Cuenca-Estrella, 2004 Efeito Sinérgico de Angentes Antifúngicos
Efeito Sinérgico do Ácido Úsnico e Agentes Antimicrobianos … · 2020. 12. 21. · RESUMO O...
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Fábio José dos Santos Aguiar
Efeito Sinérgico do Ácido Úsnico e Agentes Antimicrobianos
Frente a Staphylococcus aureus Multirresistentes
Recife, 2014
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Fábio José dos Santos Aguiar
Efeito Sinérgico do Ácido Úsnico e Agentes Antimicrobianos
Frente a Staphylococcus aureus Multirresistentes
Orientadora:
Profª. Drª. Eulália Camelo Pessoa de Azevedo Ximenes
Co-orientador:
Profº Dr. José Maurício dos Santos Filho
Recife,
2014
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Patologia do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal de
Pernambuco, para obtenção do
título de Mestre em Patologia
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freire Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr.Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA
Prof.ª Dr.ª Catarina de Oliveira Neves
COORDENADOR DO MESTRADO EM PATOLOGIA
Prof. Dr. Mário Ribeiro de Melo Júnior
VICE-COORDENADORA DO MESTRADO EM PATOLOGIA
Profa. Dr.
a Manuela Figueroa Lyra de Freitas
RECIFE
2014
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Aos meus pais, Pedro e
Terezinha Aguiar (in memorian).
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AGRADECIMENTOS
À minha família: Eliane Aguiar, Juliana Aguiar e Daniel Aguiar pela paciência e
compreensão nos numerosos momentos de ausência.
À Profa. Dra. Eulália Camelo Pessoa de Azevedo Ximenes pela orientação deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Nicácio Henrique da Silva que gentilmente aceitou participar desta pesquisa
cedendo a molécula para estudo e possibilitando a análise fitoquímica.
Ao Prof. Dr. Joás Lucas da Silva por dispor de parte de seu exíguo tempo para avaliar esta
dissertação.
À Profa. Dr.a Manuela Figueroa Lyra de Freitas pelas palavras de incentivo sempre nas horas
mais difíceis.
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia e Bioquímica dos Microrganismos: Gustavo
Dimech, Amanda Mesquita, Leonardo Aquino, Renata Ramos, Klewdma Araújo e Tacilene
Silva pela inestimável ajuda e solidariedade.
À secretária do Programa de Pós-graduação em Patologia, Margarete Valdevino pela atenção
e dedicação para com os assuntos relacionados à defesa da dissertação.
Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Patologia: Paulo Pessoa, Débora
Carthagenes, Michelly Delgado, Vanessa Fernandes, Mariléa Guimarães, Jeane Nogueira e
Cristiane Ferreira pelos momentos de aprendizado e descontração.
A Cristie Araújo pelos momentos de estudo e por seu exemplo de dedicação, esforço e
persistência que muitas vezes serviu de inspiração para irmos em frente.
Ao colega de trabalho e de turma João Soares pelas sugestões sem as quais esta pesquisa não
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teria sido realizada.
À minha tia Maria dos Anjos, um exemplo de que na vida nunca paramos de aprender
Ao colega Epitácio Villar pelas palavras de incentivo.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram com a elaboração deste trabalho.
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“A s g ran d es o b ra s sã o rea liz a d a s n ã o p ela força ,
m a s p ela p ersev era n ça.”
Autor desconhecido
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RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a ação sinérgica entre o ácido úsnico extraído de
Cladonia substellata Vainio e cinco agentes antimicrobianos (ciprofloxacino, gentamicina,
oxacilina e penicilina) sobre dez cepas de Staphylococcus aureus com fenótipo de
resistência previamente definido. Cinco destas cepas de S. aureus (ATCC 33591, AM 13,
AM 18, AM 20, AM 21) apresentaram resistência a todos os agentes antimicrobianos
avaliados e desta forma foram selecionadas para o estudo do sinergismo entre o ácido
úsnico e os agentes antimicrobianos através do método do tabuleiro de xadrez
(checkerboard method). Os critérios utilizados para avaliar a atividade sinérgica foram
definidos pelo Índice da Concentração Inibitória Fracionada (FICI). Todas as cepas de S.
