Inibição enzimática: determinação de diferentes tipos de inibição enzimática

Instituto Superior Ciências da Saúde Egas Moniz

Campus Universitário, Quinta da Granja-2829- 511 Caparica, Monte da Caparica

Tel: +351212946700 Fax: +351212946771

Licenciatura em Ciências Forenses e Criminais

Bioquímica

Prof. Doutor Carlos Monteiro

Discente: Tânia Cunha nº110509

Realização da actividade: 26 de Maio de 2014

Entrega do Relatório: 12 de Junho de 2014

1.Resumo

A inibição de um enzima corresponde a uma diminuição da sua atividade, por associação a moléculas com estrutura semelhante ao substrato denominadas inibidores. Neste trabalho experimental utilizou-se o NaF como inibidor. O objetivo desta experiência era avaliar o tipo de inibição uma vez que os processos de inibição de enzimas estão divididos em dois tipos: inibição reversível e inibição irreversível. Dentro da inibição reversível temos ainda a Inibição Competitiva, Mista e a Não-Competitiva. A avaliação do tipo de inibição foi feita consoante a análise da Vmáx e do Km que é determinado a partir da representação gráfica da equação de Lineweaver-Burk. Após o tratamento dos resultados, chegou-se à conclusão que a inibição com o NaF foi uma inibição não-competitiva. Para além da avaliação do tipo de inibição foi também determinado, a partir da equação de Lineweaver-Burk, o Ki da reação.

PALAVRAS-CHAVE: Inibição Enzimática, NaF, Inibição Competitiva, Inibição Mista, Inibição Não-Competitiva, Km, Ki, Equação de Lineweaver-Burk, Henri-Michaelis-Menten, lei de Lambert-Beer.

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2. IntroduçãoEnzimas são um grupo de substâncias orgânicas de natureza normalmente proteica, com atividade intra ou extracelular que têm funções catalisadoras. Estas catalisam reações químicas que, sem a sua presença, dificilmente aconteceriam. Isso é conseguido através do abaixamento da energia de ativação necessária para que se dê uma reação química, resultando no aumento da velocidade da reação e possibilitando o metabolismo dos seres vivos. Em sistemas vivos, a maioria das reações dá-se em vias metabólicas, que são sequências de reações em que o produto de uma reação é utilizado como reagente na reação seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metabólicas, agindo de forma concertada de modo a não interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulação da sua actividade aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via metabólica em que se insere.

As enzimas convertem uma substância, chamada de substrato, noutra denominada produto, e são extremamente específicas para a reação que catalisam. Isso significa que, em geral, uma enzima catalisa um e só um tipo de reação química. Consequentemente, o tipo de enzimas encontradas numa célula determina o tipo de metabolismo que a célula efetua.

A velocidade da reação catalisada por uma enzima é aumentada devido ao abaixamento da energia de ativação necessária para converter o substrato no produto. O aceleramento da reação pode ser da ordem dos milhões de vezes.

Como são catalisadores, as enzimas não são consumidas na reação e não alteram o equilíbrio químico dela.

A actividade enzimática pode depender da presença de determinadas moléculas, genericamente chamadas cofactores. A natureza química dos cofactores é muito variável, podendo ser, por exemplo, um ou mais iões metálicos ( como o ferro), ou uma molécula orgânica ( como a vitamina B12). Estes cofactores podem participar ou não directamente na reação enzimática.

Determinadas substâncias, podem inibir a actividade de algumas enzimas, diminuindo-a ou eliminando-a totalmente; são os chamados inibidores enzimáticos. Estas substâncias de inibição são muitas, sendo algumas delas constituintes da célula e outras são estranhas, levando com a sua presença a alterações significativas do metabolismo. Quando o inibidor é produzido pela própria célula, a variação na sua concentração vai ser muito empregado pela própria célula como uma forma de controlo da velocidade das reações. Esse mecanismo vai possibilitar ao organismo responder a diferentes condições fisiológicas. O bloqueio de uma única reação vai afetar toda a sequência de reações, já que a reação bloqueada não vai gerar o produto que vai ser necessário para reações seguintes.

Os inibidores podem ser reversíveis ou irreversíveis, de acordo com a estabilidade gerada pela sua ligação com a enzima.

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Os inibidores irreversíveis ligam se ás enzimas levando á inativação definitiva desta. Estes inibidores são muito tóxicos para o organismo já que não são específicos, sendo capazes de inativar qualquer enzima. Já os inibidores reversíveis podem ser divididos em dois grupos, os competitivos e os não-competitivos. Essa divisão é baseada na presença ou não de competição entre o inibidor e o substrato pelo centro ativo da enzima.

