EUCAST Documento Definitivo E.DEF. 7.3.2 Abril 2020
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EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
Meacutetodo para determinaccedilatildeo de concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima em caldo dos agentes antifuacutengicos
para leveduras
Autores
MC Arendrup J Meletiadis J W Mouton K Lagrou Petr Hamal J Guinea e o Subcomitecirc de Teste de
Sensibilidade aos Antifuacutengicos (Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing -AFST) do Comitecirc Europeu
para Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ESCMID European Committee for Antimicrobial
Susceptibility Testing -EUCAST)
Traduccedilatildeo
Dra Analy Salles de Azevedo Melo ndash Professora Afiliada da Disciplina de Infectologia Departamento de
Medicina Universidade Federal de Satildeo Paulo (UNIFESP) ndash Satildeo PauloSP ndash Satildeo PauloSP e Membro do
Subcomitecirc de Antifuacutengicos no Comitecirc Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (BrCAST)
Dr Joatildeo Noacutebrega de Almeida Juacutenior - Meacutedico Assistente do Laboratoacuterio de Microbiologia Divisatildeo de
Laboratoacuterio Central Hospital das Cliacutenicas Faculdade de Medicina da Universidade de Satildeo Paulo (HC-FMUSP) -
Satildeo PauloSP e Membro do Subcomitecirc de Antifuacutengicos no Comitecirc Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos
Antimicrobianos (BrCAST)
Dra Kelly Ishida - Professora Doutora do Departamento de Microbiologia Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas ndash
Universidade de Satildeo Paulo (ICB-USP) ndash Satildeo PauloSP e Coordenadora do Subcomitecirc de Antifuacutengicos no Comitecirc
Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (BrCAST)
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INTRODUCcedilAtildeO
Os testes de sensibilidade aos antifuacutengicos (TSA) satildeo indicados para fungos que causam infecccedilatildeo
especialmente quando a infecccedilatildeo eacute invasiva quando o tratamento eacute falho ou recidivante quando a resistecircncia
aos antifuacutengicos eacute possiacutevel ou quando a sensibilidade natildeo pode ser predita atraveacutes da identificaccedilatildeo da espeacutecie
O TSA eacute tambeacutem importante para a vigilacircncia de resistecircncia estudos epidemioloacutegicos e comparaccedilatildeo da
atividade in vitro dos antifuacutengicos novos e existentes
Meacutetodos de diluiccedilatildeo satildeo usados para estabelecer as concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas (CIMs) dos
antimicrobianos eles satildeo os meacutetodos de referecircncia para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos e satildeo
usados principalmente para estabelecer a atividade dos novos antifuacutengicos para confirmar a suscetibilidade
dos organismos que apresentam resultados conflitantes em outros testes de sensibilidade (como os testes
comerciais) e para determinar a suscetibilidade de organismos quando outros testes natildeo satildeo confiaacuteveis ou
natildeo foram validados Em meacutetodos de diluiccedilatildeo fungos satildeo avaliados pela sua habilidade em produzir
crescimento suficiente em poccedilos de placas de microdiluiccedilatildeo de meio de cultura liacutequido contendo diluiccedilotildees
seriadas dos agentes antifuacutengicos (microdiluiccedilatildeo em caldo)
A CIM do antifuacutengico eacute definida como a menor concentraccedilatildeo registrada em mgL do antifuacutengico que inibe o
crescimento do fungo em percentual preacute-definido (por exemplo 50 90 ou inibiccedilatildeo total) A CIM informa
sobre a sensibilidade ou a resistecircncia do organismo ao antifuacutengico a qual pode ajudar em decisotildees de
tratamento
A versatildeo atualizada (732) deste documento eacute direcionada para o teste de sensibilidade de leveduras de
importacircncia meacutedica (primariamente Candida e Cryptococcus) A primeira versatildeo deste documento foi
publicada em um documento provisoacuterio (71) em 2003 [1] e definitivo em 2008 [2] A segunda versatildeo do
documento continha informaccedilatildeo adicional a respeito dos solventes para caspofungina micafungina e
fluconazol tempo de estoque para placas contendo equinocandinas teste de sensibilidade para Cryptococcus
e os intervalos de CIM de anidulafungina para cepas de controle de qualidade [3] A terceira versatildeo foi
harmonizada em texto e formato com o documento definitivo para fungos filamentosos 932 e a definiccedilatildeo
revisada da categoria I foi introduzida e os intervalos de CIM para as cepas de controle de qualidade foram
removidos (e criado um documento separado resumindo todos os intervalos de CIM dos antifuacutengicos para as
cepas controle de qualidade - disponiacutevel no website httpwwwEUCASTorg) evitando a necessidade de
lanccedilamento de novos documentos com eventuais atualizaccedilotildees dos intervalos de CIM para as cepas controle
de qualidade A seccedilatildeo contendo a preparaccedilatildeo e calibraccedilatildeo do espectrofotocircmetro tambeacutem foi modificada no
presente documento
ESCOPO
Esta padronizaccedilatildeo EUCAST descreve um meacutetodo de teste de sensibilidade de leveduras para antifuacutengicos pela
determinaccedilatildeo da CIM As CIMs mostram a atividade in vitro de determinado antifuacutengico nas condiccedilotildees
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descritas para o teste e podem ser usados para o manejo das infecccedilotildees em conjunto com outros fatores como
farmacocineacutetica farmacodinacircmica e mecanismos de resistecircncia Os valores de CIM permitem que os fungos
sejam categorizados como ldquosensiacuteveisrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistentesrdquo para determinados
antifuacutengicos se os pontos de cortes cliacutenicos apropriados estiverem sido estabelecidos Adicionalmente a
distribuiccedilatildeo das CIMs pode ser usada para determinar populaccedilotildees selvagens ou natildeo-selvagens quando pontos
de corte epidemioloacutegicos espeacutecie-especiacuteficos satildeo aplicados
Este documento tem o intuito de fornecer um meacutetodo adequado faacutecil raacutepido e econocircmico para o teste de
sensibilidade aos antifuacutengicos de leveduras e facilitar o grau de reprodutibilidade inter-laboratorial Como os
fatores teacutecnicos laboratoriais satildeo de grande relevacircncia esta padronizaccedilatildeo eacute focada nas condiccedilotildees do teste
incluindo preparaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo do inoacuteculo tempo de incubaccedilatildeo temperatura e formulaccedilatildeo do meio
TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
1 Antifuacutengico substacircncia de origem natural sinteacutetica ou semi-sinteacutetica que inibe o crescimento ou eacute letal para
o fungo Desinfetantes antisseacutepticos ou conservantes natildeo fazem parte desta definiccedilatildeo
2 Propriedades dos antifuacutengicos
a Potecircncia Fraccedilatildeo antimicrobiana ativa de uma substacircncia testada A potecircncia eacute expressa em miligramas por
grama (mgg) ou como conteuacutedo ativo em Unidades Internacionais (UI) por grama ou como uma fraccedilatildeo de
volume ou fraccedilatildeo de massa em percentual ou como uma quantidade da concentraccedilatildeo de uma substacircncia
(fraccedilatildeo de massa) em mol por litro dos ingredientes na substacircncia teste
b Concentraccedilatildeo Quantidade de um agente antimicrobiano em um volume definido do liacutequido A concentraccedilatildeo
eacute expressa em unidades do SI como miligramas por litro (mgL)
3 Soluccedilatildeo de estoque Soluccedilatildeo inicial usada para as diluiccedilotildees adicionais
4 Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima Miacutenima concentraccedilatildeo do antifuacutengico que inibe o crescimento da levedura
em determinado periacuteodo de tempo A CIM eacute expressa em mgL
5 Pontos de corte (breakpoints) Valores especiacuteficos de CIM nos quais os fungos podem ser classificados nas
categorias cliacutenicas ldquosensiacutevelrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistenterdquo Os valores dos pontos de
corte podem ser alterados com o surgimento de novas informaccedilotildees (ex mudanccedilas na dose de antifuacutengicos
comumente usados) ou quando surgir dadosconhecimentos adicionais
a) S - Sensiacutevel regime de dose padratildeo um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel regime de dose
padratildeordquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico usando o regime de dosagem padratildeo do
agente antimicrobiano
b) I ndash sensiacutevel exposiccedilatildeo aumentada um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo
aumentadardquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico somente quando satildeo utilizadas doses
mais altas do agente antimicrobiano que o normal ou quando o agente tem elevada concentraccedilatildeo no siacutetio da
infecccedilatildeo
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c) R - Resistente um microrganismo eacute categorizado como ldquoresistenterdquo quando existe uma alta probabilidade de
falha terapecircutica mesmo quando a exposiccedilatildeo ao antimicrobiano eacute aumentada
Exposiccedilatildeo eacute uma funccedilatildeo de como o modo de administraccedilatildeo dose intervalo entre as doses tempo de
infusatildeo bem como a distribuiccedilatildeo e a excreccedilatildeo do antimicrobiano influenciaraacute o microrganismo no siacutetio de
infecccedilatildeo
6 Selvagem (Wild Type WT) Uma levedura eacute denominada selvagem (WT) para uma espeacutecie pela ausecircncia de
resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel e mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de resistecircncia para o
