Inibição enzimática

Enzimas

Profª Drª Ângela de Mattos Dutra

Importância Biomédica

Toxicologia e Farmacologia

Venenos metabólicos

Inibir ou abolir reações metabólicas essenciaisInibir a atividade de enzimas

Drogas terapeuticamente importantes

Utilizadas no tratamento de inúmeras patologias

Descoberta do mecanismo de ação de enzimas

Enzimas• Inibição enzimática

• Regulação enzimática

• Ampliação enzimática

• Uso de enzimas em diagnóstico– Isoenzimas

Inibição Enzimática

Quanto ao tipo:

competitivanão-competitivaincompetitiva

inibidor a atividade de uma única enzima ou de um grupo restrito de enzimas

irreversível reversível

inibidor a atividade de todas as enzimas ex: agentes desnaturantes

inespecífica -

específica -

Inibição Enzimática–Inibição Enzimática Irreversível

• inibidor se combina com um grupo funcional (sítio ativo) da enzima

• inibidor se liga à enzima formando um complexo ESTÁVEL

• forma-se uma ligação COVALENTE entre o inibidor e a enzima

Inibição Enzimática IrreversívelEx: Inibição da enzima ciclo-oxigenase pelo acetilsalicilato

Ciclo-oxigenase

Prostaglandinas

Processos fisiológicos, ex. sensação de dor

Ácido araquidônico

Man

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http://www.msd-brazil.com/msdbrazil/corporate/about/press/vioxx/vioxx1.html

http://www.msd-brazil.com/msdbrazil/corporate/about/press/vioxx/vioxx1.html

Inibição Enzimática IrreversívelUteís para o estudo do mecanismo de reação através da determinação do aminoácido que se liga covalentemente

ao inibidor quando a enzima é inibida

Enz - CH2-OHSerina

+ DIFP

diisopropilfluorfosfato

H+ F

Ex. DIFP inibe aceticolinesterase hidrolisa aceticolina

NeurotransmissorContração e peristaltismo intestinal

Bradicardia

Inibição Enzimática Irreversível

Inibição Enzimática Irreversível Inibidores Suicidas

Inibidores com Base no Mecanismoou

Compostos, em geral, pouco reativos até se ligarem à enzima

Convertido em um compostomuito reativo que se combina

IRREVERSIVELMENTE com a enzima

Forma um produto que é um potente inibidor do próximo passo da via

metabólica

ou

Aconitase

Exemplo de Inibidor Suicida

Reações do Ciclo de Krebs

Oxalacetato + Acetil-CoA Citrato Isocitrato

Oxalacetato + Fluoroacetato Fluorocitrato

Inibidor suicida

Citrato Sintase

Inibição Enzimática

– Inibição Enzimática Reversível• inibidor forma com a enzima um

complexo INSTÁVEL• inibição NÃO envolve modificação

COVALENTE• Tipos de inibidores reversíveis

• competitivos• não competitivos• incompetitivos

Inibição CompetitivaInibidor competitivo

Estrutura semelhante à do substrato Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima

E + S ES E + P

EI

+I

Inibição Competitiva

EnzimaSítio Ativo

IC

S

S

ICIC

IC

IC

S

P

P

SS

S

S

S S

S

P

P

P

P


[substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente

afinidade da enzima pelo substrato

Na presença do inibidor competitivo

Km aparente da enzima

Inibição Enzimática Competitiva

• Inibidor tem semelhança estrutural com o substrato

• O inibidor se liga no sítio ativo da enzima• Aumento da [substrato] diminui a inibição • Km aparente da enzima AUMENTA • Em uma concentração suficientemente alta de

substrato a VELOCIDADE da reação atinge a Vmáx

observada na ausência do inibidor


Análise Gráfica


FAD FADH2

CH2 – COOH CH - COOH

CH2 – COOH CH - COOHÁcido Succínico Ácido Fumárico

COOHCH2

COOHÁcido Malônico (inibidor)

Succinato

-

-

Fumarato

Malonato

-

-

-

-

Succinato Desidrogenase

inibidor competitivo

Exemplo: inibidor do metabolismo energético

Inibição CompetitivaIntoxicação por Metanol

MetanolÁlcool

desidrogenaseCausa lesão

tecidual

cegueriaInfusão EV

Etanol

URINA Formaldeído


Terapias com drogas

Conceitos de inibição enzimática

Drogas projetadas para inibirem uma enzima específicaANTIMETABÓLITOS

Antivirais, antibacterianos, antitumorais


Exemploantibacteriano

PABA Ácido fólico Diidropteroato

sintetasebacteriana Essencial para o

crescimento bacteriano

Sulfanilamida

Inibição CompetitivaExemplo: Quimioterápico - Leucemia


Síntese de purinas pirimídinasDiidrofolato redutase

Diidrofolato

Metotrexano

Multiplicação das células leucêmicas

Produzem vasoconstrição, elevando a pressão arterial e

promovem a síntese de aldosterona (hormônio esteróide) que promove a retenção de sódio

