase durante a mobilização do xiloglucano.

Apesar da mobilização da reserva de xiloglucano presente em sementes

de Hymenea courbaril (jatobá) ter sido sugerida por Kooiman (1960), o

acompanhamento detalhado só foi realizado por Tiné et al. (2000) (Figura 2B).

O mecanismo de degradação proposto por Tiné & colaboradores (2000)

é dividido em três partes: transglicosilação, onde o polissacarídeo seria

parcialmente hidrolisado pela XTH (xiloglucano transglicosidase hidrolase);

desgalactosilação, etapa onde certas unidades de galactose dos produtos da

ação anterior da XTH seriam hidrolisados pela β-galactosidase; e

desmontagem, onde os oligossacarídeos remanescentes da ação da β-

galactosidase entrariam no ciclo final de degradação, onde a glucose e a xilose

seriam atacadas pela β-glucosidase e α-xilosidase, produzindo

monossacarídeos livres para a utilização do embrião no desenvolvimento

(Figura 2B).

37

Figura 2: Estrutura e mobilização de xiloglucano de reserva de sementes. (A) Estrutura molecular

do xiloglucano de reserva contendo cadeia principal de glucose unida por ligações β-(1,4), onde

ocorrem ramificações regulares com xilose ligada α-(1,6). Algumas destas xiloses ainda podem

apresentar ramificações por galactose ligadas α-(1,2). (B) Representação esquemática da

38

degradação de reserva de xiloglucano em sementes. Uma sequência de XLXGXLLGXXXGXXLG é

usada como um exemplo de um segmento de um polímero de xiloglucano com a extremidade não-

redutora voltada para a esquerda. O primeiro ataque é feita por xiloglucano-endo-β-

transglicosilase (XET) e β-galactosidase (β-gal proveniente de Nasturtium apenas). Os

oligossacáridos produzidos pela ação endo da XET são atacados por β-galactosidases (Nβ-

gal=Nasturtium β-galactosidase; Cβ-gal= Copaifera β-galactosidase, o último sendo capaz de atacar

oligossacarídeos apenas em certas posições (galactoses colocadas na ponta não-redutora). A α-

xilosidase e a β-glucosidase agem em hidrólises alternadas do final não-redutor. (*) Em leguminosas

(Copaifera langsdorffii e Hymenaea courbaril), após uma rodada de ação destas duas enzimas, a

galactose estará novamente próximo do terminal não-redutor. Desata forma, a β-galactosidase pode

agora agir sobre o oligossacarídeo XLG, libertando assim a galactose e permitindo a continuidade

da ação das outras duas exo-glicosidases. Nestas duas espécies, a galactose retirada dos

oligossacarídeos é possivelmente limitadora da degradação, pois a enzima possui um pH ótimo de

3,2, enquanto as demais enzimas possuem um pH ótimo de 4,5. Figura retirada e adaptada de

Buckeridge et al. (2000c) e Buckeridge et al. (2000b).

1.5.3. Mananos

Baseado em sua estrutura e composição, o grupo dos mananos pode

ser subdividido em três grupos: mananos puros, glucomananos e

galactmananos (Buckeridge et al., 2000a)

Glucomananos

Dentre os três subgrupos de mananos, os glucomananos são os menos

conhecidos.

A estrutura determinada por metilação apresenta uma cadeia principal

formada por um número proporcionalmente equivalente de resíduos de β-

glucopiranosídeo e β-manopiranosídeo unidos por ligações β-(1,4). Com certa

frequência pode-se detectar a presença de unidades de galactopiranosídeo

unidos α-(1,6) a cadeia principal (Buckeridge et al., 2000b).

39

Mananos Puros

Os mananos puros são definidos pelo seu conteúdo maior de 90% de

resíduos de β-manopiranosideo unidos por ligações β-(1,4) formando uma

cadeia linear sem ramificações, podendo ou não o restante da cadeia estar

ramificada com α-galactopiranosídeo (Buckeridge et al., 2000b).

Dea et al. (1986) demonstraram que mananos com taxa de ramificação

com galactose abaixo de 10% eram insolúveis e precipitavam rapidamente em

solução aquosa. Assim, os mananos são estruturalmente relacionados aos

galactomananos, apenas apresentando um grau menor de ramificações por

galactose, aumentando a interação entre as moléculas de manano, formando

cristais na parede celular, o que confere dureza à parede celular (Buckeridge et

al., 2000b).

Sachs (1862) e Keusch (1968) estudaram a germinação de sementes de

Phoenix dactylifera com reserva de manano. Determinaram a presença das

enzimas endo-β-mananase e β-manosidase responsáveis pela degradação do

manano contido nestas sementes.

Além da função de reserva de parede celular, os mananos parecem

estar relacionados à dureza da semente. Groot & Karssen (1987) e Groot et al.

(1988) evidenciaram que o manano presente da região endospérmica próxima

à extremidade da raiz de tomate, exerce papel crucial na protrusão da radícula,

pois o amolecimento do endosperma, induzido pela ação da giberelina, facilitou

a germinação.

Assim, o manano na forma de um polissacarídeo de reserva de parede

celular exerceria as funções de constritor e protetor mecânico do embrião,

como também, polissacarídeo de reserva.

1.6. Galactomananos

O primeiro estudo sobre a estrutura dos galactomananos provavelmente

foi feito por Naldeman, em 1890. Esse autor reportou a presença de galactose

e manose em várias espécies de leguminosas e também verificou que os

galactomananos se comportam como substâncias viscosas (Nadelman, 1890;

Buckeridge et al., 2000a).

40

Os galactomananos ocorrem tipicamente em endospermas de sementes

de Leguminosas, mas eles também estão presentes em sementes de espécies

de outras famílias como Compositae, Convolvulaceae, Annonaceae,

Malvaceae, Palmae, Rubiaceae e Umbelliferae (Tookey et al., 1962; Dea &

Morrison, 1975; Guzmán & Hernandez, 1982; Buckeridge et al., 2000b).

1.6.1. Estrutura química dos galactomananos

Os galactomananos são polissacarídeos compostos de uma cadeia

linear de resíduos de D-manose unidas por ligações glicosídicas β-(1,4), à qual

resíduos de D-galactose estão unidos por ligações α-(1→6), formando

ramificações simples (Buckeridge et al., 2000a) (Figura 3A).

Figura 3: Estrutura molecular do polissacarídeo galactomanano e explicação para a leitura das

“abreviações” dos oligossacarídeos GalXManY. (A) Cadeia principal linear de resíduos de D-manose

unidas por ligações glicosídicas β-(1,4), na qual resíduos de D-galactose estão unidos por ligações α-

(1,6), formando ramificações simples. Figura retirada e adaptada de Buckeridge et al. (2000a). (B)

A cadeia principal de manose é numerada a partir da extremidade redutora (à direita). O número

subscrito ligado à manose indica a quantidade de resíduos de manose que a cadeia principal do

oligossacarídeo possui, enquanto o número sobrescrito ligado a galactose indica a posição do

resíduo de galactose relativo ao resíduo de manose a partir da extremidade redutora (McCleary et

al., 1983).

41

A razão manose:galactose (M/G) e a distribuição dos resíduos de

galactose ao longo da cadeia variam de espécie para espécie, com a razão

ocorrendo entre 1:1 e 4:1. Esta propriedade é importante para estudos

quimiotaxonômicos e evolutivos (Buckeridge & Diertrich, 1990; Buckeridge et

al., 2000a).

Como dito anteriormente, os galactomananos são abundantes em

endospermas de sementes de Leguminosae (ou Fabaceae), a família com o

terceiro maior número de espécies do Reino Vegetal (Buckeridge et al., 2000a;

Buckeridge et al., 2000c). Essa família é subdividida em três subfamílias

(Caesalpinoideae, Mimosoideae e Faboideae) sendo possível classificá-las de

acordo com suas razões (M/G). A subfamília Caesalpinoideae possui a maior

razão M/G, ou seja, menor o grau de ramificação com galactose, seguida pela

Mimosoideae e finalmente Faboideae (Buckeridge et al., 2000c).

Além desse parâmetro taxonômico, visto acima, a razão M/G também

dita a solubilidade do polissacarídeo em água, e consequentemente, sua

interação com outros polissacarídeos, incluindo a celulose (Buckeridge et al.,

2000a).

1.6.2. Propriedades dos galactomananos

Embora os galactomananos sejam considerados polissacarídeos de

reserva (Buckeridge et al., 2000a), tem sido demonstrado que tal polímero

pode exercer outras funções além de reserva nas sementes.

Entre as funções, os galactomananos exercem o controle da embebição

(Reid & Bewley, 1979; Buckeridge et al., 2000c), dada sua alta solubilidade nos

primeiros estágios de germinação, esse polímero absorve grandes quantidades

de água, distribuindo-a ao redor do embrião (Buckeridge et al., 2000c).

O endosperma embebido protege o embrião contra perda d’água através

de um efeito conhecido como “tampão de água” durante os períodos de seca

após o início da germinação, protegendo-o contra estresse hídrico (Reid &

Bewley, 1979; Halmer & Bewley, 1979). Um comportamento similar também

pode ser visto em leguminosas tropicais, como em Sesbania virgata (Cav.)

42

Pers. (anteriormente publicado com o sinônimo Sesbania marginata por

Buckeridge et al., 1995a; Buckeridge & Dietrich, 1996).

Ligado à embebição, Groot & Karssen (1987) demonstraram que

distensão mecânica do endosperma, pela entrada de água, facilita a protrusão

da radícula. Sendo assim, facilitação da protrusão da radícula nas primeiras

fases da germinação também é uma função dos galactomananos.

Aparentemente as funções de reserva e embebição estão limitadas às

Leguminosas, ao passo que nas não leguminosas é aparente a existência da

função de dureza dos galactomananos. Embora, a função de dureza e proteção

parece também ser mantida em Leguminosas, como demonstrado por

Buckeridge et al. (2000c) e Lisboa et al. (2006), nas sementes de Sesbania

virgata (Cav.) Pers.

Dessa forma, fica evidente que diferenças na estrutura do

galactomanano propiciam a este polímero atuação em diversas funções

biológicas. Essas diferenças encontram-se no grau de ramificação: quanto

mais ramificado for o galactomanano, maior a possibilidade de sua função

biológica estar ligada com as relações hídricas. Em contrapartida, quanto

menos ramificado for o galactomanano, maior a sua chance de atuação com

dureza e proteção (Buckeridge et al., 2000c).

Desconhece-se qual das funções é primária entre as de reserva, de

embebição ou de dureza. Entretanto, é evidente que os galactomananos são

moléculas multifuncionais, desempenhando suas funções durante fases

distintas do crescimento e desenvolvimento das plantas (Buckeridge et al.,

2000c).

Por suas propriedades físico-químicas, os galactomananos apresentam

grande importância comercial, principalmente no que se refere a solubilidade e

a sua capacidade de formar soluções viscosas, sendo utilizados em diversos

setores industriais (Buckeridge et al., 2000a).

1.6.3. Mobilização dos galactomananos

De acordo com McCleary (1983), Buckeridge & Dietrich (1996) e

Buckeridge et al. (2000a) a mobilização do galactomanano presente no

endosperma de sementes se inicia somente após a emissão da radícula.

43

Os galactomananos são hidrolisados por três enzimas: α-galactosidase

(EC 3.2.1.22), endo-β-mananase ou β-1,4-manano-endo-hidrolase (EC

3.2.1.78) e exo-β-manosidase ou β-manosidase (EC 3.2.1.25) produzindo

galactose e manose livres ao mesmo tempo em que a glucose é produzida no

endosperma. Aparentemente essa última é disponibilizada ao embrião e servirá

como fonte de carbono e energia para o estabelecimento das plântulas

(Buckeridge et al., 2000a; Lisboa et al., 2006) (Figura 4).

A α-galactosidase é a enzima responsável pela quebra das ligações α-

(1,6) existentes entre as unidades de galactose e manose, enquanto que a

endo-β-mananase atua na cadeia principal de manano, rompendo as ligações

do tipo β-(1,4) existentes entre as unidades de manose, reduzindo o manano a

oligossacarídeos. A β-manosidase atua nas ligações β-(1,4) entre as unidades

de manose dos oligossacarídeos provenientes da ação da endo-β-mananase,

liberando manoses livres (Reid & Meier, 1972; McCleary, 1983; Buckeridge et

al., 1995a; Buckeridge & Reid, 1996; Buckeridge et al., 2000a).

De acordo com Reid & Edwards (1995) e Lisboa et al. (2006), a

degradação do galactomanano pelas enzimas requer uma ordem de atuação

das mesmas. Em sementes de leguminosas a ação da α-galactosidase é uma

condição necessária para permitir acesso à enzima endo-β-mananase a cadeia

principal do galactomanano. Apesar disso, em sementes de Lactuca sativa

(alface) a α-galactosidase só pode retirar galactose do produto de ação da

endo-β-mananase (Leung & Bewley, 1983).

44

Figura 4: Rotas bioquímicas envolvidas no catabolismo do galactomanano somado ao metabolismo

pelo embrião dos monossacarídeos liberados na degradação da reserva. Quando a camada de

aleurona não está presente, aparentemente as hidrolases são produzidas dentro das células

endospermáticas e secretadas para fora da parede celular onde as mesmas vias metabólicas

ocorrem. Man = manose; Gal = galactose; SPS = sacarose fostato sintase; Man-6-P = manose-6-

fosfato; Fru-6-P = frutose-6-fosfato; UDP-gal = uridina difosfatada de galactose; Suc-6-P =

sacarose-6-fosfato. Figura retirada e adaptada de Buckeridge et al. (2000b).

Por outro lado, a ação da β-manosidase só é possível sobre o produto

da degradação da α-galactosidase e endo-β-mananase. McCleary (1983)

demonstrou que a β-manosidase não apresenta atividade sobre o polímero

inteiro, só apresentando ação sobre oligossacarídeos de manano

desgalactosilados.

45

Apesar do conhecimento das enzimas envolvidas no processo de

mobilização do galactomanano, pouco se sabe sobre as características

bioquímicas intrínsecas das mesmas e, consequentemente, no modo de ação

dessas sobre o polissacarídeo.

Lisboa et al. (2006) purificaram e caracterizaram a enzima endo-β-

mananase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Neste trabalho

estimou-se seu peso molecular em 30kDa, temperatura ótima em 45°C, bem

como o pH ótimo em um intervalo entre 3,5-4,5. O ponto isoelétrico da enzima

encontra-se em pH 4,5.

Além disso, os autores demonstram que a endo-β-mananase apresenta

dois picos de atividade: um em 24horas após a embebição, e outro em 120

horas após a embebição. O primeiro pico, aparentemente, está relacionado

com a protrusão da radícula, enquanto que o segundo com a degradação do

galactomanano de reserva da semente (Lisboa et al., 2006). Esta observação

sugere que a função de amolecimento do endosperma para permitir a

protrusão da radícula esteja presente também em Leguminosae.

Em relação à mobilização do galactomanano, esses autores observaram

que a enzima endo-β-mananase, presente em sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers., só possui atividade caso o galactomanano já tenha sofrido a ação

da α-galactosidase previamente (Lisboa et al., 2006).

As demais enzimas, α-galactosidase e β-manosidase, ainda não foram

caracterizadas para Sesbania virgata (Cav.) Pers., porém, os conhecimentos

das características de ambas são de suma importância para o aprofundamento

do conhecimento da mobilização de galactomananos para essa espécie, bem

como para as demais espécies com sementes que armazenam galactomanano

como reserva.

Quanto à produção dessas três hidrolases, nas sementes de Trigonella

foenum-graecum e Cyamopsis tetragonoloba as células endospérmicas não

são vivas devido à alta deposição de galactomananos nas paredes celulares

durante a maturação, assim, essas sementes possuem uma camada de

aleurona, a qual se acredita ser responsável pela produção das enzimas

hidrolíticas de mobilização (Reid, 1985a).

Por outro lado, as sementes de Ceratonia siliqua possuem as células do

endosperma vivas. Neste caso, não existe distinção clara entre o endosperma

46

e a camada de aleurona. Dessa forma, provavelmente a produção e a liberação

das enzimas hidrolíticas são feitas pelas próprias células endospérmicas

(Buckeridge et al., 2000a).

Diferentemente da última espécie, em sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. a camada de aleurona é claramente distinguida, estando presente

entre o tegumento da semente e o endosperma, ao mesmo tempo em que este

último possui corpos protéicos (Buckeridge et al., 2000a). Baseado nessas

observações, Buckerigde & Dietrich (1996) propuseram que as enzimas de

hidrólise do galactomanano poderiam ser produzidas em ambos os locais,

camada de aleurona e células endospérmicas. Tonini et al. (2007) sugerem,

ainda, que a produção dessa enzimas possa ser feita não só no endosperma,

como no endotegumento. Porém, Tonini (2008) sugere que a produção dessas

enzimas hidrolíticas só ocorra durante a maturação da semente, não existindo

produção de novo das enzimas quando a semente já se encontra madura.

1.6.4. Regulação da Mobilização de Reserva de Galactomanano

Groot & Karsen (1987) demonstraram que a giberelina regula a

germinação da semente através da indução do amolecimento do endosperma

em sementes de tomate e Spyropoulos & Reid (1985) sugeriram que o

endosperma de Leguminosae deve estar sob controle de auxina e giberelina

para a degradação das reservas contidas no endosperma.

Tonini et al. (2006) demonstraram que a inibição da mobilização dos

galactomananos em sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. provavelmente

é controlada pelo tegumento da semente, pois essa contém ABA que age

negativamente na produção da enzima α-galactosidase. No entanto, Tonini et

al. (2010) sugerem que, antagonicamente ao ABA, o etileno induza a

degradação das reservas.

Além, disso o ABA tem sido descrito com um potente inibidor da

degradação do galactomanano em sementes de outras espécies: feno-grego

(Reid & Meier, 1973); caroba (Seiler, 1977); alface (Halmer & Bewley, 1979);

tomate (Nomaguchi et al., 1995) e Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Potomati &

Buckeridge, 2002), pela interferência na atividade das enzimas de hidrólise do

galactomanano.

47

Além da regulação esperada da mobilização de reserva por

fitohormônios, foi evidenciado uma modulação do processo de degradação de

xiloglucano de reserva de sementes realizada pela estrutura do próprio

polímero de xiloglucano (Tiné et al., 2003).

Tiné et al. (2003), analisando os oligossacarídeos produzidos pela

hidrólise com celulase do xiloglucano de reserva de diferentes espécies

(Tamarindus indica, Copaifera langsdorffii e Hymenea courbaril), constituídos

de diferentes taxas de substituição por galactose, demonstraram que

xiloglucanos de estrutura diferente são hidrolisados diferentemente; que os

oligossacarídeos menos ramificados são atacados preferencialmente pela

enzima e que a presença da β-galactosidase juntamente com a celulase,

impede a formação de oligossacarídeos combinados F2 e F3, sugerindo que o

padrão das substituições por D-galactose possuem influência direta na ação

enzimática.

Dessa forma, eles concluem que a estrutura do polissacarídeo, através

de suas ramificações pela galactose, codificaria, pelo menos, uma parte da

informação para a sua própria degradação, o que eles denominaram código do

xiloglucano.

Sendo o galactomanano um polissacarídeo de reserva de parede

celular, como o xiloglucano, espera-se que a estrutura fina do polissacarídeo

também apresente, pela distribuição das ramificações de galactose, uma parte

da informação para a sua própria degradação, como o demonstrado para o

xiloglucano.

1.7. Caracterização de α-galactosidase

Alfa-galactosidases (E.C. 3.2.1.22) catalisam a hidrólise de ligações α-

(1,6) de galacto-oligossacarídeos e de polímeros de galacto-(gluco)-mananos.

Essas enzimas estão amplamente distribuídas em animais, plantas e

microorganismos (Fujimoto et al., 2003).

Em humanos, a α-galactosidase é uma exoglicosilase lisossomal que

quebra resíduos de α-D-galactose de glicolipídeos e glicoproteínas. Mutações

no gene da α-galactosidase causam a incompleta degradação de carboidratos

da globotriaosilceramida ou GL-3, um glicolipídeo, que acaba por se acumular

48

nas células e consequentemente nos tecidos e órgãos (principalmente parede

de vasos sanguíneos, coração, cérebro e rim), resultando na doença de Fabry

(Fujimoto et al., 2003).

Em plantas, o galactomanano é um dos compostos mais encontrados

como reserva de parede celular de sementes e a α-galactosidase é uma

enzima chave para a mobilização deste composto para o crescimento do

embrião (Reid, 1985). Apesar de apresentar a função de mobilização de

reserva, algumas α-galactosidases podem estar associadas a outras funções

(McCleary & Matheson, 1974).

McCleary & Matheson (1974) detectaram múltiplas formas de α-

galactosidase em sementes de Cyamopsis tetragonoloba, embora somente

uma delas estivesse associada com a degradação do galactomanano presente

no endosperma. As sementes de Lycopersicon esculentum apresentam três

isoformas da enzima α-galactosidase e, através da obtenção e sequenciamento

do cDNA da enzima, demonstraram alta similaridade desta α-galactosidase

com outras galactosidases, especialmente a de Coffea arabica (Fuertado et al.,

2001).

Atualmente, já se deduziu, a partir de genes ou cDNA, estruturas

primárias de mais de cinquenta α-galactosidases. Análises da estrutura

primária e domínios hidrofóbicos demonstraram que as α-galactosidases

podem ser classificadas em três famílias de hidrolases glicosídicas: 4, 27 e 36

(Fujimoto et al., 2003). Em geral, as α-galactosidases de eucariotos possuem

alta similaridade na sequência de aminoácidos, inclusive quanto ao seu resíduo

catalítico (aspartato), e são classificadas na família 27, enquanto α-

galactosidases de bactérias são agrupadas nas famílias 4 e 36 (Fujimoto et al.,

2003).

De acordo com o banco de dados CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes

database) (Cantarel et al., 2008) as α-galactosidases possuem um domínio

conservado com a sequência G - [LIVMFY] - x - [LIVMFY] - x - [LIVM] - D - [DF]

- x - W - x - [RV] - [DNSF].

49

1.8. Caracterização da endo-β-mananase

As endo-enzimas como as endo-β-mananases (E.C. 3.2.1.78) catalisam

a hidrólise de ligações β-(1,4) de homoglicanos não ramificados compostos de

um único tipo de resíduo em sua cadeia principal, neste caso, manose, a

oligossacarídeos contendo no mínimo 2 a 3 resíduos (disssacarídeos e

trissacarídeos) (McCleary & Matheson, 1983).

Essas endo-enzimas que hidrolisam mananos puros vêm sendo

apontadas como importantes em eventos germinativos, antes da protrusão da

radícula, em sementes de Lycopersicon esculentum e em sementes de Lactuca

sativa, bem como, em eventos pós-germinativos de mobilização de reserva em

paredes celulares do endosperma de Lactuca sativa e Trigonella foenum-

graecum (Dirk et al., 1995).

Estudos conduzidos por McCleary & Matheson (1983) com endo-β-

mananases provenientes de fontes diversas, bactérias (Bacillus subtilis),

fungos (Aspergillus niger), animais (Helix pomatia) e plantas (Cyamopsis

tetragonoloba e Medicago sativa) evidenciaram que as endo-β-mananases

variam significativamente na habilidade de hidrolisar polissacarídeos de

galactomanano.

As endo-β-mananases de fungos prontamente hidrolisam polímeros com

alto grau de substituição por galactose e a presença de trissacarídeos 61-α-D-

galactopiranosídeo-(1,4)-β-D-manobiose no hidrolisado indica que estas

enzimas são capazes de hidrolisar alguns sítios de clivagem, onde um único

resíduo de manose não está substituído (McCleary & Matheson, 1983).

Em contraste, as endo-β-mananases de bactérias, animais e plantas

(proveniente de sementes germinadas de leguminosas) possuem uma ação

mais limitada em galactomananos com muitas substituições, onde somente

uma quantidade traço de trissacarídeo é liberada, mostrando que a ramificação

com galactose bloqueia alguns sítios disponíveis de clivagem pela endo-β-

mananase (McCleary & Matheson, 1983).

Quando estes mesmos autores compararam a diversidade e quantidade

de oligossacarídeos produzidos pela ação das endo-β-mananases de fontes

variadas sobre galactomanano de goma caroba, notaram que a enzima de

Aspergillus niger formou seis oligossacarídeos simples (F1), enquanto a de

50

Cyamopsis tetragonologa (guar) formou dez oligossacarídeos simples (F1),

evidenciando que a endo-β-mananase de plantas possui uma ação mais

limitada na clivagem do polissacarídeos altamente ramificado.

Apesar da diferença na diversidade dos oligossacarídeos, os

oligossacarídeos comuns às enzimas possuíam a mesma estrutura, indicando

que a enzima endo-β-mananase cliva os mesmos tipos de ligações, mas possui

uma especificidade diferenciada dependo da fonte (McCleary & Matheson,

1983).

As endo-β-mananases são capazes de hidrolisar oligossacarídeos de

tamanho mínimo de três resíduos de manose, no entanto, a taxa de hidrólise

aumenta consistentemente com oligossacarídeos com 5 a 6 resíduos,

indicando o número de monômeros envolvidos na afinidade máxima da enzima

pelo substrato, ou seja, a endo-β-mananase possui 5 subsítios de

reconhecimento da cadeia de manose (McCleary & Matheson, 1983).

A figura 5 representa um oligossacarídeo hipotético (cada resíduo de

manose identificado de A-E) e os 5 subsítios de reconhecimento da enzima (α-

ε), estando a extremidade redutora do oligossacarídeo a direita. De acordo,

com os dados apresentados por McCleary & Matheson (1983), a quebra do

oligossacarídeo com 5 manoses (hipotético) ocorreria sempre entre as

manoses C e D.

Figura 5: Representação esquemática dos subsítios de reconhecimento (α – ε) e ligação da endo-β-

mananase ao oligossacarídeo hipotético com 5 resíduos de manose (A-E) ligados β-(1,4). Figura

retirada de McCleary & Matheson, 1983.

A endo-β-mananase de Aspergillus niger é capaz de clivar entre as

manoses C e D mesmo havendo ramificações por galactose nas manoses A, C

ou E, porém a endo-β-mananase de Cyamopsis tetragonoloba fica bloqueada

caso exista uma substituição por galactose na manose C, novamente

51

mostrando que as enzimas de plantas possuem mais requisitos para a

clivagem e, portanto, apresentam uma maior diversidade de oligossacarídeos

(McCleary & Matheson, 1983). Além disso, evidencia a importância da co-

atuação da α-galactosidase e da endo-β-mananase para a completa

degradação do galactomanano de reserva, indicando que possivelmente as

ramificações com galactose possuam uma ação modulatória na endo-β-

mananase.

1.9. Espécie Sesbania virgata

Sesbania virgata (Cav.) Pers. está entre as espécies que acumulam

galactomanano em suas sementes. Essa espécie é pertencente à família

Leguminosae (= Fabaceae), subfamília Faboideae (= Papilionoideae), tribo

Robinieae (Kissman & Groth, 1999).

A planta é nativa do sul da América do Sul, abrangendo os seguintes

países: Paraguai, Uruguai, Argentina e Brasil. Neste último país, Sesbania

virgata (Cav.) Pers. ocorre nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste (Kissman

& Groth, 1999), normalmente associada a matas de galeria (Lisboa et al.,

2006). Esta espécie é infestante, perene, reproduzida por semente, de hábito

arbustivo, atingindo de 2 a 4 metros de altura, 25 cm de diâmetro a altura do

peito e 5 metros de copa. Possui flores pequenas e amarelas. Seus frutos

consistem em legumes indeiscentes de cor marrom opaco quando maduros,

corticosos, subarticulados, com pseudosseptos, com brusco afinamento tanto

da base, como da extremidade, sendo esta pontiaguda. Os frutos possuem de

4-8 sementes reniformes, que são lateralmente um pouco compridas, com

tegumento relativamente espesso e embrião axial curvo (Kissman & Groth,

1999; Araujo et al., 2004).

1.9.1. Justificativa para o uso da espécie

As sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. são um modelo

conveniente para o estudo da mobilização de reserva de galactomananos

devido: ao grande número de sementes produzidas por indivíduo, propiciando

uma grande quantidade de material para execução de experimentos; à alta

52

viabilidade das sementes, mesmo após armazenamento por anos, podendo ser

embebidas a qualquer momento para a realização de experimentos; ao

pequeno período de tempo necessário entre a embebição ao estabelecimento

da plântula, cerca de 7 dias, permitindo a execução de muitos experimentos em

um curto período de tempo; à fácil manipulação das sementes, pois são

pequenas para a embebição e germinação em placas de Petri, ao mesmo

tempo que são grandes o suficiente para manipulação individual com mãos

nuas; à grande regularidade de comportamento observada em diversas teses e

experimentos já realizados pelo grupo; e, principalmente, à bagagem de

conhecimento desenvolvida pelo grupo na maioria dos aspectos que

concernem à mobilização de reservas: desde a localização in situ da produção

das enzimas, à purificação da endo-β-mananase e regulação do processo, até

as características do galactomanano de reserva.

53

OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo a semipurificação e a

caracterização bioquímica da enzima α-galactosidase presente em sementes

de Sesbania virgata (Cav.) Pers., associado ao estudo da estrutura fina do

polissacarídeo de reserva (galactomanano) de sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers., visando determinar a interação enzima-substrato. Para tanto

buscou-se:

Avaliar a taxa de germinação das sementes, bem como, a máxima

atividade enzimática da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. durante a germinação e estabelecimento da plântula, através de

incubação das sementes por 7 dias consecutivos em câmaras de

germinação com acompanhamento da protrusão da radícula e atividade

enzimática a cada 24 horas;

Purificar a α-galactosidase presente em extrato bruto enzimático de

sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers., através de precipitação com

sulfato de amônio, seguido de Cromatografia de Troca-Iônica em coluna

Aniônica (Mono-Q – Pharmacia Biotech.) em sistema FPLC e

Cromatografia de Gel Filtração (Superose 6 – GE Healthcare®) em

sistema FPLC;

Caracterizar bioquimicamente a α-galactosidase de Sesbania virgata

(Cav.) Pers., em extrato bruto e após purificação, quanto a pH e

temperatura ótimos de atividade enzimática e aspectos cinéticos,

através de ensaios enzimáticos variando o pH, temperatura e

concentração do substrato colorimétrico 4-Nitrophenil-α-D-

Galactopiranosídeo (Sigma®);

Analisar sequências gênicas de α-galactosidase de plantas depositadas

em bancos de dados, através de comparação e análise filogenética

(construção de árvore de relação);

Avaliar a estrutura fina do polissacarídeo de reserva (galactomanano),

através da análise do perfil, em HPAEC-PAD, de oligossacarídeos

produzidos após hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania

54

virgata (Cav.) Pers. com endo-β-mananase de Aspergillus niger

(Megazyme®) somente e associada à ação da α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. ou de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®).

Avaliar a estrutura fina do polissacarídeo de reserva (galactomanano),

através da comparação do perfil, em HPAEC-PAD, dos oligossacarídeos

produzidos após hidrólises enzimáticas de (galacto)mananos de reserva

de sementes de 6 espécies (proporção manose:galactose variando de

1:1 a 150:1) com endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®).

55

CAPÍTULO 1

SEMIPURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DA ENZIMA α-GALACTOSIDASE PRESENTE EM SEMENTES DE

Sesbania virgata (CAV.) PERS.