agente em questatildeo
7 Natildeo Selvagem (Non-Wild Type NWT) Uma levedura eacute denominada natildeo selvagem (NWT) para uma espeacutecie
pela presenccedila de resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel ou mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de
resistecircncia para o agente em questatildeo
Notas
a) Um isolado de levedura eacute classificado como S I ou R ao se aplicar os pontos de corte cliacutenicos (clinical
breakpoints) em um teste fenotiacutepico definido
b) Um isolado de levedura eacute classificado como selvagem (WT) ou natildeo selvagem (NWT) ao se aplicar os pontos de
corte epidemioloacutegicos (ECOFFs) em um teste fenotiacutepico definido
c) Microrganismos natildeo selvagens (NWT) podem ter um ou mais mecanismos de resistecircncia mas dependendo
dos valores dos pontos de cortes cliacutenicos (clinical breakpoints) microrganismos selvagens (WT) e natildeo selvagens
(NWT) podem ou natildeo responder clinicamente ao tratamento com o agente especiacutefico
d) O microrganismo selvagem eacute apresentado como WT lez mgL e o natildeo selvagem como NWT gt z mgL (onde z eacute
o ponto de corte epidemioloacutegico ou ECOFF) O ECOFF eacute o maior valor de CIM para isolados sem mecanismos
de resistecircncia fenotipicamente detectaacuteveis
e) O valor de ECOFF natildeo seraacute alterado a natildeo ser que novos dados acumulativos de CIM indiquem a necessidade
de ajuste
8 Cepas de referecircncia para controle de qualidade Cepas catalogadas e caracterizadas com estaacuteveis e definidos
fenoacutetipos eou genoacutetipos de sensibilidade aos antifuacutengicos Satildeo obtidas de coleccedilotildees de culturas e usadas para
fins de controle de qualidade
9 Meacutetodo do teste de sensibilidade
a) Diluiccedilatildeo em caldo Teacutecnica em que diluiccedilotildees seriadas (usualmente 12) do antifuacutengico satildeo realizadas em
meio liacutequido que eacute inoculado com um nuacutemero padronizado de organismos e incubado por um tempo
determinado O objetivo deste meacutetodo eacute a determinaccedilatildeo de CIM
b) Microdiluiccedilatildeo Execuccedilatildeo da diluiccedilatildeo em caldo em placas de microdiluiccedilatildeo com uma capacidade de
aproximadamente 300 microL por poccedilo
10 Caldo Meio liacutequido usado para o crescimento in vitro do fungo
11 Inoacuteculo Nuacutemero de leveduras (unidades formadoras de colocircnias) suspendida em um certo volume O inoacuteculo
eacute expressado como unidades formadoras de colocircnia por mililitro (UFCmL)
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PROCEDIMENTO DO TESTE
Geral
O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo
devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio
Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem
valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na
ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes
fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores
de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto
melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho
de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados
Meio
RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma
concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de
concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do
ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70
eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute
apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o
dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver
ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue
1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada
2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos
3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio
4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL
5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m
6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses
7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para
re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia
Meio para teste de anfotericina B
Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico
Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a
detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e
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tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um
inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3
AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
Geral
Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes
puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis
Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste
de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data
de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos
a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo
fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento
de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente
antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute
Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do
antifuacutengico que seraacute utilizado
A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue
Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)
Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)
O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso
por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo
da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo
menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees
sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a
aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o
antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis
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de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
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4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
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Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
2
INTRODUCcedilAtildeO
Os testes de sensibilidade aos antifuacutengicos (TSA) satildeo indicados para fungos que causam infecccedilatildeo
especialmente quando a infecccedilatildeo eacute invasiva quando o tratamento eacute falho ou recidivante quando a resistecircncia
aos antifuacutengicos eacute possiacutevel ou quando a sensibilidade natildeo pode ser predita atraveacutes da identificaccedilatildeo da espeacutecie
O TSA eacute tambeacutem importante para a vigilacircncia de resistecircncia estudos epidemioloacutegicos e comparaccedilatildeo da
atividade in vitro dos antifuacutengicos novos e existentes
Meacutetodos de diluiccedilatildeo satildeo usados para estabelecer as concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas (CIMs) dos
antimicrobianos eles satildeo os meacutetodos de referecircncia para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos e satildeo
usados principalmente para estabelecer a atividade dos novos antifuacutengicos para confirmar a suscetibilidade
dos organismos que apresentam resultados conflitantes em outros testes de sensibilidade (como os testes
comerciais) e para determinar a suscetibilidade de organismos quando outros testes natildeo satildeo confiaacuteveis ou
natildeo foram validados Em meacutetodos de diluiccedilatildeo fungos satildeo avaliados pela sua habilidade em produzir
crescimento suficiente em poccedilos de placas de microdiluiccedilatildeo de meio de cultura liacutequido contendo diluiccedilotildees
seriadas dos agentes antifuacutengicos (microdiluiccedilatildeo em caldo)
A CIM do antifuacutengico eacute definida como a menor concentraccedilatildeo registrada em mgL do antifuacutengico que inibe o
crescimento do fungo em percentual preacute-definido (por exemplo 50 90 ou inibiccedilatildeo total) A CIM informa
sobre a sensibilidade ou a resistecircncia do organismo ao antifuacutengico a qual pode ajudar em decisotildees de
tratamento
A versatildeo atualizada (732) deste documento eacute direcionada para o teste de sensibilidade de leveduras de
importacircncia meacutedica (primariamente Candida e Cryptococcus) A primeira versatildeo deste documento foi
publicada em um documento provisoacuterio (71) em 2003 [1] e definitivo em 2008 [2] A segunda versatildeo do
documento continha informaccedilatildeo adicional a respeito dos solventes para caspofungina micafungina e
fluconazol tempo de estoque para placas contendo equinocandinas teste de sensibilidade para Cryptococcus
e os intervalos de CIM de anidulafungina para cepas de controle de qualidade [3] A terceira versatildeo foi
harmonizada em texto e formato com o documento definitivo para fungos filamentosos 932 e a definiccedilatildeo
revisada da categoria I foi introduzida e os intervalos de CIM para as cepas de controle de qualidade foram
removidos (e criado um documento separado resumindo todos os intervalos de CIM dos antifuacutengicos para as
cepas controle de qualidade - disponiacutevel no website httpwwwEUCASTorg) evitando a necessidade de
lanccedilamento de novos documentos com eventuais atualizaccedilotildees dos intervalos de CIM para as cepas controle
de qualidade A seccedilatildeo contendo a preparaccedilatildeo e calibraccedilatildeo do espectrofotocircmetro tambeacutem foi modificada no
presente documento
ESCOPO
Esta padronizaccedilatildeo EUCAST descreve um meacutetodo de teste de sensibilidade de leveduras para antifuacutengicos pela
determinaccedilatildeo da CIM As CIMs mostram a atividade in vitro de determinado antifuacutengico nas condiccedilotildees
3
descritas para o teste e podem ser usados para o manejo das infecccedilotildees em conjunto com outros fatores como
farmacocineacutetica farmacodinacircmica e mecanismos de resistecircncia Os valores de CIM permitem que os fungos