Inibidores da ECA(Enzima Conversora de Angiotensina)

CaptropilEnalapril

Exemplo:Tratamento de hipertensão


Inibição CompetitivaExemplo:Tratamento de hipercolesterolemia

Lovastatina

Droga que inibe competitivamente a HMG-

CoA redutase(hidroximetil glutaril-CoA redutase)

Inibição CompetitivaExemplo:Tratamento de hipercolesterolemia

Inibição Não-Competitiva

E + S ES E + P

EI + S

+I

+I

EIS

• Inibido não-competitivoNÃO se liga ao sítio ativo da enzima

Inibição Enzimática Não-Competitiva

• Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato

• NÃO se liga no sítio ativo da enzima• Aumento da [substrato] não diminui a

inibição • Km aparente da enzima NÃO se altera• A VELOCIDADE máxima DIMINUI na

presença do inibidor


Diminui a concentração de enzima ativa

Velocidade Máxima da Reação

Exemplos: Metais pesados - Pb+2


Análise Gráfica

Mecanismos de Regulação da Atividade Enzimática

Mecanismos de Regulação da Atividade Enzimática

• Compartimentalização intracelular• Disponibilidade de substrato• Enzimas alostéricas• Clivagem proteolítica de pró-enzimas• Controle à nivel gênico

– indução– repressão

• Modificação covalente - Fosforilação

R

Regulação da Atividade EnzimáticaEnzimas Alostéricas

• Reguladas por

efetores ou moduladores alostéricos

fora do sítio ativo (sítio alostérico)

modo não covalente

positivos negativos

Regulação da Atividade EnzimáticaEnzimas Alostéricas

R

Efetor positivo

Efetor negativo

Sítio catalítico

Em muitas enzimas alostéricas existe

um protômero regulatório distinto do protômero que

contém o sitio catalí

EX: Proteína Quinase AQuando a subunidade regulatória (R) da proteína quinase A (PKA)

liga o efetor alostérico, AMPc, permitindo a atividade das

subunidades catalíticas

Regulação da Atividade EnzimáticaClivagem Proteolítica

Enzima Ativa

Pró-EnzimasZimogênios

Clivagem Proteolítica

Enzimas digestivas - Proteases

Pepsinogênio PepsinaTripsinogênio Tripsina

Quimiotripsinogênio Quimiotripsina

Regulação da Atividade EnzimáticaClivagem Proteolítica

Regulação da Atividade EnzimáticaControle à Nível Gênico

Mensagem genética

RNAm

PROTEÍNA(ENZIMA)

Algumas enzimas não são sintetizadas continuamente pelas células

ENZIMAS

•Constitutivas

•Induzidas ou Adaptativas

Enzimas Constitutivas

• Organismos possuem independente da constituição do meio

• Organismos sintetizam quando em presença do substrato

Enzimas Induzidas ou Adaptativas

Indução enzimática

Exemplo: galactosidase (Lactase)


Sua produção é induzida pela presença de uma substância adequada

INDUTOR

Induzir a transcrição dos genes da proteína (enzima)


INDUTORpresente

Síntese da proteína

INDUTORausente

NÃO ocorre a síntese da

proteína

Exemplo: lac operon (E. coli)

• Operon - Unidade regulatória completa•Gene regulador•Sítios de controle•Genes estruturais

lac operon (E. coli)

RNA polimerase

Genes estruturais NÃO serão transcritos

Proteína NÃO será sintetizada

Gene regulador

lac operon (E. coli)lac operon (E. coli)

RNA polimerase

(Lactose)

Repressorinativo

-galactosidase Permease Transacetilase

RNAm

Lac operon

Exemplos de Enzimas Induzidas no Fígado no no ESTADO ABSORTIVOESTADO ABSORTIVO

1. Glicoquinase2. Glicose 6-fosfato desidrogenase3. 6-fosfogluconato desidrogenase4. PFK15. Piruvato quinase6. Enzima málica7. Citrato liase8. Acetil-CoA carbolixase9. Ácido graxo sintase10. 9 dessaturase (estearoil CoA dessaturase)

Exemplos de Enzimas Induzidas no Fígado no no ESTADO DE JEJUMESTADO DE JEJUM

1. Glicose 6-fosfatase2. Frutose1,6difosfatase3. Fosfoenolpiruvato carboxiquinase4. Aminotransferases

Regulação da Atividade EnzimáticaModificação Covalente

Fosforilação de enzimas Mediada por intervenção hormonal

Regula inúmeros processos metabólicos

Proteínas quinases e fosfatases(ENZIMAS)

Regulação da Atividade EnzimáticaModificação Covalente

Fosforilação

Enzima-OH Enzima-OPO3-

ATP ADP

H2OHPO4-

Quinase

Fosfatase

EX:

