Extratos vegetais so, muitas vezes, misturas complexas constitudas de diversos compostos com grupos funcionais diferentes. O isolamento destas substncias, seja para identificao ou, em maior quantidade, para a realizao de ensaios farmacolgicos, um processo lento que acaba envolvendo grandes quantidades de solventes extratores. Para que seja possvel separar e identificar essas substncias removidas da amostra vegetal aps a fase extrativa necessrio o uso de uma tcnica capaz de diferenci-las de acordo com suas caractersticas qumicas, como interaes intermoleculares destas com outras substncias que possam ser empregadas. Por estes fatores que as tcnicas cromatogrficas so de enorme importncia.A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao que se fundamenta na migrao diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis: fase mvel (gs, lquido ou um fluido supercrtico) e fase estacionria (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfcie slida), esta separao depende da diferena entre o comportamento dos analitos entre as fases. A mistura adsorvida em uma fase fixa, e uma fase mvel "lava" continuamente a mistura adsorvida. Pela escolha apropriada da fase fixa e da fase mvel, alm de outras variveis, pode-se fazer com que os componentes da mistura sejam arrastados por eluio ordenadamente. Aqueles que interagem pouco com a fase fixa so arrastados facilmente e aqueles com maior interao ficam mais retidos.Os componentes da mistura adsorvem-se com as partculas de slido devido a interao de diversas foras intermoleculares. O composto ter uma maior ou menor adsoro, dependendo das foras de interao, que variam na seguinte ordem: formao de sais > pontes de hidrognio > dipolo-dipolo > Van der Waals.Ela foi relatada pela primeira vez h pouco mais de 100 anos por Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No perodo de 1899 1901 Tswett trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura fsico-qumica da clorofila das plantas, sendo que no ano de 1903 relatou uma nova categoria de anlise adsortiva (ETTRE, 2000). O trabalho de Tswett foi apresentado em forma de tratado para a Sociedade de Cincias de Varsvia, no qual descreveu os resultados preliminares de suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma coluna de vidro recheada com carbonato de clcio, separando os constituintes do extrato pela passagem de ter dietlico (COLLINS, 2006). No entanto, as denominaes de cromatografia e cromatograma somente surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A palavra cromatografia designava o processo de separao, tendo sua origem do grego chroma, com o significado de cor, e tambm do grego graphe, significando escrever. J a palavra cromatograma refere-se s bandas separadas na coluna (COLLINS, 2006; NOGUEIRA, 2006).Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam ser considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi praticamente ignorada at a dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea possibilitaram seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticao, que resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas.A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura.As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critrios, sendo alguns deles listados abaixo:

1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrficoEm relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP), cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em camada delgada (CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais sero mais bem compreendidos quando classificados por outro critrio.

2. Classificao pela fase mvel empregadaEm se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel. No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro empacotadas com a fase estacionria.3. Classificao pela fase estacionria utilizadaQuanto fase estacionria, distingue-se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao.4. Classificao pelo modo de separaoPor este critrio, separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos. Para se ter uma viso mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os mesmos esto dispostos no diagrama da Figura 1. Dentre os vrios tipos de cromatografia, especial nfase ser dada cromatografia em camada delgada (CCD) e a cromatografia em coluna ou por adsoro (CC).

FLUXO DAS CROMATOGRAFIAS FIG 01

A cromatografia em camada delgada uma tcnica de adsoro lquido-slido, na qual a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionria (DEGANI et al., 1998). A CCD est embasada na separao de substncias por meio das suas diferentes velocidades de migrao em razo da afinidade relativa com solventes, fixando-se numa fase slida (XAVIER et al., 2007). A CCD um mtodo simples, rpido e econmico, sendo a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaes orgnicas (DEGANI et al., 1998).Neste mtodo a fase estacionria uma camada fina formada por um slido granulado (slica, alumina ou poliamida) depositado sobre uma placa que deve atuar como suporte inerte. Na CCD gotas da soluo a ser separada so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior da placa. Aps a secagem da placa, ela colocada em um recipiente contendo a fase mvel, de modo que somente sua base fique submersa. O solvente comea a molhar a fase estacionria e sobe por capilaridade. Aps o deslocamento da fase mvel deixasse a placa secar, e posteriormente realizada a revelao da placa com reativos que deem cor as substncias de interesse (PERES, 2002).O parmetro de maior importncia na CCD o fator de reteno, que a razo entre a distncia percorrida pela substncia e a distncia percorrida pela fase mvel. Esse fator determinar se a substncia analisada confere com a substncia padro (DEGANI et al., 1998).

Rf = dc / desendo: dc: distncia percorrida pelo componente da mistura; de: distncia percorrida pelo componente da mistura;

FIGURA: DESENHO DA PLACA COM A EXPLICAO DO RF E TUDO MAIS.DEIXE UM ESPAO IDEAL PARA DUAS IMAGENS.

Na prtica, os valores de Rf obtidos em uma placa raramente se repetem em outra, devido a fatores, como tamanho da partcula do adsorvente, composio do solvente grau de saturao da cmara de eluio, ativao e condies de estocagem das placas, espessura da camada do adsorvente, etc. Os valores de Rf so, todavia, importantes quando se faz um estudo comparativo utilizando solues de substncias-padro aplicadas na mesma placa.

J a cromatografia em coluna uma tcnica de partio entre duas fases, slida e lquida, baseada na capacidade de adsoro e solubilidade. O slido deve ser um material insolvel na fase lquida associada, sendo que os mais utilizados so a slica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de p. A mistura a ser separada colocada na coluna com um eluente(solvente) menos polar e vai-se aumentando gradativamente a polaridade do eluente e consequentemente o seu poder de arraste de substncias mais polares. Uma sequncia de eluentes normalmente utilizada a seguinte: ter de petrleo, hexano, ter etlico, tetracloreto de carbono, acetato de etila, etanol, metanol, gua e cido actico.

O fluxo de solvente deve ser contnuo. Os diferentes componentes da mistura mover-se-o com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e tambm pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com relao ao composto.

medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou zonas mveis comeam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam atravs da coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros tm menor afinidade com a fase estacionria. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela no se mover. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eludos sem serem separados. Por uma escolha cuidadosa das condies, praticamente qualquer mistura pode ser separada (Figura 2).

Figura 2: Cromatografia em coluna em funcionamento.Outros adsorventes slidos para cromatografia de coluna em ordem crescente de capacidade de reteno de compostos polares so: papel, amido, acar , sulfato de clcio, slica gel, xido de magnsio, alumina e carvo ativo. Ainda, a alumina usada comercialmente pode ser cida, bsica ou neutra.

SLIDOMASSA INICIAL (g)MASSA FINAL (g)RENDIMENTO

------------------------------------------RECUPERAO

TOTAL

SLIDOHCl 20%NaOH 10%H2OEtOHter de Petrleoter EtlicoHAc Glacial

SLIDOREAGENTES

NaHCO3 (aq)p-N,N-Dimetilaminobelzaldedo

SLIDOPONTO DE FUSO (TERICO)PONTO DE FUSO (DETERMINADO)