Sumário

• Propriedades das enzimas: relação enzima – substrato•Condições necessárias na actividade enzimática.• Mecanismos de inibição enzimática.• Síntese dos principais processos associados à Biotecnologia no diagnóstico e terapêutica de doenças.

Lisboa, 30 de Abril de 2009

Produção de alimentos e sustentabilidade

ACTIVIDADE ENZIMÁTICA

Prof

esso

ra e

stag

iária

Mar

garid

a Fl

ores

Mar

tins

ENZIMAMetabolismo celular

A vida dos microrganismos, como aliás, a de todos os sistemas biológicos, depende de um conjunto de reacções que, de forma ordenada, ocorrem em cada instante e constituem o metabolismo celular.

Catabolismo

Há degradação de compostos orgânicos complexos em compostos orgânicos mais simples, com libertação de ATP. São reacções exoenergéticas.

Ex: digestão, renovação celular

Anabolismo

Há formação de substâncias mais complexas a partir de substâncias mais simples. Há consumo de ATP, que se libertou pelo catabolismo e que não foi usado. São reacções endoenergéticas.

Ex: crescimento, síntese de proteínas

História

ENZIMA

Catálise biológica início séc. XIXdigestão da carne: estômago;digestão do amido: saliva.

Década de 50Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era

catalisada por “fermentos” = enzimas.

Eduard Buchner (1897)extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool;enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva.

James Sumner (1926)Isolou e cristalizou a urease;Cristais eram de proteínas;Postulou que “todas as enzimas são proteínas”.

John Northrop (década 30)Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;

Década de 50 – séc. XX75 enzimas isoladas e cristalizadas;Ficou evidenciado caráter protéico.

Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas

Substâncias que aumentam a velocidade de uma reacção sem serem consumidas

mecanismo: diminuição da barreira de energia de activação

A adição de um catalisador não altera a posição de equilíbriomas apenas a velocidade em que o equilíbrio é atingido.

Características

ENZIMA/BIOCATALIZADOR

•

Estrutura

ENZIMA

RNA

Estrutura Enzimática

Ribozimas

Se covalente

Apoenzima ouApoproteína

Holoenzima

CofatorProteína

Pode ser:• íon inorgânico• molécula orgânica

Coenzima

Grupo Prostético

Cofator

ENZIMAEnergia de activação

Vias metabólicas

ENZIMA

Acção

ENZIMAAs enzimas...

Aceleram reações químicas

Ex: Decomposição do H2O2

1

2,77 x 104

6,51 x 108

H2O2 H2O O2+

Catalase

E E + SS EE + PP

Acção

ENZIMA

Não são consumidas na reacção…..A catalase é um enzima;

• O enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio molecular;

• A polpa de batata contém catalase;

• A imersão de polpa de batata em peróxido de hidrogénio resulta na libertação de bolhas gasosas.

Acção

ENZIMA

• Atuam em pequenas concentrações•

1 molécula de Catalase

decompõe5 000 000 de moléculas de H2O2

pH = 6,8 em 1 min

Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.

Acção

ENZIMA

Diferença entrea energia livre

de S e P

Caminho da Reação

Energia de ativação com enzima

En

erg

ia

Energia de ativação sem enzima

SSPP

Não alteram o estado de equilíbrio

•Baixam a energia de ativação;•Keq não é afetado pela enzima.

Não apresenta efeito termodinâmico global

G não é afetada pela enzima.

Acção

ENZIMA

Apresentam alto grau de especificidade;

Características

ENZIMA

São produtos naturais biológicos;

Reações baratas e seguras;

São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida);

São econômicas, reduzindo a energia de ativação;

Não são tóxicas;

Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica.

Centro activo

ENZIMA

A reacção ocorre no centro activo:

– contém os resíduos de aminoácidos directamente envolvidos na reacção;

– ocupa uma parte relativamente pequena do volume total da enzima;

– trata-se de uma entidade tridimensional;

– corresponde, geralmente, a uma cavidade na molécula de enzima, com um ambiente químico muito próprio.

– o substrato entra no sítio activo e liga-se à enzima através de interacções fracas, não covalentes

Especificidade

ENZIMA

Especificidade

ENZIMA

A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. Especificidade relativa: Quando esta relação existe apenas em relação a tipos de ligação, como certas peptidases, fosfatases, podendo-se citar a lipase que hidrolisa as ligações ácido-alcóol de quase todos os ésteres orgânicos.

Especificidade absoluta: Tipo de especificidade exclusiva, isto é, quando uma enzima actua somente sobre um determinado composto, como a urease que hidrolisa a ureia, mas nenhum dos seus derivados, ou a tripsina que hidrolisa apenas ligações peptídicas formadas por grupos carboxílicos dos aminoácidos básicos.