56

I. Resumo

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de

carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular,

o galactomanano. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve

três enzimas hidrolíticas (α-galactosidase, endo-β-mananase e exo-β-

manosidase). A α-galactosidase é a primeira enzima a atuar sobre o

galactomanano, hidrolisando as ligações α-(1,6) das galactoses ramificadas

à cadeia principal de manano (ligados β-1,4), permitindo a ação da endo-β-

mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a β-

manosidase atuará (ligações β-1,4), transformando oligossacarídeos em

monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. A α-

galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers., uma leguminosa nativa,

presente no endosperma e tegumento da semente, foi semipurificada,

caracterizada quanto à temperatura ótima, pH ótimo, aspectos cinéticos (Km

e Vmáx), sequência interna, e comparada a Cyamopsis tetragonoloba (guar),

quanto as suas características bioquímicas e a 35 sequências de

aminoácidos de α-galactosidases de plantas já descritas na literatura,

quanto à similaridade na sequência de aminoácidos. Uma curva de tempo

de germinação e desenvolvimento da plântula mostrou germinação em 24

horas após embebição com atividade enzimática máxima da α-

galactosidase em 96 horas após a embebição (4° dia). A purificação da

enzima foi conduzida por 3 etapas: precipitação com Sulfato de Amônio

40% e 80%, Cromatografia de Troca-Iônica Aniônica em FPLC utilizando

coluna Mono-Q e Cromatografia de Gel Filtração em FPLC utilizando coluna

Superose 6. A α-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42

kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente

72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma

estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na

faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a

velocidade máxima de 0,5024 µmolGal.min-1.mgprot-1. Essas características

diferem daquelas encontradas para a α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba. A espectrometria de massas gerou os fragmentos:

57

ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADSNDK

W-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-

WNR, que fazem referência a 22% da proteína e possuem alta similaridade

com a sequência depositada de Cyamopsis tetragonoloba, estando

relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e

sequenciamento interno da α-galactosidase foram detectadas isoformas da

α-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-

se que estas isoformas encontradas após purificação em Cromatografia de

Troca-Iônica Aniônica em FPLC utilizando coluna Mono-Q estejam

relacionadas com outras funções da α-galactosidase, enquanto as

isoformas encontradas após Cromatografia de Gel Filtração em FPLC

utilizando coluna Superose 6 e identificação por espectrometria de massas

estejam relacionadas com ativação e adaptação da α-galactosidase durante

todo o processo de mobilização de reservas. A presença de isoformas e a

possível estrutura quartenária da enzima sugerem que a α-galactosidase de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. forme complexos enzimáticos para ativação

de α-galactosidases inativas, através de proteólise, no início da mobilização

de reserva e também forme complexos enzimáticos para a adaptação da α-

galactosidase no processo de mobilização de reserva, também por

proteólise (diminuição do peso molecular), onde as ramificações com a

galactose se tornariam raras, o que explicaria a gama de pesos moleculares

apresentados pelas diferentes isoformas (sequenciamento interno). Essas

evidências sugerem que no início da mobilização de reserva proteases

sejam transcritas e atuem sobre α-galactosidases inativas, ativando-as;

essas α-galactosidases ativas seriam as responsáveis pela ativação das α-

galactosidases inativas restantes e adaptação das α-galactosidases ativas

durante o processo de mobilização, também por proteólise, permitindo que

a enzima apresente características melhoradas para hidrolisar

eficientemente as ramificações por galactose cada vez mais raras no

decorrer do processo de mobilização. A α-galactosidase semipurificada foi

submetida, juntamente com a α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®), a ensaios enzimáticos com o substrato galactomanano,

visando determinar o modo de ação da enzima e a estrutura fina do

polissacarídeo (dados apresentados no Capítulo 2).

58

II. Introdução

Uma das mais espetaculares inovações que surgiram durante a

evolução das plantas vasculares (Angiospermas e “Gimnospermas”) foi a

semente. Este sucesso deve-se ao fato das sementes possuírem uma grande

capacidade de sobrevivência quando comparada com esporos livres, devido à

proteção que esta confere ao embrião, além dos recursos nela armazenados

para os estágios de germinação e estabelecimento (Raven, 2001).

Sementes de diversas espécies de leguminosas acumulam

galactomananos na parede celular dos endospermas, sendo denominados

polissacarídeos de reserva de parede celular (PRPC) (Reid, 1985; Buckeridge

& Reid, 1996; Buckeridge et al. 2000b; Buckeridge et al., 2004a).

Os polissacarídeos de reserva, além da função de armazenar e prover

energia para o embrião, também desempenham um papel importante no

controle da embebição de água no início da germinação, absorvendo grande

quantidade de água e a distribuindo ao redor do embrião, protegendo-o contra

dessecação (Reid & Bewley, 1979; Buckeridge et al., 2000c).

Outras funções já foram descritas para os polissacarídeos de reserva de

parede celular: dureza e resistência física ao endosperma no período de

germinação, sendo importante na regulação da constrição mecânica à

protrusão da radícula (Buckeridge et al., 2000a; Lisboa et al., 2006).

Os polissacarídeos de parede são classificados em três grupos:

mananos, xiloglucanos e os (arabino)galactanos. O grupo dos mananos

engloba os mananos puros, glucomananos e galactomananos (Buckeridge et

al., 2000c).

Os galactomananos são polissacarídeos hemicelulósicos constituídos de

uma cadeia principal formada por unidades de D-manose unidas entre si por

ligações glicosídicas β-(1,4), na qual unidades de D-galactose formam

ramificações simples ligadas α-(1,6) (Moe et al., 1947; Unrau, 1961; Somme,

1968; Manzi & Cerezo, 1984).

A mobilização do galactomanano de reserva de sementes de

leguminosas já descritas se inicia após a germinação (Buckeridge et al., 2000c;

Tonini et al., 2006), sendo realizada pela ação de três enzimas hidrolíticas: α-

59

galactosidase (EC 3.2.1.22), endo-β-mananase (EC 3.2.1.78) e exo-β-

manosidase (EC 3.2.1.25), necessariamente nesta ordem (Reid & Meier, 1972;

McCleary & Matheson, 1976; Buckeridge & Dietrich, 1996), pois a presença das

ramificações de D-galactose na cadeia principal interferem na ação da endo-β-

mananase sobre a cadeia de manano (Reid & Edwards, 1995; Buckeridge et

al., 2000a; Lisboa et al, 2006).

As alfa-galactosidases (E.C. 3.2.1.22) catalisam a hidrólise de ligações

α-(1,6) de galacto-oligossacarídeos e de polímeros de galacto-(gluco)-

mananos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas em animais, plantas e


A presença de isoformas de α-galactosidase foi primeiramente descrita

por Petek & Dong (1961) em sementes de Coffea sp e Plantago ovata. Tonini

et al. (2006) sugerem que a presença de isoformas de endo-β-mananase em

endosperma de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seja para garantir a hidrólise do

galactomanano, mesmo com as modificações estruturais que este sofre

durante a mobilização.

Feurtado et al. (2001) sugeriram pelo menos três isoformas da α-

galactosidase durante e após a germinação de sementes de tomate e, através

da obtenção e sequenciamento do cDNA da enzima, demonstraram alta

homologia da forma ativa da α-galactosidase do tomate (40 kDa) com outras

galactosidases, especialmente com as de sementes de Coffea arabica (café)

(Zhu & Goldstein, 1994). Como apenas um gene para a α-galactosidase foi

identificado em sementes de tomate, as isoformas aparentemente se formam a

partir de modificações pós-traducionais (Feurtado et al., 2001).

McCleary & Matheson (1974) também detectaram múltiplas isoformas da

α-galactosidase, nas sementes de Cyamopsis tetragonoloba, embora apenas

uma delas (40 kDa) esteja associada com o endosperma (Overbeeke et al.

1989). DeMason & colaboradores (1992) detectaram quatro isoformas da

enzima durante o desenvolvimento do endosperma de sementes de palmeira.

Em sementes de alfafa, Cyamopsis tetragonoloba, Ceratonia siliqua, soja,

palmeira, café, feijão, Lupinus angustifolius (lupino) e Trifolium repens pelo

menos duas isoformas da α-galactosidase estão presentes, com massas

moleculares variando entre 17-57 kDa (Courtois & Petek 1966, McCleary &

60

Mathenson 1974, Williams et al. 1978, Itoh et al. 1979, Plant & Moore 1982,

Chandra Sekhar & DeMason 1990, Dhar et al. 1994).

As α-galactosidases também foram descritas relacionadas ao

amadurecimento de frutos. Soh et al. (2006) detectaram três isoformas da α-

galactosidase no fruto de Carica papaya (mamão papaia), com pesos

moleculares de 170, 57 e 29 kDa. Durante o desenvolvimento de frutos de

Cucumis melo (melão), três isoformas da α-galactosidase também foram

detectadas, uma delas com peso molecular em torno de 27 kDa (Gao &

Schaffer, 1999).

Assim, as diferentes isoformas de α-galactosidase podem estar

relacionadas tanto a diferenças estruturais do galactomanano durante a

mobilização, como por exemplo, à diminuição de substituições por galactose o

que demandaria uma α-galactosidase com maior afinidade ao substrato; como

também a diferentes funções além da degradação do galactomanano, por

exemplo, a degradação de açúcares da série rafinósica (Bewley,1997) e até o

amadurecimento de frutos (remodelamento da parede celular) (Gao & Schaffer,

1999; Soh et al., 2006).

A ação das enzimas relacionadas com a mobilização de reserva de

sementes é regulada por fito-hormônios. O ácido abscísio (ABA) é um potente

inibidor da degradação da reserva de galactomanano e está envolvido no

mecanismo de regulação dessa mobilização em sementes de Ceratonia siliqua

(Seller, 1977), Lactuca sativa (Halmer & Bewley, 1979), Lycopersicon

sculentum (Groot & Karssen, 1992), Trigonella foenum-graecum (Reid & Meier,

1973; Malek & Bewley, 1991; Kontos & Spyropoulos, 1995) e Sesbania virgata

(Cav.) Pers. (Potomati & Buckeridge, 2002; Tonini et al., 2006).

Tonini (2009) demonstrou que a mobilização de reserva de

galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. é modulada

negativamente pela presença do ABA, enquanto o etileno é promotor da

mobilização.

Além da regulação direta realizada pelos fito-hormônios, a degradação

da reserva pode ser regulada pela ação de proteases, que normalmente são

moduladas pelos fito-hormônios (Tonini, 2009). Sabe-se que proteases são

responsáveis por modificações pós-traducionais de proteínas, com ação

proteolítica limitada a regiões específicas, necessárias para o processamento e

61

maturação de enzimas pré-formadas e controle da atividade destas (Schaller,

2004). Em sementes de Cyamopsis tetragonoloba (guar) e cevada, a enzima

α-galactosidase e β-amilase, respectivamente, podem ser ativadas através de

digestão por enzimas proteolíticas (Overbeeke et al. 1989, Guerin et al. 1992).

Tendo em vista a importância da α-galactosidase na mobilização de

reserva de galactomanano e visando a compreensão das suas características e

modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação e

caracterização bioquímica da α-galactosidase de sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers.

III. Material e Métodos

3.1. Coleta do Material Vegetal

As sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizadas na execução

dos experimentos de purificação e caracterização foram coletadas de diversos

indivíduos localizados nas imediações da Universidade de São Paulo, São

Paulo/SP, evitando, assim, vício amostral. As sementes foram separadas dos

frutos maduros e mantidas em frascos herméticos a temperatura ambiente.

As sementes coletadas foram utilizadas na preparação do extrato bruto

enzimático visando à semipurificação da enzima α-galactosidase presente nas

sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

3.2. Determinação da porcentagem de germinação e pico de

atividade enzimática

A fim de determinar a viabilidade das sementes coletadas e o momento

(em dias) após a embebição, onde se encontra a maior atividade enzimática da

α-galactosidase, procedeu-se com a embebição das sementes e

acompanhamento da germinação e desenvolvimento da plântula por 7 dias sob

luz e temperatura constantes, seguido de preparação de extrato enzimático e

mensuração da atividade enzimática.

62

3.2.1. Germinação das sementes quiescentes

Após o beneficiamento dos frutos, as sementes quiescentes foram

escarificadas mecanicamente com lixa na região abaixo do hilo e,

posteriormente, esterilizadas com uma solução de hipoclorito de sódio a 0,75%

por 15 minutos, seguido por enxágue com água destilada.

Em seguida, as sementes quiescentes foram incubadas em placas de

Petri (10cm de diâmetro) sobre papel de filtro, 10 sementes por placa e 0,5mL

de água destilada/semente (5mL), sendo mantidas sob condições de luz

constante e temperatura de 28°C, durante 7 dias (período que abrange as

fases de germinação e degradação total da reserva - galactomanano).

A cada 24 horas de incubação a partir da embebição (168 horas - 7 dias)

3 placas de Petri, contendo 10 sementes por placa, foram retiradas da

incubação e processadas individualmente.

Essas sementes coletadas, cada grupo de 10 sementes, foram

dissecadas, separando o tegumento e o endosperma do embrião (descartado)

e os tecidos submetidos à mensuração do peso fresco, extração de proteínas

mensuração da atividade enzimática, descritos a seguir.

3.2.2. Determinação do peso fresco do endosperma e tegumento

Cada grupo de 10 sementes foi pesado (peso fresco total), em seguida,

determinado a taxa de germinação através da observação da emissão da

radícula (total de sementes com emissão de radícula/total de sementes por

placa), as sementes foram dissecadas para separação do tegumento e

endosperma, os tegumentos e endospermas foram novamente pesados (peso

fresco sem embrião) e finalmente foram submetidos à extração de proteínas,

visando à determinação da atividade enzimática.

63

3.2.3. Extração protéica, determinação de proteínas totais, determinação

da atividade enzimática da α-galactosidase e eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE)

Os tecidos isolados, endosperma e tegumento, das sementes coletadas

(10 sementes a cada dia, com 3 repetições) foram macerados usando

nitrogênio líquido, homogeneizados em tampão Tris-HCl 20mM pH 7.8 e

2g/100mL de Polivinilpirrolidona (PVPP) e deixados em repouso por 1 hora a

5°C. Após repouso, o extrato foi submetido à centrifugação a 10.000g, a 5°C

por 10 minutos e o sobrenadante (extrato bruto enzimático) foi submetido à

dosagem de proteínas e da atividade enzimática da α-galactosidase.

O conteúdo de proteínas totais em cada amostra foi determinado pelo

método de Bradford de quantificação de proteínas (Bradford,1976), utilizando

como padrão Albumina de Soro Bovino (BSA). Trinta microlitros de amostra

(podendo estar diluída 1:10) foram homogeneizados a 170µL de reagente de

Bradford diluído 4:1 (4 partes de reagente de Bradford para 1 parte de água

Milli-Q®). As leituras de absorbâncias foram feitas em leitor de placa Elisa no

comprimento de onda (λ) de 595nm.

O pico de atividade enzimática, dia após embebição onde se encontra a

maior atividade enzimática, foi determinado através de ensaio enzimático

utilizando as réplicas de cada coleta e o substrato enzimático 4-Nitrophenil-D-

galactopiranosídeo (Sigma Chem. Co. St. Louis, USA) (PNP-α-Gal), seguido de

leitura em espectrofotômetro a 405nm, de acordo com Alcântara et al.(1999).

As três réplicas de cada horário (24h a 168h) foram ensaiadas

separadamente, seguindo o seguinte protocolo: 10µL de tampão McIlvaine pH

5.0, 10µL de PNP-α-Gal a 50mM e 10µL de extrato bruto (proveniente de cada

réplica de cada horário). Após homogeneização, os tubos foram incubados a

45°C por 15 minutos e, em seguida, a reação foi interrompida com 2mL de

carbonato de sódio a 0,1N e a absorbância determinada a 405nm.

A atividade enzimática específica foi determinada através da seguinte

equação:

64

Onde, Constante é o coeficiente de extinção molar do PNP-α-

galactopiranosídeo; VTE é o volume total de ensaio (2,03mL); VTEB é o

volume total de extrato bruto em mL; VEE é o volume de enzima utilizada no

ensaio (0,01mL); t é o tempo do ensaio enzimático (15 minutos); TPEB é

proteína total (mg) do extrato bruto.

A análise qualitativa das proteínas foi feita através de eletroforese em

gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes, em presença de dodecil

sulfato de sódio (SDS-PAGE), empregando-se um sistema descontínuo,

baseado no método descrito por Laemmli (1970).

As eletroforeses foram feitas em mini-géis de 0,75 mm de espessura (9

X 6cm), contendo 12% de acrilamida, montados em cuba vertical de

eletroforese modelo mini-protean (Bio-Rad). Durante a corrida foi mantida

corrente constante de 100 mA por cerca de 70 minutos, tempo necessário para

o marcador alcançar a extremidade inferior do gel.

O marcador de peso molecular utilizado foi Kaleidoscope Prestained

Standard (Bio-Rad) que contém: miosina (195 kDa), β-galactosidase (111,6

kDa), albumina de soro bovino (59,4 kDa), anidrase carbônica (30 kDa), inibidor

de tripsina de soja (24,7 kDa), lisozima (12,5 kDa) e aprotinina (6,4 kDa).

Para revelação das proteínas, após a corrida, o gel foi imerso em

solução de Coomassie Brilliant Blue R250 0,1% dissolvido em ácido

acético:metanol:água (1:4:5 - v/v/v), durante 1 hora a temperatura ambiente e

sob agitação contínua. Em seguida, o gel foi mantido em solução descorante,

ácido acético:metanol:água (1:4:5 - v/v/v), sob agitação contínua e trocas

frequentes da solução (Hames, 1990).

65

3.3. Purificação da α-galactosidase de sementes de Sesbania


3.3.1. Incubação das sementes de Sesbania virgata para purificação da α-

galactosidase

Com a finalidade de obter extrato bruto enzimático visando à

caracterização em extrato bruto e purificação da α-galactosidase presente em

sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers., aproximadamente 1000 sementes

de Sesbania virgata (Cav.) Pers. foram escarificadas mecanicamente e

esterilizadas com hipoclorito de sódio 0,75%, como descrito no item 3.2.1.

Germinação das sementes quiescentes.

As 1000 sementes foram incubadas em 4 bandejas sobre papel de filtro

por 96 horas após embebição (4 dias após embebição) sob luz constante e

temperatura de 28°C.

Ao final das 96 horas, as sementes foram pesadas (Peso Fresco Total),

dissecadas para separação do tegumento e endosperma, e estes foram

pesados para determinação do Peso fresco sem embrião.

O extrato bruto foi realizado a partir dos tegumentos e endospermas

dissecados, seguindo o mesmo protocolo anteriormente descrito no item 3.2.1.

Germinação das sementes quiescentes, resultando em um volume final de

156mL de extrato bruto disponível para purificação da α-galactosidase e

caracterização do extrato bruto.

O extrato bruto foi submetido à determinação das proteínas totais, pelo

método de Bradford (Bradford, 1976), e determinação da atividade enzimática

da α-galactosidase, ensaio enzimático com PNP-α-Gal, seguindo o mesmo

protocolo anteriormente descrito no item 3.2.1. Germinação das sementes

quiescentes.

66

3.3.2. Caracterização da temperatura ótima e pH ótimo da α-

galactosidase em extrato bruto enzimático

A fim de padronizar o ensaio enzimático da α-galactosidase para as

etapas de purificação e caracterizar esta enzima quando no extrato bruto,

procedeu-se com a determinação da temperatura ótima e pH ótimo de

atividade enzimática da α-galactosidase.

3.3.2.1. Temperatura Ótima

Para determinar a temperatura ótima da α-galactosidase em extrato

bruto, amostras de 10µL de extrato bruto foram incubadas juntamente com

10µL de PNP-α-galactopiranosídeo e 10µL de tampão McIlvaine pH 5.0 em

temperaturas crescentes: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 e 60°C, por 15 minutos,

seguido de acréscimo de 2mL de Na2CO3 a 0,1N e leitura a 405nm, como

descrito no item 3.2.1. Germinação das sementes quiescentes.

3.3.2.2. pH Ótimo

Para determinar o pH ótimo da α-galactosidase em extrato bruto,

amostras de 10µL de extrato bruto foram incubadas juntamente com 10µL de

PNP-α-Gal e 10µL de tampão McIlvaine variando de pH 2 a 7 (2.6; 3.0; 3.4; 4.0;

4.4; 5.0; 5.4; 6.0; 6.4 e 7.0) (McIlvaine, 1921) ou 10µL de tampão Fosfato para

pH 7.5 e 8.0, por 15 minutos, seguido de acréscimo de 2mL de Na2CO3 a 0,1N

e leitura a 405nm, de acordo com a metodologia descrita no item 3.2.1.

Germinação das sementes quiescentes.

3.3.3. Primeira Etapa de Purificação da α-galactosidase: Precipitação com

Sulfato de Amônio

Primeiramente, foi realizada uma precipitação com sulfato de amônio

com saturações de 20%, 40%, 60% e 80% visando padronizar o protocolo e

determinar a saturação, na qual a enzima α-galactosidase, é precipitada.

67

Partiu-se de 144mL de extrato bruto de tegumento e endosperma de

Sesbania virgata (Cav.) Pers., realizado como descrito no item 3.2.1.

Germinação das sementes quiescentes, acrescentou-se a massa de sulfato de

amônio referente a saturação de 20%, após homogeneização, a mistura foi

deixada a 5°C por 40 minutos, seguido de centrifugação a 13000g a 5°C por 15

minutos.

O precipitado, proteínas precipitadas com 20% de Sulfato de Amônio, foi

ressuspendido com tampão Tris-HCl 20mM pH7.8 e armazenado a -20°C até

ensaio enzimático, quantificação de proteínas pelo método de Bradford

(Bradford, 1976) utilizando BSA como padrão e eletroforese em gel de

poliacrilamida 12% (Laemmli, 1970) corado com Coomassie R250 a 0,1%

(dissolvido em ácido acético:metanol:água (1:4:5 - v/v/v)), utilizando como

padrão Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad).

Ao sobrenadante, após verificação de volume, foi acrescido massa de

sulfato de amônio referente à saturação de 40% e a mesma metodologia foi

aplicada até o acréscimo da massa referente a saturação de 80%, onde o

sobrenadante após centrifugação, denominado de descarte, foi armazenado a

-20°C até ensaio enzimático, quantificação de proteínas e eletroforese em gel

de poliacrilamida, e o precipitado de 80% também foi ressuspendido com

tampão Tris-HCl 20mM pH7.8 e armazenado a -20°C até ensaio enzimático,

quantificação de proteínas e eletroforese em gel de poliacrilamida.

Uma alíquota do extrato bruto, os precipitados de 20%, 40%, 60% e 80%

e o descarte foram submetidos a ensaio enzimático utilizando o substrato

sintético PNP-α-Gal, tampão McIlvaine pH4,4 a 45°C, como descrito no item

3.2.1. Germinação das sementes quiescentes, para determinação do

precipitado com maior atividade de α-galactosidase, e foram submetidos à

eletroforese em gel de poliacrilamida 12% (Laemmli, 1970) corado com

Coomassie R250 a 0,1% (dissolvido em ácido acético:metanol:água (1:4:5 -

v/v/v)), utilizando como padrão Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad).

Após este experimento inicial de precipitação com sulfato de amônio

seguido de ensaio enzimático optou-se por utilizar somente as saturações de

40% e 80% seguindo o protocolo descrito.

Dessa forma, os 156mL de extrato bruto, destinados a purificação, foram

submetidos a saturação de 40% de sulfato de amônio, resultando em 16,5mL

68

de precipitado ressuspendido em tampão Tris-HCl 20mM pH 7.8, que foram

congelados a -20°C até ensaio enzimático. O sobrenadante foi submetido a

saturação de 80% de sulfato de amônio resultando em 13.5mL de precipitado

ressuspendido em tampão Tris-HCl 20mM pH 7.8 e 320mL de descarte, ambos

congelados a -20°C até ensaio enzimático, quantificação de proteínas e a

próxima etapa de purificação.

Alíquotas dos precipitados de 40% e 80% ressuspendidos em tampão

Tris-HCl 20mM pH 7.8 e do descarte foram submetidas a ensaios enzimáticos

e quantificação de proteínas como descrito no item 3.2.1. Germinação das

sementes quiescentes, visando confirmar a atividade enzimática da α-

galactosidase e determinar qualquer perda nesta atividade enzimática pelo

protocolo de precipitação com sulfato de amônio, quando comparado com a

atividade enzimática determinada no extrato bruto.

Todo o volume do precipitado de 80% ressuspendido em tampão Tris-

HCl 20mM pH7.8 foi destinado a segunda etapa de purificação.

3.3.4. Segunda Etapa de Purificação da α-galactosidase: Cromatografia de

Troca-Iônica com Coluna Aniônica (Mono-Q)

Inicialmente 5 mL do precipitado de 80% ressuspendido em Tris-HCl

20mM pH7.8 foi dialisado por 24 horas, com trocas a cada 2 horas, contra o

mesmo tampão (tampão Tris-HCl 20mM pH7.8) visando retirar todo o sulfato de

amônio diluído na amostra.

Em seguida, a amostra dialisada foi concentrada em concentrador de

amostras Amicon® Ultra-4 Centrifugal Units (Millipore) e, posteriormente,

submetida à coluna de dessalinização P-10 Desalting Colunm (GE Healthcare)

para garantir completa retirada de sulfato de amônio.

Finalmente, a amostra foi submetida à Cromatografia de Troca-Iônica

Aniônica utilizando FPLC ÄKTA (GE Healthcare), com coluna Aniônica, Mono-

Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech), tendo como eluentes: tampão Tris-HCl 20mM

pH7.8 e tampão Tris-HCl 20mM pH7.8 com 0.5M de NaCl.

A purificação da α-galactosidase ocorreu através da seguinte

metodologia em FPLC ÄKTA: equilíbrio da coluna com 5 volumes de coluna

(40mL) com tampão Tris-HCl 20mM pH7.8, seguido de injeção da amostra na

69

coluna, lavagem da coluna com 2 volumes de coluna (8mL) com tampão Tris-

HCl 20mM pH7.8 para retirar o pool de proteínas que não interagiram com a

coluna, em seguida, foi iniciado o gradiente de NaCl variando de 0M a 0.5M em

12 volumes de coluna (96mL) para liberação das proteínas gradualmente

dependendo de sua interação com a coluna, finalmente a concentração de

0.5M de NaCl foi mantida por mais 5 volumes de coluna (40mL) para limpeza

da coluna.

A atividade enzimática da α-galactosidase, nas frações de 1mL

coletadas durante o processo de purificação, foi monitorada com PNP-α-D-

galactopiranosídeo, tampão McIlvaine pH4,4 a 45°C, conforme descrito no item

3.2.1. Germinação das sementes quiescentes.

As frações que apresentaram atividade enzimática foram reunidas, uma

alíquota (50µL) sempre armazenada a -20°C e o restante submetido à

eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-

PAGE), visando o acompanhamento da purificação da α-galactosidase, ou

submetido a experimentos para desenvolvimento da tabela de purificação, ou

submetido à terceira etapa de purificação.

3.3.5. Terceira Etapa de Purificação da α-galactosidase: Cromatografia de

Gel Filtração (Superose)

Primeiramente, a amostra proveniente da cromatografia aniônica foi

concentrada em concentrador de amostras Amicon® Ultra-4 Centrifugal Units

(Millipore) e, posteriormente, submetida à coluna de dessalinização P-10

Desalting Colunm (GE Healthcare) para troca do tampão Tris-HCl 20mM pH 7.8

para tampão acetato de amônio 50mM pH5.0.

A amostra foi submetida à Cromatografia de Gel filtração utilizando

FPLC ÄKTA (GE Healthcare), com coluna Superose 6 (GE Healthcare), tendo

como eluente: tampão acetato de amônio 50mM pH5.0.

A purificação da α-galactosidase ocorreu através da seguinte

metodologia em FPLC ÄKTA: equilíbrio da coluna com 4 volumes de coluna

(100mL) de água deionizada Milli-Q, seguido de equilíbrio com 2 volumes de

coluna (50mL) de tampão acetato de amônio 50mM pH5.0, em seguida, a

70

amostra foi injetada na coluna, sendo mantido um fluxo de acetato de amônio

50mM pH5.0 de 0.3mL/minuto até ausência de detecção de proteína por UV.

A atividade enzimática da α-galactosidase, nas frações de 0,5mL

coletadas durante o processo de purificação, foi monitora com PNP-α-D-Gal,

tampão McIlvaine pH 4,4 a 45°C, conforme descrito no item 3.2.1. Germinação

das sementes quiescentes.

As frações que apresentaram atividade enzimática foram reunidas e uma

alíquota (20µL) sempre foi armazenada a -20°C, sendo o restante dos 2 mL

submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de

sódio (SDS-PAGE) ou submetidos a experimentos de caracterização

enzimática e desenvolvimento da tabela de purificação ou submetidos ao

sequenciamento interno da proteína ou submetidos aos experimentos com

polissacarídeo – galactomanano (Capítulo 2).

Salienta-se que para a realização dos diversos experimentos, a

purificação foi realizada mais de uma vez, sempre partindo do mesmo volume

inicial do precipitado de 80% ressuspendido e seguindo a mesma metodologia

descrita.

3.3.6. Tabela de Purificação

Para o desenvolvimento da tabela de purificação todo o processo de

purificação, do extrato bruto à purificação em coluna Superose 6 em FPLC, foi

realizado com o armazenamento de alíquotas em cada etapa de purificação

(extrato bruto, precipitação com sulfato de amônio 80%, Mono-Q e Superose).

Cada alíquota de cada etapa foi submetida a ensaio enzimático com

PNP-α-Gal e quantificação de proteínas totais pelo método de Bradford

(Bradford, 1976), como descrito no item 3.2.1. Germinação das sementes

quiescentes.

Após coleta dos dados foram realizados cálculos para a determinação

do fator de purificação e rendimento da purificação.

71

3.3.7. Caracterização da α-galactosidase semipurificada de Sesbania

virgata (Cav.) Pers e da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (guar) (Megazyme®) quanto a temperatura ótima,

pH ótimo e aspectos cinéticos

A enzima α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. proveniente de uma das purificações (seguindo os três passos de

purificação) e a α-galactosidase de guar (Megazyme®) foram caracterizadas

quanto aos aspectos de temperatura ótima, pH ótimo e aspectos cinéticos, Km

e Vmáx.

3.3.7.1. Temperatura ótima

Para determinar a temperatura ótima da α-galactosidase semipurificada

e da α-galactosidase de guar (Megazyme®), alíquotas de 5µL de amostra foram

incubadas juntamente com 5µL de PNP-α-Gal e 5µL de tampão McIlvaine pH

4,4 em temperaturas crescentes: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 e 60°C, por 15

minutos, seguido de acréscimo de 1mL de Na2CO3 a 0.1N e leitura a 405nm,

como descrito no item 3.2.1. Germinação das sementes quiescentes. Para

cada temperatura o ensaio enzimático foi realizado em triplicata.

3.3.7.2. pH ótimo

Para determinar o pH ótimo da α-galactosidase semipurificada e da α-

galactosidase de guar (Megazyme®), alíquotas de 5µL de amostra foram

incubadas juntamente com 5µL de PNP-α-Gal e 5µL de tampão McIlvaine

variando de pH 2 a 7 (2.6; 3.0; 3.4; 4.0; 4.4; 5.0; 5.4; 6.0; 6.4 e 7.0) (McIlvaine,

1921) por 15 minutos a 45°C, seguido de acréscimo de 1mL de Na2CO3 a 0.1N

e leitura a 405nm, de acordo com a metodologia descrita no item 3.2.1.

Germinação das sementes quiescentes. Para cada pH o ensaio enzimático foi

realizado em triplicata.

72

3.3.7.3. Aspectos Cinéticos – Km e Vmáx

Para determinar os aspectos cinéticos da α-galactosidase semipurificada

e da α-galactosidase de guar (Megazyme®), alíquotas de 5µL de amostra foram

incubadas juntamente com 5µL de tampão McIlvaine pH 4.4 e 5µL de PNP-α-

Gal variando de 0,1mM a 30mM (0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.8; 1.0; 2.0; 3.0; 5.0; 8.0;

10; 13; 15; 17; 20; 25; 30mM) por 15 minutos a 45°C, seguido de acréscimo de

1mL de Na2CO3 a 0.1N e leitura a 405nm, de acordo com a metodologia

descrita no item 3.2.1. Germinação das sementes quiescentes. Para cada

concentração de substrato o ensaio enzimático foi realizado em triplicata.

3.3.8. Sequenciamento interno da α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers

O sequenciamento interno da α-galactosidase semipurificada foi

realizado no Laboratório de Espectrometria de Massas do Laboratório Nacional

de Biociências, CNPEM-ABTLuS.

Para a determinação de fragmentos da sequência interna da α-

galactosidase semipurificada, todo o processo de purificação, do extrato bruto à

purificação em coluna Superose 6 em FPLC, foi realizado com o

armazenamento de alíquotas em cada etapa de purificação (extrato bruto,

precipitação com sulfato de amônio 80%, Mono-Q e Superose).

Todo o material proveniente da purificação em Superose 6, bem como

as alíquotas de cada etapa, foram destinados à eletroforese em gel de

poliacrilamida 12% com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).

Oito bandas (proteínas) da amostra da purificação em Superose 6, entre

os pesos moleculares de 59,4 kDa e 12,5 kDa, foram recortadas do gel em

segmentos de 1mm com auxílio de um bisturi, armazenados em microtubos de

1,5 mL e submetidas a preparação para o sequenciamento interno.

Cada uma das oito bandas foi submetida a: descoloração, desidratação,

redução, alquilação, reidratação, digestão com tripsina e extração,

anteriormente à aplicação ao espectrômetro de massas. A metodologia de

cada uma das etapas de preparo está descrita a seguir.

Descoloração: os segmentos de gel contendo as proteínas foram

acrescidos de 0,5 mL da solução Destain (metanol 50%, ácido acético 2,5% em

73

água purificada) e incubados por 2 horas a temperatura ambiente. Após

descarte da solução, repetiu-se a etapa incubando somente por 1 hora.

Desidratação: a solução de Destain foi descartada e acrescentou-se aos

segmentos de gel 200 µL de acetonitrila 100%, incubou-se por 5 minutos e

descartou-se a solução. Esta etapa foi repetida e ao final o restante da

acetonitrila foi evaporado em evaporador por 2 a 3 minutos.

Redução: aos fragmentos de gel foi acrescido 30 µL de DTT 10 mM

(Ditiotreitol), incubado por 30 minutos a temperatura ambiente e descartada a

solução após centrifugação rápida (spin).

Alquilação: aos fragmentos de gel foi acrescido 30 µL de IAA 50mM

(Iodoacetamida), incubado por 30 minutos a temperatura ambiente e

descartada a solução após centrifugação rápida (spin). Os fragmentos de gel

foram lavados com 100µL de bicarbonato de amônio 100mM por 10 minutos e

descartada a solução. Os fragmentos de gel foram novamente desidratados

com 200µL de acetonitrila 100% por 5 minutos a temperatura ambiente.

Reidratação: os fragmentos de gel foram reidratados com 200µL de

bicarbonato de amônio 100mM por 10 minutos, descartada a solução após

centrifugação rápida (spin), novamente desidratados com 200µL de acetonitrila

100% por 5 minutos a temperatura ambiente. Esta última etapa foi repetida e

ao final o restante da acetonitrila foi evaporada em evaporador por 2 a 3

minutos.

Digestão das proteínas: aos fragmentos de gel for adicionados 30µL da

solução da tripsina 20ng/µL (20µg de tripsina em 1000µL de bicarbonato de

amônio 50mM gelado) e incubou-se por 30 minutos em gelo para a reidratação.

Centrifugou-se rapidamente (spin), retirou-se o excesso de tripsina, adicionou-

se 20µL de bicarbonato de amônio 50mM para cobrir o gel e incubou-se a 30°C

por 15 horas (overnight).

Extração: sem retirar a solução de bicarbonato de amônio 50mM

adicionou-se 10 µL de ácido fórmico 5% em água purificada, incubou-se por 10

minutos a temperatura ambiente e após centrifugação rápida (spin) armazenou-

se o sobrenadante em outro microtubo de 1,5 mL. Ao gel foi adicionado 12µL

ácido fórmico 5% em acetonitrila 50%, incubado por 10 minutos a temperatura

ambiente e após centrifugação rápida (spin) armazenou-se o sobrenadante no

74

tubo que fora previamente separado. Este último passo é repetido e ao final

todo o sobrenadante armazenado é evaporado até restar cerca de 5µL, o qual

é submetido ao espectrômetro de massas.

Os peptídeos de cada amostra, resultantes da digestão com tripsina,

foram analisados por LC-MSMS. Os peptídeos foram separados por gradiente

de hidrofobicidade em coluna C18 (100 µm x 100 mm) (Waters) em nano

Acquity Ultra Performance LC (Waters) acoplado a uma interface de ESI

nanospray em um espectrômetro de massa do tipo Q-Tof Ultima

(MicroMass/Waters). Volume de 4,5µL dos peptídeos foram injetados

automaticamente e os peptídeos foram eluídos da coluna com gradiente de 0-

90% de acetonitrila contendo ácido fórmico a 0,1% durante 40 min sob fluxo de

0,6 µL/min.

Os arquivos de dados gerados pelo Q-Tof foram processados em

programa Mascot Distiller v.2.3.2.0, 2009 (Matrix Science Ldt.). Para a

identificação das proteínas foi utilizado o programa Mascot Server v.2.3.01.0

(Matrix Science Ltda.), tendo como parâmetros uma clivagem perdida pela

tripsina, modificação fixa de carbamidometilação, modificação variável de

oxidação da metionina e 0,1 Da de tolerância de massas para MS e 0,1 Da de

tolerância de massas para MSMS. As buscas foram realizadas utilizando o

banco de dados Human International Protein Database (IPI) v. 3.72 (86392

sequências; 35093930 resíduos).

3.4. Análises das sequências de α-galactosidase previamente

identificadas em plantas

Visando determinar similaridades entre sequências gênicas codificantes

e de aminoácidos para α-galactosidase de plantas já depositadas em bancos

de dados públicos e a sequência interna da a-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers., foi realizada a análise das sequências de α-

galactosidase, através de alinhamento e construção de árvores de relação.

O levantamento das sequências das α-galactosidases de plantas foi

realizado por comparação através de BLAST de sequências gênicas

codificantes de Cyamopsis tetragonolobus (guar), Glycine Max (soja) e

75

Phaseolus vulgares (feijão), por serem da mesma subfamília Fabaceae que

Sesbania virgata (Cav.) Pers., contra sequências depositadas em banco de

dados públicos: GenBank (http:://www.ncbi.nlm.nih.gov) e CAZy (Carbohydrate-

Active EnZymes database) (Cantarel et al., 2008). As sequências foram

escolhidas através do valor do e-value superior a -70.

A análise das sequências por alinhamento foi feita através do programa

Mega versão 4.0 (Tamura et al., 2007), bem como a construção da árvore de

relação com bootstrap de 1000 repetições.

IV. Resultados



A fim de determinar a viabilidade das sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers., bem como, determinar o pico de atividade enzimática da enzima

α-galactosidase durante o desenvolvimento da plântula, foi avaliada a taxa de

germinação, através da protrusão da radícula, e a atividade enzimática da α-

galactosidase, através de ensaio enzimático com substrato enzimático 4-

Nitrophenyl-D-galactopyranoside (Sigma Chem. Co. St. Louis, USA) (PNP-α-

galactopiranosídeo), durante e após germinação, em um período de 7 dias (168

horas).

Analisando a porcentagem de germinação ao longo do período,

observou-se que a germinação completa das sementes ocorreu somente no

segundo dia após a embebição com viabilidade das sementes de 100% (Figura

6).

76

Figura 6. Porcentagem de germinação das sementes de Sesbania virgata (cav.) Pers. ao longo de 7

dias (168 horas) após a embebição.

Quanto à determinação do pico de atividade enzimática da α-

galactosidase, responsável pela retirada das substituições por galactose do

galactomanano durante a mobilização de reserva, permitindo a ação das

demais enzimas do processo de degradação (endo-β-mananase e β-

manosidase), observou-se um aumento progressivo na atividade enzimática

específica até 96 horas (4° dia após a embebição), quanto atinge seu valor

máximo, diminuindo sua atividade enzimática até 168 horas (7° dia após a

embebição), não atingindo o valor basal (Figura 7).

Sob o ponto de vista do desenvolvimento do protocolo de purificação da

enzima α-galactosidase, as sementes utilizadas no processo de purificação

foram mantidas em BOD até o 4° dia após embebição (96 horas), garantindo

máxima concentração de enzima a ser purificada.

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144 168

% d

e s

em

en

tes

germ

inad

as

Tempo em horas após a embebição

77

Figura 7. Atividade enzimática específica da enzima α-galactosidase presente em sementes de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. ao longo de 7 dias (168 horas) após a embebição.



4.2.1. Caracterização da temperatura ótima e pH ótimo da α-

galactosidase em extrato bruto enzimático

Com a finalidade de padronizar o ensaio enzimático da α-galactosidase

para as etapas de purificação e caracterizar esta enzima quando em extrato

bruto, permitindo futuras comparações em condições de enzima purificada,

procedeu-se com a determinação da temperatura ótima e pH ótimo de

atividade enzimática da α-galactosidase.


Avaliando o perfil de atividade enzimática da α-galactosidase sob

diferentes temperaturas (25° a 60°C, variando a cada 5°C), observou-se um

acréscimo progressivo na atividade enzimática de 25°C a 50°C, sendo entre

45°C e 50°C a faixa de temperatura com maior atividade enzimática, seguido

de uma queda abrupta na atividade enzimática a 60°C, valor este menor do

que a atividade enzimática a 30°C (Figura 8).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0 24 48 72 96 120 144 168

μm

olG

al.m

in-1

.mgp

rot-1

Tempo em horas

78

Figura 8. Determinação da temperatura ótima de atividade enzimática da α-galactosidase em

extrato bruto enzimático de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. após 4 dias de incubação em

BOD.

4.2.1.2. pH ótimo

A caracterização da atividade enzimática da α-galactosidase sob

condições variadas de pH (2,3 a 8) evidencia um aumento na atividade

enzimática entre o pH 2,3 a pH 4,4, sendo entre pH 4,4 e pH 5,4 o intervalo

com maior atividade enzimática, seguido de decréscimo mais acentuado desta

atividade enzimática entre pH 5,4 e pH 8,0, onde a atividade enzimática é

inexistente (Figura 9).

A determinação dos parâmetros de temperatura e pH ótimos (Figuras 8

e 9) em extrato bruto, nos quais a atividade enzimática é máxima, foi

considerada no desenvolvimento do protocolo do processo de purificação;

sendo assim, os ensaios enzimáticos performados, durante acompanhamento

da purificação da α-galactosidase, utilizaram PNP-αGalactopiranosídeo,

tampão McIlvaine pH 4,4 a 45°C, por 15 minutos.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0 10 20 30 40 50 60 70

μm

olG

al.m

in-1

.mgp

rot.

-1

Temperatura (°C)

79

Figura 9. Determinação do pH ótimo de atividade enzimática da α-galactosidase em extrato bruto

enzimático de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. após 4 dias de incubação em BOD.

4.2.2. Primeira etapa de purificação da α-galactosidase: Precipitação com

Sulfato de Amônio

Visando diminuir a quantidade de proteínas contaminantes no processo

de purificação em FPLC, procedeu-se com a precipitação com sulfato de

amônio do extrato bruto, como primeira etapa de purificação.

No entanto, primeiramente foi necessária a padronização do protocolo

de precipitação com sulfato de amônio, a fim de determinar qual das

saturações escolhidas (20%, 40%, 60% ou 80%) era a responsável pela

precipitação da α-galactosidase. Dessa forma, realizou-se um experimento

piloto de precipitação com acompanhamento da atividade enzimática, através

de ensaio enzimático, e de perfil proteico de cada saturação de sulfato de

amônio, através de gel de poliacrilamida.

Como se pode observar na Figura 10, comparando a atividade

enzimática específica da α-galactosidase em todas as saturações previamente

escolhidas de Sulfato de Amônio, 20%, 40%, 60% e 80%, a saturação de 80%

de sulfato de amônio é a responsável pela precipitação da α-galactosidase.

Além disso, a atividade enzimática específica na saturação de 60%

(0,026µmolGalactose.min-1.mgproteína-1), embora consideravelmente menor do

que a saturação de 80%, não pôde ser desprezada, tendo em vista a perda

proteica durante todo o processo de purificação.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0 2 4 6 8 10

μm

olG

al.m

in-1

.mgp

rot.

-1

pH

80

Embora a atividade enzimática específica do descarte seja alta

(0,059µmolGalactose.min-1.mgproteína-1) comparativamente a saturação de

60%, devido ao cálculo levar em consideração o volume total de amostra, o

descarte não foi considerado por conter proteínas contaminantes (Figura 10).

Figura 10. Padronização da etapa de purificação da Precipitação com Sulfato de Amônio.

Determinação da saturação de sulfato de amônio responsável pela precipitação da enzima α-

galactosidase através quantificação da atividade enzimática específica da α-galactosidase em

extrato bruto e em cada precipitado ressuspendido referente à utilização de uma porcentagem de

saturação de sulfato de amônio.

Na Figura 11 observa-se o perfil proteico do extrato bruto, das 4

saturações de sulfato de amônio e do descarte. No perfil proteico do extrato

bruto nota-se uma ausência em proteínas de peso molecular acima de

111,6kDa, porém com grande diversidade de proteínas entre 111,6kDa e

6,4kDa.

Comparando todas as amostras, percebe-se uma diminuição gradual

das proteínas de peso molecular abaixo de 30KDa e acima de 59,4kDa a

medida que a saturação de sulfato de amônio aumenta, ao ponto de observar-

se no descarte somente 6 bandas de proteínas abaixo de 30KDa e ausência de

proteínas acima de 59,4kDa, em comparação ao extrato bruto com 11 bandas

e 2 bandas, respectivamente. Além disso, nas saturações de 60% e 80% de

sulfato de amônio existe uma concentração das proteínas de peso molecular

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Ext. Bruto 20% 40% 60% 80% Descarte

μm

olG

al.m

in-1

.mgp

rot-1

81

intermediário, entre 59,4kDa e 30kDa, intervalo de peso onde se encaixa a α-

galactosidase.

Figura 11. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% do extrato bruto enzimático; precipitados

ressuspendidos de 20%, 40%, 60% e 80% de saturação de sulfato de amônio e o descarte resultante

da precipitação com sulfato de amônio, com cerca de 50µg de proteína nas amostras aplicadas.

Tendo em vista os resultados do experimento piloto de precipitação com

sulfato de amônio decidiu-se por utilizar somente as concentrações de 40% e

80% de sulfato de amônio para a primeira etapa de purificação da α-

galactosidase, garantindo diminuição de proteínas contaminantes (saturação

de 40%) e máxima concentração de α-galactosidase (soma das saturações de

60% e 80%).

Na Figura 12 observa-se o perfil de atividade enzimática específica da

primeira etapa de purificação da α-galactosidase com precipitação com sulfato

de amônio nas saturações de 40% e 80% da amostra submetida à purificação,

onde se vê, novamente, a saturação de 80% como a responsável pela

precipitação da α-galactosidase, pois é a maior atividade enzimática específica

encontrada.

Padrão

195 kDa

111,6 kDa

59,4 kDa

30 kDa

24,7 kDa

12,6 kDa

Ext.Bruto 20% 40% 60% 80% Descarte

82

A fração referente a saturação de 80% foi, portanto, destinada a

segunda etapa de purificação em FPLC Äkta (GE Healthcare) utilizando coluna

de troca iônica aniônica Mono-Q (Pharmacia Biotech).

Figura 12. Comparação da atividade enzimática da enzima α-galactosidase no: extrato bruto

(Ext.Bruto); ressuspendido do precipitado com 40% de saturação de Sulfato de Amônio (40%);

ressuspendido do precipitado com 80% de saturação de Sulfato de Amônio (80%); sobrenadante

resultante da precipitação com 80% de saturação de Sulfato de Amônio (Descarte), após Primeira

etapa de purificação: Precipitação com Sulfato de Amônio em 40% e 80% de saturação.

4.2.3. Segunda etapa de purificação da α-galactosidase: Cromatografia de

troca-iônica com coluna aniônica (Mono-Q)

Com a finalidade de purificar a α-galactosidase, a amostra proveniente

da precipitação com 80% de sulfato de amônio foi submetida à cromatografia

de troca-iônica em coluna aniônica Mono-Q (Pharmacia Biotech) em sistema

de purificação FPLC Äkta (GE Healthcare) utilizando tampão Tris-HCl 20mM

pH 7.8 e gradiente salino 0 a 0.5M de NaCl. Esta purificação foi acompanhada

com ensaio enzimático de cada fração coletada durante a purificação, além da

visualização do perfil proteico por eletroforese em gel de poliacrilamida.

O cromatograma, resultado da purificação em Mono-Q, está

apresentado na Figura 13, no qual é possível verificar, anteriormente ao início

da aplicação do gradiente salino, um pico de proteínas que não interagiram

0

1

2

3

4

5

6

7

Ext.Bruto 40% 80% Descarte

µm

olG

alac

tose

.min

-1.m

gpro

t-1

83

com a coluna e saíram na lavagem da coluna com tampão Tris-HCl 20mM pH

7.8 (wash).

Além disso, pode-se verificar que os picos A, B e C, picos que

apresentaram atividade enzimática de α-galactosidase (Figura 13), deixaram de

interagir com a coluna em concentrações baixas a medianas de NaCl, entre

100mM a 250mM.

Figura 13. Perfil cromatográfico da purificação em FPLC Äkta do extrato bruto enzimático

submetido à coluna aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). Identificação com letras (A-

C) das frações coletadas que apresentaram atividade enzimática de α-galactosidase, onde: (A)

Frações 47 a 51; (B) Frações 63 a 65; (C) Frações 66 a 69. (―) Perfil proteico quantificado por UV;

(―) Gradiente de NaCl variando de 0-0.5M em 12 volumes de coluna (‖) Frações coletadas com seus

respectivos números.

O acompanhamento da purificação foi realizado através de ensaio

enzimático de todas as frações coletadas durante a purificação em FPLC

(Figura 14), utilizando como substrato PNP-α-Galactopiranosídeo, e

eletroforese em gel de poliacrilamida das frações reunidas que continham

atividade enzimática (Figura 15), visando determinar quais frações continham a

enzima α-galactosidase e a qualidade da purificação, respectivamente.

84

A atividade enzimática da α-galactosidase, expressa em absorbância do

PNP-α-Galactopiranosídeo a 405nm, de todas as frações coletadas na

purificação em coluna Mono-Q se encontra na Figura 14. Observam-se três

picos de atividade enzimática: frações 47 a 51 (pico A); frações 63 a 65 (pico B)

e frações 66 a 69 (pico C), evidenciando mais de uma isoforma (pelo menos

três) da enzima α-galactosidase, sendo uma delas, pico A, predominante.

Figura 14. Atividade enzimática da α-galactosidase expressa em absorbância a 405nm das frações

coletadas durante a purificação em FPLC Äkta do extrato bruto enzimático submetido à coluna

aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). (a) Frações 47 a 51; (b) Frações 63 a 65; (c)

Frações 66 a 69.

As frações 47 a 51 (pico A) foram reunidas e uma alíquota foi destinada

ao perfil proteico em eletroforese em gel de poliacrilamida (Figura 15), a fim de

visualizar a qualidade da purificação, através da quantidade de bandas

presentes.

O gel de poliacrilamida (Figura 15) após purificação em Mono-Q ainda

apresentou muitas proteínas contaminantes, no entanto, observou-se uma

banda (indicada pela seta) entre 59,4kDa e 30kDa. Esta banda se apresenta

mais concentrada, do que as demais, evidenciando que este passo de

purificação, apesar de não eliminar grande parte das proteínas contaminantes,

concentrou a enzima de interesse.

A

B C

85

Figura 15. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% corado com Coomassie Blue R250 das

frações reunidas 47 a 51 (pico A) após purificação em FPLC Äkta utilizando coluna aniônica

Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). (→) Banda proteica concentrada de tamanho esperado

para α-galactosidase.

4.2.4. Terceira etapa de purificação da α-galactosidase: Cromatografia de

Gel Filtração (Superose)

Com a finalidade melhorar a purificação da α-galactosidase, as frações

47 a 51 reunidas na etapa de purificação em coluna aniônica Mono-Q

(Pharmacia Biotech) foram submetidas à Cromatografia de Gel Filtração em

coluna Superose 6 (GE Healthcare) em sistema de purificação FPLC Äkta (GE

Healthcare) utilizando tampão Acetato de Amônio 50mM pH 5.0. Esta

purificação foi acompanhada com ensaio enzimático de cada fração coletada

durante a purificação somada à visualização do perfil proteico por eletroforese

em gel de poliacrilamida.

O cromatograma, resultado da purificação da α-galactosidase em coluna

Superose 6, está apresentado na Figura 16, no qual se observa a presença de

um único pico predominante. O pico identificado por D foi o único a apresentar

atividade enzimática de α-galactosidase (Figura 17).

Padrão

195 kDa

111,6 kDa

59,4 kDa

30 kDa

24,7 kDa

12,6 kDa

6,4 kDa

86

.

Figura 16. Perfil cromatográfico da purificação em FPLC Äkta utilizando coluna de gel filtração

Superose 6 (GE Healthcare) das frações previamente semipurificadas (frações 47 a 51) em coluna

aniônica Mono-Q HR 10/10 (Pharmacia Biotech). Identificação com letra (D) das frações coletadas

que apresentaram atividade enzimática de α-galactosidase, onde: (D) Frações 30-33. (―) Perfil

proteico por quantificação por UV; (―) Gradiente de NaCl variando de 0-0.5M em 12 volumes de

coluna; (‖) Frações coletadas com seus respectivos números.

O acompanhamento da purificação foi realizado através de ensaio

enzimático de todas as frações coletadas durante a purificação em FPLC

(Figura 17), utilizando como substrato PNP-α-Galactopiranosídeo, e

eletroforese em gel de poliacrilamida das frações reunidas que continham

atividade enzimática (Figura 18) visando determinar a qualidade da purificação.

A atividade enzimática de α-galactosidase, expressa em absorbância do

PNP-α-Galactopiranosídeo a 405nm, de todas as frações coletadas na

purificação em coluna Superose 6 se encontra na Figura 17. Observa-se 1 pico

de atividade enzimática que foi reunido em uma única fração: frações 30 a 33

(pico D).

D

87

Figura 17. Atividade enzimática da α-galactosidase expressa em absorbância a 405nm das

frações coletadas durante a purificação em FPLC Äkta, utilizando coluna de gel filtração

Superose 6 (GE Healthcare), da amostra semipurificada em coluna aniônica Mono-Q HR

10/10 (Pharmacia Biotech). (D) Frações 30 a 33.

As frações 30 a 33 (pico D) foram reunidas e uma alíquota foi destinada

ao perfil proteico em eletroforese em gel de poliacrilamida (Figura 18), a fim de

visualizar a qualidade da purificação, através da quantidade restante de

proteínas contaminantes (bandas presentes).

O perfil proteico em gel de poliacrilamida (Figura 18) após purificação

em Superose 6 ainda apresenta muitas proteínas contaminantes, no entanto,

observa-se que a banda correspondente a α-galactosidase (ver item 4.2.6.4),

banda indicada pela seta, apresenta-se mais concentrada quando comparado a

mesma banda nas etapas anteriores de purificação (figura 25).

D

88

Figura 18. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% corado com Coomassie Blue R250 das

frações reunidas 30 a 33 (pico D) após purificação em FPLC Äkta utilizando coluna de gel filtração

Superose 6 (Pharmacia Biotech). (→) Banda proteica concentrada de tamanho esperado para α-

galactosidase.

Como visualizado no gel de poliacrilamida (Figura 25), a purificação

proposta não foi eficiente em efetivamente purificar a α-galactosidase, no

entanto a concentrou (ver tabela de purificação) e a semipurificou.

Tendo em vista a utilização da alíquota semipurificada em experimentos

com o polissacarídeo galactomanano, procedeu-se com o sequenciamento

interno de 8 bandas (entre os pesos moleculares de 59,4 kDa e 12,6kDa) para

identificação da banda referente a α-galactosidase e determinação da

sequência interna da enzima, bem como determinar a presença ou ausência

das demais enzimas de mobilização de reserva do galactomanano (endo-β-

mananase e β-manosidase) na alíquota semipurificada.

A determinação do peso molecular da α-galactosidase foi realizado por

duas técnicas: através do gel de poliacrilamida e através da coluna Superose

(purifica por peso molecular). A diferença entre as duas técnicas permite

visualizar se a proteína assumiu estrutura quartenária com consequente

mudança no peso molecular, pois o gel de poliacrilamida desnatura as

proteínas, enquanto através da gel filtração a proteína está na forma nativa,

podendo interagir com outras.

89

O peso molecular da α-galactosidase semipurificada determinado

através do gel de poliacrilamida pelo cálculo do Rf da proteína de interesse e

sua localização na curva de calibração traçada com os valores de Rf das

proteínas marcadoras versus o log de seus pesos moleculares, conforme

Weber & Osborn (1969), foi de, aproximadamente, 42 kDa (Figura 18). Os

marcadores de peso molecular utilizados foram a miosina (195 kDa), -

galactosidase (111,6 kDa), albumina de soro bovino (59,4 kDa), anidrase

carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina de soja (24,7 kDa), lisozima (12,5 kDa)

e aprotinina (6,4 kDa), adquiridos da Bio-Rad.

Enquanto o peso molecular da α-galactosidase determinado, através da

Gel Filtração utilizando a calibração do fabricante (Tiroglobulina 669kDa,

Ferritina 440 kDa, BSA 67 kDa e Ribonuclease 13,7 kDa), foi de

aproximadamente 72 kDa.

4.2.5. Tabela de purificação

Visando determinar o fator de purificação e o rendimento da purificação,

procedeu-se com a mensuração de proteínas totais e atividade enzimática da

α-galactosidase com PNP-αGal de alíquotas de cada etapa de purificação. Na

Tabela 1 encontram-se os valores de atividade específica, fator de purificação

e rendimento para cada etapa de purificação.

Analisando os valores da Tabela 1, nota-se um aumento de 2600% na

atividade enzimática específica da α-galactosidase após purificação em

Superose, quando comparado com a atividade enzimática específica do extrato

bruto. Além disso, o fator de purificação encontrado após as 3 etapas de

purificação é de 26,2 vezes e o rendimento da purificação de 1,28 %.

90

Tabela 1. Tabela de purificação da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers. desenvolvida

após a realização das três etapas de purificação: precipitação com Sulfato de Amônio 80%,

Cromatografia de troca-iônica aniônica (Mono-Q) e Cromatografia de gel filtração (Superose).

Etapa de

Purificação

Atividade Enzimática

Específica

(μmolGal.min-1

.mgprot.-1

)

Fator de

purificação

Rendimento da

Purificação (%)

Extrato Bruto 0,041 - 100

Precipitação com

Sulfato de Amônio

80%

0,078 1,886 22,764

Mono-Q (aniônica) 0,742 17,962 3,219

Superose 6 (Gel

Filtração) 1,083 26,196 1,275

4.2.6. Caracterização da α-galactosidase semipurificada de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. e da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (guar) (Megazyme®) quanto a temperatura ótima,

pH ótimo e aspectos cinéticos

A α-galactosidase semipurificada foi caracterizada bioquimicamente

quanto temperatura ótima, pH ótimo e aspectos cinéticos, Km e Vmáx.

Paralelamente a caracterização da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. foi realizada a caracterização da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (guar) (Megazyme®) quanto os mesmos aspectos.


Avaliando o perfil de atividade enzimática da α-galactosidase de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. sob diferentes temperaturas (25° a 60°C,

variando a cada 5°C), observou-se um acréscimo progressivo na atividade

enzimática de 25°C a 50°C, sendo entre 50°C e 55°C a faixa de temperatura

com maior atividade enzimática, seguido de uma queda abrupta na atividade

enzimática a 60°C (Figura 19).

91

Figura 19. Determinação da temperatura ótima da α-galactosidase semipurificada de Sesbania


Avaliando o perfil de atividade enzimática da α-galactosidase

(Megazyme®) de Cyamopsis tetragonoloba sob diferentes temperaturas (25° a

60°C, variando a cada 5°C), observou-se um acréscimo progressivo na

atividade enzimática de 25°C a 40°C, sendo 40°C a temperatura com maior

atividade enzimática. Observa-se também, uma queda da atividade enzimática

a 45°C, um leve aumento na atividade enzimática a 55°C e, novamente, uma

queda na atividade enzimática a 60°C (Figura 20).

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Temperatura (°C)

Ati

vid

ade

Esp

ecí

fica

(µm

olG

alac

tose

.min

-1.m

gpro

t-1)

92

Figura 20. Determinação da temperatura ótima da α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®).

4.2.6.2. pH ótimo

A caracterização da atividade enzimática da α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. sob condições variadas de pH

(2,3 a 7) evidenciou um aumento na atividade enzimática entre o pH 2,3 a pH

5,0, sendo entre pH 4,4 e pH 5,4 o intervalo com maior atividade enzimática,

seguido de decréscimo mais acentuado desta atividade enzimática entre pH

5,4 e pH 7,0, onde a atividade enzimática é muito baixa (Figura 21).

Enquanto a caracterização da atividade enzimática da α-galactosidase

de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) sob condições variadas de pH (2,3

a 7,0) evidenciou um aumento na atividade enzimática entre o pH 2,3 a pH 6,0,

sendo entre pH 5,4 e pH 6,4 o intervalo com maior atividade enzimática,

seguido de decréscimo acentuado desta atividade enzimática entre pH 6,4 e

pH 7,0 (Figura 22).

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0 10 20 30 40 50 60 70

Temperatura (°C)

Ati

vid

ade

En

zim

átic

a (µ

mo

lGal

.min

-1)

93

Figura 21. Determinação do pH ótimo da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.)

Pers.

Figura 22. Determinação do pH ótimo da α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme).

4.2.6.3. Aspectos cinéticos – Km e Vmáx

A determinação dos aspectos cinéticos, Km e Vmáx, da α-galactosidase

de Sesbania virgata (Cav.) Pers. foi calculado a partir dos dados conseguidos

com o ensaio enzimático da α-galactosidase semipurificada e PNP-α-Gal em

diferentes concentrações. Esses dados podem ser observados na figura 23.

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0,9000

1,0000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

pH

Ati

vid

ade

Esp

ecí

fica

(µm

olG

alac

tose

.min

-1.m

gpro

t-1)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,045

0 2 4 6 8

pH

Ati

vid

ade

En

zim

átic

a (µ

mo

lGal

.min

-1)

94

O Km da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

é de 1,8276mM, e o velocidade máxima é de 0,5024 µmolGal.min-1.mgproteína-

1.

Figura 23. Curva de saturação do substrato 4-Nitrofenil-D-Galactopiranosídeo na presença da

α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Os ensaios enzimáticos foram

conduzidos com o PNP-α-Gal nas seguintes concentrações (mM): 0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.8; 1.0; 2.0; 3.0;

5.0; 8.0; 10; 13; 15; 17; 20; 25; 30. A partir dos dados coletados foi calculado o Km e o Vmáx da α-

galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

Os aspectos cinéticos, Km e Vmáx, da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®) foram calculados a partir dos dados conseguidos

com o ensaio enzimático enzima comercial (0,250U/mL) e PNP-α-Gal em

diferentes concentrações. Esses dados podem ser observados na figura 24.

O Km da α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) é de

2,398 mM e a velocidade máxima é de 0,0248 µmolGal.min-1.mgproteína-1.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30

Ati

vid

ad

e E

nzi

mát

ica

(µ

mo

lGal

.min

-1.m

gpro

teín

a-1)

Concentração de 4-Nitrofenil-D-Galactopiranosídeo (mM)

95

Figura 24. Curva de saturação do substrato 4-Nitrofenil-D-Galactopiranosídeo na presença da

α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®). Os ensaios enzimáticos foram

conduzidos com o PNP-α-Gal nas seguintes concentrações (mM): 0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 0.8; 1.0; 2.0; 3.0;

5.0; 8.0; 10; 13; 15; 17; 20; 25. A partir dos dados coletados foi calculado o Km e o Vmáx da α-

galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®).

4.2.6.4. Análise do perfil proteico em gel de poliacrilamida sob condições

desnaturantes de todas as etapas de purificação

Para comparar qualitativamente o perfil proteico de cada etapa da

purificação: extrato bruto, precipitação com Sulfato de Amônio 80%,

cromatografias de troca-iônica (Mono-Q) e gel filtração (Superose), foi realizada

a separação das proteínas de cada etapa de purificação por eletroforese em

gel de poliacrilamida 12% (figura 25).

Analisando e comparando o perfil de proteínas do extrato bruto (figura

25 A) com os três passos de purificação (Figura 25 B, C, D), percebe-se uma

evidente diminuição na quantidade de proteínas contaminantes após

cromatografias de troca-iônica e gel filtração, no entanto, a precipitação com

sulfato de amônio 80% parece não alterar o perfil de proteínas quando

comparado com o extrato bruto.

Ao comparar-se o perfil de proteínas após as purificações em

cromatografia de troca-iônica e cromatografia de gel filtração nota-se o

desaparecimento de algumas bandas, evidenciando certa purificação, porém o

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0 5 10 15 20 25

Concentração do 4-Nitrofenil-D-Galactopiranosídeo (mM)

Ati

vid

ade

Esp

ecí

fica

(µm

olG

alac

tose

.min

-1.m

gpro

t-1)

96

perfil proteico é muito parecido. Além disso, a banda de α-galactosidase

correspondente a 42KDa (entre 59,4kDa e 30kDa), evidenciada pela seta

(figura 25 D), fica mais concentrada quando compara-se o perfil proteico após

cromatografia de troca-iônica (figura 25 C) e cromatografia de gel filtração

(figura 25 D).

Dessa forma, com praticamente a manutenção do perfil proteico entre as

purificações em FPLC e concentração da α-galactosidase, considera-se que a

α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers. foi semipurificada.

Figura 25. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% corado com Coomassie Blue R250 de

todas as etapas de purificação. (A) Extrato bruto enzimático; (B) Precipitado de 80% de

Sulfato de Amônio (ressuspendido em tampão Tris-HCl 20mM ph 7,8); (C) Alíquota das

frações reunidas após purificação em FPLC Äkta utilizando coluna de troca-iônica

aniônica (Mono-Q); (D) Alíquota das frações reunidas após purificação em FPLC Äkta

utilizando coluna de gel filtração Superose 6 (GE Healthcare).

4.2.7. Sequenciamento interno da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

Inicialmente a proposta do sequenciamento interno da α-galactosidase

foi idealizada para obter-se a sequência interna da enzima purificada e

compará-la com as α-galactosidases já descritas e depositadas em bancos de

dados.

97

No entanto, após análise dos resultados da purificação, onde houve uma

semipurificação ainda com uma quantidade razoável de proteínas

contaminantes, optou-se por realizar o sequenciamento interno de oito bandas

do gel de poliacrilamida entre 59,4 kDa e 12,6 kDa (Figura 26), visando

confirmar a banda referente da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. e, consequentemente, a sequência interna da proteína, e identificar as

demais bandas, para excluir a presença das demais enzimas da mobilização

de reservas, endo-β-mananase e β-manosidase.

Figura 26. Identificação com números, de 1 a 8, das bandas recortadas do gel de poliacrilamida

12% submetidas ao sequenciamento interno para identificação das proteínas, principalmente da α-

galactosidase, juntamente com a determinação da sequência interna da α-galactosidase

semipurificada de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

Como o esperado, devido ao peso molecular conhecido de α-

galactosidases de plantas, a banda 1 foi identificada como uma α-

galactosidase, tendo como primeiro Hit no banco de dados a α-galactosidase

de sementes de Cyamopsis tetragonoloba (guar).

Os fragmentos identificados pela espectrometria compõem 22% da

sequência de aminoácidos da α-galactosidase, sendo a sequência de

aminoácidos apresentada abaixo:

Padrão

195 kDa

111,6 kDa

59,4 kDa

30 kDa

24,7 kDa

12,6 kDa

6,4 kDa

1 2

3 4

5 6

7

8

98

ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADSNDK

W-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-

WNR

As bandas de 2 a 8 foram sequenciadas e na Figura 39 a 45 no ANEXO

se encontram a lista de possíveis proteínas para cada uma delas, sendo que as

bandas 2, 3, 4, 5 e 8 apresentaram α-galactosidase como possível proteína

componente dessas bandas, mas não se apresentando como primeiro hit.

Ressalta-se que nenhuma dessas proteínas foram identificadas como: endo-β-

mananase ou β-manosidase, resultado importante para embasar a utilização da

alíquota semipurificada nos experimentos conduzidos com o polissacarídeo

galactomanano descrito no Capítulo 2 desta dissertação.

4.3. Análises das sequências de α-galactosidases previamente identificadas em plantas

Visando determinar similaridades entre a sequência de aminoácidos

para α-galactosidases de plantas já depositadas em bancos de dados públicos

e a sequência interna da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata

(Cav.) Pers., foi realizada a análise de 35 sequências de aminoácidos de α-

galactosidases de plantas já depositadas em bancos de dados e a sequência

interna da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.,

através de alinhamento e construção de árvores de relação.

Na Figura 27 encontra-se o resultado da construção da árvore de

relação com bootstrap de mil repetições das 35 sequências de plantas e a

sequência interna da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Nota-se

a presença de três grandes ramos, aparentemente sem qualquer relação com a

filogenia.

Embora a relação das α-galactosidases em 3 três grandes ramos não

esteja relacionada à filogenia, alguns dos ramos mais internos, ramos

identificados de a-f estão de acordo com a filogenia: (a) Fabaceae; (b)

Fabaceae; (c) Fabaceae, (d) Rubiaceae; (e) Poaceae; (f) Pinaceae.

99

Os ramos marcados com • são ramos consistentes, visto que em 95% ou

mais das árvores geradas para a construção da árvore de consenso estes

ramos ficaram agrupados desta maneira, entre eles estão alguns dos ramos

relacionados com a filogenia: ramo b (99%), ramo d (99%) e ramo e (98%).

Os demais ramos não identificados reúnem espécies de diversas

famílias não apresentando relação com a filogenia, provavelmente apresenta

relação com a função da enzima.

Figura 27: Análise das sequências de aminoácidos 35 de α-galactosidase de plantas conjuntamente

com a sequência dos fragmentos de α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers. semipurificada

determinados por Espectrometria de Massas (MALDI-TOF). Grupos identificados por letras estão

de acordo com a filogenia: (A – vermelho) Fabaceae; (B - rosa) Fabaceae; (C – azul escuro)

Fabaceae; (D - verde) Rubiaceae; (E – roxo) Poaceae; (F – azul claro) Pinaceae. A coloração dos

ramos é a mesma da árvore de relação das 35 sequências de aminoácidos somente localizada na

100

figura 46 do anexo, no entanto, a identificação pelas letras é diferente, ou seja, os ramos coloridos

por cada cor são os mesmos em ambas as árvores, mas a letra que o identifica não é a mesma. (•)

Bootstrap ˃ 95, ou seja, em 95% ou mais das 1000 árvores de relação geradas os ramos marcados

com (•) ficaram agrupados como mostrado nesta árvore de relação.

V. Discussão



A germinação de sementes, fase compreendida entre a embebição e

protrusão da radícula, é responsável por um conjunto de eventos fisiológicos e

bioquímicos de reativação do metabolismo embrionário, culminando com o

crescimento embrionário (Bewley & Black, 1994).

De acordo com Buckeridge & Dietrich (1996), Potomati & Buckeridge

(2002), Tonini et al. (2007) o processo germinativo em sementes de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. ocorre entre o segundo e terceiro dias após embebição,

dado em concordância com 100% de sementes germinadas em 48 horas (2

dias) após embebição (Figura 6).

Após a protrusão da radícula, a mobilização da reserva de parede

celular de galactomanano das sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. se

inicia, atingindo seu auge entre o quarto e quinto dias após a embebição

(Buckeridge & Dietrich, 1996; Tonini et al., 2006), devido ao aumento da

atividade das hidrolases, α-galactosidase, endo-β-mannanase e β-manosidase,

no endosperma (Buckeridge & Dietrich, 1996).

A máxima atividade de α-galactosidase encontrada no experimento

proposto, durante o período pós-germinativo, ocorreu, consistentemente, no

quarto dia após embebição (Figura 7), um dia atrasado ao que foi descrito por

Potomati & Buckeridge (2002), Tonini et al. (2007). No entanto, possivelmente

este atraso está relacionado às diferentes condições de embebição e

desenvolvimento da plântula (fotoperíodo e temperatura) entre ambos os

trabalhos (fotoperíodo de 12 horas e 27°C) e o experimento conduzido no

presente trabalho (claro constante e 28°C).

101

Dessa forma, as sementes Sesbania virgata (Cav.) Pers. destinadas à

purificação da α-galactosidase foram retiradas das câmaras de germinação

(BOD) no quarto dia após embebição, garantindo máxima concentração de

enzima a ser purificada.



As α-galactosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de resíduos

de galactose α-1,6-ligados de galacto-oligossacarídeos e polímeros galacto-

(gluco)-mananos (Fujimoto et al., 2003).

Durante a mobilização de reserva de parede celular de galactomanano

foi detectada a presença de três enzimas hidrolíticas: α-galactosidase, endo-β-

mananase e β-manosidase (Reid & Meier, 1972; McCleary & Matheson, 1976;

Buckeridge et al, 1995a; Buckeridge & Dietrich, 1996), que atuam sobre o

galactomanano, liberando manose e galactose para o metabolismo,

promovendo o crescimento da plântula (Buckeridge et al., 2000a; Lisboa et al.,

2006).

McCleary & Matheson (1975), Reid & Edwards (1995) e Lisboa et al.

(2006) evidenciaram que a degradação do galactomanano pelas três enzimas

requer uma ordem de atuação das mesmas. Em sementes de leguminosas a

ação da α-galactosidase é uma condição necessária para permitir acesso da

enzima endo-β-mananase à cadeia principal do galactomanano, uma vez que,

McCleary & Matheson (1976) demonstraram que a β-mannanase de Gleditsia

triacanthos só hidrolisa as ligações β-(1,4) entre duas manoses contínuas sem

ramificação.

Desta forma, a α-galactosidase é a primeira a atuar sobre o

polissacarídeo, hidrolisando as ligações α-(1,6) entre as unidades de manano e

galactose, em seguida, a endo-β-mananase atua nas ligações β-(1,4) da

cadeia principal de manose, hidrolisando-a a oligossacarídeos, que, por sua

vez, serão levados a monossacarídeos pela ação, nas ligações β-(1,4), da β-

manosidase nas extremidades não-redutoras dos oligossacarídeos (Reid &

102

Meier, 1972; McCleary, 1983; Buckeridge et al., 1995a; Buckeridge & Reid,

1996; Buckeridge et al., 2000a).

Neste contexto fica evidente a importância da enzima α-galactosidase no

processo de mobilização de reserva de parede celular de galactomanano e

torna-se claro que a α-galactosidase ocorre em associação com outras

hidrolases que podem dificultar o processo de purificação (Dey & Pridham,

1972).

Comumente, as técnicas mais utilizadas no processo de isolamento

desta enzima são a precipitação com sulfato de amônio, fracionamento com

solventes orgânicos, tratamento térmico, acidificação, troca-iônica, gel filtração

e focalização isoelétrica (Dey & Pridham, 1972).

O procedimento adotado para a purificação da α-galactosidase de

sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. foi adaptado do protocolo

apresentado por Silva, 2001.

No presente caso, o processo de purificação não foi precedido por uma

etapa de digestão do galactomanano endógeno visando evitar a perda de

atividade enzimática durante a incubação a 30°C. Dessa forma o processo de

purificação se inicia com a precipitação em sulfato de amônio, seguido de

Cromatografia de Troca Aniônica (coluna Mono-Q – Pharmacia Biotech) em

sistema FPLC (GE Healthcare) e Cromatografia de Gel Filtração (Superose 6)

(GE Healthcare) também em sistema FPLC (GE Healthcare).

A primeira etapa de purificação: precipitação com sulfato de amônio,

inicialmente foi padronizada para se determinar a saturação necessária para a

precipitação da α-galactosidase. Conforme apresentado na Figura 10, a

saturação de 80% foi a responsável pela precipitação da enzima de interesse,

uma vez que, foi o precipitado a apresentar maior atividade enzimática.

A saturação de 60%, embora não apresentando valores de atividade

enzimática comparáveis a de 80%, foi considerada possuidora de uma fração

rica em α-galactosidase e, portanto, foi inclusa na padronização.

Diferentemente da saturação de 60%, o descarte não foi levado em

consideração, pois mesmo apresentando atividade enzimática, possuía muitas

proteínas contaminantes.

Conjuntamente aos resultados de atividade enzimática, a comparação

do perfil proteico do extrato bruto, das saturações de 20%, 40%, 60% e 80% de

103

sulfato de amônio e do descarte (Figura 11), demonstraram que a precipitação

com sulfato de amônio foi eficaz no seu objetivo, devido à gradual eliminação

de proteínas contaminantes, visualizado pelo desaparecimento de bandas.

Além disso, a presença marcada de proteínas de peso molecular

intermediário, entre 59,4kDa e 30kDa (Figura 11) nas saturações de 60% e

80%, intervalo de peso esperado para a α-galactosidase, corrobora a atividade

enzimática encontrada nestas saturações. Feurtado et al. (2001) e Lisboa et al.

(2003) demonstraram que a α-galactosidase de sementes de Lycopersicum

esculentum (tomate) e de Sesbania virgata (Cav.) Pers. possuem peso

molecular de 39.8kDa e 45kDa, respectivamente.

Assim, a padronização da precipitação com Sulfato de Amônio resultou

em um protocolo onde as saturações a serem utilizadas são de 40%, visando

retirar proteínas contaminantes e pigmentos, e de 80%, visando reunir a fração

de enzima da saturação de 60% com a da saturação de 80%, aumentando a

quantidade de enzima a ser purificada, uma vez que, o rendimento de

purificação é baixo devido a perdas a cada etapa.

A aplicação do protocolo de precipitação com sulfato de amônio na

amostra a ser submetida a todos os passos de purificação se fez necessária

para diminuir a contaminação com pigmentos e proteínas, bem como,

concentrar a α-galactosidase visando maiores rendimentos de purificação.

Na comparação dos perfis proteicos após precipitação com Sulfato de

Amônio variando de 20% a 80% (padronização) e somente nas concentrações

de 40% e 80% (etapa de purificação), nota-se que o protocolo de

padronização, as 4 concentrações, é mais eficiente na retirada de proteínas

contaminantes (figura 11 e figura 25) as custas de grande perda da enzima α-

galactosidase.

Entretanto, a precipitação com Sulfato de Amônio como etapa de

purificação (40% e 80%) apresenta praticamente o mesmo perfil proteico, mas

com um aumento na concentração da α-galactosidase, visualizado por

intensidade da banda referente à enzima (figura 25). Muito provavelmente a

saturação de 60% seria a responsável pela retirada de grande parte das

proteínas contaminantes, porém a perda enzimática é muito grande, sendo

assim, optou-se pelas saturações de 40% e 80%, incorporando algumas

proteínas contaminantes no processo de purificação.

104

A precipitação com Sulfato de Amônio é um protocolo reprodutível, pois,

como se observa nas Figuras 10 e 12, o perfil de atividade enzimática se

repete, sendo a saturação de 80% a responsável pela precipitação da α-

galactosidase.

A segunda etapa de purificação: Cromatografia de Troca-Iônica com

coluna aniônica (Mono-Q) em sistema FPLC revelou a presença de três

isoformas de α-galactosidase (Figura 13 e 14 A, B, C), sendo a isoforma A

identificada como a encontrada predominantemente às demais, devido a maior

atividade enzimática encontrada (Figura 14).


por Petek & Dong (1961) em sementes de Coffea sp e Plantago ovata. Tonini





Por outro lado, McCleary & Matheson (1974) detectaram múltiplas

formas de α-galactosidase em sementes de Cyamopsis tetragonolobus (guar),

no entanto, somente uma delas estava relacionada ao endosperma.



mobilização, como por exemplo, a diminuição de substituições por galactose

demandaria uma α-galactosidase com maior afinidade ao substrato; como


exemplo, a degradação de açúcares da série rafinósica (Bewley,1997).

Somado à demonstração da presença de isoformas, a cromatografia de

troca aniônica, concentrou a α-galactosidase (Figura 15 e Tabela 1) e, embora

o extrato semipurificado ainda apresente considerável quantidade de proteínas

contaminantes (Figura 15), a cromatografia aniônica foi eficaz na remoção de

parte desta contaminação, visto pelo pico de proteína anterior a aplicação do

gradiente salino, denominado wash, que não interagiu com a coluna (Figura 13)

e aumento de aproximadamente 18 vezes (Tabela 1) na atividade enzimática

quando comparado com o extrato bruto.

A escolha da fração 47 a 51, pico A, para dar continuação a purificação

em coluna de gel filtração foi realizada por dois motivos: a alta atividade

105

enzimática encontrada, o que possivelmente indica maior concentração de

enzima e, portanto, maior rendimento ao final da purificação; e por entender

que a presença predominante desta isoforma somado ao momento do

desenvolvimento que estas sementes foram retiradas da incubação, pico da

mobilização de reserva, indique alta probabilidade desta enzima estar

relacionada a degradação do galactomanano.

A terceira etapa de purificação: Cromatografia de Gel Filtração com

Coluna Superose 6 não foi efetiva na purificação da α-galactosidase de

Sesbania virgata (Cav.) Pers., pois, como observado na figura 18, o perfil

proteico após purificação em Superose apresentou proteínas contaminantes,

no entanto, houve uma considerável concentração da enzima, visualizado pela

intensidade da banda identificada pela seta (figura 18) e aumento de 26 vezes

na atividade enzimática da α-galactosidase quando comparado com o extrato

bruto (Tabela 1).

Sendo a Superose 6 uma coluna de gel filtração, ou seja, purifica por

peso molecular, não era esperado que um pool de proteínas de diferentes

pesos moleculares fosse agrupado em um mesmo pico. Infere-se que a α-

galactosidase possa assumir estrutura quartenária com isoformas de peso

molecular diferente, pois possui peso molecular diferente sob condições

desnaturantes, 42 kDa, e na forma nativa, 72 kDa, como também a coluna

Superose 6 apresentar problemas na separação, como por exemplo ruptura de

gel.

Embora a purificação não tenha sido efetiva na eliminação completa de

proteínas contaminantes, ela foi efetiva na concentração da α-galactosidase

(Figura 18 seta; Tabela 1), o que permitiu o sequenciamento interno da enzima

e consequente identificação como α-galactosidase.

A tabela de purificação (Tabela 1) corrobora a semipurificação da α-

galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers., evidenciado pelo aumento de

26 vezes na atividade enzimática específica, ou seja, pela atividade enzimática

específica levar em consideração a quantidade total de proteínas (em mg) na

amostra, o aumento da atividade enzimática observada faz referência a

diminuição da quantidade total de proteínas e manutenção da atividade da

enzima.

106

Além disso, a tabela de purificação (Tabela 1) mostra um rendimento de

purificação menor que 1,5%, como visto no trabalho de (Lisboa et al., 2003),

rendimento baixo para a condução dos experimentos do Capítulo 2, dado que

nos fez caracterizar também a α-galactosidase comercial de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®). Dessa forma, se ambas as enzimas possuírem as

mesmas características, os experimentos do Capítulo 2 seriam realizados

somente com a enzima comercial.

Conjuntamente aos dados da tabela de purificação (Tabela 1), os dados

da eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS-

PAGE) também mostram que as etapas de purificação da α-galactosidase não

foram eficientes na efetiva purificação, no entanto havendo uma concentração

da enzima e, consequentemente, uma semipurificação (Figura 25).

Ao compararmos, na figura 25, a raia identificada como extrato bruto (A)

e a raia após precipitação em Sulfato de Amônio 80% (B) nota-se ausência de

grandes mudanças no perfil proteico, pois, como dito anteriormente, a

saturação de 60% de Sulfato de Amônio deve ser a responsável pela retirada

de grande parte das proteínas contaminantes, porém com um custo alto na

perda de enzima disponível para os próximos passos de purificação.

Por outro lado, a comparação do perfil proteico do extrato bruto (Figura

25 A) com os perfis proteicos das cromatografias em FPLC (Figura 25 C e D),

nota-se a semipurificação, pela diminuição das bandas apresentadas e

concentração da banda identificada como α-galactosidase (seta).

O mesmo pode ser dito da comparação entre as cromatografias em

FPLC, Troca-iônica aniônica Mono-Q (Figura 25 C) e Gel Filtração Superose 6

(Figura 25 D), onde o perfil proteico apresenta pequenas diferenças, com

desaparecimento e diminuição de intensidade de bandas, no entanto, os perfis

se mostram muito semelhantes, evidenciando novamente a semipurificação.

A padronização da purificação da α-galactosidase, inicialmente, levava

em consideração um quarto passo de purificação a Cromatografia de Troca-

Iônica Catiônica em FPLC utilizando a coluna CM (carboximetil). A inclusão

desta etapa anteriormente a etapa de gel filtração se mostrou efetiva na

purificação da α-galactosidase, no entanto, a coluna CM utilizada já era muito

antiga e, além de reduzir muito a atividade enzimática da α-galactosidase,

apresentou sinais evidentes de mau funcionamento, como vazamentos e

107

despressurização (bolhas de ar), o que tornou esta etapa de purificação

inviável.

Assim, as etapas de purificação propostas, Precipitação em Sulfato de

Amônio, Cromatografia de Troca-Iônica Aniônica e cromatografia de Gel

Filtração, só foram eficazes na semipurificação e concentração da enzima

(Figura 25; Tabela 1).

Embora a α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers. só tenha

sido semipurificada, o sequenciamento interno foi possível e eficaz no

sequenciamento de 22% da enzima.

Observando a Figura 27, nota-se que a sequência da α-galactosidase de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. possui alta homologia com a sequência já

descrita para Cyamopsis tetragonoloba, uma vez que em 99% das árvores de

relação realizadas ambas as enzimas formaram um ramo.

O sequenciamento interno das demais bandas permitiu excluir a

presença das demais enzimas da mobilização de reserva (Endo-β-mananase e

β-manosidase), possibilitando a utilização da alíquota semipurificada nos

experimentos apresentados no Capítulo 2, pois a ausência das demais

enzimas permite a análise do modo de ação da α-galactosidase

individualmente.

Além disso, a espectrometria de massas das demais bandas corroborou

a hipótese da α-galactosidase, possivelmente, formar estrutura quartenária,

pois as bandas 2, 3, 4, 5 e 8, de peso molecular menor do que a banda 1

(identificada como α-galactosidase) podem também ser identificadas como α-

galactosidase, apesar desta possibilidade não ser o primeiro Hit, o que poderia

evidenciar que as bandas apresentadas no gel de poliacrilamida não

representam uma única proteína, sendo assim, essas bandas seriam uma

mistura de isoformas de α-galactosidase com outras proteínas (Figuras 39 - 45,

Anexo).

De forma a corroborar a hipótese da estrutura quartenária, Tonini et al.

(2010) demonstraram por Western Blot utilizando anticorpo anti α-galactosidase

e extrato bruto enzimático de Sesbania virgata (Cav.) Pers. a presença de 8

bandas variando de 78 kDa a 12 kDa reativas ao anticorpo, evidenciando a

presença de isoformas da α-galactosidase com diferentes tamanhos, que

poderiam interagir entre si formando a estrutura quartenária.

108

A interação das isoformas de α-galactosidase formando a estrutura

quartenária pode significar que a enzima necessite da formação do complexo

de uma ou mais α-galactosidase para promover a mobilização de reserva, pela

retirada das ramificações de galactose do galactomanano, de forma mais

eficiente.

No entanto, Overbeeke & colaboradores (1989), Guerin & colaboradores

(1992), demonstraram que a α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba

(guar) e a β-amilase de cevada podem ser ativadas através de digestão por

enzimas proteolíticas.

Tonini & colaboradores (2010) sugeriram que haja a ação de proteases

na ativação da α-galactosidase pré-formadas (peso molecular alto) e

armazenadas na semente de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Dessa forma, pode-

se inferir que as proteases na realidade são α-galactosidases já ativas que

reconhecem uma α-galactosidase inativa e a cliva promovendo a ativação.

Além disso, durante a mobilização de reserva o polissacarídeo

apresentaria uma mudança no padrão de ramificação com galactose, o que

demandaria uma adaptação da α-galactosidase, esta adaptação poderia ser

novamente uma proteólise por outras α-galactosidases ativas diminuindo a

ainda mais o tamanho da enzima o que explicaria a variação de pesos

moleculares encontrada.

Dessa forma, tanto a α-galactosidase poderia formar uma estrutura

quartenária para agir sobre o galactomanano, na retirada das ramificações de

galactose, como também, e mais provável, a interação entre as α-

galactosidases seria para processamento da enzima, diminuindo o seu

tamanho, ativando-a e/ou adequando-a as mudanças ao polissacarídeo.

A enzima α-galactosidase já foi descrita ocorrendo em micro-

organismos, plantas e animais (Dey & Pridham, 1972) com o pH ótimo variando

entre 3.8 a 6.7 e temperatura ótima também bastante variada (Dey & Pridham,

1972; Ademark, P. et al., 2001).

Guimarães et al. (2001), Viana et al. (2002b) demonstraram

temperaturas ótimas de α-galactosidase de sementes de Glycine max (soja)

variedade Doko e CAC-1 nas faixas de 45°C-50°C e 40°C-55°C,

respectivamente. Lima et al. (2004) apresentam a caracterização de

temperatura ótima de α-galactosidase de cotilédones de Platymiscium

109

pubensces (Tamboril-da-mata) entre 50°C-55°C, enquanto Silva (2007)

apresentou a temperatura ótima da α-galactosidase presente em cotilédones

de Schizolobium parahyba (Guapuruvu) entre 40°C-45°C. Em todos os

trabalhos, os autores relatam queda acentuada da atividade enzimática em

60°C.

Da mesma maneira, estudos de caracterização de pH ótimo de α-

galactosidase de fontes diversas demonstram ampla variação nos valores.

Guimarães et al. (2001), Viana et al. (2002b) demonstraram pH ótimo de α-

galactosidase de sementes de Glycine max (soja) variedade Doko e CAC-1 nas

faixas de pH 5.0 a 5.5 e pH 5.0 a 6.0, respectivamente. Lima et al. (2004)

apresentaram a caracterização de pH ótimo de α-galactosidase de cotilédones

de Platymiscium pubensces (Tamboril-da-mata) entre pH 4.5 a 6.0, enquanto

Silva (2007) apresentou o pH ótimo entre 5.0 e 6.0 da α-galactosidase presente

em cotilédones de Schizolobium parahyba (Guapuruvu).

Dessa forma, os resultados apresentados de temperatura ótima,

variando entre 45°C a 50°C, e pH ótimo, variando na faixa pH 4.4 e pH 5.4, da

enzima α-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. em

Extrato Bruto corroboram com a bibliografia (Figura 8 e 9).

O pH ótimo da enzima α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

em extrato bruto (Figura 9) e semipurificada (Figura 21) é o mesmo, estando

em ambos os casos na faixa de 4,4 a 5,4. A temperatura ótima apresenta uma

ligeira diferença (em extrato bruto: 45°C a 50°C; semipurificada 50°C a 55°C),

mas pode-se considerar praticamente a mesma faixa de temperatura ótima

(Figuras 8 e19).

No entanto, a comparação da α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. e da α-galactosidase comercial (Megazyme®)

evidencia diferenças consideráveis em todos os quesitos analisados (Figuras

19 a 24), inclusive nos aspectos cinéticos, porém os valores de temperatura

ótima, pH ótimo da α-galactosidase comercial (Megazyme®) estão dentro dos

valores descritos na bibliografia (Dey & Pridham, 1972; Viana et al., 2002b;

Lima et al. (2004).

Tendo em vista as diferenças apresentadas entre as duas enzimas,

semipurificada e a comercial, os experimentos conduzidos no Capítulo 2 foram

110

realizados com ambas as enzimas, até para determinar se essas

características influenciavam no modo de ação da enzima em seu substrato.

Como apresentado anteriormente, as características de pH, temperatura

e aspectos cinéticos são bem distintos entre as α-galactosidases já descritas

de plantas (Dey & Pridham, 1972; Ademark, P. et al., 2001), assim, as

diferenças apresentadas pelas α-galactosidases estão de acordo com o que o

já foi descrito para α-galactosidases na literatura.

5.3. Análises das sequências de α-galactosidase previamente

identificadas em plantas

Feurtado et al. (2001) analisaram a sequência genômica da α-

galactosidase de Lycopersicum esculentum (tomate) determinando o gene em

5,7Kb, com a região de codificante da enzima composta por 14 éxons

interrompidos por 14 íntrons. Além disso, resultados da análise de hibridização

do Southern com a sonda de cDNA de α-galactosidase de tomate (LeaGal)

evidenciaram 1 única cópia do gene.

O número de genes em outras espécies não foi determinado, porém em

alfafa, guar, Ceratonia siliqua, soja, Phoenix dactylifera, café, feijão, Lupinus

angustifolius e Trifolium repens, que a α-galactosidase foi purificada, foram

determinadas, pelo menos, 2 isoformas da enzima (Courtois & Petek, 1966;

McCleary & Matheson, 1974; Williams et al., 1978; Itoh et al., 1979; Plant &

Moore, 1982; Chandra Sekhar & DeMason, 1990; Dhar et al., 1994).

A α-galactosidase de tomate não foi purificada, porém, Feurtado et al.

(2001) demonstrou a presença de 3 isoformas, através da focalização

isoelétrica, e concluiu que, pela presença de apenas 1 cópia do gene de α-

galactosidase, as diferenças apresentadas pelas isoformas são provenientes

de modificações pós-transcricionais.