sejam categorizados como ldquosensiacuteveisrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistentesrdquo para determinados
antifuacutengicos se os pontos de cortes cliacutenicos apropriados estiverem sido estabelecidos Adicionalmente a
distribuiccedilatildeo das CIMs pode ser usada para determinar populaccedilotildees selvagens ou natildeo-selvagens quando pontos
de corte epidemioloacutegicos espeacutecie-especiacuteficos satildeo aplicados
Este documento tem o intuito de fornecer um meacutetodo adequado faacutecil raacutepido e econocircmico para o teste de
sensibilidade aos antifuacutengicos de leveduras e facilitar o grau de reprodutibilidade inter-laboratorial Como os
fatores teacutecnicos laboratoriais satildeo de grande relevacircncia esta padronizaccedilatildeo eacute focada nas condiccedilotildees do teste
incluindo preparaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo do inoacuteculo tempo de incubaccedilatildeo temperatura e formulaccedilatildeo do meio
TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
1 Antifuacutengico substacircncia de origem natural sinteacutetica ou semi-sinteacutetica que inibe o crescimento ou eacute letal para
o fungo Desinfetantes antisseacutepticos ou conservantes natildeo fazem parte desta definiccedilatildeo
2 Propriedades dos antifuacutengicos
a Potecircncia Fraccedilatildeo antimicrobiana ativa de uma substacircncia testada A potecircncia eacute expressa em miligramas por
grama (mgg) ou como conteuacutedo ativo em Unidades Internacionais (UI) por grama ou como uma fraccedilatildeo de
volume ou fraccedilatildeo de massa em percentual ou como uma quantidade da concentraccedilatildeo de uma substacircncia
(fraccedilatildeo de massa) em mol por litro dos ingredientes na substacircncia teste
b Concentraccedilatildeo Quantidade de um agente antimicrobiano em um volume definido do liacutequido A concentraccedilatildeo
eacute expressa em unidades do SI como miligramas por litro (mgL)
3 Soluccedilatildeo de estoque Soluccedilatildeo inicial usada para as diluiccedilotildees adicionais
4 Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima Miacutenima concentraccedilatildeo do antifuacutengico que inibe o crescimento da levedura
em determinado periacuteodo de tempo A CIM eacute expressa em mgL
5 Pontos de corte (breakpoints) Valores especiacuteficos de CIM nos quais os fungos podem ser classificados nas
categorias cliacutenicas ldquosensiacutevelrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistenterdquo Os valores dos pontos de
corte podem ser alterados com o surgimento de novas informaccedilotildees (ex mudanccedilas na dose de antifuacutengicos
comumente usados) ou quando surgir dadosconhecimentos adicionais
a) S - Sensiacutevel regime de dose padratildeo um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel regime de dose
padratildeordquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico usando o regime de dosagem padratildeo do
agente antimicrobiano
b) I ndash sensiacutevel exposiccedilatildeo aumentada um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo
aumentadardquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico somente quando satildeo utilizadas doses
mais altas do agente antimicrobiano que o normal ou quando o agente tem elevada concentraccedilatildeo no siacutetio da
infecccedilatildeo
4
c) R - Resistente um microrganismo eacute categorizado como ldquoresistenterdquo quando existe uma alta probabilidade de
falha terapecircutica mesmo quando a exposiccedilatildeo ao antimicrobiano eacute aumentada
Exposiccedilatildeo eacute uma funccedilatildeo de como o modo de administraccedilatildeo dose intervalo entre as doses tempo de
infusatildeo bem como a distribuiccedilatildeo e a excreccedilatildeo do antimicrobiano influenciaraacute o microrganismo no siacutetio de
infecccedilatildeo
6 Selvagem (Wild Type WT) Uma levedura eacute denominada selvagem (WT) para uma espeacutecie pela ausecircncia de
resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel e mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de resistecircncia para o
agente em questatildeo
7 Natildeo Selvagem (Non-Wild Type NWT) Uma levedura eacute denominada natildeo selvagem (NWT) para uma espeacutecie
pela presenccedila de resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel ou mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de
resistecircncia para o agente em questatildeo
Notas
a) Um isolado de levedura eacute classificado como S I ou R ao se aplicar os pontos de corte cliacutenicos (clinical
breakpoints) em um teste fenotiacutepico definido
b) Um isolado de levedura eacute classificado como selvagem (WT) ou natildeo selvagem (NWT) ao se aplicar os pontos de
corte epidemioloacutegicos (ECOFFs) em um teste fenotiacutepico definido
c) Microrganismos natildeo selvagens (NWT) podem ter um ou mais mecanismos de resistecircncia mas dependendo
dos valores dos pontos de cortes cliacutenicos (clinical breakpoints) microrganismos selvagens (WT) e natildeo selvagens
(NWT) podem ou natildeo responder clinicamente ao tratamento com o agente especiacutefico
d) O microrganismo selvagem eacute apresentado como WT lez mgL e o natildeo selvagem como NWT gt z mgL (onde z eacute
o ponto de corte epidemioloacutegico ou ECOFF) O ECOFF eacute o maior valor de CIM para isolados sem mecanismos
de resistecircncia fenotipicamente detectaacuteveis
e) O valor de ECOFF natildeo seraacute alterado a natildeo ser que novos dados acumulativos de CIM indiquem a necessidade
de ajuste
8 Cepas de referecircncia para controle de qualidade Cepas catalogadas e caracterizadas com estaacuteveis e definidos
fenoacutetipos eou genoacutetipos de sensibilidade aos antifuacutengicos Satildeo obtidas de coleccedilotildees de culturas e usadas para
fins de controle de qualidade
9 Meacutetodo do teste de sensibilidade
a) Diluiccedilatildeo em caldo Teacutecnica em que diluiccedilotildees seriadas (usualmente 12) do antifuacutengico satildeo realizadas em
meio liacutequido que eacute inoculado com um nuacutemero padronizado de organismos e incubado por um tempo
determinado O objetivo deste meacutetodo eacute a determinaccedilatildeo de CIM
b) Microdiluiccedilatildeo Execuccedilatildeo da diluiccedilatildeo em caldo em placas de microdiluiccedilatildeo com uma capacidade de
aproximadamente 300 microL por poccedilo
10 Caldo Meio liacutequido usado para o crescimento in vitro do fungo
11 Inoacuteculo Nuacutemero de leveduras (unidades formadoras de colocircnias) suspendida em um certo volume O inoacuteculo
eacute expressado como unidades formadoras de colocircnia por mililitro (UFCmL)
5
PROCEDIMENTO DO TESTE
Geral
O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo
devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio
Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem
valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na
ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes
fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores
de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto
melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho
de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados
Meio
RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma
concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de
concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do
ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70
eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute
apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o
dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver
ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue
1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada
2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos
3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio
4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL
5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m
6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses
7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para
re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia
Meio para teste de anfotericina B
Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico
Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a
detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e
6
tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um
inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3
AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
Geral
Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes
puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis
Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste
de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data
de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos
a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo
fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento
de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente
antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute
Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do
antifuacutengico que seraacute utilizado
A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue
Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)
Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)
O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso
por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo
da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo
menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees
sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a
aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o
antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis
7
de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
3
descritas para o teste e podem ser usados para o manejo das infecccedilotildees em conjunto com outros fatores como
farmacocineacutetica farmacodinacircmica e mecanismos de resistecircncia Os valores de CIM permitem que os fungos
sejam categorizados como ldquosensiacuteveisrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistentesrdquo para determinados
antifuacutengicos se os pontos de cortes cliacutenicos apropriados estiverem sido estabelecidos Adicionalmente a
distribuiccedilatildeo das CIMs pode ser usada para determinar populaccedilotildees selvagens ou natildeo-selvagens quando pontos
de corte epidemioloacutegicos espeacutecie-especiacuteficos satildeo aplicados
Este documento tem o intuito de fornecer um meacutetodo adequado faacutecil raacutepido e econocircmico para o teste de
sensibilidade aos antifuacutengicos de leveduras e facilitar o grau de reprodutibilidade inter-laboratorial Como os
fatores teacutecnicos laboratoriais satildeo de grande relevacircncia esta padronizaccedilatildeo eacute focada nas condiccedilotildees do teste
incluindo preparaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo do inoacuteculo tempo de incubaccedilatildeo temperatura e formulaccedilatildeo do meio
TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
1 Antifuacutengico substacircncia de origem natural sinteacutetica ou semi-sinteacutetica que inibe o crescimento ou eacute letal para
o fungo Desinfetantes antisseacutepticos ou conservantes natildeo fazem parte desta definiccedilatildeo
2 Propriedades dos antifuacutengicos
a Potecircncia Fraccedilatildeo antimicrobiana ativa de uma substacircncia testada A potecircncia eacute expressa em miligramas por
grama (mgg) ou como conteuacutedo ativo em Unidades Internacionais (UI) por grama ou como uma fraccedilatildeo de
volume ou fraccedilatildeo de massa em percentual ou como uma quantidade da concentraccedilatildeo de uma substacircncia
(fraccedilatildeo de massa) em mol por litro dos ingredientes na substacircncia teste
b Concentraccedilatildeo Quantidade de um agente antimicrobiano em um volume definido do liacutequido A concentraccedilatildeo
eacute expressa em unidades do SI como miligramas por litro (mgL)
3 Soluccedilatildeo de estoque Soluccedilatildeo inicial usada para as diluiccedilotildees adicionais
4 Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima Miacutenima concentraccedilatildeo do antifuacutengico que inibe o crescimento da levedura
em determinado periacuteodo de tempo A CIM eacute expressa em mgL
5 Pontos de corte (breakpoints) Valores especiacuteficos de CIM nos quais os fungos podem ser classificados nas
categorias cliacutenicas ldquosensiacutevelrdquo ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo aumentadardquo ou ldquoresistenterdquo Os valores dos pontos de
corte podem ser alterados com o surgimento de novas informaccedilotildees (ex mudanccedilas na dose de antifuacutengicos
comumente usados) ou quando surgir dadosconhecimentos adicionais
a) S - Sensiacutevel regime de dose padratildeo um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel regime de dose
padratildeordquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico usando o regime de dosagem padratildeo do
agente antimicrobiano
b) I ndash sensiacutevel exposiccedilatildeo aumentada um microrganismo eacute categorizado como ldquosensiacutevel exposiccedilatildeo
aumentadardquo quando existe alta probabilidade de sucesso terapecircutico somente quando satildeo utilizadas doses
mais altas do agente antimicrobiano que o normal ou quando o agente tem elevada concentraccedilatildeo no siacutetio da
infecccedilatildeo
4
c) R - Resistente um microrganismo eacute categorizado como ldquoresistenterdquo quando existe uma alta probabilidade de
falha terapecircutica mesmo quando a exposiccedilatildeo ao antimicrobiano eacute aumentada
Exposiccedilatildeo eacute uma funccedilatildeo de como o modo de administraccedilatildeo dose intervalo entre as doses tempo de
infusatildeo bem como a distribuiccedilatildeo e a excreccedilatildeo do antimicrobiano influenciaraacute o microrganismo no siacutetio de
infecccedilatildeo
6 Selvagem (Wild Type WT) Uma levedura eacute denominada selvagem (WT) para uma espeacutecie pela ausecircncia de
resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel e mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de resistecircncia para o
agente em questatildeo
7 Natildeo Selvagem (Non-Wild Type NWT) Uma levedura eacute denominada natildeo selvagem (NWT) para uma espeacutecie
pela presenccedila de resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel ou mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de
resistecircncia para o agente em questatildeo
Notas
a) Um isolado de levedura eacute classificado como S I ou R ao se aplicar os pontos de corte cliacutenicos (clinical
breakpoints) em um teste fenotiacutepico definido
b) Um isolado de levedura eacute classificado como selvagem (WT) ou natildeo selvagem (NWT) ao se aplicar os pontos de
corte epidemioloacutegicos (ECOFFs) em um teste fenotiacutepico definido
c) Microrganismos natildeo selvagens (NWT) podem ter um ou mais mecanismos de resistecircncia mas dependendo
dos valores dos pontos de cortes cliacutenicos (clinical breakpoints) microrganismos selvagens (WT) e natildeo selvagens
(NWT) podem ou natildeo responder clinicamente ao tratamento com o agente especiacutefico
d) O microrganismo selvagem eacute apresentado como WT lez mgL e o natildeo selvagem como NWT gt z mgL (onde z eacute
o ponto de corte epidemioloacutegico ou ECOFF) O ECOFF eacute o maior valor de CIM para isolados sem mecanismos
de resistecircncia fenotipicamente detectaacuteveis
e) O valor de ECOFF natildeo seraacute alterado a natildeo ser que novos dados acumulativos de CIM indiquem a necessidade
de ajuste
8 Cepas de referecircncia para controle de qualidade Cepas catalogadas e caracterizadas com estaacuteveis e definidos
fenoacutetipos eou genoacutetipos de sensibilidade aos antifuacutengicos Satildeo obtidas de coleccedilotildees de culturas e usadas para
fins de controle de qualidade
9 Meacutetodo do teste de sensibilidade
a) Diluiccedilatildeo em caldo Teacutecnica em que diluiccedilotildees seriadas (usualmente 12) do antifuacutengico satildeo realizadas em
meio liacutequido que eacute inoculado com um nuacutemero padronizado de organismos e incubado por um tempo
determinado O objetivo deste meacutetodo eacute a determinaccedilatildeo de CIM
b) Microdiluiccedilatildeo Execuccedilatildeo da diluiccedilatildeo em caldo em placas de microdiluiccedilatildeo com uma capacidade de
aproximadamente 300 microL por poccedilo
10 Caldo Meio liacutequido usado para o crescimento in vitro do fungo
11 Inoacuteculo Nuacutemero de leveduras (unidades formadoras de colocircnias) suspendida em um certo volume O inoacuteculo
eacute expressado como unidades formadoras de colocircnia por mililitro (UFCmL)
5
PROCEDIMENTO DO TESTE
Geral
O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo
devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio
Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem
valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na
ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes
fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores
de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto
melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho
de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados
Meio
RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma
concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de
concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do
ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70
eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute
apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o
dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver
ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue
1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada
2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos
3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio
4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL
5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m
6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses
7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para
re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia
Meio para teste de anfotericina B
Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico
Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a
detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e
6
tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um
inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3
AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
Geral
Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes
puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis
Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste
de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data
de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos
a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo
fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento
de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente
antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute
Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do
antifuacutengico que seraacute utilizado
A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue
Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)
Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)
O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso
por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo
da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo
menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees
sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a
aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o
antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis
7
de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
4
c) R - Resistente um microrganismo eacute categorizado como ldquoresistenterdquo quando existe uma alta probabilidade de
falha terapecircutica mesmo quando a exposiccedilatildeo ao antimicrobiano eacute aumentada
Exposiccedilatildeo eacute uma funccedilatildeo de como o modo de administraccedilatildeo dose intervalo entre as doses tempo de
infusatildeo bem como a distribuiccedilatildeo e a excreccedilatildeo do antimicrobiano influenciaraacute o microrganismo no siacutetio de
infecccedilatildeo
6 Selvagem (Wild Type WT) Uma levedura eacute denominada selvagem (WT) para uma espeacutecie pela ausecircncia de
resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel e mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de resistecircncia para o
agente em questatildeo
7 Natildeo Selvagem (Non-Wild Type NWT) Uma levedura eacute denominada natildeo selvagem (NWT) para uma espeacutecie
pela presenccedila de resistecircncia fenotiacutepica adquirida detectaacutevel ou mutaccedilotildees relacionadas a mecanismos de
resistecircncia para o agente em questatildeo
Notas
a) Um isolado de levedura eacute classificado como S I ou R ao se aplicar os pontos de corte cliacutenicos (clinical
breakpoints) em um teste fenotiacutepico definido
b) Um isolado de levedura eacute classificado como selvagem (WT) ou natildeo selvagem (NWT) ao se aplicar os pontos de
corte epidemioloacutegicos (ECOFFs) em um teste fenotiacutepico definido
c) Microrganismos natildeo selvagens (NWT) podem ter um ou mais mecanismos de resistecircncia mas dependendo
dos valores dos pontos de cortes cliacutenicos (clinical breakpoints) microrganismos selvagens (WT) e natildeo selvagens
(NWT) podem ou natildeo responder clinicamente ao tratamento com o agente especiacutefico
d) O microrganismo selvagem eacute apresentado como WT lez mgL e o natildeo selvagem como NWT gt z mgL (onde z eacute
o ponto de corte epidemioloacutegico ou ECOFF) O ECOFF eacute o maior valor de CIM para isolados sem mecanismos
de resistecircncia fenotipicamente detectaacuteveis
e) O valor de ECOFF natildeo seraacute alterado a natildeo ser que novos dados acumulativos de CIM indiquem a necessidade
de ajuste
8 Cepas de referecircncia para controle de qualidade Cepas catalogadas e caracterizadas com estaacuteveis e definidos
fenoacutetipos eou genoacutetipos de sensibilidade aos antifuacutengicos Satildeo obtidas de coleccedilotildees de culturas e usadas para
fins de controle de qualidade
9 Meacutetodo do teste de sensibilidade
a) Diluiccedilatildeo em caldo Teacutecnica em que diluiccedilotildees seriadas (usualmente 12) do antifuacutengico satildeo realizadas em
meio liacutequido que eacute inoculado com um nuacutemero padronizado de organismos e incubado por um tempo
determinado O objetivo deste meacutetodo eacute a determinaccedilatildeo de CIM
b) Microdiluiccedilatildeo Execuccedilatildeo da diluiccedilatildeo em caldo em placas de microdiluiccedilatildeo com uma capacidade de
aproximadamente 300 microL por poccedilo
10 Caldo Meio liacutequido usado para o crescimento in vitro do fungo
11 Inoacuteculo Nuacutemero de leveduras (unidades formadoras de colocircnias) suspendida em um certo volume O inoacuteculo
eacute expressado como unidades formadoras de colocircnia por mililitro (UFCmL)
5
PROCEDIMENTO DO TESTE
Geral
O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo
devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio
Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem
valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na
ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes
fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores
de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto
melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho
de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados
Meio
RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma
concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de
concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do
ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70
eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute
apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o
dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver
ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue
1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada
2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos
3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio
4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL
5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m
6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses
7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para
re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia
Meio para teste de anfotericina B
Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico
Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a
detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e
6
tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um
inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3
AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
Geral
Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes
puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis
Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste
de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data
de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos
a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo
fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento
de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente
antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute
Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do
antifuacutengico que seraacute utilizado
A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue
Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)
Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)
O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso
por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo
da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo
menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees
sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a
aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o
antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis
7
de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
5
PROCEDIMENTO DO TESTE
Geral
O teste eacute realizado em uma placa de microdiluiccedilatildeo de fundo chato Tampas de vedaccedilatildeo de evaporaccedilatildeo natildeo
devem ser utilizadas pois afetam a concentraccedilatildeo de oxigecircnio
Dados preliminares sugerem que placas de microdiluiccedilatildeo tratadas versus natildeo tratadas para tecido produzem
valores de CIMs diferentes (dados natildeo publicados) Aleacutem disso diferentes plaacutesticos parecem ter impacto na
ligaccedilatildeo da droga o que pode afetar os valores de CIM Estudos futuros satildeo necessaacuterios para avaliar estes
fatores Para a maioria das distribuiccedilotildees de CIM obtidas pelo comitecirc do EUCAST para determinaccedilatildeo de valores
de ECOFF e pontos de corte foram utilizadas placas de microdiluiccedilatildeo tratadas para tecidos e satildeo portanto
melhores para produzir valores de CIM similares O meacutetodo eacute baseado na preparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalho
de agentes antifuacutengicos em volumes de 100 L por poccedilo aos quais inoacuteculos de 100 L satildeo adicionados
Meio
RPMI 1640 (com L-glutamina e indicador de pH sem bicarbonato) suplementado com glicose para uma
concentraccedilatildeo final de 2 (RPMI 2 G) eacute recomendado [4] A utilizaccedilatildeo de 2 ao inveacutes do padratildeo de 02 de
concentraccedilatildeo de glicose tem mostrado resultados com melhor crescimento e facilidade na determinaccedilatildeo do
ponto final [5] Aacutecido 3-(N-morfolino) propanosulfocircnico (MOPS) em concentraccedilatildeo final de 0165 molL pH 70
eacute o tampatildeo recomendado para ser usado para o meio RPMI 1640 A composiccedilatildeo do RPMI 1640 estaacute
apresentada na Tabela 1 O meio recomendado RPMI com 2 de glicose (RPMI 2 G) eacute preparado com o
dobro da concentraccedilatildeo (para permitir diluiccedilatildeo de 50 [11] uma vez que o inoacuteculo eacute adicionado ver
ldquoPreparaccedilatildeo de soluccedilotildees de trabalhordquo em diante) como segue
1 Adicione os componentes conforme a Tabela 2 a 900 mL de aacutegua destilada
2 Agitar ateacute que os componentes estejam completamente dissolvidos
3 Com agitaccedilatildeo ajuste o pH para 70 a 25C com 1 M de hidroacutexido de soacutedio
4 Adicione aacutegua para um volume final de 1000 mL
5 Esterilizar por filtraccedilatildeo utilizando filtro com poros de 022 m
6 Armazenar a temperatura de 4C ou menor por ateacute 6 meses
7 Para controle de qualidade use uma aliacutequota do meio esterilizado para verificar a esterilidade para
re-testar o pH (69 ndash 71 eacute aceitaacutevel) e para controle de crescimento com uma cepa referecircncia
Meio para teste de anfotericina B
Atualmente eacute recomendado que o RPMI 2 G seja usado tambeacutem para anfotericina B O caldo natildeo-sinteacutetico
Antibiotic Medium 3 (AM3) suplementado com concentraccedilatildeo final de glicose a 2 tem sido utilizado para a
detecccedilatildeo de resistecircncia a anfotericina B [6-9] Entretanto existe variaccedilotildees de lote para lote deste meio e
6
tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um
inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3
AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
Geral
Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes
puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis
Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste
de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data
de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos
a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo
fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento
de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente
antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute
Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do
antifuacutengico que seraacute utilizado
A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue
Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)
Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)
O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso
por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo
da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo
menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees
sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a
aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o
antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis
7
de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
6
tambeacutem no desempenho do meio de diferentes fabricantes Resultados preliminares tambeacutem indicam que um
inoacuteculo de 05 ndash 25 x 105 UFCmL eacute muito alto para testar anfotericina B em AM3
AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
Geral
Todas as soluccedilotildees de antifuacutengicos devem ser preparadas de acordo com as Boas Praacuteticas de Fabricaccedilatildeo Poacutes
puros de antifuacutengicos devem ser adquiridos diretamente de fabricantes ou de fontes comerciais confiaacuteveis
Preparaccedilotildees cliacutenicas natildeo devem ser utilizadas porque podem conter excipientes que podem interferir no teste
de sensibilidade Os poacutes devem ser fornecidos com o nome geneacuterico da droga nuacutemero de lote potecircncia data
de vencimento e condiccedilotildees recomendadas de armazenamento Armazenar os poacutes em recipientes hermeacuteticos
a -20C ou temperatura mais baixa com dessecante exceto quando recomendado de outra forma pelo
fabricante Idealmente agentes higroscoacutepicos devem ser dispensados em aliacutequotas antes do congelamento
de forma que seja usado uma para cada ocasiatildeo Os recipientes devem ser deixados a temperatura ambiente
antes de serem abertos para evitar condensaccedilatildeo de aacutegua sobre o poacute
Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
Soluccedilotildees dos antifuacutengicos devem ser preparadas levando-se em consideraccedilatildeo a potecircncia do lote do poacute do
antifuacutengico que seraacute utilizado
A quantidade do poacute ou diluente necessaacuterios para preparar a soluccedilatildeo padratildeo deve ser calculada como segue
Volume (L) x Concentraccedilatildeo (mgL) Peso (g) = ______________________________ Potecircncia (mgg)
Peso (g) x Potecircncia (mgg) Volume (L) = _____________________________ Concentraccedilatildeo (mgL)
O poacute do antifuacutengico deve ser pesado em balanccedila analiacutetica que tenha sido calibrada com referecircncias de peso
por uma organizaccedilatildeo certificada em metrologia A porccedilatildeo do poacute do antifuacutengico pesado deve exceder a precisatildeo
da balanccedila em pelo menos 10-100 vezes Prepare a soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico em concentraccedilotildees pelo
menos 200 vezes maiores que a maior concentraccedilatildeo a ser testada na placa de microdiluiccedilatildeo Informaccedilotildees
sobre a solubilidade dos antifuacutengicos devem ser fornecidas pelos fornecedores Solventes que natildeo sejam a
aacutegua satildeo necessaacuterios para dissolver a maioria dos antifuacutengicos (Tabela 3) Eacute essencial certificar-se que o
antifuacutengico esteja completamente dissolvido antes do congelamento Diversos antifuacutengicos podem ser difiacuteceis
7
de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
7
de dissolver resultando em CIMs artificialmente elevados Colocar o tubo da soluccedilatildeo estoque em um agitador
por uma hora ou mais antes de continuar o procedimento pode resolver este problema Esterilizaccedilatildeo das
soluccedilotildees estoque eacute normalmente desnecessaacuteria Entretanto se esterilizaccedilatildeo for necessaacuteria o procedimento
deve ser validado por meios apropriados (por exemplo amostras antes e apoacutes filtraccedilatildeo devem ser testadas)
para certificar que o antifuacutengico natildeo tenha sido adsorvido (por exemplo em um filtro esteacuteril) ou degradada
durante o processo
A menos que outra maneira seja indicada pelo fabricante do antifuacutengico armazene as soluccedilotildees em pequenos
volumes em frascos de polipropileno ou polietileno a -70C ou abaixo Os antifuacutengicos podem ser armazenados
a -70C por pelo menos 6 meses sem perda significativa de atividade [10 11] As equinocandinas foram
previamente consideradas como instaacuteveis a -70C entretanto elas se mantiveram estaacuteveis por pelo menos 6
meses a esta temperatura [11]
Remova os frascos do freezer -70C e use no mesmo dia que forem descongelados Deterioraccedilatildeo significativa
do antifuacutengico iraacute refletir nos resultados dos testes de sensibilidade das cepas de controle de qualidade
(disponiacutevel no website do EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se necessaacuterio o antifuacutengico pode ser testado
para determinar a potecircncia
Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
A variaccedilatildeo das concentraccedilotildees testadas iraacute depender do organismo e do antifuacutengico a serem testados A
variaccedilatildeo das concentraccedilotildees deve incluir o ponto de corte se este existir bem como os resultados esperados
para as cepas de controle de qualidade As variaccedilotildees das concentraccedilotildees dos antifuacutengicos recomendadas estatildeo
na Tabela 3 Seacuteries de diluiccedilotildees de 2 vezes baseadas em 1 mgL satildeo preparadas em RPMI 2 G 2x concentrado
O meio RPMI 2 G usado nas placas eacute preparado com o dobro da concentraccedilatildeo final para permitir uma diluiccedilatildeo
de 50 uma vez que o inoacuteculo seraacute adicionado Esta abordagem permite que o inoacuteculo seja preparado em
aacutegua destilada
As diluiccedilotildees devem ser preparadas de acordo com o ISO de recomendaccedilotildees [12] Por exemplo uma alternativa
que utiliza volumes menores para a preparaccedilatildeo de seacuteries com concentraccedilotildees finais de 0125-64 mgL eacute
mostrado na Tabela 4 (veja a Tabela 3 para verificar os solventes necessaacuterios para cada antifuacutengico) Um
resumo dos passos necessaacuterios para preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho (2 x concentraccedilatildeo final) estaacute descrito
a seguir
1 Tire um tubo da soluccedilatildeo estoque do antifuacutengico do freezer -70C Vaacuterios antifuacutengicos podem ser
difiacuteceis de dissolver resultando em CIMs elevadas e artificiais
2 Dispense volumes apropriados do solvente (consulte a Tabela 3 para os tipos de solventes e Tabela
4 para o volume dos solventes) em outros 9 tubos
3 Siga os passos descritos na tabela 4 para processar as seacuteries de diluiccedilotildees a 200 vezes a concentraccedilatildeo
final Esquemas de diluiccedilotildees com concentraccedilotildees de 3200 mgL ou 1600 mgL no passo 1 da Tabela 4 satildeo
necessaacuterios para as seacuteries de diluiccedilotildees de 003-16 mgL e 0015-8 mgL respectivamente
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
8
4 Dispense 99 mL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo em 10 tubos
5 Retire 100 microL de cada tubo com 200 x a concentraccedilatildeo final da droga antifuacutengica em solvente e
transfira para 10 tubos com 99 mL do meio de cultura (diluiccedilatildeo 1100) A concentraccedilatildeo do solvente nos tubos
com o meio de cultura eacute 1 e a concentraccedilatildeo dos agentes antifuacutengicos eacute 2 x a concentraccedilatildeo final
Esquemas de diluiccedilatildeo alternativos podem ser usados se eles mostrarem uma performance tatildeo boa quanto ao
meacutetodo de referecircncia [13]
Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
Usar plaacutesticos esteacutereis (evitando os plaacutesticos de alta ligaccedilatildeo) descartaacuteveis placas de microdiluiccedilatildeo com 96
poccedilos com poccedilos de fundo chato sem tampas de baixa evaporaccedilatildeo com capacidade de aproximadamente
300 microL por poccedilo
Nos poccedilos de 1 a 10 de cada coluna da placa de microdiluiccedilatildeo dispense 100 microL de cada tubo contendo a
concentraccedilatildeo correspondente (2 x a concentraccedilatildeo final) do agente antifuacutengico Por exemplo para itraconazol
dispense na coluna 1 o meio contendo 16 mgL na coluna 2 meio contendo 8 mgL e assim por diante ateacute a
coluna 10 para o meio contendo 003 mgL
Para cada poccedilo das colunas 11 e 12 dispense 100 microL do meio RPMI 2 G com o dobro da concentraccedilatildeo
Sendo assim cada coluna de 1 a 10 conteraacute 100 microL de 2x a concentraccedilatildeo final do antifuacutengico em meio RPMI
2 G com o dobro da concentraccedilatildeo e com 1 do solvente As colunas 11 e 12 conteratildeo o dobro da
concentraccedilatildeo do meio RPMI 2 G
Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
As placas podem ser seladas com filme plaacutestico ou folha de alumiacutenio e estocadas a -70ordmC ou abaixo por ateacute 6
meses ou a -20ordmC por no maacuteximo 1 mecircs sem perda da potecircncia do antifuacutengico [11] As equinocandinas satildeo
menos estaacuteveis portanto devem ser preparadas e estocadas a -70ordmC (e natildeo a -20ordmC) (dados natildeo publicados M
Cuenca-Estrella)
Uma vez que as placas forem descongeladas natildeo devem ser recongeladas As placas devem ser usadas
imediatamente quando forem retiradas do freezer particularmente CIMs de anidulafungina podem aumentar
se as placas forem deixadas a temperatura ambiente depois de descongeladas muito antes da inoculaccedilatildeo
PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
A padronizaccedilatildeo do inoacuteculo eacute essencial para a acuraacutecia e reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos
antifuacutengicos
O inoacuteculo deve ser preparado ressuspendendo 5 colocircnias representativas obtidas de cultura de 18-24 h em
meio aacutegar nutritivo em aacutegua destilada A concentraccedilatildeo final deve ficar entre 05 x 105 e 25 x 105 CFUmL
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
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Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
9
Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
1 Cultive todas as leveduras em ar ambiente entre 34 e 37ordmC em meio aacutegar nutritivo natildeo seletivo (aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose) por 18-48 h antes do teste
2 Prepare o inoacuteculo ressuspendendo 5 colocircnias distintas ge 1 mm de diacircmetro de uma cultura de 24 h
em pelo menos 3mL de aacutegua destilada
3 A suspensatildeo eacute homogeneizada por 15 segundos em agitador giratoacuterio a aproximadamente 2000
rpm Ajuste a densidade celular para a densidade da escala 05 McFarland (Tabela 5) medindo a absorbacircncia
em espectrofotocircmetro em comprimento de onda de 530 nm e adicione aacutegua destilada necessaacuteria Isto daraacute
um suspenccedilatildeo de leveduras de 1-5 x 106 CFUmL Prepare uma suspenccedilatildeo de trabalho para uma diluiccedilatildeo de 1
para 10 da suspensatildeo padratildeo de 1-5 x 106 CFUmL A densidade celular tambeacutem pode ser ajustada em um
turbidiacutemetro com autocalibraccedilatildeo ajustada assegurando um inoacuteculo com a densidade da escala 05 McFarland
Cryptococcus spp
Cryptococcus spp satildeo leveduras natildeo fermentadoras A falta de fermentaccedilatildeo compromete o crescimento nas
placas de microdiluiccedilatildeo quando realizado de acordo com os protocolos sugeridos pelo CLSI e EUCAST
Um estudo recente explorou as variaccedilotildees dos protocolos dos testes de sensibilidade do EUCAST em
comparaccedilatildeo com o protocolo padratildeo para Candida [14] As modificaccedilotildees incluiacuteram 1) meio de crescimento
(meio RPMI versus base nitrogenada de levedura (YNB)) 2) concentraccedilatildeo de glicose (02 versus 2) 3) fonte
de nitrogecircnio (sulfato de amocircnio) 4) temperatura (30 ordmC versus 35 ordmC) 5) agitaccedilatildeo 6) tamanho do inoacuteculo
(103 104 e 105 ceacutelulas) Taxa de crescimento e CIM foram analisados e comparados Embora o uso do meio
YNB reduccedilatildeo da temperatura de incubaccedilatildeo para 30 ordmC e agitaccedilatildeo das placas durante a incubaccedilatildeo aumentaram
a taxa de crescimento natildeo houve nenhuma diferenccedila significativa entre os valores de CIM obtidos com os
diferentes meacutetodos A diferenccedila entre os valores de CIM natildeo foi mais que duas diluiccedilotildees 12 Por isso eacute
recomendado por enquanto que a metodologia EUCAST seja adotada para o testes de sensibilidade para
espeacutecies de Cryptococcus Consequentemente eacute recomendado o uso do meio RMPI 2G como meio de
crescimento inoacuteculo final de 05-25 x 105 UFCmL incubaccedilatildeo sem agitaccedilatildeo e leituras das placas quando o
valor de DO exceda 02 Nos casos em que o crescimento eacute insuficiente eacute sugerido que o teste seja repetido
mas com temperatura de incubaccedilatildeo de 30 ordmC
INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
As placas de microdiluiccedilatildeo devem ser inoculadas dentro de 30 min da preparaccedilatildeo da suspensatildeo do inoacuteculo a
fim de manter a concentraccedilatildeo de ceacutelulas viaacuteveis
Agitar a suspensatildeo do inoacuteculo e inocular em cada poccedilo da placa de microdiluiccedilatildeo com 100 L da suspensatildeo de
leveduras 1-5 x 105 UFCmL padronizadas em aacutegua destilada esteacuteril sem tocar no conteuacutedo do poccedilo Este
procedimento daraacute a concentraccedilatildeo do antifuacutengico e a densidade do inoacuteculo requeridos (inoacuteculo final = 05-25
x 105 UFCmL) Tambeacutem inocular nos poccedilos do controle de crescimento (coluna 11) contendo 100 L de meio
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
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Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
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- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
10
esteacuteril livre de antifuacutengico com 100 L da mesma suspensatildeo do inoacuteculo Preencher a coluna 12 da placa de
microdiluiccedilatildeo com 100 L da aacutegua esteacuteril do lote usado para o preparo do inoacuteculo como controle de
esterilidade para o meio e aacutegua destilada (somente meio livre de antifuacutengico) Teste os organismos de controle
de qualidade pelo mesmo meacutetodo cada vez que um isolado for testado
Contagem de viabilidade deve ser realizada para controle de qualidade para confirmar que os poccedilos testes
conteacutem entre 1 ndash 5 x 105 UFCmL do seguinte modo Uma suspensatildeo eacute homogeneizada com um agitador
giratoacuterio a 2000 rpm Em seguida 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar (como aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar cromogecircnico) e a placa incubada por 24-48 h ou ateacute que as colocircnias possam ser
verificadas quanto agrave pureza Uma outra diluiccedilatildeo de 50 μL da suspensatildeo em 495 mL de aacutegua destilada esteacuteril
homogeneizado e 10 L da suspensatildeo deve ser cultivada na superfiacutecie do aacutegar para proporcionar uma
contagem opcionaladicional ndash dez a cinquenta colocircnias seria esperado Eacute recomendado que seja realizado o
procedimento completo para todos os isolados quando o laboratoacuterio estiver padronizando o teste quando o
teste eacute raramenteperiodicamente realizado ou quando os resultados forem incoerentes (a ser definido
localmente dependendo da necessidade)
INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
Incubar as placas de microdiluiccedilatildeo sem agitaccedilatildeo a 35 plusmn 2 C por 24 plusmn 2 h em ar atmosfeacuterico Uma absorbacircncia
le 02 indica um pobre crescimento e eacute comumente visto entre os isolados de Candida parapsilosis e Candida
guilliermondii Tais placas devem ser reincubadas por mais 12-24 h e depois realizar a leitura novamente Se
absorbacircncia permanecer le 02 apoacutes 48 h este resultado indica falha no teste Como descrito acima uma
absorbacircncia le 02 apoacutes 48 h para Cryptococcus spp o teste deveraacute ser repetido com incubaccedilatildeo a 30 C
RESULTADOS DA LEITURA
As placas de microdiluiccedilatildeo deveratildeo ser lidas em um leitor de placas de microdiluiccedilatildeo O comprimento de onda
recomendado para determinar a absorbacircncia da placa eacute de 530 nm embora outros possam ser utilizados por
exemplo 405 nm ou 450 nm A valor do branco da amostra deveraacute ser subtraiacutedo das leituras dos outros poccedilos
Anfotericina B
A CIM da anfotericina B eacute a menor concentraccedilatildeo que leva a inibiccedilatildeo 90 de crescimento quando comparado
com controle de crescimento livre de antifuacutengico
Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
A CIM de flucitosina (5-flucitosina) agentes azoacutelicos e equinocandinas eacute a menor concentraccedilatildeo que leva agrave
inibiccedilatildeo 50 de crescimento quando comparado com controle de crescimento livre de antifuacutengico
INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
EUCAST tem estabelecido os valores de pontos de corte dos compostos ativos para a maioria das leveduras e
espeacutecies de Candida (que juntamente com a literatura relevante satildeo encontrados em publicaccedilotildees [15-17] e
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
11
no site da EUCAST httpwwwEUCASTorg) Interpretaccedilatildeo de CIMs para outras combinaccedilotildees de
antifuacutengicosorganismos na ausecircncia de pontos de corte estaacute mudando e deve ser feito muito cuidadosamente
levando em consideraccedilatildeo dados disponiacuteveis incluindo experiecircncia cliacutenica exposiccedilatildeo ao antifuacutengico durante a
terapia etc Entretanto a CIM ainda pode fornecer algumas informaccedilotildees sobre suscetibilidade e
importantemente gerar dados de CIMs para outras leveduras eacute um preacute-requisito vital para futuras escolhas de
valores de pontos de corte e de ECOFF
CONTROLE DE QUALIDADE
Procedimentos de controle satildeo os meios pelos quais a qualidade dos resultados eacute assegurada e satildeo descritos
em detalhes pelo CLSI [18] A qualidade dos resultados dos testes eacute monitorado pelo uso de cepas controles
Cepas controle
CIMs para as cepas controles devem idealmente estar proacuteximos aos situados no meio do intervalo das
concentraccedilotildees de uma seacuterie 12 e o padratildeo de suscetibilidade aos antifuacutengicos deve ser estaacutevel As cepas
controles recomendadas (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) foram selecionadas de
acordo com esses criteacuterios Um estudo recente tem indicado que as duas cepas controles comumente usadas
C parapsilosis ATCC 22019 e C krusei ATCC 6258 natildeo satildeo suficientemente sensiacuteveis na detecccedilatildeo da variaccedilatildeo
da potecircncia da caspofungina e que C albicans ATCC 64548 ou C albicans ATCC 64550 satildeo superiores para
este propoacutesito [11] Cepas controles devem ser obtidas de fontes confiaacuteveis como American Type Culture
Collection (ATCC) National Collection for Pathogenic Fungi (NCPF) Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
ou fornecedores comerciais que oferecem garantia de qualidade similar
Estoque das cepas controles
Leveduras isoladas podem ser estocadas como liofilizados ou congelados a -60 ⁰C ou inferior Culturas podem
ser estocados em curto tempo (menos de 2 semanas) sobre aacutegar Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose
inclinados a 2-8 ⁰C com novas culturas sendo preparadas de estoques congelados a cada duas semanas
Uso de rotina das cepas controles
Para o uso de rotina de cepas controles culturas frescas devem ser preparadas de cultura em aacutegar inclinado
ou congelada ou liofilizada pela inoculaccedilatildeo sobre um aacutegar de meio nutritivo e natildeo seletivo (por exemplos aacutegar
Sabouraud dextrose ou aacutegar batata dextrose)
1 Pelo menos uma cepa controle deve ser incluiacuteda por teste e as CIMs devem estar dentro do intervalo
esperado (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) Se mais de um em 20 testes estiver fora
do intervalo esperado a fonte do erro deveraacute ser investigada
2 Cada teste deve incluir um poccedilo de meio sem antifuacutengico para demonstrar crescimento do organismo
teste e produzir a turbidez controle para as leituras do ponto final
3 Subcultura do inoacuteculo sobre um meio adequado (preferencialmente um meio cromogecircnico) para
garantir a pureza e para produzir colocircnias frescas se o teste for repetido
12
4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
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REFEREcircNCIAS
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Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
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4 Testar cada novo lote de meio RPMI 1640-2 G e placas de microdiluiccedilatildeo com pelo menos duas cepas
controle (disponiacutevel no website EUCAST httpwwwEUCASTorg) para garantir que as CIMs estejam dentro
dos intervalos esperados
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
13
REFEREcircNCIAS
14
15
Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
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- Geral
- Meio
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- Anfotericina B
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- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
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Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
17
Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
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- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
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- Geral
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- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
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- Anfotericina B
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- Estoque das cepas controles
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- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
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Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
Constituinte
gL
L-arginina (base livre) 0200
Biotina 00002
L-asparagina (anidra) 0050
D-pantotecircnico 000025
L-aspaacutertico aacutecido 0020
Colina cloreto de 0003
L-cistina bull 2HCI 00652
Foacutelico aacutecido 0001
L-glutacircmico aacutecido 0020
Mioinositol 0035
L-glutamina 0300
Niacinamida 0001
Glicina 0010
PABA 0001
L-histidina (base livre) 0015
Piridoxina HCl 0001
L-hidroxiprolina 0020
Riboflavina 00002
L-isoleucina 0050
Tiamina HCl 0001
L-leucina 0050
Vitamina B12 0000005
L-lisina bull HCI 0040
Nitrato de caacutelcioH2O 0100
L-metionina 0015
Cloreto de potaacutessio 0400
L-fenilalanina 0015
Sulfato de magneacutesio
(anidro)
004884
L-prolina 0020
Cloreto de soacutedio 6000
L-serina 0030
Fosfato de soacutedio dibaacutesico
(anidro)
0800
L-treonina 0020
D-glicose 2000
L-triptofano 0005
Glutationa reduzida 0001
L-tirosina bull 2Na 002883
Vermelho fenol Na 00053
L-valina 0020
16
Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
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Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
Componentes Concentrado 2x
Aacutegua destilada 900 mLa
RPMI 1640 (Tabela 1) 208 g
MOPS 6906 g
Glicose 36 g
aDissolver o poacute em 900 mL de aacutegua destilada Apoacutes a dissoluccedilatildeo e sob agitaccedilatildeo ajustar o pH para
70 a 25 C usando 1 M de hidroacutexido de soacutedio Adicionar o restante de aacutegua destilada ateacute o volume
final de 1000 mL Esterilizar por filtraccedilatildeo antes do uso
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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
18
Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
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Tabela 3 Solventes para preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoques caracteriacutesticas e intervalos de
concentraccedilatildeo teste apropriados para os agentes antifuacutengicos
Agente antifuacutengico Solvente Caracteriacutesticas Intervalo teste (mgmL)
Anfotericina B DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Anidulafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Caspofungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Fluconazol DMSOaacuteguaa Hidrofoacutebicohidrofiacutelico 0125 - 64
Flucitosina aacutegua hidrofiacutelico 0125 - 64
Isavuconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Itraconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Micafungina DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Posaconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
Voriconazol DMSO Hidrofoacutebico 0008 - 4
DMSO dimetil sulfoacutexido
aDe acordo com as instruccedilotildees do fabricante A substacircncia pura original da Pfizer foi prontamente
soluacutevel em aacutegua O poacute da Sigma-Aldrich eacute altamente hidrofoacutebico e pouco soluacutevel em aacutegua devendo
portanto ser diluiacutedo em DMSO como recomendado pelo fornecedor
(httpwwwsigmaaldrichcomcatalogProductDetaildolang=enampN4=F8929|SIGMAampN5=SEARCH
_CONCAT_PNO|BRAND_KEYampF=SPEC)
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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
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Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
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Tabela 4 Esquema para preparar as seacuteries de diluiccedilatildeo dos antifuacutengicos com concentraccedilotildees finais de 0125 ndash
64 mgL
Etapa Concentraccedilatildeo
(mgL)
Fonte Volume do
antifuacutengico
(L)
Volume do
solventea
(L)
Concentraccedilatildeo
intermediaacuteria
(mgL)
Concentraccedilatildeo (mgL)
apoacutes diluiccedilatildeo 11000
com meio RPMI 2 G
(2x concentrado)b
1 12800 c Estoque 200 0 12800 128
2 12800 Estoque 100 100 6400 64
3 12800 Estoque 50 150 3200 32
4 12800 Estoque 50 350 1600 16
5 1600 Etapa 4 100 100 800 8
6 1600 Etapa 4 50 150 400 4
7 1600 Etapa 4 50 350 200 2
8 200 Etapa 7 100 100 100 1
9 200 Etapa 7 50 150 50 05
10 200 Etapa 7 25 175 25 025
a Consultar a Tabela 3 para solventes requeridos para diluir os antifuacutengicos
b Diluiccedilatildeo 11 com suspensatildeo do inoacuteculo resulta em concentraccedilotildees final agrave metade daquelas indicadas na
tabela
c Para diluiccedilatildeo em seacuterie com a mais alta concentraccedilatildeo de 16 mgL ou 8 mgL iniciar com as concentraccedilotildees
estoques de 3200 mgL e 1600 mgL respectivamente
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-
19
Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
Etapa Procedimento
1 Adicionar 05 mL de 0048 molL BaCl2 (1175 wv BaCl2 x 2 H2O) a 995 mL de
018 molL (038 N) H2SO4 (1 vv) e misturar completamente
2 Checar a densidade com um espectrofotocircmetro em cubeta de 1 cm A absorbacircncia
a 625 nm deveraacute ser de 008 a 013
3 Distribuir em tubos de tampa de rosca do mesmo tamanho do tubo que seraacute
usado para ajustar o inoacuteculo
4 Estocar os padrotildees fechados protegidos da luz e a temperatura ambiente
5 Agitar os padrotildees completamente no agitador imediatamente antes do uso
6 Renovar os padrotildees ou checar a sua absorbacircncia apoacutes 3 meses
- EUCAST ndash Documento Definitivo EDEF 732 ndash Abril 2020
- Autores
- Traduccedilatildeo
- INTRODUCcedilAtildeO
- ESCOPO
- TERMOS E DEFINICcedilOtildeES
- Notas
- PROCEDIMENTO DO TESTE
- Geral
- Meio
- Meio para teste de anfotericina B
- AGENTES ANTIFUacuteNGICOS
- Geral
- Preparaccedilatildeo de soluccedilotildees estoque
- Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de trabalho
- Preparaccedilatildeo das placas de microdiluiccedilatildeo
- Estoque das placas de microdiluiccedilatildeo
- PREPARACcedilAtildeO DO INOacuteCULO
- Meacutetodo de suspenccedilatildeo da colocircnia
- Cryptococcus spp
- INOCULACcedilAtildeO DA PLACA DE MICRODILUICcedilAtildeO
- INCUBACcedilAtildeO DAS PLACAS DE MICRODILUICcedilAtildeO
- RESULTADOS DA LEITURA
- Anfotericina B
- Flucitosina agentes azoacutelicos e equinocandinas
- INTERPRETACcedilAtildeO DOS RESULTADOS
- CONTROLE DE QUALIDADE
- Cepas controle
- Estoque das cepas controles
- Uso de rotina das cepas controles
- REFEREcircNCIAS
- Tabela 1 Composiccedilatildeo do meio RPMI 1640
- Tabela 2 Componentes do meio RPMI 2 G
- Tabela 5 Preparaccedilatildeo da escala padratildeo de turbidez 05 Mc Farland
-