• Modelo de Fischer ou Modelo Chave/Fechadura: prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma fechadura.

Modelos

ENZIMA

Modelo de Koshland ou Modelo do encaixe induzido: existe um sítio de ligação não totalmente préformado, mas sim moldável à molécula do substrato – a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença, sendo complementar ao seu estado de transição

Modelos

ENZIMA

• Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma "torção" da molécula do substrato, que o "activaria" e o prepararia para a sua transformação em produto.

Modelos

ENZIMA

Componente não proteíco

ENZIMA

Inibição competitiva

ENZIMA

O inibidor liga-se ao centro activo, competindo com o substrato, e

diminuindo a actividade da enzima.

Inibição não competitiva

ENZIMA

O inibidor liga-se numa região distinta do centro activo,

afectando-o, e diminuindo a actividade da enzima.

Inibição alostérica

ENZIMA

A ligação do indutor provoca modificações

no centro activo, permitindo a actuação

enzimática.

• Algumas enzimas além dos centros activos, possuem centros alostéricos (centros reguladores), onde se ligam inibidores que não têm estrutura semelhante ao substrato.

• Século XIX - poucas enzimas identificadas

• Adição do sufixo “ASE”“ASE” ao nome do substrato:

Ex:

- gorduras (lipo - grego) – LIPASE

- amido (amylon - grego) – AMILASE

• Nomes arbitrários:

- Tripsina e pepsina – proteases

Classificação

ENZIMA

Classificação

ENZIMA

• 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar.

• Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:

•1° dígito - classe

•2° dígito - subclasse

•3° dígito - sub-subclasse

•4° dígito - indica o substrato

Factores que influenciam actividade enzimática

ENZIMA

pH

O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia.

Enzimas grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.

A temperatura ótima para que a enzima atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte.

por um período de tempo.

TEMPERATURA

temperatura dois efeitos ocorrem:(a) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas;(b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.O efeito da temperatura depende:

- pH e a força iônica do meio;- a presença ou ausência de ligantes.

CONCENTRAÇÃO DAS ENZIMAS

•Velocidade de transformação do S em P qtidade de E.

• Desvios da linearidade ocorrem:• Presença de inibidores na solução de enzima;• Presença de substâncias tóxicas;• Presença de um ativador que dissocia a enzima;• Limitações impostas pelo método de análise.

•Recomenda-se:• Enzimas com alto grau de pureza;• Substratos puros;• Métodos de análise confiável.

CONCENTRAÇÃO DOS SUBSTRATOS

• [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.• Medir Vo = velocidade inicial da reação.

•[E] = cte.•[S] pequenas Vo linearmente.•[S] maiores Vo por incrementos cada vez

menores.•Vmax [S] Vo insignificantes.•Vmax é atingida E estiverem na forma ES e a [E]

livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com de [S].

vo

Vmax

INIBIDORES

REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS

COMPETITIVOS NÃO COMPETITIVOS INCOMPETITIVOS

Cinética enzimática

ENZIMA

• Victor Henri (1903): E + S ES

K1

K-1ES

Kp

Etapa rápida Etapa lenta

E + S E + P

• Em 1913: Leonor Michaelis -EnzimologistaMaud Menten - Pediatra

Enzimas Vs Catalisadores químicos

ENZIMA

CaracterísticaCaracterística EnzimasEnzimas Catalisadores Catalisadores QuímicosQuímicos

Especificidade ao substrato alta baixa

Natureza da estrutura complexa simples

Sensibilidade à T e pH alta baixa

Condições de reação (T, P e pH) suaves drástica (geralmente)

Custo de obtenção (isolamento e purificação) alto moderado

Natureza do processo batelada contínuo

Consumo de energia baixo alto

Formação de subprodutos baixa alta

Separação catalisador/ produtos difícil/cara simples

Atividade Catalítica (temperatura ambiente) alta baixa

Presença de cofatores sim não

Estabilidade do preparado baixa alta

Energia de Ativação baixa alta

Velocidade de reação alta baixa

TIPOS DE APLIÇÕES INDUSTRIAIS• Alimentos

• Rações animais

• Papel e celulose

• Couro

• Têxtil

Aplicações

ENZIMA

ALIMENTOS

• Indústria de azeite de oliva:

- Aplicação de polygalacturonase e pectinesterase na melhoria de aspectos organolépticos e estabilidade a longo prazo.

• Panificação:

- Melhoria de cor, sabor e estrutural através de preparado enzimático que contém alfa-amilase fúngicas. Atua sobre a farinha de trigo, acelerando o processo de fermentação devido a uma maior formação de açúcares para o fermento.