Os inibidores competitivos competem com o substrato pelo centro ativo da enzima. Estas moléculas apresentam configuração semelhante ao substrato e por isso são capazes de se ligarem ao centro ativo da enzima. Eles produzem um complexo enzima-inibidor que é semelhante ao complexo enzima- substrato.

Os inibidores não-competitivos não tem semelhança estrutural com o substrato de reação que inibem. A sua inibição se dá pela sua ligação a radicais que não pertencem ao grupo ativo. Esta ligação vai alterar a estrutura da enzima e inviabiliza a sua catálise.

3. Protocolo Experimental/ Materiais e MétodosPreparar os ensaios enzimáticos tal como está indicado na Tabela 1, até à adição de água. Iniciar a reação com a adição de fosfotase ácida 0,10 U/ml, contando um minuto de intervalo entre a adição de cada tubo. Após 10 minutos de incubação de cada tubo, parar a reação adicionando KOH, homogeneizado. Para cada tubo, ler a absorvância a 405 nm, após acertar o zero do espectrofotómetro, realizar as leituras contra ar.

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Tabela 1- Estudo da inibição do fosfatase ácido pelo inibidor escolhido

Preparar os ensaios enzimáticos tal como está indicado na Tabela 2, até à adição da água. Iniciar a reação com a adição de fosfatase ácida 0,10 U/ml, contando um minuto de intervalo entre a adição de cada tubo. Após 10 minutos de incubação de cada tubo, parar a reação adicionando KOH, homogeneizando. Para cada tubo, ler a absorvância a

405 nm, após acertar o zero do espectrofotómetro, realizar as leituras contra ar.

4. ResultadosTabela 3-Estudo da inibição do fosfatase ácida pelo inibidor escolhido: Avaliação do tipo de inibição

Tubo Absorvância Absorvância Corrigida

Vi pNPP(ml)

Ci pNPP(M)

Vf pNPP(ml)

Cf pNPP(M)

1 0,121 0 0 0,01 2,5 02 0,373 0,252 0,0125 0,01 2,5 0,000053 0,521 0,4 0,025 0,01 2,5 0,00014 0,72 0,599 0,0625 0,01 2,5 0,00255 1,152 1,031 0,125 0,01 2,5 0,00056 1,29 1,169 0,250 0,01 2,5 0,0017 1,66 1,539 0,625 0,01 2,5 0,00258 2,09 1,969 1,250 0,01 2,5 0,005

Cálculos concentração final de pNPP:

Ci×Vi=Cf×Vf

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Tabela 2- Estudo da inibição do fosfatase ácido pelo inibidor escolhido: determinar Ki

Tabela 4- Estudo da inibição do fosfatase ácido pelo inibidor escolhido:avaliação do tipo de inibição

Tubo Cf de pNPP Absorvância Corrigida [P] pNPP V0 1/V0 1/S1 0 0 0 0 0 02 0,00005 0,252 0,0000014 0,00000014 7142857,1 20000

3 0,0001 0,4 2,22222E-06

2,2222E-07 4500000 10000

4 0,0025 0,599 3,32778E-06

3,3278E-07 3005008,3 400

5 0,0005 1,031 5,72778E-06

5,7278E-07 1745877,8 2000

6 0,001 1,169 6,49444E-06

6,4944E-07 1539777,6 1000

7 0,0025 1,539 0,00000855 8,55E-07 1169590,6 400

8 0,005 1,969 1,09389E-05

1,0939E-06 914169,63 200

Cálculo da concentração do produto de pNPP:

Pela lei de Lambe-Beer: Absorvância180000

Cálculo de V0: concentraçãodo produtode pNPP

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0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.0060

0.5

1

1.5

2

2.5

f(x) = 206.857142857143 x + 0.961571428571428R² = 0.989593874129676

Absorvância vs. Cf de pNPP

Cf de pNPP

Abso

rvÂn

cia

Figura 1- Absorvância vs. Cf de pNPP

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Figura 2- Grafico de Lineweaver-Burk

Calcular Vmáx: b=1

Vmáx. (=) Vmáx.=

1b

(=) Vmáx.=1

109959 (=) Vmáx.=9,1 E-06 cm/min

Calcular Km: m=km/Vmáx (=) 30,996=Km/9,1 E-06 (=) Km=2,8 E-4

Tabela 5- Estudo do efeito da concentração de substrato na actividade enzimática de fosfatase ácida

