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Aula de enzimologia
Tema Cinética enzimática: Inibição
enzimática
Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo – [email protected]
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Cinética enzimática
Sumário:
• Inibição reversívelModelos de inibição
• Modificação química
• Inibição irreversível
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INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.
INIBIDORES
REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS
Competitivos Não Competitivos Incompetitivos
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INIBIÇÃO COMPETITIVA:
substrato e inibidor competem para o mesmo sítioKm kcat
K4[E] [I] = K5[EI
[K5] = [E] [I][K4] [EI]
1) V = K3 [ES]2) [ET] = [E] +[ES] +[EI]
V = K3 [ES][ET] [E] +[ES] +[EI]
[E][S]V = Vmax Km [E] + [E][S] + [E][I] Km Ki
V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki
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INIBIÇÃO COMPETITIVA
1- sem inibidor
2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
Km (1 +[I]) + [S]1= _____Ki_______V Vmax [S]
V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki
Km (1 +[I]) 1 = _____Ki__ 1 + 1V Vmax [S] Vm
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INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:
substrato e inibidor ligam-se em sítios diferentes
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INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:
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1- sem inibidor
2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]
INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA
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INIBIÇÃO MISTA
α
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Diagrama Lineweaver-Burk para inibição mista
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EQUAÇÃO GERAL DE INIBIÇÃO
α
Km
αKm
K3
βK3
α = ∞ e β = 0 - Inibição competitiva pura
1 < α <∞ e β = 1 - Inibição competitiva parcial
α = 1 e β = 0 - Inibição não competitiva pura
α = 1 e 0< β <1 - Inibição não competitiva parcial
1 < α <∞ e β = 0 - Inibição tipo misto
1 < α <∞ e 0< β <1 – Inibição do tipo misto com β# 0
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1__ [i]
1_____inclin.
1_____inclin.
1_____interc.
1_____interc.
βVmKs(α- β)
βVm1-β
-βαKi
Para inibições com diagnóstico hiperbólico
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INIBIÇÃO PELO PRODUTO
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INIBIÇÃO PELO SUBSTRATO
Se K4 = 0
Se 0 < K4 < K2
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Exemplo 1: Síntese de Dopamina
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Exemplo 2:Fosfofrutoquinase
Frutose 6P Frutose 1,6 BiP
ATP ADP
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MODIFICAÇÃO QUÍMICA
Moléculas específicas podem interagir com a enzima inibindo-a
Inibidores irreversíveis
E + M F em que:
E – enzimaM – modificadorF – enzima modificada inativaK2 - constante de segunda ordem
K2
V = K2 [M][E]
V = KOBS [E]
KOBS = K2 [M]
K2 = KOBS
M
Log EnzimaRemanescente (%)
t
Kobs
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nLog Kobs
Log M
E + nM F e [M] >>> [E]k2
Kobs = k2 Mn
Log Kobs = log K2 + nlog M
Segundo caso: n é o numero de moléculas para inativar a enzima
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Inibidores irreversíveis:
Compostos orgânicos clorados ou fosforados reagem com o resíduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversível.
Uma das enzimas altamente sensível a esses compostos é a acetilcolinesterase, responsável pela metabolização do neurotransmissor acetilcolina em neurônios centrais e periféricos.
Este é o mecanismos de ação dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion.
dose letal: 3-13 mg/Kg, oral
Inseticidasorganofosforados
meia vida – 23 anos
“gás dos nervos” (dose letal 0,01 mg/kg, oral),
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PMSF phenylmethane
sulphonyl fluoride
H3C SO2F
No laboratório, serino-enzimas podem ser identificadas por serem eficientemente inibidas por compostos organofosforados menos tóxicos como o diisopropilfluorofosfato (DFP) ou o fluoreto de fenilmetilenosulfonila (PMSF).
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A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.
Entre estes mecanismos, destacam-se:
Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ?
Agora vamos falar de:
1. Inibidores:• irreversíveis: não protéicos e protéicos• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo
2. Alosteria:• ativadores e inibidores• cooperatividade
3. Modulação covalente• Fosforilação e defosforilação • Ativação de zimogênios
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inativa ativa
Fosforilação - Defosforilação
quinase
fosfatase
enzima
fosfato
substrato
Ao contrário da alosteria, em que os efetores ligam-se à enzima apenas por ligações fracas, na modulação covalente a enzima é modificada covalentemente por duas outras enzimas: uma quinase fosforila a enzima às custas de ATP, e uma fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada. A modulação covalente é energéticamente cara, pois necessita duas outras proteínas e ATP para regular a atividade de uma enzima. Ao contrário, na alosteria a enzima é controlada pelas concentrações relativas de seus efetores e a afinidade da enzima por estes.
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A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas
vezes atuam em conjunto na mesma enzima.
Entre estes mecanismos, destacam-se:
Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ?
Agora vamos falar de:
1. Inibidores:• irreversíveis: não protéicos e protéicos• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo
2. Alosteria:• ativadores e inibidores• cooperatividade
3. Modulação covalente• Fosforilação e defosforilação • Ativação de zimogênios
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• zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em uma conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos resíduos do sítio catalítico.
• conformação desfavorável resulta de porções adicionais da cadeia poli-peptídica, que devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa.
• podem acontecer duas situações, combinadas ou não: - zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a. - zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada (proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades.
• conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica de outra protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsorção do zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam mudança conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease.
• ativação é irreversível, e porisso, energeticamente cara para o organismo.
Ativação de zimogênios é um caso específico de modulação covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolíticas.