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Sumário
• Propriedades das enzimas: relação enzima – substrato•Condições necessárias na actividade enzimática.• Mecanismos de inibição enzimática.• Síntese dos principais processos associados à Biotecnologia no diagnóstico e terapêutica de doenças.
Lisboa, 30 de Abril de 2009
Produção de alimentos e sustentabilidade
ACTIVIDADE ENZIMÁTICA
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ENZIMAMetabolismo celular
A vida dos microrganismos, como aliás, a de todos os sistemas biológicos, depende de um conjunto de reacções que, de forma ordenada, ocorrem em cada instante e constituem o metabolismo celular.
Catabolismo
Há degradação de compostos orgânicos complexos em compostos orgânicos mais simples, com libertação de ATP. São reacções exoenergéticas.
Ex: digestão, renovação celular
Anabolismo
Há formação de substâncias mais complexas a partir de substâncias mais simples. Há consumo de ATP, que se libertou pelo catabolismo e que não foi usado. São reacções endoenergéticas.
Ex: crescimento, síntese de proteínas
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História
ENZIMA
Catálise biológica início séc. XIXdigestão da carne: estômago;digestão do amido: saliva.
Década de 50Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era
catalisada por “fermentos” = enzimas.
Eduard Buchner (1897)extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool;enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva.
James Sumner (1926)Isolou e cristalizou a urease;Cristais eram de proteínas;Postulou que “todas as enzimas são proteínas”.
John Northrop (década 30)Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;
Década de 50 – séc. XX75 enzimas isoladas e cristalizadas;Ficou evidenciado caráter protéico.
Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas
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Substâncias que aumentam a velocidade de uma reacção sem serem consumidas
mecanismo: diminuição da barreira de energia de activação
A adição de um catalisador não altera a posição de equilíbriomas apenas a velocidade em que o equilíbrio é atingido.
Características
ENZIMA/BIOCATALIZADOR
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•
Estrutura
ENZIMA
RNA
Estrutura Enzimática
Ribozimas
Se covalente
Apoenzima ouApoproteína
Holoenzima
CofatorProteína
Pode ser:• íon inorgânico• molécula orgânica
Coenzima
Grupo Prostético
Cofator
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ENZIMAEnergia de activação
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Vias metabólicas
ENZIMA
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Acção
ENZIMAAs enzimas...
Aceleram reações químicas
Ex: Decomposição do H2O2
1
2,77 x 104
6,51 x 108
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H2O2 H2O O2+
Catalase
E E + SS EE + PP
Acção
ENZIMA
Não são consumidas na reacção…..A catalase é um enzima;
• O enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio molecular;
• A polpa de batata contém catalase;
• A imersão de polpa de batata em peróxido de hidrogénio resulta na libertação de bolhas gasosas.
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Acção
ENZIMA
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• Atuam em pequenas concentrações•
1 molécula de Catalase
decompõe5 000 000 de moléculas de H2O2
pH = 6,8 em 1 min
Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.
Acção
ENZIMA
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Diferença entrea energia livre
de S e P
Caminho da Reação
Energia de ativação com enzima
En
erg
ia
Energia de ativação sem enzima
SSPP
Não alteram o estado de equilíbrio
•Baixam a energia de ativação;•Keq não é afetado pela enzima.
Não apresenta efeito termodinâmico global
G não é afetada pela enzima.
Acção
ENZIMA
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Apresentam alto grau de especificidade;
Características
ENZIMA
São produtos naturais biológicos;
Reações baratas e seguras;
São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida);
São econômicas, reduzindo a energia de ativação;
Não são tóxicas;
Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica.
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Centro activo
ENZIMA
A reacção ocorre no centro activo:
– contém os resíduos de aminoácidos directamente envolvidos na reacção;
– ocupa uma parte relativamente pequena do volume total da enzima;
– trata-se de uma entidade tridimensional;
– corresponde, geralmente, a uma cavidade na molécula de enzima, com um ambiente químico muito próprio.
– o substrato entra no sítio activo e liga-se à enzima através de interacções fracas, não covalentes
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Especificidade
ENZIMA
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Especificidade
ENZIMA
A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. Especificidade relativa: Quando esta relação existe apenas em relação a tipos de ligação, como certas peptidases, fosfatases, podendo-se citar a lipase que hidrolisa as ligações ácido-alcóol de quase todos os ésteres orgânicos.
Especificidade absoluta: Tipo de especificidade exclusiva, isto é, quando uma enzima actua somente sobre um determinado composto, como a urease que hidrolisa a ureia, mas nenhum dos seus derivados, ou a tripsina que hidrolisa apenas ligações peptídicas formadas por grupos carboxílicos dos aminoácidos básicos.