Tubo Cf de pnPP (M) Absorvância [P] pNPP V0 1/V0 1/S1 0 0,069 3,83333E-

073,83333E-

0826086956,5 0

2 0,00005 0,165 9,16667E-07

9,16667E-08

10909090,9 20000

3 0,0001 0,211 1,17222E-06

1,17222E-07

8530805,69 10000

4 0,00025 0,332 1,84444E-06

1,84444E-07

5421686,75 4000

5 0,0004 0,424 2,35556E-06

2,35556E-07

4245283,02 2500

6 0,001 0,648 0,0000036 0,00000036

2777777,78 1000

7 0,0025 1,239 6,88333E-06

6,88333E-07

1452784,5 400

8 0,005 2,076 1,15333E-05

1,15333E-06

867052,023 200

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Figura 3-Gráfico de Lineweaver-Burk dos resultados experimentais e da reta controlo

Calcular Vmáx.: b=1/Vmáx. (=) 452187= 1/Vmáx (=) Vmáx=2,2 E-6 cm/min

Calcular Km: m=Km/Vmáx (=) 32,223=Km/2,2 E-6 (=) Km= 7,12 E-5

Calculo de Ki

Tabela 6- Estudo da inibição do fosfatase ácido pelo inibidor escolhido: Determinação Ki

Tubo Absorvância Vi de NaF Ci de NaF Vf de NaF Cf de NaF1 0,901 0 0,005 2,5 02 0,891 0,025 0,005 2,5 5,00E-053 0,821 0,125 0,005 2,5 2,50E-044 0,759 0,25 0,005 2,5 5,00E-045 0,423 0,375 0,005 2,5 7,50E-046 0,366 0,5 0,005 2,5 1,00E-037 0,348 0,625 0,005 2,5 1,25E-038 0,329 0,78 0,005 2,5 1,56E-03

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Figura 4- Absorvância Vs Cf de NaF

Calcular concentração de NaF:

A= ε* C*l (=) C=Aε∗l (=) C=

A18000∗1

Cálculo de V0: concentraçãodo produto pNPP

10min

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Tabela 7-Estudo da inibição do fosfatase ácido pelo inibidor escolhido: Determinação Ki

Figura 5- Gráfico de Lineweaver- Burk

Calcular Vmáx. : b=1/Vmáx. (=) 664504= 1/ Vmáx (=) Vmáx= 1,5 E-6 cm/min

Calcular do Ki: m=Ki/ Vmáx (=) -177,98=Ki/1,5 E-6 (=) Ki= -2,68 E-4

5. Discussão e ConclusãoPara a avaliação do tipo de inibição temos que tomar especial atenção à leitura das absorvências da tabela 1. Para começar calcularam-se todos os parâmetros necessários à realização dos respetivos gráficos. Em primeiro lugar, começou-se por corrigir o valor da absorvência. Para os valores serem mais precisos e corretos subtraiu-se o valor do tubo 1 a todos os tubos, funcionando assim o tubo 1 como o branco da experiência.

Em segundo lugar, recorreu-se à relação Ci x Vi = Cf x Vf para calcular a concentração final de pNPP de cada um dos tubos. A concentração final de pNPP é importante para o cálculo de 1/[S]. Como a concentração inicial era de 10mM, o volume final era de 2,5ml e o volume inicial era diferente nos diferentes tubos (ver tabela 1), a concentração final também seria diferente nos mesmos. Desta forma, foi possível obter a tabela 3.

Após se possuir os parâmetros já calculados foi necessário calcular a concentração de produto de pNPP. Para calcular essa concentração recorreu-se à lei de Lambert-Beer. A = ε.c.l Sendo, A a absorvência, ε a absortividade molar da substância (18000M-1cm-1), c a concentração de sustância absorvente no meio e l a distância que a luz atravessa pelo corpo (1cm da cuvete), temos:

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Possuindo a concentração de produto de pNPP, foi possível calcular a velocidade inicial (V0).

Desta forma, temos então todos os parâmetros calculados. A tabela 4 permite visualizar todos os valores necessários.

Primeiramente, devemos traçar o gráfico da absorvência corrigida vs concentração final de pNPP. De seguida, traçamos o Gráfico de Lineweaver-Burk com os valores experimentais.

A partir do gráfico de Lineweaver-Burk podemos determinar os respetivos valores de Vmáx e Km uma vez que possuímos já a equação (y = mx + b): y=30,996x + 109959

De seguida calculou-se a partir da recta a Vmáx e o Km.

Para podermos chegar a uma conclusão é necessário possuir uma reta controlo (1). Essa reta controlo permite-nos avaliar o tipo de inibição presente. Os valores da reta controlo foram fornecidos por uma colega que tinha como experiência laboratorial a cinética enzimática.

O cálculo dos diferentes parâmetros fazia-se da mesma forma que se fez anteriormente pelo que, desta vez, apenas se representará os valores finais na tabela 5.

Através dos valores presentes na tabela 5 foi possível sobrepor a reta controlo ao gráfico que já tinha sido feito em relação à inibição enzimática. Desta forma podemos visualizar o gráfico 3. Pela visualização do gráfico é possível supor que se trata de uma inibição não-competitiva, uma vez que as duas retas estão muito próximas de ser paralelas.

Porém, deve-se fazer uma avaliação mais aprofundada, calculando a Vmás e o Km destes novos valores e ver se os valores anteriores diminuem, aumentam, ou se mantêm constantes. A nova equação da reta é: y = 32,223x +452187

De seguida calculou-se o valor de Vmáx e de Km

Ora, tendo as duas Vmáx e os dois Km calculados podemos comparar ambos os valores.

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Trata-se de uma inibição não competitiva quando Vmáx diminui e Km é constante, assim sendo, vamos comprovar este caso.

Em relação à Vmáx: 9,1E-6 cm/min > 2,2E-6 cm/min Há uma diminuição da Vmáx. Em relação ao Km: 2,8E-4>7,12E-5 Há uma diminuição do Km. Desta forma, não podemos concluir com exatidão que se trata de uma inibição não-competitiva mas também é normal que tal tenha acontecido uma vez que este tipo de inibição, apesar de muito mencionado na literatura, corresponde a uma situação experimental rara (2).

Determinação do Ki

Para a avaliação do tipo de inibição temos que tomar especial atenção à leitura das absorvências da tabela 2. Para começar calcularam-se todos os parâmetros necessários à realização dos respetivos gráficos. Em primeiro lugar, recorreu-se à relação Ci x Vi = Cf x Vf para calcular a concentração final de inibidor (NaF) de cada um dos tubos. A concentração final de inibidor é importante para o cálculo de 1/[S]. Como a concentração inicial era de 5mM, o volume final era de 2,5ml e o volume inicial era diferente nos diferentes tubos (ver tabela 2), a concentração final também será diferente nos mesmos. Desta forma foi possível obter a tabela 6.

Após se possuir os parâmetros já calculados foi necessário calcular a concentração de produto de NaF. Para calcular essa concentração recorreu-se à lei de Lambert-Beer

A = ε.c.lSendo, A a absorvância, ε a absortividade molar da substância (18000M-1cm-1), c a concentração de sustância absorvente no meio e l a distância que a luz atravessa pelo corpo (1cm da cuvete), temos:

Por último, calculou-se a velocidade inicial (V0) e obteve-se a tabela 7, com todos os valores necessários.

Primeiramente, devemos traçar o gráfico da absorvência vs concentração final de NaF (gráfico 4)

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De seguida, traçamos o Gráfico de Lineweaver-Burk com os valores experimentais (gráfico 5)

A partir do gráfico de Lineweaver-Burk podemos determinar os respetivos valores de Vmáx e Ki uma vez que possuímos já a equação (y = mx + b): y= -177,98x + 664504

De seguida calculou-se o Vmáx e o Ki.

A inibição de uma enzima corresponde a uma diminuição da sua atividade, por associação a moléculas com estrutura semelhante ao substrato denominadas inibidores. O conceito biológico de inibidor enzimático diz respeito à substância que é capaz de interferir, de maneira específica, na taxa de uma reação de catálise enzimática, retardando ou reduzindo o processo ou a especificidade biológica da reação. Os processos de inibição de enzimas estão divididos em dois tipos: inibição reversível e inibição irreversível. Dentro da inibição reversível temos ainda a Inibição Competitiva, Mista e a Não-Competitiva. A avaliação do tipo de inibição pode ser feita consoante a análise da Vmáx e do Km que é determinado a partir da representação gráfica da equação de Lineweaver-Burk. Para além da avaliação do tipo de inibição, pode ser determinado também, a partir da equação de Lineweaver-Burk o Ki da reação.

6. Referênicas (1) (Valores fornecidos pela aluna Joana Gomes do curso de Ciências Forenses e Criminais, 1º Ano do Institudo Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz)

(2) (Quintas, Alexandre, Freire, Ana Ponces, Halpern Manuel J. (2008), BIOQUÍMICA – Organização Molecular da Vida. Lisboa, LIDEL)

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