A análise de cDNA da α-galactosidase de tomate, performada pelo

mesmo autor, determina que a enzima madura possui 364 aminoácidos de

comprimento, 39,8kDa, pI de 4,91 e é precedida por um peptídeo sinal. A

presença de peptídeos sinais já foi reportada em café, guar, soja, feijão

(Overbeeke et al., 1989; Zhu & Goldstein, 1994; Davis et al., 1996, 1997).

111

A presença de peptídeo sinal está relacionada ao envio das proteínas a

mais de um local dentro da célula, como a parede celular, aos corpos protéicos

ou embrião, evidenciando, possivelmente diferentes funções exercidas pelas α-

galactosidases, dependendo do local para onde são enviadas (Feurtado et al.,

2001).

Feurtado et al. (2001) demonstraram, através do alinhamento da

sequência de aminoácidos de α-galactosidase de tomate com sequências de

aminoácidos de α-galactosidases de outras eudicotiledôneas, que a proteína α-

galactosidase é conservada entre as espécies, apresentando cerca de 70% de

identidade.

Além disso, a análise dessas sequências somadas as sequências de

aminoácidos de fungos e metazoários na forma de árvore de relação produziu

3 clados distintos acompanhando a taxonomia (Feurtado et al., 2001) e

totalizou 40 resíduos conservados entre as α-galactosidases de eucariotos,

entre eles a assinatura característica de α-galactosidase: G - [LIVMFY] - x -

[LIVMFY] - x - [LIVM] - D - [DF] - x - W - x - [RV] - [DNSF] (Hofman et al.,

1999).

A análise das 35 sequências de aminoácidos de α-galactosidases de

plantas, através da construção da árvore de relação (Figura 46, Anexo),

realizada no presente trabalho se mostrou bastante similar a árvore

apresentada por Feurtado et al. (2001), com alguns ramos acompanhando a

filogenia, porém a visualização não é tão clara devido a maior quantidade de

sequências analisadas. Diferentemente a Feurtado & colaboradores (2001),

neste trabalho preferiu-se a análise somente de sequências de plantas, visando

entender as relações neste clado.

Por sua vez, a análise das 35 sequências de aminoácidos de α-

galactosidases já descritas em plantas conjuntamente com a análise da

sequencia de aminoácidos da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.)

Pers., através da construção da árvore de relação, quando comparada com a

árvore de relação somente das 35 sequências de aminoácidos apresenta uma

mudança na formação dos ramos e suas relações, o que aparentemente

melhorou a explicação sobre as possíveis funções das α-galactosidases

analisadas.

112

Da mesma forma que a árvore de relação das 35 sequências de

aminoácidos, análise conjunta com a α-galactosidase sequenciada também

agrupou algumas das sequências da enzima segundo a filogenia (Figura 27, A-

F), entretanto, a maioria dos ramos não acompanhou a filogenia, o que pode

ser devido a um agrupamento da enzima pela função exercida: degradação da

série rafinósica, mobilização de reserva, entre outros.

Observa-se na Figura 27, cujos ramos identificados como A, B e C são

ramos que acompanham a filogenia, família Fabaceae, que as α-

galactosidases de leguminosas não se agruparam em um único ramo, mas em

três com uma relação muito distante um do outro, corroborando a hipótese que

as α-galactosidases estão sendo agrupadas de acordo com a função,

independentemente, se acompanham a filogenia ou não.

O ramo b, ramo que agrupa as sequências de α-galactosidases de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. e Cyamopsis tetragonolaba, muito provavelmente

agrupa as α-galactosidases responsáveis pela retirada das galactoses do

galactomanano durante a mobilização de reservas da semente, pois

sabidamente essas espécies possuem como reserva de semente o

galactomanano, reserva de parede celular (McCleary & Matheson, 1974;

Buckeridge & Dietrich, 1990).

No entanto o ramo c, que agrupa Glycine max e Phaseolus vulgaris

espécies que acumulam reserva proteica e oleogenosa, e amilácea,

respectivamente, a α-galactosidase presente seria, provavelmente, responsável

pela degradação de açúcares da série rafinósica, nos primeiros estágios da

germinação.

O ramo a, por sua vez, por estar agrupado juntamente a espécies como

Carica papaya e Cucumis sativus, espécies produtoras de frutos com

amadurecimento de fruto e, consequentemente, degradação da parede celular,

deve conter α-galactosidases responsáveis pelo remodelamento do

polissacarídeo durante a desmontagem da parede celular no amadurecimento

do fruto (Gao & Schaffer, 1999; Soh et al., 2006), e, no caso das espécies

agrupadas (Glycine Max e Pisum sativum) no processo da mínima deposição

de galactomanano existente nestas sementes.

Sugere-se que as sequências de aminoácidos de α-galactosidase que

não se agruparam de acordo com a filogenia, sejam α-galactosidases com

113

funções similares, não necessariamente relacionadas à degradação do

galactomanano, mas à degradação de oligossacarídeos da série rafinósica ou

de substratos galactosilados estocados no citoplasma, como demonstrado por

McCleary & Matheson (1974) que das múltiplas isoformas apresentadas pelo

guar, apenas uma estava relacionada à degradação de galactomanano.

A α-galactosidase sequenciada quando comparada as demais 35

sequências possui alta similaridade com a α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (ramo consistente: 99%) e possivelmente possui a mesma

função, de mobilização de reserva, sendo também utilizada nos experimentos

conduzidos no Capítulo 2, como comparação no modo de ação da enzima.

VI. Conclusão

Baseado em todos os resultados apresentados, nota-se que as etapas

de purificação escolhidas para a purificação da α-galactosidase de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. (precipitação com Sulfato de Amônio 80%, Cromatografia

de Troca-Iônica aniônica – Mono-Q, Cromatografia de Gel Filtração – Superose

6), não foi efetiva na purificação da α-galactosidase, mas sim em uma

semipurificação (Figura 25).

A semipurificação da α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

se mostrou livre das demais enzimas de mobilização de reserva (endo-β-

mananase e β-manosidase) e a análise da sequência da α-galactosidase

semipurificada evidenciou que esta realmente está envolvida na mobilização de

reserva.

Embora só tenha ocorrido a semipurificação da α-galactosidase de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. foi possível a detecção de isoformas da α-

galactosidase, possivelmente estando estas isoformas relacionadas a

diferentes funções (figuras 13 e 14, B e C) e adaptações da enzima a

mudanças do polissacarídeo durante a mobilização de reservas (Figuras 26 e

27).

As duas isoformas encontradas após purificação em Mono-Q (Figuras 13

e 14, B e C) estariam relacionadas a outras funções, enquanto, as isoformas de

114

diferentes pesos moleculares encontradas após purificação em Superose

(Figuras 25 D, 38 a 42 e 45, Anexo) estariam relacionadas com a mobilização

de reserva (42kDa) e adaptações da enzima a mudanças do galactomanano

(pesos moleculares menores).

Foi possível observar uma mudança do peso molecular da enzima α-

galactosidase em condições desnaturantes (42kDa) e nativas (72kDa) (Figuras

16 e 18) possibilitando a inferência na formação de complexos enzimáticos

(estrutura quartenária) na forma nativa, sugerindo que a própria α-

galactosidase catalisaria a sua proteólise ativando α-galactosidases inativas

(manteria o peso molecular) e modificando a enzima para se adaptar as

mudanças no padrão de ramificação (diminuiria o peso molecular da enzima).

Dessa forma, é possível especular sobre a necessidade de proteases

somente no início do processo de mobilização de reserva, para a ativação das

primeiras α-galactosidases, que seriam modificadas proteoliticamente durante o

restante do processo, como proposto por Tonini et al. (2010).

A α-galactosidase de Sesbania virgata (Cav.) Pers. semipurificada e

caracterizada foi submetida a ensaios com o polissacarídeo nativo,

galactomanano, da mesma espécie, visando a compreensão do modo de ação

da enzima e, principalmente, da estrutura fina do galactomanano (Capítulo 2).

115

VII. Referências Bibliográficas

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120

CAPÍTULO 2

ESTRUTURA FINA DO GALACTOMANANO E A MODULAÇÃO DA MOBILIZAÇÃO DE RESERVA EM SEMENTES DE Sesbania

virgata (CAV.) PERS.

121

I. Resumo

Todas as células vegetais possuem parede celular. Além das funções

típicas da parede celular primária, a parede celular ainda pode apresentar

especializações, como o acúmulo de alguns polissacarídeos específicos, em

sementes, que constituem uma reserva de carbono para o crescimento da

plântula após a germinação. O galactomanano é um dos polissacarídeos

hemicelulósicos que podem exercer este papel de reserva de parede celular.

Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal

de resíduos de D-manose ligadas β-(1,4), ramificada por resíduos de D-

galactose α-(1,6) ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e

envolve três enzimas hidrolíticas: α-galactosidase, endo-β-mananase e exo-β-

manosidase. A compreensão da distribuição dos grupos de D-galactose ao

longo da cadeia principal de D-manano é determinar a estrutura fina do

polissacarídeo. Embora haja diferenças na estrutura fina de galactomananos

de diferentes espécies, demonstrou-se a correlação direta entre o conteúdo de

galactose e a viscosidade do polissacarídeo, bem como sugeriram a existência

de um requerimento mínimo de substituições por galactose para manter o

polissacarídeo solúvel. A quantidade e distribuição das substituições com D-

galactose ao longo da cadeia principal (1,4)-β-D-manano estão intima e

diretamente relacionadas à taxa de hidrólise do polissacarídeo pela

endohidrolase endo-β-mananase. Além da regulação da mobilização pelos já

esperados fitohormônios, existe a evidência em xiloglucanos de reserva que a

estrutura do polissacarídeo, através de suas ramificações pela galactose,

codificaria, pelo menos, uma parte da informação para a sua própria

degradação, o que se denominou código do xiloglucano. Visando evidenciar a

presença de um código de degradação presente na estrutura fina do

galactomanano, procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-β-mananase de

Aspergillus niger (Megazyme®) somente ou em conjunto com a α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a α-

galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®), seguido

122

de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD. Além disso, também

procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com

razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-β-mananase de

Aspergillus niger (Megazyme®) e análise dos oligossacarídeos produzidos por

HPAEC-PAD. Os dados obtidos das comparações dos oligossacarídeos

gerados em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano

podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-β-

mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1,

F2 e F3 (Figura 28) após hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase,

como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem

proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-β-

mananase em diferentes concentrações (Experimento I e Experimento IV),

evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a

presença da α-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e

F3, mostrando que a estes não possuem resistência intrínseca à hidrólise e

que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de

clivagem ainda disponíveis (Experimento III); (4) e que polissacarídeos com

estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são

digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando

que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-β-mananase. Através

dos resultados obtidos neste capítulo, sugere-se que a estrutura do

polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da

informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua

degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações

com resíduos de D-galactose.

II. Introdução

Todas as células vegetais possuem parede celular. Esta estrutura é

responsável por diversas funções, entre elas: propriedades mecânicas da

parede celular, determinação da forma celular, manutenção do ambiente iônico

celular, defesa contra invasão de patógenos, sinalização e controle do

123

potencial hídrico celular (Street & Öpik, 1984; Waldron & Brett, 1990; Carpita &

Gibeaut, 1993).

A diversidade de funções exercidas pela parede celular reflete a

diversidade da composição da parede celular. Segundo Carpita & Gibeaut

(1993), a parede celular primária é composta por três domínios independentes

com funções e composição distintas: domínio celulósico-hemicelulósico,

péctico e protéico.

Além das funções típicas da parede celular primária, citadas acima, a

parede celular ainda pode apresentar especializações, entre elas: o acúmulo

de alguns polissacarídeos específicos, em sementes, que constituem uma

reserva de carbono para o crescimento da plântula após a germinação (Bewley

& Black, 1978; Buckeridge & Reid, 1996).

Entre os polissacarídeos que podem exercer este papel de reserva

estão: o xiloglucano, o galactano e o (galacto)manano. Exceto pelo galactano,

que constitui um acúmulo do domínio péctico, os demais polissacarídeos são

do domínio hemicelulósico (celulose-hemicelulose) (Buckeridge et al., 2000c).

Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia

principal de resíduos de D-manose ligadas β-(1,4), ramificada por resíduos de

D-galactose α-(1,6) ligados (Buckeridge et al., 2000a). As substituições por

galactose variam de espécie para espécie, se apresentando em razões

Manose:Galactose (Man:Gal) de 1:1 a 4:1, ou seja, na proporção máxima (1:1)

teoricamente todos os resíduos de manose estão substituídos por galactose,

enquanto que na razão 4:1 a cada quatro resíduos de manose, apenas 1 é

ramificado com galactose (Buckeridge & Dietrich, 1990; Buckeridge et al.,

2000a).

A razão manose:galactose, e por consequência, a distribuição dos

resíduos de galactose, de acordo com Buckeridge & Dietrich (1990) e

Buckeridge et al. (2000a, c), são aspectos importantes do polissacarídeo,

estando relacionados à solubilidade da molécula e, consequente interação

entre os polissacarídeos.

A compreensão da distribuição dos grupos de D-galactose ao longo da

cadeia principal de D-manano é determinar a estrutura fina do polissacarídeo

(McCleary et al., 1985).

124

Diversas técnicas já foram empregadas em estudos de distribuição de

resíduos de D-galactose ao longo da cadeia principal de D-manano de

galactomananos de reserva de sementes de leguminosas (McCleary et al.,

1985).

Palmer & Ballantyne (1950) determinaram a estrutura do galactomanano

de Cyamopsis tetragonolobus (guar), como arranjo de resíduos de manose

substituídos e não-substituídos por galactose, através de raio-X. Em 1978,

Hoffman & Svensson, através de procedimento químico, determinaram que o

arranjo das substituições de D-galactose na cadeia principal de D-manano, no

galactomanano presente em guar, era aos pares e aos trios, contradizendo o

estudo de Palmer & Ballantine (1950), onde as substituições por D-galactose

foram determinadas como randômicas.

Estudos mais recentes, conduzidos por McCleary et al. (1985), utilizando

uma estratégia alternativa para análise da estrutura fina do galactomanano,

empregando enzimas particulares de degradação do galactomanano (endo-β-

mananase, principalmente) e análise da composição dos oligossacarídeos

produzidos, determinaram que a estrutura fina do galactomanano de Ceratonia

siliqua possui substituições por D-galactose não-regulares, típico de

substituições randômicas, enquanto o galactomanano de Cyamopsis

tetragonolobus (guar) possui as ramificações agrupadas aos duplos e aos trios,

não se apresentando randômica.

Embora haja diferenças na estrutura fina de galactomananos de

diferentes espécies, McCleary & colaboradores (1976) demonstraram a

correlação direta entre o conteúdo de galactose e a viscosidade do

polissacarídeo, bem como sugeriram a existência de um requerimento mínimo

de substituições por galactose para manter o polissacarídeo solúvel.

No mesmo contexto, McCleary & Matheson (1983) concluiram que a

quantidade e distribuição das substituições com D-galactose ao longo da

cadeia principal (1,4)-β-D-Manano estão intima e diretamente relacionadas à

taxa de hidrólise do polissacarídeo pela endohidrolase endo-β-mananase.

Neste mesmo trabalho, endo-β-mananases provenientes de plantas

foram ensaiadas com galactomananos altamente ramificados e o perfil de

oligossacarídeos analisado por cromatografia de gel filtração. A análise dos

perfis evidenciou, através da baixa quantidade de trissacarídeos (manotriose –

125

Man3 - e manobiose com uma galactose – Gal1Man2), que há limitação na ação

da enzima em polissacarídeos altamente ramificados.

Utilizando endo-β-mananase de fungos a taxa de hidrólise reportada ao

guar (38% de substituição com galactose) foi entre 2%-12% (Reese & Shibata,

1965; Courtois & Le Dizet, 1968; Tsujisaka et al., 1972; Emi et al., 1972). No

entanto, taxas de hidrólise para galactomananos contendo menores taxas de

substituição foram maiores: para Ceratonia siliqua (23% de substituição com

galactose) entre 15%-39% (Reese & Shibata, 1965; Courtois & Le Dizet, 1968);

para café (2% de substituição com galactose) entre 36%-58% (Tsujisaka et al.,

1972; Emi et al., 1972).

Tiné et al. (2003), analisando os oligossacarídeos produzidos pela

hidrólise com celulase de xiloglucano de reserva de diferentes espécies

(Tamarindus indica, Copaifera langsdorffii e Hymenea courbaril), constituídos

de diferentes taxas de substituição por galactose, demonstraram que

xiloglucanos de estrutura diferente são hidrolisados diferentemente; que os

oligossacarídeos menos ramificados são atacados preferencialmente pela

enzima e que a presença da β-galactosidase juntamente com a celulase,

impede a formação de oligossacarídeos complexos F2 e F3 (combinações de

oligossacarídeos menores), sugerindo que o padrão das substituições por D-

galactose possuem influencia direta na ação enzimática.

Dessa forma, eles concluem que a estrutura do polissacarídeo, através

de suas ramificações pela galactose, codificaria, pelo menos, uma parte da

informação para a sua própria degradação (Tiné et al., 2003), o que Buckeridge

(2010) denominou código do xiloglucano.

O trabalho de Tiné e colaboradores (2003) foi possível pela identificação

prévia da composição da estrutura dos oligossacarídeos produzidos após

hidrólise com celulase realizada por Buckeridge et al. (1992), pois permitiu

identificar sítios preferenciais da enzima pela presença ou ausência de

ramificação (estrutura do polissacarídeo).

Dessa forma, no presente trabalho objetivou-se compreender a

importância das ramificações de galactose presentes nos galactomananos na

atuação da endoenzima endo-β-mananase, visando determinar se a estrutura

fina do galactomanano também possui, pelo menos, parte da informação para

126

a sua própria degradação, ou seja, determinar a existência de um código em

galactomananos.

III. Material e Métodos

3.1. Material Vegetal

As sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizadas na execução

dos experimentos de determinação da estrutura fina foram coletadas de

diversos indivíduos localizados nas imediações da Universidade de São Paulo,

São Paulo/SP, evitando, assim, vício amostral. As sementes foram separadas

dos frutos maduros e mantidas em frascos herméticos a temperatura ambiente.

As sementes de Senna alata, Dimorphandra mollis, Cyamopsis

tetragonoloba, Coffea arabica e Euterpe edulis utilizadas na execução do

experimento de determinação e comparação das estruturas finas dos

galactomananos de diferentes proporções de galactose, foram adquiridas do

banco de sementes presente no Laboratório de Fisiologia Ecológica de Plantas

(Lafieco).

3.2. Extração do manano e galactomanano

Os polissacarídeos de reserva (manano ou galactomanano) das 6

espécies (Sesbania virgata, Senna alata, Dimorphandra mollis, Cyamopsis

tetragonoloba, Coffea arabica e Euterpe edulis) foram extraídos de suas

sementes a fim de possibilitar os experimentos de hidrólise enzimática visando

o entendimento da estrutura fina do polissacarídeo (manano ou

galactomanano) em cada espécie e a importância das ramificações de

galactose na modulação do processo de mobilização de reserva.

127

3.2.1. Extração do manano de reserva das sementes de Coffea arabica e

Euterpe edulis

A extração do manano presente nas sementes de Coffea arabica e de

Euterpe edulis foi feita, através do fracionamento da parede celular a partir do

pulverizado das sementes, método outro do utilizado para a extração do

galactomanano presente nas demais sementes, visto as diferenças de

solubilidade encontrada entre os dois polissacarídeos.

O fracionamento de parede celular inicia-se com a extração de açúcares

solúveis do pulverizado de sementes através de 4 lavagens com etanol 80% a

80°C por 20 minutos sob agitação, seguida de centrifugação a 1000g por 10

minutos e descarte do sobrenadante. Ao final das 4 etapas de extração de

açúcar solúvel o precipitado foi seco em estufa a 60°C por 24 horas.

Em seguida, realizou-se a extração de pectinas através de 3 lavagens

com oxalato de amônio 0,5% pH 7, seguido de centrifugação a 2700g por 15

minutos com descarte do sobrenadante e secagem do precipitado em estufa a

60°C por 24 horas.

Finalmente, realizou-se a extração do manano através de 3 lavagens

com hidróxido de sódio 8M, seguido de centrifugação a 3000g por 15 minutos

com descarte do precipitado, neutralização com ácido acético glacial e diálise

contra água do sobrenadante. O dialisado foi congelado a -20°C e seco em

liofilizador.

3.2.2. Extração do galactomanano de reserva das sementes de Sesbania

virgata, Senna alata, Dimorphandra mollis, Cyamopsis

tetragonoloba

A extração do galactomanano contido no endosperma das sementes de

Sesbania virgata, Senna alata, Dimorphandra mollis e Cyamopsis

tetragonoloba foi realizada segundo Buckerigde & Dietrich (1996). Partindo de

endosperma e tegumento de sementes após 12 horas de embebição, isolados,

secos e pulverizados em moinho de bolas foi extraído o galactomanano com

água quente (80°C) por 6 horas, seguido de filtração através de dupla camada

de tecido (cheesecloth). O extrato filtrado foi centrifugado a 10.000g por 30 min

128

a 5°C, seguido de precipitação do sobrenadante com 3 volumes de etanol a

5°C por 12 horas (overnight). O precipitado gerado após centrifugação a 3000g

por 5 minutos a 5°C foi coletado, seco e pesado.

3.3. Análise de monossacarídeos

A análise de monossacarídeos dos polissacarídeos extraídos das seis

espécies (Sesbania virgata, Senna alata, Dimorphandra mollis, Cyamopsis

tetragonoloba, Coffea arabica e Euterpe edulis) foi realizada através da

hidrólise ácida com H2SO4, a fim de determinar a razão manose:galactose de

cada (galacto)manano, ou seja, determinar a proporção de ramificação com

galactose.

Cinco miligramas de cada polissacarídeo foi hidrolisado a seus

monossacarídeos constituintes utilizando 72% H2SO4 – 4% H2SO4 (Saeman,

Buhl & Harris, 1945). A solução de monossacarídeos foi neutralizada com

NaOH 8M até pH entre 6 e 7, submetidas às resinas de troca iônica Dowex®

para retirada do sal e analisadas em HPAEC-PAD em coluna Carbo Pac PA-1

(DIONEX, USA) em sistema Dionex DX-500, tendo como eluentes com fluxo 1

mL/min: NaOH 20mM, água e pós-coluna contendo NaOH 500mM.

3.4. Hidrólise enzimática com Endo-β-Mananase e α-Galactosidases

Todo o estudo de determinação da estrutura fina do polissacarídeo

galactomanano, da compreensão da função das ramificações por galactose na

modulação da mobilização de reserva e determinação no modo de ação da

enzima α-galactosidase, foram realizados através de ensaios enzimáticos

utilizando galactomanano ou manano comercial (Megazyme®) como substrato,

a enzima endo-β-mananase de Aspergilus niger (Megazyme®) individualmente

ou em conjunto com as α-galactosidases (de Cyamopsis tetragonoloba –

Megazyme® – e a semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo

1)).

O (galacto)manano utilizado como substrato nas hidrólises enzimáticas

foi proveniente de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. individualmente,

129

ou em conjunto com o (galacto)manano de sementes de 5 espécies (Senna

alata, Dimorphandra mollis, Cyamopsis tetragonoloba, Coffea arabica e

Euterpe edulis), enquanto o manano comercial (Megazyme®) é proveniente do

galactomanano de goma caroba submetido a tratamento enzimático e químico.

A concentração do substrato foi diferente dependo do experimento, estando na

concentração de 1% ou 0,1%.

Como o substrato, as enzimas utilizadas também variaram a

concentração dependendo do experimento. A endo-β-mananase foi utilizada

em 4 concentrações 0,005U/mL, 0,05U/mL, 0,5U/mL e 1U/mL, enquanto a α-

galactosidase comercial (Megazyme®) foi inicialmente diluída para 0,5U/mL e,

como a α-galactosidase semipurificada, foi diluída para 4 concentrações

diferentes: 1:5, 1:10, 1:100 e 1:1000.

A digestão enzimática, em si, foi preparada a partir de uma solução de

galactomanano à 1% ou 0,1% (peso/volume) em tampão acetato de amônio

50mM pH 5.0, na qual foi acrescido a endo-β-mannanase e/ou α-galactosidase

na concentração desejada.

A incubação da mistura foi realizada a 30°C por 15 horas (overnight) ou

24 horas, com posterior fervura por 5 minutos (adaptado de Cavalari, 2009).

Após a fervura, os tubos foram centrifugados à 2700g, por 5 minutos a

temperatura ambiente e o sobrenadante coletado. Ao sobrenadante foi

acrescido 3 volumes de etanol absoluto, para a precipitação do polissacarídeos

não digeridos, centrifugado à 4000g por 3 minutos, o sobrenadante coletado,

seco em concentrador de amostras (sem aquecimento) e então ressuspendido

em 1 mL de água deionizada para análise dos oligossacarídeos formados pela

digestão enzimática, por HPAEC-PAD e/ou TLC.

Os experimentos conduzidos para determinação da estrutura fina,

importância da ramificação de galactose na regulação da mobilização e o modo

de ação da α-galactosidase podem ser divididos e dois grupos. No primeiro

grupo estão cinco experimentos (Experimentos I a V) de hidrólise enzimática do

galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (a 1% ou 0,1%) ou manano

comercial (Megazyme) com as enzimas endo-β-mananase (0,005U/mL,

0,05U/mL e 1U/mL) e α-galactosidases (0,5U/mL, 1:5, 1:10, 1:100 e 1:1000) em

diferentes concentrações.

130

Enquanto o segundo grupo de experimentos utilizou galactomanano de

seis espécies (Sesbania virgata, Senna alata, Dimorphandra mollis, Cyamopsis

tetragonoloba, Coffea arabica e Euterpe edulis) a 1% e somente a enzima

endo-β-mananase a 0,5U/mL.

A descrição de cada experimento se encontra nos itens: 3.6. Análise da

estrutura fina do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. através de

hidrólises enzimáticas com Endo-β-manase de Aspergilus Níger (Megazyme),

α-Galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme) e α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. e 3.7. Análise da estrutura fina

do (Galacto)manano de 6 espécies com diferentes proporções de ramificações

com galactose, respectivamente.

3.5. Análise dos oligossacarídeos de (Galacto)manano

Os oligossacarídeos produzidos pelas digestões enzimáticas com endo-

β-mananase sozinha ou em conjunto com a α-galactosidase foram analisados

por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with

Pulsed Amperometric Detection) e/ou TLC (Thin Layer Chromatography).

3.5.1. Análise dos oligossacarídeos de (Galacto)manano por HPAEC-PAD

(High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed

Amperometric Detection)

A análise por HPAEC-PAD de oligossacarídeos produto das hidrólises

enzimáticas de (galacto)mananos foi desenvolvido por Crivellari, A.C.(2009 –

dados não publicados) e performado no modelo ICS-3000 (Dionex®), utilizando

coluna CarboPac PA-100. O eluente de base utilizado foi 88mM de NaOH e o

eluente de arraste acetato de sódio 200mM em NaOH 88mM. Um gradiente da

solução de acetato de sódio 200mM em NaOH 88mM foi aplicado à amostra

visando separar os oligossacarídeos antes de sua detecção pelo detector de

pulso amperométrico.

131

3.5.2. Análise dos oligossacarídeos de (Galacto)manano por TLC (Thin

Layer Cromatography)

A análise por cromatografia em camada delgada de oligossacarídeos

produto das hidrólises enzimáticas de (galacto)mananos foi realizada como

uma segunda maneira de analisar a diferença entre os oligossacarídeos da

digestão das 6 espécies analisadas (Sesbania virgata, Senna alata,

Dimorphandra mollis, Cyamopsis tetragonoloba, Coffea arabica e Euterpe

edulis).

O material hidrolisado ressuspendido em água deionizada foi aplicado a

1 cm da base da placa de sílica (Merck®) de 20x20cm e submetido à 3 corridas

utilizando como eluente propanol:água:nitrometano na proporção 5:3:2.

A revelação da placa foi feita com a aspersão de solução etanólica

contendo 5% de ácido sulfúrico, seguido de incubação em estufa a 100°C e

fotografia do perfil de oligossacarídeos apresentados após revelação.

3.6. Análise da estrutura fina do galactomanano de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. através de hidrólises enzimáticas com

Endo-β-manase de Aspergilus Níger (Megazyme), α-

Galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme) e α-


As hidrólises enzimáticas conduzidas nos cinco experimentos descritos

abaixo visavam elucidar: a estrutura fina do galactomanano de Sesbania

virgata (Cav.) Pers., através da identificação de cada oligossacarídeo; a

importância das substituições de galactose na atuação da endoenzima endo-β-

mananase, observada através da comparação dos oligossacarídeos formados

na presença da α-galactosidase e na ausência de mesma; e a compreensão do

modo de ação da enzima α-galactosidase, através da determinação de sítios

preferenciais de ataque, visualizado pelos oligossacarídeos formados em

diferentes concentrações da endo-β-mananase.

132

3.6.1. Experimento I

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento I visaram produzir

o substrato para o Experimento II (oligossacarídeos provenientes da hidrólise

do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. com endo-β-mananase) e

analisá-lo quanto à proporção dos oligossacarídeos produzidos nas diferentes

concentrações da enzima. Além disso, o Experimento I visou produzir

oligossacarídeos de manano puro (sem ramificações com galactose) variando

de monossacarídeo (manose) a heptassacarídeos (oligossacarídeo de 7

manoses) de manose para identificar nas análises de HPAEC-PAD os

oligossacarídeos ramificados e não ramificados, possibilitando a determinação

da composição de cada oligossacarídeo (hidrólise do manano comercial).

Dessa forma, as digestões enzimáticas foram preparadas a partir de

uma solução de (galacto)manano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. à 1% e

manano comercial à 1% (peso/volume) em tampão acetato de amônio 50mM

pH 5.0, na qual foi acrescido o volume equivalente a concentração final de

0,005U/mL, 0,05U/mL e 1U/mL de endo-β-mannanase de Aspergilus niger

(Megazyme®), obtendo-se um volume final de ensaio de 1 mL para cada

concentração de enzima.

As hidrólises foram mantidas a 30°C por 15 horas (overnight) e após 5

minutos de fervura foram submetidas ao protocolo de precipitação com 3

volumes de etanol, já descritas no item 3.4. hidrólise enzimática com endo-β-

mananase e α-galactosidases, para posterior análise dos oligossacarídeos

produzidos e submissão dos oligossacarídeos ao Experimento II.

A metodologia de análise dos oligossacarídeos, produtos desta hidrólise

por HPAEC-PAD, é a mesma descrita no item: 3.5. Análise dos

oligossacarídeos de (Galacto)manano.

Para cada substrato (galactomanano ou manano) em cada concentração

de endo-β-mananase (0,005U/mL, 0,05U/mL e 1U/mL) a hidrólise enzimática

foi realizada em duplicata. Além disso, dois controles foram feitos:

galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. e manano comercial

(Megazyme®) em tampão acetato de amônio 50mM pH 5.0 sem a adição de

enzima.

133

3.6.2. Experimento II

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento II visaram produzir

a desramificação da galactose dos oligossacarídeos provenientes da digestão

do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. produzidos no Experimento

I e, consequente, identificação da composição desses oligossacarídeos quanto

a quantidade de manose e galactose presente, através da comparação dos

cromatogramas da análise em HPAEC-PAD do Experimento I com do

Experimento II.

Dessa forma, as digestões enzimáticas foram preparadas a partir de

200µL dos oligossacarídeos do Experimento I (provenientes da hidrólise do

galactomanano e manano) ressuspendidos em tampão acetato de amônio

50mM pH 5.0, no qual foi acrescido 10 µL de α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. ou 10 µL de α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL.





produzidos por HPAEC-PAD.




Para combinação de cada substrato (oligossacarídeos de

galactomanano ou de manano) com cada α-galactosidase (semipurificada ou

comercial) a hidrólise enzimática foi realizada em duplicata. Além disso, três

controles foram feitos: galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. a 1% e

α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (duplicata),

galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. a 1% e α-galactosidase

Comercial (Megazyme®) (duplicata) e galactomanano de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. a 1% e celulase de Trichoderma longibachiatum (Megazyme®).

134

3.6.3. Experimento III

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento III visaram

compreender a importância das ramificações de galactose no processo de

degradação do galactomanano, através da comparação das hidrólises do

polissacarídeo galactomanano a 1% com endo-β-mananase (Megazyme®) a 1U

somente (Experimento I) e do polissacarídeo galactomanano a 1% com endo-

β-mananase (Megazyme®) a 1U conjuntamente a α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. ou a α-galactosidase de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®).

Dessa forma, a comparação da diversidade e da concentração dos

oligossacarídeos formados nas hidrólises contendo ou não a α-galactosidase

pode sugerir que a ramificação com galactose de alguma forma modula a

degradação do galactomanano.

Assim, as digestões enzimáticas foram preparadas a partir de uma

solução de galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. à 1% em tampão

acetato de amônio 50mM pH 5.0, na qual foi acrescido 10 µL de endo-β-

mannanase de Aspergilus niger (Megazyme®) a 1U/mL somente ou

conjuntamente com 10 µL de α-galactosidase a 0,5U/mL (semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. ou de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®)).

A concentração de 0,5U/mL só é válida para a α-galactosidase

comercial, a α-galactosidase semipurificada está na concentração após

purificação, ou seja, sem qualquer diluição.









Todas as hidrólises enzimáticas foram realizadas em duplicata.

135

3.6.4. Experimento IV

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento IV visaram

compreender o modo de ação da enzima endo-β-mananase (Megazyme) em

diferentes concentrações (0,005U/mL, 0,05U/mL e 1U/mL) quando na presença

da α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. e a α-

galactosidase comercial (Megazyme®), ambas na máxima concentração de

0,5U/mL e galactomanano nas concentrações de 1% e 0,1%.

Dessa forma, a comparação dos oligossacarídeos formados nas

diferentes concentrações da endo-β-mananase na mesma concentração da α-

galactosidase (0,5U/mL) e em concentrações distintas do galactomanano (1%

ou 0,1%) pode evidenciar preferência em alguns sítios de clivagem na cadeia

de principal de manano.

Assim, as digestões enzimáticas foram preparadas a partir de uma

solução de galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. à 1% ou 0,1% em

tampão acetato de amônio 50mM pH 5.0, na qual foi acrescido 10 µL de endo-

β-mannanase de Aspergilus niger (Megazyme®) (0,005U/mL, 0,05U/mL e

1U/mL) e 10 µL de α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. (0,5U/mL – concentração pós-purificação) ou 10 µL de α-galactosidase

de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL.

A concentração de 0,5U/mL só é válida para a α-galactosidase

comercial, a α-galactosidase semipurificada está na concentração após

purificação, ou seja, sem qualquer diluição.









Para combinação de cada concentração da endo-β-mananase

(0,005U/mL, 0,05U/mL e 1U/mL) com cada concentração (1% ou 0,1%) do

136

substrato galactomanano e cada α-galactosidase (semipurificada ou comercial)

a 0,5U/mL, a hidrólise enzimática foi realizada em duplicata.

3.6.5. Experimento V

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento V visaram produzir


de manose a heptassacarídeos de manose para identificar nas análises de

HPAEC-PAD os oligossacarídeos ramificados e não ramificados, possibilitando

a determinação da composição de cada oligossacarídeo (hidrólise do manano

comercial).

Dessa forma, as digestões enzimáticas foram realizadas em 2 ciclos de

hidrólises, no primeiro ciclo a α-galactosidase comercial a 0,5U/mL acrescida

de uma solução de manano a 1% (Megazyme®) em tampão acetato de amônio

50mM pH 5.0, e no segundo ciclo de digestão o manano foi submetido à

hidrólise com a enzima endo-β-mananase (Megazyme®) em diferentes

concentrações (0,005U/mL, 0,05U/mL e 1U/mL).


minutos de fervura foram submetidas a centrifugação para descarte do

sobrenadante e, em seguida, o precipitado (manano desgalactosilado) foi

submetido a novo ciclo de digestão, agora com endo-β-mananase.

Novamente as hidrólises foram mantidas a 30°C por 15 horas (overnight)

e após 5 minutos de fervura foram submetidas ao protocolo de precipitação

com 3 volumes de etanol, já descritas no item 3.4. hidrólise enzimática com

endo-β-mananase e α-galactosidases, para posterior análise dos

oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A metodologia de análise dos

oligossacarídeos, produtos desta hidrólise por HPAEC-PAD, é a mesma

descrita no item: 3.5. Análise dos oligossacarídeos de (Galacto)manano.

Para combinação de cada concentração da endo-β-mananase

(0,005U/mL, 0,05U/mL e 1U/mL) com a α-galactosidase comercial a 0,5U/mL e

substrato galactomanano a 1%, a hidrólise enzimática foi realizada em

duplicata.

137

3.7. Análise da estrutura fina do (Galacto)manano de 6 espécies

com diferentes proporções de ramificações com galactose

Visando determinar as diferenças na estrutura fina do polissacarídeo

(manano ou galactomanano) de cada espécie (Sesbania virgata, Senna alata,


edulis) e a importância das substituições de galactose na atuação da

endoenzima endo-β-mananase, impedindo-a de hidrolisar o polissacarídeo a

oligossacarídeos, realizou-se o experimento que comparou os oligossacarídeos

(produtos da hidrólise com endo-β-mananase), das 6 espécies vegetais, que

sabidamente possuem proporções de substituição por D-galactose diferentes,

ou seja, razão manose:galactose variando de 1:1 a 500:1, através de hidrólises

enzimáticas e posterior análise por HPAEC-PAD e TLC dos oligossacarídeos

formados.

As digestões enzimáticas foram preparadas a partir de uma solução de

(galacto)manano (de cada espécie) à 1% (peso/volume) em tampão acetato de

amônio 50mM pH 5.0, na qual foi acrescido o volume equivalente a

concentração final de 0,5U de endo-β-mannanase, obtendo-se um volume final

de ensaio de 1 mL. As hidrólises foram mantidas a 30°C por 24 horas e após 5



mananase e α-galactosidases, para posterior análise dos oligossacarídeos.

A metodologia de análise dos oligossacarídeos, produtos desta

hidrólise, por HPAEC-PAD e TLC, são as mesmas descritas no item: 3.5.

Análise dos oligossacarídeos de (Galacto)manano.

138

IV. Resultados



Endo-β-manase de Aspergilus niger (Megazyme), α-

Galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme) e α-


As hidrólises enzimáticas conduzidas nos cinco experimentos descritos

visavam elucidar: a estrutura fina do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.)

Pers., através da identificação de cada oligossacarídeo; a importância das

substituições de galactose na atuação da endoenzima endo-β-mananase,

observada através da comparação dos oligossacarídeos formados na presença

da α-galactosidase e na ausência de mesma; e a compreensão do modo de

ação da enzima α-galactosidase, através da determinação de sítios

preferenciais de ataque desta enzima, visualizado pelos oligossacarídeos

formados após hidrólise da α-galactosidase e hidrólise da endo-β-mananase

em diferentes concentrações.

4.1.1. Experimento I

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento I visaram produzir

o substrato para o Experimento II (oligossacarídeos provenientes da hidrólise

do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. com endo-β-mananase) e

analisá-lo quanto à proporção dos oligossacarídeos produzidos nas diferentes

concentrações da enzima. Além disso, o Experimento I visou produzir


de monossacarídeo (manose) a decassacarídeos (oligossacarídeo de 10

manoses) de manose para identificar, nas análises de HPAEC-PAD, os


da composição de cada oligossacarídeo (hidrólise do manano comercial).

139

A hidrólise enzimática do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. resultou no perfil de oligossacarídeos apresentados na Figura 28. Os

oligossacarídeos são identificados como: oligossacarídeos F1, os quais variam

de dissacarídeos a decassacarídeos galactosilados ou não, enquanto os

oligossacarídeos identificados como F2 e F3 são oligossacarídeos F1

combinados aos pares e trios, respectivamente (Figura 28).

É possível observar nos primeiros 19 minutos de corrida um grupo de 6

picos identificados como oligossacarídeos F1, ou seja, os oligossacarídeos

base da estrutura do galactomanano.

Entre os 20 e 22 minutos de corrida, encontra-se um segundo grupo de

picos que são identificados como oligossacarídeos F2, ou seja, a combinação

aos pares dos oligossacarídeos F1. Já entre os minutos 24 e 27 da corrida,

encontra-se um terceiro grupo de picos identificados como oligossacarídeos

F3, a combinação aos trios dos oligossacarídeos F1 (Figura 28).

Ao visualizar e comparar o perfil cromatográfico apresentado na figura

28 com os demais experimentos (Experimento I a V) nota-se a junção dos

picos G e H e a separação dos oligossacarídeos F2 e F3, diferentemente do

encontrado nos Experimentos I a V, devido ao ajuste no programa do HPAEC-

PAD para justamente separar os oligossacarídeos F2 e F3.

Figura 28: Análise em HPAEC-PAD (Dionex) com coluna PA-100 dos oligossacarídeos formados

após hidrólise enzimática exaustiva com Endo-β-mannanase do galactomanano de Sesbania virgata

(Cav.) Pers., visando verificar perfil dos oligossacarídeos produto da hidrólise enzimática do

galactomanano com endo-β-mananase. (F1) dissacarídeos a decassacarídeos galactosilados ou não

140

base do polissacarídeo; (F2) combinação aos pares dos oligossacarídeos de F1; (F3) combinação aos

trios dos oligossacarídeos de F1.

Os produtos das hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. a 1% com endo-β-mananase de Aspergilus niger

(Megazyme) (0,005U, 0,05U e 1U) e a comparação aos pares (0,005Ux0,05U;

0,005Ux1U; 0,05Ux1U) dos oligossacarídeos formados se encontram na figura

29.

Nas três concentrações de endo-β-mananase utilizadas é possível

identificar os oligossacarídeos identificados de A-I e os oligossacarídeos

agrupados F2 e F3. Apesar da presença de todos os oligossacarídeos nas três

concentrações, a proporção entre os oligossacarídeos formados e, portanto, a

preferência na produção de cada oligossacarídeo difere em cada concentração

(Figura 29 II, III e IV).

O perfil cromatográfico comparativo da hidrólise enzimática do

galactomanano com endo-β-mananase a 0,005U e 0,05U (Figura 29 V)

evidencia a preferência da formação do pico C e G na concentração de 0,005U

de enzima, enquanto o pico A (manobiose) é preferencialmente formado em

0,05U.


galactomanano com endo-β-mananase a 0,005U e 1U (Figura 29 VI) apresenta

como oligossacarídeos preferencialmente produzidos na concentração de

0,005U os representados por B (manotriose), enquanto os picos A, C, E e H

são preferencialmente produzidos em 1U.


galactomanano com endo-β-mananase a 0,05U e 1U (Figura 29 VII) não difere

muito do comparativo a 0,005U e 1U (Figura 29 VI), onde o oligossacarídeo

preferencialmente produzido a 0,05U é a manotriose (pico B), enquanto os

oligossacarídeos formados preferencialmente por 1U são os presentes nos

picos A, C, E, G e H.

141

Figura 29: Cromatogramas gerados por HPAEC-PAD, utilizando coluna PA- 100, da análise dos

oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers

com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U. (I) Controle (galactomanano sem endo-

B-mananase); (II) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase na

concentração de 0,005U; (III) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-

mananase na concentração de 0,05U; (IV) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com

142

endo-β-mananase na concentração de 1U; (V) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados

após hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de 0,005U e 0,05U; (VI) comparação dos

perfis de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de

0,005U e 1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-

mananase nas concentrações de 0,05U e 1U. (A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3) e/ou

trissacarídeo (G1M2); (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G

1M3); (D) pentassacarídeos



1,3M4 e/ou

G4M5 e/ou G


3,4M5); (G-I) oligossacarídeos >8

resíduos (G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5


identificados A-I são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes são

identificados como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos trios.

A razão entre oligossacarídeos F1 e os oligossacarídeos F2+F3 (razão

F1/F2) representa o quanto a enzima endo-β-mananase foi capaz de reduzir o

polissacarídeo a oligossacarídeos F1 e/ou F2 e F3 e é realizada pela divisão da

somatória de todas as áreas dos picos denominados F1, pela somatória de

todas as áreas dos picos denominados F2+F3.

A razão F1/F2 encontrada para as concentrações de 0,005U, 0,05U e

1U foram 4,11; 2,85 e 5,26, respectivamente.

Os produtos das hidrólises enzimáticas do manano comercial

(Megazyme®) a 1% com endo-β-mananase de Aspergilus niger (Megazyme®)

(0,005U, 0,05U e 1U) e a comparação aos pares (0,005Ux0,05U; 0,005Ux1U;

0,05Ux1U) dos oligossacarídeos formados se encontram na figura 30.

Ao analisar os oligossacarídeos formados nas três concentrações de

enzima (0,005U, 0,05U e 1U) nota-se uma tendência na diminuição da

diversidade de oligossacarídeos formados. Nas concentrações de 0,005U e

0,05U de endo-β-mananase utilizadas é possível identificar os oligossacarídeos

identificados de A, B, D, E, H e F, picos F1, sem a detecção de qualquer pico

F2 e/ou F3. Na concentração de 1U de endo-β-mananase somente os picos A,

B e E são detectados, sem qualquer detecção de oligossacarídeos F2 e/ou F3

(Figura 30 II, III e IV).

Os oligossacarídeos comuns às três concentrações de endo-β-

mananase, A, B e E, possuem proporções distintas entre os oligossacarídeos

formados evidenciando, novamente, que a preferência na produção de cada

oligossacarídeo difere em cada concentração (Figura 30 II, III e IV).

143

O perfil cromatográfico comparativo da hidrólise enzimática do manano

com endo-β-mananase a 0,005U e 0,05U (Figura 30 V) evidencia a preferência

da formação do pico B (manotriose) na concentração de 0,005U de endo-β-

manananse, enquanto o pico A (manobiose) e pico E são preferencialmente

formados em 0,05U. Além disso, com exceção do pico D, os demais picos

possuem área total maior, indicando maior quantidade de oligossacarídeos, em

0,05U do que em 0,005U.


com endo-β-mananase a 0,005U e 1U (Figura 30 VI) apresenta como

oligossacarídeos preferencialmente produzidos na concentração de 0,005U os

representados por B (manotriose), D e F enquanto os picos A e E são

preferencialmente produzidos em 1U.


com endo-β-mananase a 0,05U e 1U (Figura 30 VII) não difere muito do

comparativo a 0,005U e 1U (Figura 30 VI), onde os oligossacarídeos

preferencialmente produzidos a 0,05U são a manotriose (pico B), pico D e pico

F enquanto o oligossacarídeo formado preferencialmente por 1U é o presente

no pico A (manobiose).

A presença de oligossacarídeos diferentes de manobiose (A) e

manotriose (B) nas hidrólises de manano com endo-β-mananase sugere a

presença remanescente de ramificações com galactose (Figura 30 V, VI, VII).

Dessa forma, realizou-se o Experimento V visando a retirada das galactoses

remanescentes, consequentemente, a hidrólise completa do manano a

manobiose e manotriose na maior concentração de endo-β-mananase (1U) e a

formação de oligossacarídeos de tamanho variado (monossacarídeo a

nonassacarídeo) sem ramificações de galactose na menor concentração

(0,005U), principalmente.

A comparação da área total dos oligossacarídeos formados nas três

concentrações de enzima permite a inferência na taxa de hidrólise do

polissacarídeo a oligossacarídeo F1 e é realizada pela soma da área de todos

os picos denominados F1.

A área total dos oligossacarídeos F1 encontrada para as concentrações

de 0,005U, 0,05U e 1U foi 308,747; 434,737 e 425,389, respectivamente.

144

Figura 30: Cromatogramas gerados por HPAEC-PAD, utilizando coluna PA-100, da análise dos

oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do manano comercial (Megazyme®) com endo-β-

mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U. (I) Controle (manano sem endo-B-mananase); (II)

perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase na concentração de

0,005U; (III) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase na

145

concentração de 0,05U; (IV) perfil de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-

mananase na concentração de 1U; (V) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após

hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de 0,005U e 0,05U; (VI) comparação dos perfis

de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase nas concentrações de 0,005U e

1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados após hidrólise com endo-β-mananase

nas concentrações de 0,05U e 1U. (A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3); (D) pentassacarídeos



1,3M4 e/ou

G4M5 e/ou G


3,4M5). Os oligossacarídeos

identificados A-F são denominados oligossacarídeos F1.

4.1.2. Experimento II

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento II visaram produzir

a desramificação da galactose dos oligossacarídeos provenientes da digestão

do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. produzidos no Experimento

I e, consequente, identificação da composição desses oligossacarídeos quanto

a quantidade de manose e galactose presentes, através da comparação dos

cromatogramas da análise em HPAEC-PAD do Experimento I com do

Experimento II.

Os produtos das hidrólises enzimáticas dos oligossacarídeos do

Experimento I (galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. a 1% com

endo-β-mananase de Aspergilus niger (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U)

com α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers., a

comparação do perfil de oligossacarídeos produto do Experimento I e do

Experimento II em cada concentração de endo-β-mananase e os controles da

hidrólise se encontram na figura 31.

O controle do polissacarídeo a 1% na ausência de qualquer enzima

(figura 31 I) mostra que o polissacarídeo apresenta em quantidade apreciável

os oligossacarídeos representados pelos picos C e G. Um segundo controle

com polissacarídeo a 1% e α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. (Figura 31 II) mostra atividade esperada da α-galactosidase, pela

presença do pico de galactose, e os mesmos picos C e G apresentados pelo

controle do polissacarídeo a 1% sem qualquer enzima, evidenciando que não

146

há contaminação da enzima semipurificada por Endo-β-mananase ou β-

manosidase.

O terceiro controle com polissacarídeo a 1% e celulase de Trichoderma

longibachiatum (Megazyme®) (Figura 31 III) apresentou os mesmos picos C e

G apresentados pelo controle do polissacarídeo a 1% sem qualquer enzima,

evidenciando que o galactomanano não é digerido a oligossacarídeos pela

ação da celulase, bem como, demonstrando que o substrato de galactomanano

possui um grau de pureza considerável, sendo livre de xiloglucano, β-glucano e

celulose.

A ação da α-galactosidase semipurificada foi muito semelhante nos

oligossacarídeos produtos da hidrólise prévia com a endo-β-mananase nas três

concentrações, visto pela mesma diversidade de picos apresentados nos perfis

cromatográficos, picos estes identificados de A-M (F1) e dos oligossacarídeos

F2 e F3. (Figura 31 IV, V, VI).

Apesar da presença de todos os oligossacarídeos nas três

concentrações, existem diferenças na proporção entre os oligossacarídeos em

cada concentração de endo-β-mananase após ação da α-galactosidase

semipurificada (Figura 31 IV, V, VI).

A determinação da razão entre oligossacarídeos F1 e os

oligossacarídeos F2+F3 (razão F1/F2) após a ação da α-galactosidase

semipurificada sugere que ocorra a realocação dos oligossacarídeos F2 e F3

em picos de oligossacarídeos F1, visto que a perda das ramificações com

galactose diminuem os oligossacarídeos tornando-os F1, bem como pode

sugerir a realocação dos oligossacarídeos F1 ainda ramificados a

oligossacarídeos F1 menores. Assim, era esperado que após hidrólise com a α-

galactosidase a razão F1/F2 fosse maior da encontrada no Experimento I

(Tabela 2).

A razão F1/F2 encontrada após hidrólise com a α-galactosidase

semipurificada dos oligossacarídeos produtos da hidrólise do galactomanano

com endo-β-mananase nas concentrações de 0,005U, 0,05U e 1U foram: 4,92;

14,26 e 7,98, respectivamente, valores estes maiores do que os encontrados

após a hidrólise com endo-β-mananase no Experimento I (Tabela 2).

147

Tabela 2: Comparação da razão F1/F2 do Experimento I (hidrólise do galactomanano a 1%

somente com endo-β-mananase) com a razão do Experimento II (hidrólise dos oligossacarídeos do

Experimento I somente com α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.).

Endo-β-Mananase

(U/mL)

Razão F1/F2

Experimento I

Razão F1/F2

Experimento II

0,005 U 4,11 4,92

0,05U 2,85 14,26

1U 5,26 7,98


galactomanano com endo-β-mananase a 0,005U (Experimento I) e da hidrólise

com α-galactosidase semipurificada dos oligossacarídeos produto da digestão

com endo-β-mananase na mesma concentração (Experimento II) (Figura 31

VII) evidencia o surgimento de três novos oligossacarídeos, picos K, L e M, e

desaparecimento do oligossacarídeo identificado pelo pico I, após ação da α-

galactosidase.

Além disso, após a hidrólise com α-galactosidase semipurificada dos

oligossacarídeos produtos da digestão com endo-β-mananase a 0,005U notou-

se a mudança na proporção dos picos de manobiose (A), manotriose (B),

tetrassacarídeos (C), hexassacarídeos (E) e octa e nonassacarídeos (G e H)

(Figura 31 VII). Esta mudança na proporção está explorada na Tabela 3.

Os perfis cromatográficos comparativos das hidrólises enzimáticas do

galactomanano com endo-β-mananase a 0,05U e 1U (Experimento I) e da

hidrólise com α-galactosidase semipurificada dos oligossacarídeos produtos

das digestões com endo-β-mananase nas mesmas concentrações

(Experimento II) (Figura 31 VIII e IX) apresentaram os mesmos resultados

descritos para a concentração de 0,005U: o surgimento de três novos

oligossacarídeos, picos K, L e M, desaparecimento do oligossacarídeo

identificado pelo pico I e mudança nas proporções dos picos A, B, C, E, G e H,

após ação da α-galactosidase semipurificada (Figura 31 VIII e IX).

149


oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática com α-galactosidase semipurificada de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. dos oligossacarídeos produto da hidrólise do galactomanano a 1% de Sesbania

virgata (Cav.) Pers com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U (Experimento I). (I)

Controle (galactomanano a 1% sem enzima); (II) Controle (galactomanano a 1% com α-

galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.; (III) Controle (galactomanano a 1%

com celulase de Trichoderma longibrachiatum (Megazyme®)); (IV) perfil de oligossacarídeos

formados após ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise com endo-β-mananase a 0,005U; (V)

perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise com endo-

β-mananase a 0,05U; (VI) perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre

prévia hidrólise com endo-β-mananase a 1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos

formados no Experimento I e Experimento II na concentração de 0,005U de endo-β-mannanase;

(VIII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados no Experimento I e Experimento II na

concentração de 0,05U de endo-β-mannanase; (IX) comparação dos perfis de oligossacarídeos

formados no Experimento I e Experimento II na concentração de 1U de endo-β-mannanase. (A)

manobiose (M2); (B) manotriose (M3); (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D)



e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G


3,4M5); (G-I)

oligossacarídeos >8 resíduos (possíveis oligossacarídeos presentes: G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6;

G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7); (K-L) octassacarídeos e nonassacarídeos sem ramificação;

(M) oligossacarídeos >10 resíduos de manose (possivelmente resultado da desramificação do pico I).

Os oligossacarídeos identificados A-M são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos

restantes são identificados como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos

trios.

McCleary et al. (1976) descreveu que a hidrólise completa de manano

com endo-β-mananase resultaria em manobiose e manotriose somente, sendo

a produção de manobiose maior do que a de manotriose, portanto, a

determinação da razão manobiose/manotriose (M2/M3) e a sua comparação

sob diferentes condições de hidrólise evidencia a taxa de conversão do

150

polissacarídeo e de oligossacarídeos grandes (F1, F2 e F3) aos produtos

máximos manobiose e manotriose.

Já a determinação e comparação da razão: manotriose/tetrassacarídeos

(pico C) (M3/C), sob diferentes condições de hidrólise permite a identificação

da mudança da proporção entre os picos, possibilitando a inferência na

estrutura do oligossacarídeo original (antes da ação da α-galactosidase) e após

a ação da α-galactosidase, bem como a inferência na realocação nos picos de

oligossacarídeos F1.

A tabela 3 reúne as razões M2/M3 e M3/C dos perfis cromatográficos

das hidrólises do galactomanano a 1% com endo-β-mananase a 0,005U, 0,05U

e 1U (Experimento I) e dos perfis cromatográficos das hidrólises com α-

galactosidase semipurificada dos oligossacarídeos produto das hidrólises do

galactomanano a 1% com endo-β-mananase a 0,005U, 0,05U e 1U

(Experimento II).

Tabela 3: Comparação das razões Manobiose (M2)/Trissacarídeo (M3 e/ou G1M2) (M2/M3) e

Trissacarídeo (M3 e/ou G1M2)/Tetrassacarídeo (M4 e/ou G

1M3) (M3/C) dos Experimentos I e II.

Razão Experimento I Experimento II

0,005U 0,05U 1U 0,005U 0,05U 1U

M2/M3 1,05 1,22 3,35 1,11 1,34 3,36

M3/C 0,74 1,53 0,39 1,01 1,91 0,48

De forma geral, todas as razões analisadas sofreram um aumento

quando houve a adição da α-galactosidase semipurificada, permitindo a

sugestão de realocação dos picos F1 B e C nos picos A e B.

A razão M2/M3 após ação da α-galactosidase aumenta

independentemente da concentração de endo-β-mananase utilizada

previamente, evidenciando que a retirada das galactoses proporciona um

aumento na digestibilidade do polissacarídeo, pelo aumento na taxa de

conversão de oligossacarídeos F1, F2 e F3 e polissacarídeo aos produtos

máximos de hidrólise: manobiose e manotriose.

Pela análise dos resultados da hidrólise dos oligossacarídeos do

Experimento I com α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®)

151

o modo de ação das α-galactosidases não difere, sendo o resultado muito

semelhante ao descrito para α-galactosidase semipurificada, portanto, a figura

47 expõe os resultados das digestões com α-galactosidase comercial se

encontra no Anexo.

4.1.3. Experimento III

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento III visaram

compreender a importância das ramificações de galactose no processo de

degradação do galactomanano, através da comparação das hidrólises do

polissacarídeo galactomanano a 1% com endo-β-mananase (Megazyme®) a 1U

somente (Experimento I) e do polissacarídeo galactomanano a 1% com endo-

β-mananase (Megazyme®) a 1U conjuntamente a α-galactosidase

semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. ou a α-galactosidase de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®).

Dessa forma, a comparação da diversidade e da concentração dos

oligossacarídeos formados nas hidrólises contendo ou não a α-galactosidase

pode sugerir que a ramificação com galactose de alguma forma modula a

degradação do galactomanano.

A comparação das hidrólises do galactomanano a 1% com endo-β-

mananase a 1U na presença ou ausência da α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. está apresentada na Figura 32. Quando o

polissacarídeo galactomanano nativo foi tratado somente com α-galactosidase

semipurificada, uma pequena quantidade de galactose foi retirada e

praticamente não houve detecção de oligossacarídeo (Figura 32 III), os

oligossacarídeos C e G são os mesmos que aparecem no controle sem

qualquer enzima (Figura 32 IV).

Quando o polissacarídeo de galactomanano de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. a 1% foi hidrolisado somente pela endo-β-mananase de Aspergillus niger

(Megazyme®) houve a produção de oligossacarídeos F1, F2 e F3, sendo a

razão F1/F2=5,26 (Figura 32 I). Além disso, a proporção de oligossacarídeos

F1 formados é praticamente a mesma de oligossacarídeos F2 e F3, mostrando

que a enzima não está sendo capaz de hidrolisar completamente o

polissacarídeo a F1, ainda mantendo intermediários F2 e F3.

152

Entretanto, a ação prolongada da combinação da endo-β-mananase de

Aspergillus niger (Megazyme®) com a α-galactosidase semipurificada de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. sobre o galactomanano a 1% também gerou

oligossacarídeos F1, F2 e F3, porém, a proporção de oligossacarídeos F1 é

muito maior do que os oligossacarídeos F2 e F3, razão F1/F2= 11,81 (Figura

32 III), evidenciando que a presença da α-galactosidase efetivamente melhorou

a hidrólise do polissacarídeo e oligossacarídeos F2 e F3 a oligossacarídeos F1.

O Experimento III conduzido seguindo a mesma metodologia, porém

com a α-galactosidase comercial (Megazyme®) substituindo a α-galactosidase

semipurificada, apresentou os mesmos resultados, estando os cromatogramas

apresentados na figura 48 no Anexo.

154



com endo-β-mananase (Megazyme®) a 1U com acréscimo ou não da α-galactosidase semipurificada

de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (I) perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do

galactomanano a 1% somente com endo-β-mananase a 1U; (II) perfil de oligossacarídeos formados

na hidrólise do galactomanano a 1% com endo-β-mananase a 1U/mL e α-galactosidase de

semipurificada Sesbania virgata (Cav.) Pers. a 0,5U/mL; (III) perfil de oligossacarídeos formados

na hidrólise do galactomanano a 1% somente com α-galactosidase semipurificada Sesbania virgata

(Cav.) Pers. a 0,5U/mL; (IV) Controle (galactomanano sem enzima). (Gal) Galactose; (A)




e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G


3,4M5); (G-I)

oligossacarídeos >8 resíduos (G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7). Os

oligossacarídeos identificados A-I são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos

restantes são identificados como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos

trios.

4.1.4. Experimento IV

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento IV visaram

compreender o modo de ação da enzima endo-β-mananase (Megazyme®) em

diferentes concentrações (0,005U/mL e 1U/mL) quando na presença da α-

galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. e a α-

galactosidase comercial (Megazyme®), ambas na máxima concentração de

0,5U/mL e galactomanano nas concentrações de 1% e 0,1%.

Dessa forma, a comparação dos oligossacarídeos formados nas

diferentes concentrações da endo-β-mananase, na mesma concentração da α-

galactosidase (0,5U/mL) e em concentrações distintas do galactomanano (1%

ou 0,1%) pode evidenciar preferência em alguns sítios de clivagem na cadeia

de principal de manano.

Os perfis cromatográficos dos oligossacarídeos produtos das hidrólises

do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. a 0,1% e 1%, com endo-β-

mananase a 0,005U e 1U e α-galactosidase semipurificada a 0,5U/mL se

encontram na figura 33.

155

Independente da concentração do substrato e da enzima endo-β-

mananase a diversidade de oligossacarídeos produzida é mesma visto pela

presença dos picos A a I em todos os cromatogramas (Figura 33 I a IV).

No entanto, o aumento da concentração da enzima endo-β-mananase,

de 0,005U para 1U, ou a diminuição na concentração do substrato, de 1% para

0,1%, melhorou a eficiência da digestão, sendo o aumento da concentração da

enzima mais eficiente, devido a maior formação de oligossacarídeos F1, F2 e

F3 (Figura 33 III e IV).

A proporção dos oligossacarídeos F1 formados após hidrólise com endo-

β-mananase na menor concentração (0,005U) não reflete a proporção de

oligossacarídeos no polímero, devido a poucos fragmentos galactosilados (C-I)

aparecerem, sugerindo que os oligossacarídeos galactosilados são mais

dificilmente formados (Figura 33 I e II).

O mesmo foi visto para as hidrólises com α-galactosidase comercial de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®), dados apresentados na figura 49

presente no Anexo deste documento.



156

com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U e 1U e α-galactosidase semipurificada de Sesbania

virgata (Cav.) Pers. a 0,5U/mL. (I) Galactomanano a 1%, 0,005U de endo-β-mananase e α-

galactosidase semipurificada a 0,5U/mL; (II) Galactomanano a 0,1%, 0,005U de endo-β-mananase e

α-galactosidase semipurificada a 0,5U/mL; (III) Galactomanano a 1%, 1U de endo-β-mananase e α-

galactosidase semipurificada a 0,5U/mL; (IV Galactomanano a 0,1%, 1U de endo-β-mananase e α-

galactosidase semipurificada a 0,5U/mL. (A) manobiose (M2); (B) manotriose(M3); (C)

tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D) pentassacarídeos (manopentose – M5 e/ou

G1M3 e/ou G


1,3M4 e/ou G

4M5 e/ou G

3M5); (F)



M5;

G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7). Os oligossacarídeos identificados A-I são

denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes são identificados como F2, quanto

combinação aos pares, e F3, quando combinação aos trios.

4.1.5. Experimento V

As hidrólises enzimáticas conduzidas no Experimento V visaram produzir


de monossacarídeo (manose) a decassacarídeos (oligossacarídeo de 10

manoses) de manose para identificar, nas análises de HPAEC-PAD, os


da composição de cada oligossacarídeo.

Os produtos das hidrólises enzimáticas do manano comercial

(Megazyme®) a 1% com endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®)

(0,005U, 0,05U e 1U) após ação da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®) e a co-injeção de manose e galactose se

encontram na figura 34.

Ao analisar os oligossacarídeos formados nas três concentrações de

enzima (0,005U, 0,05U e 1U) nota-se uma tendência na diminuição da

diversidade de oligossacarídeos formados, mesmo após a hidrólise com α-

galactosidase em um primeiro ciclo de digestão. Nas concentrações de 0,005U

e 0,05U de endo-β-mananase utilizadas é possível identificar os

oligossacarídeos identificados de A, B, C, D, E e F, picos F1, sem a detecção

de qualquer pico F2 e/ou F3. Na concentração de 1U de endo-β-mananase

somente os picos A e B são detectados, sem qualquer detecção de

oligossacarídeos F2 e/ou F3 (Figura 34 I, II e III).

157

Os oligossacarídeos comuns às três concentrações de endo-β-

mananase, A e B, possuem proporções distintas entre os oligossacarídeos

formados podendo ser devido a diferença na concentração da enzima e não a

preferência na produção de cada oligossacarídeo em cada concentração

(Figura 34 I, II e III), visto que a concentração de 1U gerou,

preponderantemente, manobiose (A) e manotriose (B).

Nas menores concentrações de endo-β-mananase (0,005U e 0,05U) já

existe a preferência pela formação da manobiose (pico A) e, principalmente na

concentração de 0,05U, a proporção dos picos B, C, D e E, em relação ao pico

A, é maior do que a encontrada no perfil cromatográfico da concentração de 1U

de endo-β-mananase (Figura 34 I, II e III).

O perfil cromatográfico da hidrólise enzimática do manano com endo-β-

mananase a 1U (Figura 34 III) mostra a clivagem completa do manano a

manobiose e manotriose (picos A e B) com pouquíssima quantidade dos

demais oligossacarídeos (D, E e F) evidenciando ação da α-galactosidase na

retirada das galactoses restantes.

Na comparação dos perfis cromatográficos dos oligossacarídeos

formados após hidrólise com 0,05U e 1U de endo-β-mananase nota-se que os

oligossacarídeos identificados como D, E e F estão em concentração razoável

em 0,05U (em relação aos demais picos), mas a 1U eles praticamente

desaparecem, mostrando que são oligossacarídeos de manose tamanhos

diversos não galactosilados.

Os perfis cromatográficos das co-injeções com os padrões de manose e

galactose (figura 34 IV, V) mostra o tempo de retenção de 4,450 para a

manose e 4,675 para a galactose.

158


oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do manano comercial (Megazyme®) com endo-β-

mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U e α-galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba

comercial (Megazyme®) a 0,5U/mL. (I) perfil de oligossacarídeos formados na concentração de

0,005U de endo-β-mananase; (II) perfil de oligossacarídeos formados na concentração de 0,05U de

endo-β-mananase; (III) perfil de oligossacarídeos formados na concentração de 1U de endo-β-

mananase; (IV) injeção com padrão de manose; (V) injeção com padrão de galactose. (A)




e/ou G1,3

M4 e/ou G4M5 e/ou G


3,4M5). Os

oligossacarídeos identificados A-F são denominados oligossacarídeos F1.

159



Visando determinar se as substituições de galactose interferem na

atuação da endoenzima endo-β-mannanase, dificultando a ação de hidrolisar o

polissacarídeo a oligossacarídeo, realizou-se o experimento que comparou os

oligossacarídeos, produto da hidrólise com endo-β-mannanase, de

(galacto)mananos de 6 espécies vegetais (Sesbania virgata, Senna alata,


edulis, que sabidamente possuem proporções de substituição por galactose

diferentes, ou seja, razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1). O

método de análise dos oligossacarídeos formados foi realizado através de

HPAEC-PAD e TLC.

A razão manose:galactose das 6 espécies estudadas, apresentada na

Tabela 4, foi determinada pela análise em HPAEC-PAD dos monossacarídeos

provenientes da hidrólise ácida com ácido sulfúrico do polissacarídeo,

(galacto)manano, de cada espécie.

Pela Tabela 4 fica evidente a diferença na proporção manose:galactose

das espécies estudadas, enquanto Euterpe edulis e Coffea arabica possuem

razão manose:galactose 150:1 e 40:1, respectivamente, sendo denominados

mananos; Dimorphandra mollis e Senna Alata possuem razão 2:1 e Cyamopsis

tetragonoloba e Sesbania virgata possuem razão 1:1, e são denominados de

galactomananos.

Após identificação da razão manose:galactose dos (galacto)mananos

das 6 espécies estudadas, realizou-se a hidrólise enzimática dos mesmos

polissacarídeos com endo-β-mannanase de Aspergillus niger (Megazyme®) e o

perfil de oligossacarídeos produzidos foram analisados por Cromatografia em

Camada Delgada (TLC) (Figura 35) e por HPAEC-PAD utilizando coluna PA-

100 (Figura 36).

160

Tabela 4. Razão manose:galactose das 6 espécies estudadas determinada pela análise de

monossacarídeos em HPAEC-PAD (Dionex). Apresentado por ordem crescente na quantidade de

substituições de galactose: Manano (Euterpe edulis; Coffea arábica); Galactomanano de proporção

2:1, ou seja, a cada 2 manose existe a ramificação por 1 galactose (Dimorphandra mollis; Senna

alata); Galactomanano de proporção 1:1, ou seja, teoricamente todo o polissacarídeo é substituído

por galactose (Cyamopsis tetragonoloba; Sesbania virgata) .

Espécies Razão Manose:Galactose

Euterpe edulis 150,51 (150:1)

Coffea arabica 40,2 (40:1)

Dimorphandra mollis 1,82 (2:1)

Senna alata 1,77 (2:1)

Sesbania virgata 1,53 (1:1)

Cyamopsis tetragonoloba 1,17 (1:1)

O perfil dos oligossacarídeos revelados em TLC encontra-se na Figura

35, onde o conjunto de oligossacarídeos foi aplicado de acordo com a razão

manose:galactose da espécie. Dessa forma, em A estão os oligossacarídeos

de Euterpe edulis (150:1); em B os de Coffea arabica (40:1); em C os de

Dimorphandra mollis (2:1); em D os de Senna alata (2:1); em E os de Sesbania

virgata (1:1); e em F os de Cyamopsis tetragonoloba (1:1).

Em uma comparação inicial dos oligossacarídeos das 6 espécies nota-

se que (galacto)mananos com diferentes proporções exibem perfis de

oligossacarídeos diversos.

Quando se compara o perfil de oligossacarídeos dos galactomananos

(Figura 35 C-F) observa-se de forma imediata diferenças nas intensidades das

bandas, enquanto em C e D as bandas são fortes em sua totalidade, em E e F

somente as bandas superiores (oligossacarídeos F1) apresentam intensidade,

ainda muito mais fraca do que as das primeiras, e as bandas inferiores

(oligossacarídeos F2 e F3) estão presentes mas em baixíssima concentração.

Além disso, nota-se que Cyamopsis tetragonoloba (F) possui dois

oligossacarídeos F1 exclusivos (Figura 35 F, →1, 2) e conjuntamente com

Sesbania virgata (Cav.) Pers. possuem um oligossacarídeo F2/F3 exclusivo de

ambas as espécies (Figura 34, →3).

161

Quando se comparam as espécies com reserva de manano (Figura 35

A e B), observam-se três oligossacarídeos exclusivos da espécie A (Figura 35

A, →1, 2, 3), razão manose:galactose 150:1, e um oligossacarídeo exclusivo da

espécie B (Figura 35 B, →4), razão 40:1.

Na comparação entre as espécies com reserva de manano e as com

reserva de galactomanano, observa-se três oligossacarídeos exclusivos das

espécies com reserva de manano, oligossacarídeos identificados por *→, no

entanto, nota-se uma ausência dos oligossacarídeos de maior peso (F2/F3)

nas espécies com reserva de manano (Figura 35, chave vermelha) e presentes

em todas as espécies com reserva de galactomanano, apesar das diferenças

nas concentrações.

162

Figura 35. Análise por Thin Layer Chromatography (TLC) dos oligossacarídeos obtidos após

hidrólise enzimática exaustiva com endo-β-mannanase (Megazyme®) das 6 espécies estudadas. (A)

Euterpe edulis (150:1); (B) Coffea arabica (40:1); (C) Dimorphandra mollis (2:1); (D) Senna alata

(2:1); (E) Sesbania virgata (Cav.) Pers. (1:1); (F) Cyamopsis tetragonoloba (1:1). (→)

Oligossacarídeos exclusivo de 1 ou mais espécies: (→1, 2) exclusivo de Cyamopsis tetragonoloba;

(→3) exclusivo de Sesbania virgata e Cyamopsis tetragonoloba; (→) Comparação dos

oligossacarídeos formados entre as espécies (A e B) com reserva de manano: (→1, 2, 3) exclusivo de

Euterpe edulis; (→4) exclusivo de Coffea arabica. (*→) Oligossacarídeos exclusivos das espécies com

reserva de manano. (Chave vermelha) Oligossacarídeos e suas combinações em pares (F2) e em

trios (F3) exclusivos de espécies com reserva de galactomanano.

*

*

1

2

3

A B C D F E A A

1

3 2

4

*

163

Os perfis cromatográficos da análise por HPAEC-PAD dos

oligossacarídeos provenientes da hidrólise com endo-β-mannanase dos

polissacarídeos das 6 espécies encontram-se agrupados na Figura 36.

Da mesma maneira como no TLC (Figura 35), os perfis cromatográficos

estão identificados de forma crescente quanto à substituição por galactose,

assim: A perfil dos oligossacarídeos de Euterpe edulis (150:1); em B perfil dos

oligossacarídeos de Coffea arabica (40:1); em C perfil dos oligossacarídeos de

Dimorphandra mollis (2:1); em D perfil dos oligossacarídeos de Senna alata

(2:1); em E perfil dos oligossacarídeos de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (1:1); e

em F perfil dos oligossacarídeos de Cyamopsis tetragonoloba (1:1).

As letras de a-m identificam cada oligossacarídeo, onde: (a) manose; (b)

galactose; (c) manobiose; (d) manotriose; (f-h, j-m) oligossacarídeos ainda não-

identificados; (i) combinações aos pares e aos trios dos oligossacarídeos

identificados c-h, j-m. Os oligossacarídeos identificados como a-h e j-m são

denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos identificados por i são

denominados F2 quando combinação aos pares e F3 quando combinação aos

trios de F1 (Figura 36).

Os picos identificados pela mesma letra (a-m) correspondem ao mesmo

oligossacarídeo, por apresentarem o mesmo tempo de retenção na coluna.

Ao analisar os perfis cromatográficos de forma crescente, quanto às

substituições por galactose, nota-se gradualmente o aparecimento dos

oligossacarídeos F2 e F3, enquanto A (150:1) não apresenta qualquer pico

denominado h e/ou i, a partir de B (40:1) estes picos estão presentes. Ainda

quanto aos picos h e i, observa-se que os perfis C e D apresentam a maior

concentração destes.

Além disso, observa-se que os perfis cromatográficos E e F possuem,

comparativamente aos demais, baixa detecção (concentração) de todos os

oligossacarídeos.

Os oligossacarídeos identificados por: a, c, d, f, g, h, i, são comuns a

todos os perfis cromatográficos, com exceção do perfil A que não possui o

oligossacarídeo identificado por g, no entanto apresenta um oligossacarídeo

exclusivo a ele, identificado por l, e um segundo oligossacarídeo, identificado

por k, presente nos perfis A, B, D e E.

164

O oligossacarídeo b parece ser exclusivo nos perfis cromatográficos B e

F, o oligossacarídeo j, apesar de baixa detecção, é exclusivo do perfil

cromatográfico de C e, por fim, o oligossacarídeo e, se apresenta em uma

quantidade razoável no perfil F, sendo exclusivo desta espécie.

Figura 36. Cromatogramas gerados por HPAEC-PAD, utilizando coluna PA- 100, da análise dos

oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática exaustiva com endo-β-mannanase (Megazyme®),

das 6 espécies estudadas. (A) Euterpe edulis (150:1); (B) Coffea arabica (40:1); (C) Dimorphandra

mollis (2:1); (D) Senna alata (2:1); (E) Sesbania virgata (1:1); (F) Cyamopsis tetragonoloba (1:1). (a)

manose; (b) galactose; (c) manobiose; (d) manotriose; (f-h, j-m) oligossacarídeos ainda não-

identificados; (i) combinações aos pares e aos trios dos oligossacarídeos identificados (c-h, j-m). Os

oligossacarídeos identificados a-h e j-m são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos

identificados por i são denominados F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação

aos trios.

165

Os oligossacarídeos formados não diferem dos oligossacarídeos

identificados nos Experimentos I a V, porém a análise conduzida em HPAEC-

PAD, embora tenha seguido a mesma metodologia, este experimento foi o

primeiro a ser conduzido e na época a coluna PA-100 utilizada já estava muito

antiga, prejudicando a separação dos oligossacarídeos. Dessa forma,

consegue-se identificar a manobiose e a manotriose, mas os demais picos

possuem muitos oligossacarídeos co-eluídos e não seguem a mesma

identificação dos Experimentos I a V.

V. Discussão



Endo-β-manase de Aspergillus niger (Megazyme®), α-

Galactosidase de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) e α-


Diversas técnicas já foram empregadas em estudos de distribuição de

resíduos de D-galactose ao longo da cadeia principal de D-manano de

galactomananos de reserva de sementes de leguminosas (McCleary et al.,

1985).

Os estudos sobre a estrutura fina de galactomananos e glucomananos

conduzidos por McCleary foram realizados utilizando como técnicas: a hidrólise

do polissacarídeo com endo-β-mananase de Aspergillus niger, já bem

caracterizada no seu modo de ação (McCleary & Matheson, 1983), isolamento

e identificação da composição de cada oligossacarídeo por Ressonância

Magnética Nuclear (RMN) e/ou Raio-X (McCleary et al., 1976; McCleary et

al.,1983; McCleary & Matheson, 1983).

A compreensão no modo de ação da endo-β-mananase de Aspergilus

niger foi realizada pela identificação dos oligossacarídeos formados após a sua

ação sobre galactomanano de goma caroba razão manose:galactose 4:1, em

comparação com os oligossacarídeos formados após ação de endo-β-

166

mananases de bactéria (Bacillus subtilis), fungo (Irpex lacteus), animais (Helix

pomatia) e plantas (Cyamopsis tetragonoloba e Medicago sativa) sobre o

mesmo substrato (McCleary & Matheson, 1983).

De forma geral, McCleary & Matheson (1983), determinaram que endo-

β-mananases de fontes variadas possuem capacidades hidrolíticas diferentes,

requerendo um maior número de resíduos de manose sem ramificação para

conseguirem hidrolisar o polissacarídeo. A endo-β-mananase de Aspergillus

niger é a enzima menos específica no seu modo de ação, necessitando de no

mínimo de um oligossacarídeo de 3 resíduos de manose galactosilados ou não

para ainda conseguir identificar um sítio de clivagem, e com a maior

capacidade de clivar o polissacarídeo altamente galactosilado, pois possui

maior tolerância às ramificações com galactose.

Dessa forma, endo-β-mananases de fontes variadas diferem entre si na

capacidade de hidrolisar um mesmo polissacarídeo, no entanto, os

oligossacarídeos formados após a ação enzimática são os mesmos e estão

descritos na Tabela 5.

Analisando esta tabela, percebe-se que alguns oligossacarídeos são

inexistentes quando da ação da endo-β-mananase de Aspergillus niger, pois

esta enzima consegue clivar estes oligossacarídeos a fragmentos ainda

menores, exatamente pela sua maior tolerância às ramificações com galactose.

Independentemente da endo-β-mananase utilizada, McCleary &

Matheson (1983), demonstraram que quanto menor for a razão

manose:galactose de um polissacarídeo, ou seja, quanto mais ramificado for

um polissacarídeo, menor será a porcentagem de hidrólise deste dado

polissacarídeo pela endo-β-mananase.

Tiné et al. (2003) sugeriram, também através de hidrólises enzimáticas

do polissacarídeo xiloglucano e identificação dos oligossacarídeos formados,

que a estrutura do xiloglucano de reserva de sementes conteria, pelo menos,

parte da informação requerida para o seu próprio metabolismo, o que

posteriormente chamou-se de código do xiloglucano (Buckeridge, 2010).

A sugestão da presença de um código presente no polissacarídeo

contendo informações que afeta a sua hidrólise foi realizada através da

visualização de diminuição dos oligossacarídeos F2 e F3 formados na

presença da β-galactosidase, que os oligossacarídeos menos ramificados eram

167

formados preferencialmente pela enzima e que polímeros de estrutura fina

diferente possuíam porcentagem de hidrólise diferente na presença da mesma

enzima.

Assim, sugere-se, através dos resultados obtidos nesta dissertação, que

a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos,

parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua


com resíduos de D-galactose.

Da mesma forma que o determinado por Tiné et al. (2003), nota-se que

a hidrólise do galactomanano pela endo-β-mananase de Aspergillus niger

(Figura 28) forma oligossacarídeos F1 (base do galactomanano), bem como,

oligossacarídeos F2 e F3, evidenciando equilíbrio de reação e impedimento da

hidrólise total do polissacarídeo.

Apesar de não ter sido analisada a composição dos oligossacarídeos F2

e F3, os resultados apresentados no Experimento III (Figura 32), permitem a

sugestão que estes grupos de oligossacarídeos são mais galactosilados, pois

na presença da α-galactosidase conjuntamente com a endo-β-mananase existe

a diminuição na formação de F2 e F3 e aumento na formação de F1, sugerindo

que a ramificação com galactose parece ser a responsável pelo impedimento

da hidrólise.

A análise dos resultados do Experimento I (Figura 29) evidenciou a

preferência na formação de oligossacarídeos dependente da concentração

utilizada de endo-β-mananase. Em concentrações baixas de enzima (0,005U e

0,05U) a manotriose (M3) e/ou o trissacarídeo (G1M2) (pico B) são

preferencialmente produzidos, enquanto na concentração de 1U os

oligossacarídeos pares manobiose (M2) (pico A) e o tetrassacarídeo (G1M3) são

preferencialmente produzidos, sugerindo que a enzima, quando em baixa

concentração, prefere locais com menor quantidade de ramificações,

evidenciando que a digestão do polissacarídeo não é ao acaso.

168

Tabela 5: Oligossacarídeos produzidos na hidrólise do galactomanano de goma caroba, razão

manose:galactose 4:1 pelas endo-β-mananase de Aspergillus niger e de sementes de Medicago sativa

(alfafa). O final redutor da molécula está sempre a esquerda, manose denominada de 1. (#) O

subscrito indica a quantidade de resíduos de manose o oligossacarídeo possui em sua cadeia

principal, enquanto o sobrescrito indica a posição da substituição da galactose na cadeia relativa ao

final redutor da molécula; (*) As estruturas dos oligossacarídeos >7 resíduos produzidos pela

hidrólise da endo-β-mananase de M.sativa não foram caracterizadas. Estes oligossacarídeos

representam 26,9% do total de oligossacarídeos produzidos. (-) Oligossacarídeos não produzidos

pela hidrólise da endo-β-mananase de Aspergillus niger por esta ser mais inespecífica em sua ação,

conseguindo “triblar” a presença de ramificação com galactose diminuindo o tamanho do

oligossacarídeo. Tabela retirada e adapatada de McCleary et al. (1983)

Oligossacarídeos Quantidade (%)

N°

resíduos Composição Estrutura

Aspergillus

niger

Medicago

sativa

1 Man

1,8 traço

2 Man2 23,9 13,3

3 Man3 20,2 19,3

3 Gal1Man2#

15,9 1,0

4 Gal1Man3

7,4 4,2

4 Man4 - 8,0

5 Gal3Man4

- 9,0

5 Gal1Man4

- 2,0

6 Gal1,3Man4

- 0,4

M-M-M-M

G G

M-M-M-M

G

M-M-M-M

G

M-M-M-M

M-M-M

G

M-M

G

M-M-M

M-M

M

169

6 Gal4Man5

- 3,3

6 Gal3Man5

- 3,3

7 Gal3,4Man5

11,1 9,2

8 Gal1,3,4Man5

0,6 26,9*

8 Gal4,5Man6

1,2 26,9*

8 Gal3,4Man6

4,2 26,9*

9 Gal3,4,5Man6

2,5 26,9*

9 Gal1,4,5Man6

2,3 26,9* M-M-M-M-M-M

G

G G

M-M-M-M-M-M

G

G G

M-M-M-M-M-M

G

G

M-M-M-M-M-M

G

G

M-M-M-M-M

G

G G

M-M-M-M-M

G

G

M-M-M-M-M

G

M-M-M-M-M

G

170

9 Gal1,3,4Man6

0,5 26,9*

9 Gal4,5Man7

0,7 26,9*

>9 - 7,7 26,9*

A razão F1/F2 do Experimento I (Tabela 2) corrobora a hipótese de que

existe uma preferência por sítios menos galactosilados, pois na concentração

de enzima a 1U, percebe-se uma diminuição na preferência dos sítios de

clivagem, reduzindo o polissacarídeo a oligossacarídeos F2 e F3, mas

principalmente F1, visto que a razão F1/F2(1U) é a maior das 3 concentrações.

Na menor concentração de enzima, 0,005U, aparentemente há muita

dificuldade no processamento do polissacarídeo, sendo assim, a enzima ataca

sítios de clivagem de preferência, produzindo preferencialmente F1, uma vez

que a produção de oligossacarídeos F2 e F3 requer que as enzimas lidem com

as ramificações por galactose.

Contudo, na concentração de 0,05U de enzima, parece pela menor

razão F1/F2 apresentada, que a enzima prefere hidrolisar o polissacarídeo a F2

e F3, do que reprocessar F2 e F3 a F1 pela presença das ramificações com

galactose presentes nestes oligossacarídeos, permitindo a sugestão que as

ramificações parecem dificultar a digestão pela endo-β-mananase, que não age

ao acaso, preferindo sítios menos galactosilados. Estes resultados permitem

concluir que as ramificações com galactose modulam a ação da endo-β-

mananase, possivelmente em moldes parecidos com os observados por Tiné et

al. (2003) para xiloglucanos.

Na comparação do Experimento I com o Experimento II era esperado

encontrar no perfil cromatográfico do Experimento II uma mudança no padrão

de oligossacarídeos presentes no Experimento I, pois inicialmente entendia-se

que os oligossacarídeos ramificados não eram co-eluídos com os

M-M-M-M-M-M-M

G

G

M-M-M-M-M-M

G

G G

171

oligossacarídeos não-ramificados (somente a cadeia principal de manano),

sendo assim, após o uso da α-galactosidase, os oligossacarídeos ramificados

seriam desramificados e realocados no pico referente ao oligossacarídeo de

manose, com o desaparecimento dos picos galactosilados.

Assim, o objetivo do Experimento II era observar os picos que sumiriam

para identificar os oligossacarídeos ramificados e com o aumento dos demais

picos (representantes dos oligossacarídeos de manose) inferir sobre a

composição.

Entretanto, a análise comparativa do Experimento I e do Experimento II

não evidenciou o desaparecimento de picos, com exceção do pico I, mas a

mudança na proporção dos picos (Figura 31 VII,VIII,IX) sugerindo que haja co-

eluição de oligossacarídeos com o mesmo número de resíduos, ou seja,

oligossacarídeos contendo somente manose, por exemplo manotetraose (M4)

são co-eluídos com oligossacarídeos ramificados com galactose, seguindo o

exemplo anterior, tetrassacarídeo (G1M3).

Assim, a co-eluição impossibilitou a identificação dos picos referentes a

oligossacarídeos ramificados, dificultando a identificação da composição de

cada oligossacarídeo formado após ação da endo-β-mananase de Aspergillus

niger. Sendo assim, foi necessária a utilização da descrição feita por McCleary

et al. (1983) (Tabela 5) dos oligossacarídeos formados após ação da endo-β-

mananase de Aspergillus niger juntamente com os resultados dos Experimento

I e Experimento V (Figuras 29 e 34) para inferir sobre a estrutura dos

oligossacarídeos, explicação abrangida posteriormente nesta discussão.

Embora a co-eluição tenha dificultado a identificação dos

oligossacarídeos, é inegável que a presença da α-galactosidase mudou a

proporção entre os oligossacarídeos. A razão F1/F2 de todas as concentrações

de endo-β-mananase (hidrólise anterior a ação da α-galactosidase) do

Experimento II é maior do que as razões encontradas no Experimento I,

evidenciando que a retirada da galactose propicia uma maior redução do

polissacarídeo a oligossacarídeos F1 (Tabela 2).

Aliado a isso, o aumento da razão F1/F2 encontrado no Experimento II

foi devido ao aumento na quantidade de oligossacarídeos F1 (comparação da

somatória das áreas dos picos F1 e F2-F3 de ambos os experimentos, dados

não mostrados), portanto, permite a sugestão que entre os oligossacarídeos F2

172

e F3 existem oligossacarídeos de cadeia de manose com tamanho de

oligossacarídeo F1 altamente ramificados, novamente sugerindo que a ação da

endo-β-mananase não é ao acaso, preferindo sítios de clivagem com baixa

porcentagem de ramificação.

A comparação das razões (M2/M3 e M3/C) entre os Experimentos I e II

(Tabela 3) juntamente com os oligossacarídeos identificados no trabalho de

McCleary et al. (1983) (Tabela 5) possibilitaram a inferência na composição

original dos oligossacarídeos e após a ação da α-galactosidase, pois como a

ação da endo-β-mananase foi anterior a da α-galactosidase e não

concomitante, a mudança de proporção entre os oligossacarídeos só é devido

a realocação dos oligossacarídeos desramificados.

Para a explicação da mudança das proporções dos picos utilizou-se a

descrição dos oligossacarídeos formados após ação da endo-β-mananase de

Aspergillus niger feita por McCleary et al. (1983) (Tabela 5).

Para a razão M2/M3 ter sido alterada (aumentou a quantidade de M2) só

pode ter havido a desramificação do trissacarídeo G1M2, portanto, no pico B

existe a manotriose e o oligossacarídeo ramificado G1M2.

Para a razão M3/C ter sido alterada (aumentou a quantidade de M3) só

pode ter havido a desramificação do tetrassacarídeo (G1M3), portanto no pico C

também há co-eluição de oligossacarídeos: manotetraose (M4) e

terassacarídeo G1M3.

A determinação da composição dos demais picos seguindo as

diferenças nas proporções, como realizado para os picos A, B e C, se torna

muito difícil, tendo em vista, que a desramificação de oligossacarídeos F1

maiores e dos oligossacarídeos F2 e F3 interferem na proporção dos

oligossacarídeos F1 menores impossibilitando a inferência na presença do

oligossacarídeo, às vezes ocultando ou diminuindo uma diferença na proporção

pela presença da co-eluição. Visando elucidação, toma-se como exemplo o

pico F, um heptassacarídeo, que não apresentou diferença na proporção entre

o Experimento I e Experimento II (Figura 31 VII, VIII, IX).

Sendo um heptassacarídeo (ver explicação mais abaixo), pode ser tanto

manoheptose (M7) proveniente da desramificação do nonassacarídeo (G4,5M7)

quanto um heptassacarídeo ramificado (G3,4M5). Apesar de haver uma pequena

diferença no pico D, pentassacarídeo, o pico F, heptassacarídeo, não

173

apresentou mudança na proporção, pois possivelmente recebeu por realocação

manoheptose, portanto, não é possível estabelecer quem foi o pico do

Experimento I que foi realocado para outro pico no Experimento II.

De forma geral, o Experimento II colaborou na identificação de alguns

picos e, principalmente, demonstrou que a enzima endo-β-mananase não atua

ao acaso preferindo sítios menos galactosilados, sugerindo novamente que as

ramificações com galactose modulam a sua ação.

Esta modulação pelos resíduos de galactose é também corroborada pelo

fato de que a hidrólise do manano (Megazyme®) independentemente da

concentração de enzima endo-β-mananase utilizada (0,005U, 0,05U e 1U),

Experimento I, não apresentou a geração de oligossacarídeos F2 e F3, sendo

completamente digerido a F1 (Figura 30).

O manano comercial (Megazyme®) é proveniente de tratamento

enzimático com α-galactosidase e químico com hidróxido de sódio do

galactomanano de Ceratonia siliqua (goma caroba) com razão

manose:galactose 4:1, possuindo após o tratamento 3% de galactose.

Aliado a isso, McCleary et al. (1976) afirmam que a digestão de um

manano não ramificado produz exclusivamente manobiose e manotriose, o que

foi corroborado neste trabalho.

Sendo assim, por haver mudança na proporção dos oligossacarídeos F1

formados dependente da concentração de endo-β-mananase e a presença de

oligossacarídeos diferentes de manobiose e manotriose (picos A e B) na

concentração de 1U (Figura 30), sugeriu-se que ainda houvesse ramificações

com galactose restantes no manano comercial (Megazyme®).

Dessa forma, justificou-se a execução do Experimento V, com a hidrólise

com a α-galactosidase, para garantir completa retirada das galactoses,

anteriormente à hidrólise do polissacarídeo com a endo-β-mananase nas três

concentrações (0,005U, 0,05U e 1U) (Figura 34).

Embora o objetivo do Experimento I não tenha sido atingido quanto à

produção de oligossacarídeos de manano de monossacarídeos a

heptassacarídeos, determinou-se que a baixa concentração de galactose (3%)

não é eficiente no impedimento da hidrólise (formação de F2 e F3), sugerindo

que deva existir uma quantidade de galactosilação mínima para haver

174

regulação no processo, possibilitando a explicação do porquê dos mananos

sempre possuírem um mínimo de ramificações com galactose.