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• Modelo de Fischer ou Modelo Chave/Fechadura: prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma fechadura.
Modelos
ENZIMA
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Modelo de Koshland ou Modelo do encaixe induzido: existe um sítio de ligação não totalmente préformado, mas sim moldável à molécula do substrato – a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença, sendo complementar ao seu estado de transição
Modelos
ENZIMA
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• Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma "torção" da molécula do substrato, que o "activaria" e o prepararia para a sua transformação em produto.
Modelos
ENZIMA
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Componente não proteíco
ENZIMA
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Inibição competitiva
ENZIMA
O inibidor liga-se ao centro activo, competindo com o substrato, e
diminuindo a actividade da enzima.
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Inibição não competitiva
ENZIMA
O inibidor liga-se numa região distinta do centro activo,
afectando-o, e diminuindo a actividade da enzima.
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Inibição alostérica
ENZIMA
A ligação do indutor provoca modificações
no centro activo, permitindo a actuação
enzimática.
• Algumas enzimas além dos centros activos, possuem centros alostéricos (centros reguladores), onde se ligam inibidores que não têm estrutura semelhante ao substrato.
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• Século XIX - poucas enzimas identificadas
• Adição do sufixo “ASE”“ASE” ao nome do substrato:
Ex:
- gorduras (lipo - grego) – LIPASE
- amido (amylon - grego) – AMILASE
• Nomes arbitrários:
- Tripsina e pepsina – proteases
Classificação
ENZIMA
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Classificação
ENZIMA
• 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar.
• Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:
•1° dígito - classe
•2° dígito - subclasse
•3° dígito - sub-subclasse
•4° dígito - indica o substrato
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Factores que influenciam actividade enzimática
ENZIMA
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pH
O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia.
Enzimas grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.
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A temperatura ótima para que a enzima atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte.
por um período de tempo.
TEMPERATURA
temperatura dois efeitos ocorrem:(a) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas;(b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.O efeito da temperatura depende:
- pH e a força iônica do meio;- a presença ou ausência de ligantes.
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CONCENTRAÇÃO DAS ENZIMAS
•Velocidade de transformação do S em P qtidade de E.
• Desvios da linearidade ocorrem:• Presença de inibidores na solução de enzima;• Presença de substâncias tóxicas;• Presença de um ativador que dissocia a enzima;• Limitações impostas pelo método de análise.
•Recomenda-se:• Enzimas com alto grau de pureza;• Substratos puros;• Métodos de análise confiável.
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CONCENTRAÇÃO DOS SUBSTRATOS
• [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.• Medir Vo = velocidade inicial da reação.
•[E] = cte.•[S] pequenas Vo linearmente.•[S] maiores Vo por incrementos cada vez
menores.•Vmax [S] Vo insignificantes.•Vmax é atingida E estiverem na forma ES e a [E]
livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com de [S].
vo
Vmax
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INIBIDORES
REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS
COMPETITIVOS NÃO COMPETITIVOS INCOMPETITIVOS
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Cinética enzimática
ENZIMA
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• Victor Henri (1903): E + S ES
K1
K-1ES
Kp
Etapa rápida Etapa lenta
E + S E + P
• Em 1913: Leonor Michaelis -EnzimologistaMaud Menten - Pediatra
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Enzimas Vs Catalisadores químicos
ENZIMA
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CaracterísticaCaracterística EnzimasEnzimas Catalisadores Catalisadores QuímicosQuímicos
Especificidade ao substrato alta baixa
Natureza da estrutura complexa simples
Sensibilidade à T e pH alta baixa
Condições de reação (T, P e pH) suaves drástica (geralmente)
Custo de obtenção (isolamento e purificação) alto moderado
Natureza do processo batelada contínuo
Consumo de energia baixo alto
Formação de subprodutos baixa alta
Separação catalisador/ produtos difícil/cara simples
Atividade Catalítica (temperatura ambiente) alta baixa
Presença de cofatores sim não
Estabilidade do preparado baixa alta
Energia de Ativação baixa alta
Velocidade de reação alta baixa
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TIPOS DE APLIÇÕES INDUSTRIAIS• Alimentos
• Rações animais
• Papel e celulose
• Couro
• Têxtil
Aplicações
ENZIMA
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ALIMENTOS
• Indústria de azeite de oliva:
- Aplicação de polygalacturonase e pectinesterase na melhoria de aspectos organolépticos e estabilidade a longo prazo.
• Panificação:
- Melhoria de cor, sabor e estrutural através de preparado enzimático que contém alfa-amilase fúngicas. Atua sobre a farinha de trigo, acelerando o processo de fermentação devido a uma maior formação de açúcares para o fermento.