A fosforilação de uma enzima pode aumentar ou diminuir a sua atividade

Síntese e Degradação do GlicogênioVias reguladas por fosforilação de enzimas específicas

AdrenalinaGlucagon

Adenilato CiclaseInativa

Adenilato CiclaseAtiva

ATP AMPc

PKA inativaProteína quinase

dependente de AMPc

PKA ativa

Fosforilase quinase inativa

Fosforilase quinase ativa

P

Glicogênio Fosforilase

ativa

P

Glicogênio Fosforilase

inativa

Degradação do glicogênio

Mecanismo de Amplificação Enzimática

Enzimas e a Clínica Médica

Além do papel central das enzimas na bioquímica, a atividade das enzimas no

sangue fornece informações importantes para o diagnóstico de doenças.

O perfil da atividade de enzimas no soro está relacionado à processos patológicos.

Enzimas e a Clínica MédicaAs enzimas podem ser classificadas em dois grupos

Plasma-específicas

secretadas ativamente no plasma por certos órgãos, tendo papel funcional no plasma

Não-plasma específicas

produzidas pelas células durante o metabolismo celular normal. São enzimas intracelulares, sem função fisiológica no plasma.

Liberação de enzimas a partir de células normais e de células doentes

ou expostas a um trauma

Enzimas não-plasma específicas

Atividade de enzimas intracelulares no plasma

Estado patológico

Extravazamento por lesão tecidual

Extravazamento por alteração de permeabilidade da membrana

A determinação das atividades de muitas enzimas no plasma é utilizada para fins diagnósticos em várias doenças.

O grau de elevação da atividade enzimática no plasma pode auxiliar na avaliação do prognóstico do paciente.

Enzimas não-plasma específicas

Em termos de diagnóstico deve-se considerar que:• a proporção das enzimas varia de tecido para tecido • tempo de aparecimento destas no plasma é diferente

Diagnóstico específicoValor diagnóstico

limitado

Concentração no plasma

Distribuição tecidual ampla

Distribuição tecidual restrita a um ou a

poucos tecidos

Cinética de liberação de enzimas cardíacas no soro após um IAM

CPK – creatina quinaseLDH – Lactato desidrogenaseHBDH - -hidroxibutírico desidrogenase

Diagnóstico EspecíficoIsoenzimas ou isozimas

Enzimas intracelulares que catalisam a mesma reação em diferentes tipos celulares

Enzimas formadas por várias cadeias polipeptídicas (subunidades) permitindo diferentes associações

Proteínas geneticamente diferentes Propriedades diferentes:

Km imunológicas

Aplicação na clínica médica

IsoenzimasLactato desidrogenase - LDH

Lactato Piruvato

NADox NADred

Tetrâmero: subunidades M e H 5 isoenzimas

Composição Tipo Localização

MMMM M4 LDH5 Fígado e Músculo Esquelético

MMMH M3H LDH4 Fígado e Músculo Esquelético

MMHH M2H2 LDH3 Cérebro e Rim

MHHH MH3 LDH2 Miocárdio e Hemáceas

HHHH H4 LDH1 Miocárdio e Hemáceas

Padrão normal e alterado das isoenzimas LDH no soro humano

A: paciente com infarto do miocárdioB: paciente normalC: paciente com doença hepática

Isoenzimas LDH do soro humano foram separadas em acetato de celulose, em pH 8,6 e coradas para enzima.

IsoenzimasCreatina quinase

Creatina Fosfocreatina

ATP ADP

Dímero: subunidades B e M 3 isoenzimas

Composição Tipo Localização

BB CK1/CPK1 Cérebro

MB CK2/CPK2 Coração

MM CK3/CPK3 Músculo esquelético

Aparecimento de CPK2 no sangue infarto do miocárdio

TGO - Transaminase glutâmico oxalacética

TGP - Transaminase glutâmico pirúvica

Presentes nas células do fígado, coração, músculo esquelético, rim e pâncreas.

Outras enzimas importantes em diagnóstico

Transaminases

DOENÇA HEPÁTICA

INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO TGO eleva-se após 12 horas, atingindo seu pico após 24-36 horas.

Outras enzimas importantes em diagnóstico Fosfatases

Fosfatase Alcalina Presente em muitos tecidos, principalmente no fígado e nos ossos. O aumento fisiológico é observado na GRAVIDEZ

e na INFÂNCIA.

DISTÚRBIOS ÓSSEOSDOENÇA HEPÁTICA OBSTRUTIVA

Outras enzimas importantes em diagnóstico Transferases

GAMA GLUTAMIL TRANSPEPTIDASE Presente no fígado.

INDICADOR DE DOENÇA HEPÁTICAALCOOLISMO

Outras enzimas importantes em diagnóstico Amilase

Produzida pelo pâncreas e pelas glândulas salivares.

PANCREATITE CAXUMBA

Inibição enzimática

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