As hidrólises conduzidas no Experimento V foram eficientes na retirada

das galactoses e, portanto, cumpriram com o objetivo da produção de

oligossacarídeos de manano de monossacarídeos a heptassarídeos. Isto

ocorreu porque, na concentração de 1U de endo-β-mananase houve,

preponderantemente, a produção dos oligossacarídeos manobiose (pico A) e

manotriose (pico B) e nas concentrações de 0,005U e 0,05U os

oligossacarídeos F1 diferentes de manobiose e manotriose são,

provavelmente, oligossacarídeos de manose de tamanhos diversos não

galactosilados, tendo em vista que estes picos desaparecem na concentração

de 1U, pois se fossem galactosilados, continuariam a ser produzidos (Figura

34).

Dessa forma, a partir dos dados do Experimento I X Experimento II

(Figura 31 VII, VIII, IX), dos dados de tempo de retenção dos oligossacarídeos

desgalactosilados do Experimento V (Figura 34) e da identificação dos

oligossacarídeos produtos da hidrólise de galactomanano com endo-β-

mananase de Aspergillus niger descritos por McCleary et al. (1983) (Tabela 5),

determinou-se as possíveis estruturas dos oligossacarídeos F1 das digestões

do galactomanano nos Experimentos I a V.

A partir da análise dos oligossacarídeos formados no Experimento V

com endo-β-mananase a 1U (Figura 34) determinou-se os tempos de retenção

da manobiose e manotriose, 6,084 minutos e 7,300 minutos, respectivamente.

A metodologia de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD é

isocrática somente de 0 a 11 minutos, ou seja, a concentração dos eluentes é

constante durante todo este período: 98% de NaOH 88mM e 2% de Acetato de

Sódio 200mM em NaOH 88mM. A partir dos 12 minutos até os 20 minutos a

concentração varia de 98% para 70% de NaOH 88mM e de 2% para 30% de

Acetato de Sódio 200mM em NaOH 88mM. Dos 20 minutos a 25 minutos varia-

se de 70% a 0% de NaOH 88mM e de 30% a 100% de Acetato de Sódio

200mM em NaOH 88mM. Dos 25 minutos aos 30 minutos o gradiente inicial é

reestabelecido 98% e 2% e se mantém constante até o final da corrida para o

reequilíbrio da coluna.

175

Dessa forma, criou-se a hipótese que até os 12 minutos de corrida a

cada minuto sairia um oligossacarídeo com um resíduo de manose ou

galactose a mais, assim, teoricamente aos 6 minutos um dissacarídeo

(manobiose) seria detectado. Da mesma forma, aos 7 minutos um trissacarídeo

(manotriose), aos 8 minutos um tetrassacarídeo, aos 9 minutos um

pentassacarídeo, aos 10 minutos um hexassacarídeo, aos 11 minutos um

heptassacarídeo. A partir dos 12 minutos a separação deixa de ser uniforme,

pelo aumento na concentração de acetato de sódio, e os oligossacarídeos

deixam de sair no tempo teórico e foram identificados pelas possibilidades

descritas por McCleary et al (1983) (Tabela 5).

Utilizando os tempos de retenção da digestão do galactomanano de

Sesbania virgata (Cav.) Pers. com endo-β-mananase a 1U (Experimento I –

Figura 29) para identificar os oligossacarídeos de acordo com a hipótese

formada acima, nota-se que os tempos de retenção apresentados pelos

oligossacarídeos A – F (picos) são muito próximos do tempo teórico (Tabela 6),

portanto, aceitou-se a hipótese.

Tendo em mãos o tamanho de cada oligossacarídeo em cada tempo de

retenção, utilizou-se da identificação dos oligossacarídeos formados após

hidrólise com endo-β-mananase de Aspergillus niger realizada por McCleary et

al. (1983) (Tabela 5) para identificar as possíveis estruturas dos

oligossacarídeos de Sesbania virgata (Cav.) Pers. para cada tempo de

retenção (Tabela 6).

McCleary et al. (1983) descreveram 14 oligossacarídeos formados pela

ação da endo-β-mananase de Aspergillus niger, porém no perfis

cromatográficos só observa-se 9 picos de oligossacarídeos F1, portanto,

novamente uma evidencia de co-eluição de oligossacarídeos com o mesmo

número de resíduos manose e/ou galactose, assim, cada pico identificado pode

representar mais de um oligossacarídeo.

176

Tabela 6: Identificação das possíveis estruturas dos oligossacarídeos de Sesbania virgata (Cav.)

Pers. componentes dos picos A-F de acordo com a comparação do tempo de retenção real e o tempo

de retenção teórico e os oligossacarídeos caracterizados e identificados por McCleary et al. (1983)

(Tabela 5).

Oligossacarídeo

(Picos)

Tempo de

retenção

(Real)

(minutos)

Tempo de

retenção

(Teórico)

(minutos)

Estruturas

A 5,975 6,000

B 7,159 7,000

C 8,359 8,000

D 8,909 9,000

E 9,942 10,000

F 11,200 11,000

M-M-M-M-M-M-M

M-M-M-M-M

G

G

M-M-M-M-M-M

M-M-M-M-M

G

M-M-M-M-M

G

M-M-M-M

G G

M-M-M-M-M

M-M-M-M

G

M-M-M-M

G

M-M-M

G

M-M

G

M-M

G

M-M-M

M-M

177

Vale lembrar que a manobiose e a manotriose foram identificadas

através do Experimento V e a partir delas foi idealizada a hipótese sobre os

tempos de retenção. Além disso, nas digestões do galactomanano,

diferentemente do manano tratado, houve oligossacarídeos galactosilados,

inclusive co-eluídos com a manotriose (ver Experimento II), ou seja, o pico B de

todas as hidrólises de galactomanano pode ser uma mistura de manotriose

com o oligossacarídeo de manobiose com ramificação de galactose na manose

redutora (Gal1Man2).

A leitura das “abreviações” dos oligossacarídeos GalxMany deve ser feita

da seguinte maneira: o y apresenta a quantidade de resíduos de manose na

cadeia principal do oligossacarídeo, enquanto o x apresenta em qual manose,

a partir da extremidade redutora (sempre a direita), a ramificação de galactose

está ligada. Dessa forma, o valor de y sempre será único, enquanto os valores

de x podem ser mais do que um, indicando uma ou múltiplas ramificações

(Figura 37).

Figura 37: Explicação para a leitura das “abreviações” dos oligossacarídeos GalXMany. A cadeia

principal de manose é numerada a partir da extremidade redutora (à direita). O número subscrito

ligado à manose indica a quantidade de resíduos de manose que a cadeia principal do

oligossacarídeo possui, enquanto o número sobrescrito ligado a galactose indica a posição do

resíduo de galactose relativo ao resíduo de manose a partir da extremidade redutora (McCleary et

al., 1983).

A análise comparativa da hidrólise do galactomanano exclusivamente

com endo-β-mananase (Experimento I) e da hidrólise do galactomanano com

endo-β-mananase e α-galactosidase semipurificada concomitantemente

(Experimento III) evidencia que os oligossacarídeos F2 e F3 são susceptíveis

M-M-M-M-M-M

G

G G

1 2 3 4 5 6

Gal1,3,4

Man6

Extremidade redutora

178

ao ataque da endo-β-mananase (Figura 32), pois a presença da α-

galactosidase no ensaio altera o equilíbrio da reação, produzindo mais

oligossacarídeos F1 do que F2 e F3 (ver razões F1/F2 de ambas as digestões).

Dessa forma, evidencia-se que a menor taxa de hidrólise dos

oligossacarídeos F2 e F3 nos ensaios somente com endo-β-mananase não

advém de uma possível resistência intrínseca destes fragmentos, mas

possivelmente das ramificações com galactose.

Portanto, nota-se uma importância das ramificações de galactose na

modulação do ataque da endo-β-mananase ao substrato.

Lisboa et al. (2006) demonstraram que α-galactosidases são inibidas

quando ocorre acúmulo de galactose livre. Aparentemente, o acúmulo de

oligossacarídeos galactosilados também impede a hidrólise completa da endo-

β-mananase (comparar hidrólise do manano (Experimento V) figura 34 e

hidrólise do Experimento III Figura 32). Estes fatos realçam a importância na

interação das exo-hidrolases (α-galactosidase e β-manosidase) com as endo-

hidrolases (endo-β-mananase) que ocorrem nos processos biológicos como a

degradação da reserva de sementes ou degradação da parede celular por

fungos.

Alguns autores propõem que durante a degradação do galactomanano

existe uma ordem na atuação das enzimas (Reid & Edwards, 1995; Lisboa et

al., 2006). Por outro lado, compreende-se que ambas as enzimas estejam

presentes concomitantemente durante a maior parte do processo de

degradação. Sendo assim, a α-galactosidase é capaz de alterar a afinidade da

endo-β-mananase ao substrato (galactomanano) ao retirar algumas

ramificações de galactose, dessa forma, modulando o processo de

degradação. Deste modo, a ordem de ação das enzimas se torna mais

importante quanto maior for o grau de ramificação do galactomanano.

A proporção dos oligossacarídeos F1 obtidos na digestão do

galactomanano em baixa concentração de endo-β-mananase (0,005U) é muito

diferente da proporção destes mesmos oligossacarídeos no polímero

(comparar picos A, C e E na figura 33 I e III) (Experimento IV).

A mistura dos oligossacarídeos F1 na digestão com a menor

concentração da enzima (0,005U) é rica em tetrassacarídeos (pico C) (Figura

33 I), muito embora não sendo os tetrassacarídeos os oligossacarídeos

179

presentes em maior quantidade na composição do polissacarídeo, pois na

maior concentração de enzima os oligossacarídeos preponderantemente

produzidos são a manobiose (A) e hexassacarídeos (E) (Figura 33 III) (ver

tabela 6 para visualizar as estruturas de oligossacarídeos para cada pico).

Essa diferença na proporção sugere, novamente, que o ataque da

enzima endo-β-mananase de Aspergillus niger ao polissacarídeo não é ao

acaso e as regiões menos ramificadas são preferencialmente digeridas.

McCleary et al. (1985) afirmam que as α-galactosidases não apresentam

diferenças no seu modo de ação dependente da estrutura do galactomanano,

ou seja, a quantidade de ramificação com galactose não interfere na sua ação,

sendo o seu modo de ação não randômico, apresentando uma tendência em

remover as ramificações com galactose sequencialmente de um dos lados da

cadeia de manano.

As α-galactosidases utilizadas nos experimentos, semipurificada e

comercial, muito embora apresentem características (pH ótimo, temperatura

ótima e aspectos cinéticos) diferentes, atuaram sobre o polissacarídeo ou

oligossacarídeos da mesma forma, apresentando, portanto, o mesmo modo de

ação, visto pela similaridade dos perfis de oligossacarídeos gerados

independente do experimento proposto (Experimento II, III e IV).

Sugere-se que esta similaridade esteja relacionada à importância da

mobilização de reservas no sucesso da plântula, portanto, todo o processo

seria muito conservado.

Feurtado et al. (2001) demonstraram que a sequência de aminoácidos

das α-galactosidases de plantas são bastante conservadas. Sendo assim, é

também provável que todo o processo fisiológico da mobilização de reservas

seja conservado, inclusive com uma modulação da degradação realizada pela

estrutura do polissacarídeo (distribuição das ramificações de galactoses).



Os estudos de determinação da estrutura fina, normalmente, são

realizados comparativamente, ou seja, identificando o padrão de ação da

180

enzima sobre polissacarídeos de razão manose:galactose diversa (Emi et al.,

1972; McCleary et al., 1976; McCleary, 1983; McCleary et al., 1985).

Sendo assim, adotou-se a mesma estratégia para determinação da

estrutura fina do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers., a fim de

compreender a ação regulatória das substituições por galactose na degradação

do polissacarídeo durante a mobilização de reserva (Tiné et al., 2003).

A análise dos oligossacarídeos provenientes da hidrólise dos

(galacto)mananos com razão manose:galactose variadas (de 150:1 a 1:1 –

Tabela 4) demonstra, como em McCleary (1983), que a quantidade e a

distribuição das ramificações com D-galactose influenciam na hidrólise do

polissacarídeo com endo-β-mananase, pois tanto a revelação do perfil dos

oligossacarídeos por TLC quanto por HPAEC-PAD, revelam a presença de

bandas únicas a determinadas razões de manose:galactose, ausência de

grupos de oligossacarídeos (F2 e F3), quando a substituição por galactose é

baixa; e proporção diversa (altura dos picos) de oligossacarídeos iguais

(identificados pela mesma letra) (Figura 35 e 36).

A ausência de oligossacarídeos F2 e F3 (Figura 35 e 36) após hidrólise

com endo-β-mananase do manano puro (150:1) de Euterpe edulis evidencia

que a baixíssima substituição por galactose não permite o equilíbrio da reação,

havendo, portanto, somente a produção de oligossacarídeos F1.

O aumento gradual da presença destes oligossacarídeos, F2 e F3, com

o aumento das substituições por D-galactose, mostra que o pequeno aumento

das ramificações por D-galactose é suficiente para levar a reação a atingir o

equilíbrio, impedindo a hidrólise mesmo de sítios disponíveis para a ação de

endo-β-mananase, assim, produzindo F1, F2 e F3.

A regulação da hidrólise, com o impedimento da hidrólise completa do

galactomanano durante a degradação de reserva (in vivo), é de extrema

importância para evitar que toda a energia contida na reserva e utilizada no

crescimento e estabelecimento da plântula seja rapidamente liberada com a

produção de monossacarídeos, os quais ficariam disponíveis para

fitopatógenos, como os fungos (Tiné et al., 2003), os quais competiriam com a

própria planta para o uso da energia armazenada no polissacarídeo de reserva.

Portanto, ambos os resultados apresentados corroboram a hipótese

formulada acima, que a presença dos oligossacarídeos F2 e F3 nas hidrólises

181

de galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. também esteja relacionada

ao equilíbrio de reação da hidrólise, causada pelas substituições por galactose,

como demonstrado por Tiné et al. (2003).

É possível visualizar, principalmente no perfil de oligossacarídeos

revelados por HPAEC-PAD, que os galactomananos de maior substituição por

D-galactose (Figura 36 E e F) apresentam proporções de F1 (picos de a-h e j-

m) e de F2 e F3 (pico i), quando comparados com os galactomananos de razão

2:1 (Figura 36 C e D), relativamente menores, demonstrando que a enzima,

pela alta quantidade e distribuição das ramificações, não tem acesso à cadeia

principal, resultando na baixa taxa de hidrólise do polissacarídeo, como

demonstrado por Reese & Shibata (1965); Courtois & Le Dizet (1968);

Tsujisaka et al. (1972); Emi et al. (1972).

A presença de galactose, levando ao equilíbrio de reação,

aparentemente, esconde os sítios disponíveis para a ação da enzima endo-β-

mananase. Sendo assim, evidencia a importância da interação da α-

galactosidase (exo-hidrolase) com a endo-β-mananase no processo de

degradação da mobilização de reserva. Embora a exo-hidrolase não participe

diretamente na atuação da endo-β-mananase, parece haver, por parte da α-

galactosidase, uma modulação na taxa de reação, alterando a afinidade da

endo-β-mananase pelo galactomanano.

VI. Conclusão

Cpm base no conjunto de resultados apresentados, sugere-se que a

estrutura fina do galactomanano, principalmente as ramificações com

galactose, modula a ação da endo-β-mananase (de fungos ou de plantas), não

permitindo a hidrólise completa do galactomanano na ausência da α-

galactosidase.

Embora este trabalho tenha sido realizado com galactomanano, Fanuti,

Gidley & Reid (1991) e Tiné et al. (2003) encontraram efeitos similares da

ramificação de galactose no polímero de xiloglucano sobre a ação da celulase

e a xiloglucano transglicosilase hidrolase.

182

Os resultados apresentados possuem implicações para as funções

biológicas do galactomanano. Sabidamente os galactomananos exercem

funções variadas na semente, além da função de reserva de sementes

(Buckeridge et al., 2000a). Reid & Bewley, 1979; Buckeridge et al., 2000c

demonstraram que o galactomanano pela sua alta solubilidade, dada pelo alto

conteúdo de galactoses, exerce o controle da embebição, absorvendo grandes

quantidades de água, distribuindo-a ao redor do embrião e protegendo este

contra estresse hídrico (Reid & Bewley, 1979; Halmer & Bewley, 1979).

Dessa forma, o polissacarídeo altamente ramificado resulta em grande

solubilidade da molécula (Reid & Bewley, 1979; Buckeridge et al., 2000c),

assim, o polímero com apreciáveis quantidades de ramificações será

prontamente solúvel, mas de acordo com os resultados apresentados também

será hidrolisado mais lentamente.

Além da característica de tampão de água, os galactomananos, mas

principalmente os mananos, possuem a função de proteção e dureza das

sementes, protegendo-as contra patógenos e digestão dos animais

(Buckeridge et al. 2000c).

Assim, a outra implicação leva em consideração o ataque de fungos ao

galactomanano presente em sementes. A existência de ramificações com

galactose que modulam a degradação do polímero pela endo-β-mananase,

como a abrangida nesta Dissertação, pode ter sido selecionada como uma

forma de controle da degradação pela própria plântula, mas também uma

forma de impedir ou dificultar a degradação por microorganismos, denotando

um importante aspecto de coevolução das leguminosas, que possuem reserva

de galactomanano, e os fungos capazes de degradá-lo.

183

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185

DISCUSSÃO GERAL

Os galactomananos são polissacarídeos compostos de uma cadeia

linear de resíduos de D-manose unidas por ligações glicosídicas β-(1,4), a qual

resíduos de D-galactose estão unidos por ligações α-(1,6), formando

ramificações simples (Buckeridge et al., 2000a).

O polissacarídeo galactomanano conjuntamente aos polissacarídeos

xiloglucano e (arabino)galactanos são os polímeros encontrados como

componentes de reserva de parede celular em sementes (Buckeridge et al.,

2000c).

Os galactomananos são hidrolisados por três enzimas: α-galactosidase

(EC 3.2.1.22), endo-β-mananase ou β-1,4-manano-endo-hidrolase (EC

3.2.1.78) e exo-β-manosidase ou β-manosidase (EC 3.2.1.25) produzindo

galactose e manose livres ao mesmo tempo em que a glucose é produzida no

endosperma. Aparentemente essa última é disponibilizada ao embrião e servirá

como fonte de carbono e energia para o estabelecimento das plântulas

(Buckeridge et al., 2000a; Lisboa et al., 2006).

As alfa-galactosidases (E.C. 3.2.1.22) catalisam a hidrólise de ligações

α-(1,6) de galacto-oligossacarídeos e de polímeros de galacto-(gluco)-

mananos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas em animais, plantas e



por Petek & Dong (1961) em sementes de Coffea sp. e Plantago ovata. Tonini





Feurtado et al. (2001) sugeriram pelo menos três isoformas da α-

galactosidase durante e após a germinação de sementes de tomate e, através

da obtenção e sequenciamento do cDNA da enzima, demonstraram alta

homologia da forma ativa da α-galactosidase do tomate (40 kDa) com outras

galactosidases, especialmente com as de sementes de Coffea arabica (café)

(Zhu & Goldstein, 1994). Como apenas um gene para a α-galactosidase foi

186

identificado em sementes de tomate, as isoformas aparentemente se formam a

partir de modificações pós-traducionais (Feurtado et al., 2001).

McCleary & Matheson (1974) também detectaram múltiplas isoformas da

α-galactosidase, nas sementes de Cyamopsis tetragonoloba, embora apenas

uma delas (40 kDa) esteja associada com o endosperma (Overbeeke et al.

1989).



mobilização, como por exemplo, a diminuição de substituições por galactose

demandaria uma α-galactosidase com maior afinidade ao substrato; como


exemplo, a degradação de açúcares da série rafinósica (Bewley,1997) e até o

amadurecimento de frutos (remodelamento da parede celular) (Gao & Schaffer,

1999; Soh et al., 2006).

Tonini et al. (2010) demonstraram por Western Blot utilizando anticorpo

anti α-galactosidase e extrato bruto enzimático de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

a presença de 8 bandas variando de 78 kDa a 12 kDa reativas ao anticorpo,

evidenciando a presença de isoformas da α-galactosidase com diferentes

tamanhos, que poderiam interagir entre si formando a estrutura quartenária.

Os autores sugerem que a interação entre as α-galactosidases seria

visando uma ação proteolítica da própria α-galactosidase para ativá-la, pois

argumentam que esta não seria transcrita de novo após a maturação da

semente, ou seja, toda a enzima necessária à degradação já estaria pronta,

mas não ativa; e para adaptar a enzima as mudanças no substrato durante o

processo de degradação da reserva.

A α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers.

apresentou 6 isoformas (Capítulo I – Figura 26 e figuras 38 – 42, 45, Anexo),

sendo uma delas preponderante. No entanto, durante o início do processo de

purificação ainda separou-se mais duas isoformas (Figuras 13 e 14). Sugere-se

que as duas isoformas retiradas no início da purificação estejam relacionadas a

degradação de outros substratos, como demonstrado por Bewley (1997); Gao

& Schaffer (1999) Soh et al. (2006), na degradação de oligossacarídeos da

série rafinósica e remodelamento da parede celular, respectivamente.

187

Já as demais isoformas encontradas, sugere-se que estejam

relacionadas a ação proteolítica da própria α-galactosidase em sua ativação e

remodelamento visando o aumento da afinidade ao substrato, como

demonstrado por Tonini, et al. (2010).

A regulação da degradação de reserva de sementes já foi demonstrada

pela ação de fitohormônios. O ácido abscísio (ABA) é um potente inibidor da

degradação da reserva de galactomanano e está envolvido no mecanismo de

regulação dessa mobilização em sementes de Ceratonia siliqua (Seller, 1977),

Lactuca sativa (Halmer & Bewley, 1979), Lycopersicon sculentum (Groot &

Karssen, 1992), Trigonella foenum-graecum (Reid & Meier, 1973; Malek &

Bewley, 1991; Kontos & Spyropoulos, 1995) e Sesbania virgata (Cav.) Pers.

(Potomati & Buckeridge, 2002; Tonini et al., 2006).

Tonini (2008) demonstrou que a mobilização de reserva de

galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. é modulada

negativamente pela presença do ABA, enquanto o etileno é promotor da

mobilização.

Além da regulação esperada por fitohormônios, Tiné et al. (2003)

sugeriram que a estrutura do xiloglucano de reserva de sementes conteria, pelo

menos, parte da informação requerida para o seu próprio metabolismo, ou seja,

o próprio polissacarídeo, através da distribuição de suas ramificações com

galactose, modularia a ação da endohidrolase, neste caso a endo-β-mananase.

Estes fatos realçam a importância na interação das exo-hidrolases (α-

galactosidase e β-manosidase) com as endo-hidrolases (endo-β-mananase)

que ocorrem nos processos biológicos como a degradação da reserva de

sementes ou degradação da parede celular por fungos (Tiné et al., 2003).

Durante a degradação do galactomanano existe uma ordem na atuação

das enzimas (Reid & Edwards, 1995 e Lisboa et al., 2006), mas compreende-

se que elas estejam presentes concomitantemente em grande parte do

processo de degradação, sendo assim, a α-galactosidase é capaz de alterar a

afinidade da endo-β-mananase ao substrato (galactomanano) ao retirar

algumas ramificações de galactose, dessa forma, modulando o processo de

degradação.

McCleary & Matheson (1983), demonstraram que quanto menor for a

razão manose:galactose de um polissacarídeo, ou seja, quanto mais ramificado

188

for um polissacarídeo, menor será a porcentagem de hidrólise de dado

polissacarídeo pela endo-β-mananase.

A partir da análise dos resultados sugere-se que as ramificações por

galactose no polissacarídeo galactomanano pode modular o reconhecimento

dos sítios de clivagem pela enzima endo-β-mananase.

Sugere-se esta modulação uma vez que: existe a produção de

oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 (Figura 28) após hidrólise do

galactomanano com endo-β-mananase, como demonstrado para xiloglucanos

(Tiné et al., 2003); os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas

quando da hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase em diferentes

concentrações (Figuras 29 e 33), evidenciando preferência por sítios com

menor grau de galactosilação; a presença da α-galactosidase diminui a

produção dos oligossacarídeos limites de digestão F2 e F3, mostrando que a

estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o

equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis

(Figura 32); e que polissacarídeos com estruturas diferentes, razão

manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes

taxas de hidrólise pela mesma enzima (Figuras 35 e 36), evidenciando que a

ramificação com galactose dificulta a ação da endo-β-mananase.

Através dos resultados obtidos nesta dissertação, sugere-se que a

estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos,

parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua


com resíduos de D-galactose (Capítulo 2).

A modulação da degradação feita pelo próprio polissacarídeo não só

permite a regulação do processo de liberação dos açúcares, fonte de energia

para o embrião em desenvolvimento, garantindo máximo aproveitamento pelo

embrião, mas, principalmente, dificulta a ação dos microorganismos pelo

aumento da complexidade, evidenciando um aspecto importante da co-

evolução das leguminosas e fungos capazes de atacar os polissacarídeos de

reserva de sementes.

Sugere-se que as diferentes isoformas da α-galactosidase relacionadas

à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata

(Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de

189

melhorar a afinidade da α-galactosidase ao substrato durante o processo de

mobilização de reserva. Para a ação proteolítica da α-galactosidase

possivelmente haveria a interação de duas enzimas, formando uma estrutura

quartenária, onde uma ou ambas as enzimas teriam uma parte da cadeia de

aminoácidos eliminada e, portanto, apresentariam uma diminuição do tamanho.

O aumento da afinidade da α-galactosidase ao substrato durante todo o

processo de mobilização garante a liberação das ramificações com galactose

de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima

endo-β-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do

polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio,

pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das

enzimas endo-β-mananase e α-galactosidase, respectivamente (Tiné et al.,

2003; Lisboa et al., 2006), e dificultando a ação de microorganismos,

propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu

desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da

plântula.

190

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ANEXO

Figura 38: Comparação dos fragmentos gerados por espectrometria de massas (MALDI-TOF) da BANDA 1 (gel de poliacrilamida 12% após purificação em coluna

de Gel Filtração Superose 6 utilizando FPLC) com banco de dados do NCBi. As proteínas estão organizadas quanto ao Score, ou seja, quanto maior o Score maior a

probabilidade dos fragmentos gerados serem pertencentes àquela proteína ou similares. As proteínas realssadas pelo retângulo preto fazem referência a α-

galactosidases.

199



probabilidade dos fragmentos gerados serem pertencentes àquela proteína ou similares. As proteínas realssadas pelo retângulo preto fazem referência a α-

galactosidases.

200



probabilidade dos fragmentos gerados serem pertencentes àquela proteína ou similares. A proteína realssada pelo retângulo preto faz referência a α-galactosidase.

201




202




203




204




205




Figura 46: Análise de 35 sequências de aminoácidos de α-galactosidase de plantas. Grupos identificados por

letras estão de acordo com a filogenia: (A – azul escuro) Fabaceae; (B - verde) Rubiceae; (C - amarelo)

Solanaceae; (D - vermelho) Fabaceae; (E – azul claro) Pinaceae; (F – roxo) Poaceae. (•) Bootstrap ˃ 95, ou seja,

em 95% ou mais das 1000 árvores de relação geradas os ramos marcados com (•) ficaram agrupados como

mostrado nesta árvore de relação.

208


oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática com α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®) dos oligossacarídeos produto da hidrólise do galactomanano a 1% de Sesbania virgata (Cav.) Pers

com endo-β-mananase (Megazyme®) a 0,005U, 0,05U e 1U (Experimento I). (I) Controle (galactomanano a 1%

sem enzima); (II) Controle (galactomanano a 1% com α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®); (III) Controle (galactomanano a 1% com celulase de Trichoderma longibrachiatum (Megazyme

®));

(IV) perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise com endo-β-

mananase a 0,005U; (V) perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre prévia hidrólise

com endo-β-mananase a 0,05U; (VI) perfil de oligossacarídeos formados após ação da α-galactosidase sobre

prévia hidrólise com endo-β-mananase a 1U; (VII) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados no

Experimento I e Experimento II na concentração de 0,005U de endo-β-mananase; (VIII) comparação dos perfis

de oligossacarídeos formados no Experimento I e Experimento II na concentração de 0,05U de endo-β-mananase;

(IX) comparação dos perfis de oligossacarídeos formados no Experimento I e Experimento II na concentração de

1U de endo-β-mananase. (A) Manobiose (M2); (B) Manotriose (M3) e/ou trissacarídeo G1M2; (C) tetrassacarídeos

(manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D) pentassacarídeos (manopentose – M5 e/ou G

1M3 e/ou G

3M4); (E)


M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F) heptassacarídeos (manoheptose – M7

e/ou G3,4

M5); (G-I) oligossacarídeos >8 resíduos (possíveis oloigossacarídeos presentes: G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6;

G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7); (K-L) octassacarídeos e nonassacarídeos sem ramificação; (M)

oligossacarídeos >10 resíduos de manose (possivelmente resultado da desramificação do pico I). Os

oligossacarídeos identificados A-M são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes são

identificados como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos trios.

209


oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-

210

mananase (Megazyme®) a 1U com acréscimo ou não da α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®). (I) perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do galactomanano a 1% somente com endo-β-

mananase a 1U; (II) perfil de oligossacarídeos formados na hidrólise do galactomanano a 1% com endo-β-

mananase a 1U/mL e α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (III) perfil

de oligossacarídeos formados na hidrólise do galactomanano a 1% somente com α-galactosidase comercial de

Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (IV) Controle (galactomanano sem enzima). (Gal) Galactose;

(A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3) e/ou G1M2; (C) tetrassacarídeos (manotetraose – M4 e/ou G

1M3); (D)



1,3M4

e/ou G4M5 e/ou G


3,4M5); (G-I) oligossacarídeos >8 resíduos

(G1,3,4

M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou G4,5

M7). Os oligossacarídeos identificados A-I são

denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes são identificados como F2, quanto combinação

aos pares, e F3, quando combinação aos trios


oligossacarídeos, produto da hidrólise enzimática do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers com endo-β-

mananase (Megazyme®) a 0,005U e 1U e α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme

®) a

0,5U/mL. (I) Galactomanano a 1%, 0,005U de endo-β-mananase e α-galactosidase comercial de Cyamopsis

tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (II) Galactomanano a 0,1%, 0,005U de endo-β-mananase e α-

galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (III) Galactomanano a 1%, 1U de

211

endo-β-mananase e α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®) a 0,5U/mL; (IV

Galactomanano a 0,1%, 1U de endo-β-mananase e α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba

(Megazyme®) a 0,5U/mL. (A) manobiose (M2); (B) manotriose (M3) e/ou trissacarídeo G

1M2; (C) tetrassacarídeos

(manotetraose – M4 e/ou G1M3); (D) pentassacarídeos (manopentose – M5 e/ou G

1M3 e/ou G

3M4); (E)


M4 e/ou G4M5 e/ou G

3M5); (F) heptassacarídeos (manoheptose – M7

e/ou G3,4


M5; G4,5

M6, G3,4

M6; G3,4,5

M6; G1,4,5

M6; G1,3,4

M6 e/ou

G4,5

M7). Os oligossacarídeos identificados A-I são denominados oligossacarídeos F1; os oligossacarídeos restantes

são identificados como F2, quanto combinação aos pares, e F3, quando combinação aos trios.

MODULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE ......2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Thalita Beatriz...

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