aureus foram suscetíveis ao ácido úsnico, determinado pelo método de microdiluição. O
FICI variou de 0,25 – 1,0, sugerindo uma interação sinérgica frente as cepas de S. aureus
MRSA. A associação do ácido úsnico com o ciprofloxacino apresentou efeito sinérgico
sobre todas as cepas S. aureus MRSA. A oxacilina apresentou sinergismo em associação
com ácido úsnico sobre as cepas de S. aureus ATCC 33591, AM 13, AM18 e AM24 e
exibiu os menores valores FICI. A associação do ácido úsnico com a gentamicina foi
sinérgica sobre as cepas AM18, AM21 e AM24. A associação do ácido úsnico com a
penicilina apresentou-se indiferente para todas as cepas exceto para S. aureus AM13. Este
estudo demonstrou que o ácido úsnico, quando associado à antimicrobianos
fluoroquinolônicos, betalactâmicos e aminoglicosídeos pode agir sinergicamente, inibindo
cepas de S. aureus MRSA.
Palavras-chave: Ácido Úsnico; S. aureus MRSA; Cladonia substellata; Sinergismo;
Checkerboard Method; FIC índice
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ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of usnic acid extracted from
Cladonia substellata Vainio and five antimicrobial agents ( ciprofloxacin, gentamicin,
penicillin and oxacillin ) against ten strains of Staphylococcus aureus with resistance
phenotype previously defined . Five strains of S. aureus ( ATCC 33591 , AM 13 , AM 18 ,
AM 20 , AM 21 ) were resistant to all antimicrobial agents evaluated and were selected for
this the study of the interaction of usnic acid and antimicrobial agents. All S. aureus strains
were susceptible to usnic acid, as determined by the microdilution method. The interaction
of usnic acid and the antimicrobials was performed by the checkerboard method
(checkerboard). The criteria applied to evaluate the synergistic activity were defined by the
Fractional Inhibitory Concentration Index (FICI). The FICI ranged from 0.25 - 0.5 and
suggested a synergistic interaction against strains of S. aureus MRSA. The association of
usnic acid with ciprofloxacin showed synergistic effect on all strains S. aureus MRSA. The
oxacillin showed synergism in combination with usnic acid on strains of S. aureus ATCC
33591, AM 13, AM18 and AM24 and exhibited the lowest values of FICI. The association
of usnic acid with gentamicin was synergic on AM18, AM21 and AM24 strains. The
association of usnic acid with penicillin showed indifference to all strains except for S.
aureus AM13. This study presented that usnic acid, when associated with fluoroquinolones,
beta-lactams and aminoglycosides acts synergistically inhibiting strains of S. aureus MRSA.
Keywords: Usnic Acid; S. aureus MRSA; Cladonia substellata; Synergism; Checkerboard;
FIC Index
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Lista de ilustrações
FIGURA 1 Estrutura dos enantiômeros (-) ácido úsnico e do (+) ácido úsnico ........................28
FIGURA 2 A- Cladonia substellata .........................................................................................28
B-Cristais do ácido úsnico extraído, isolado e purificado ....................................28
FIGURA 3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do ácido úsnico e agentes
antimicrobianos........................................................................................................38
FIGURA 4 Representação do método do tabuleiro de xadrez (Checkerboard method)...........39
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Origem e susceptibilidade das cepas Staphylococcus aureus utilizados na
determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)..............................41
TABELA 2 Atividade antimicrobiana do ácido úsnico e agentes antimicrobianos frente à
Staphylococcus aureus multidroga resistentes ...............................................44
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LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC American Type Culture Collection
AMC Amoxicilina/Ácido clavulânico
AMP Ampicilina
AU Ácido úsnico
AZI Azitromicina
BHI Brain Heart Infusion
CBM Concentração Bactericida Mínima
CFO Cefoxitina
CIP Ciprofloxacino
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
FIC Concentração Inibitória Fracionada
GEN Gentamicina
LFBM Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos
MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistentes
TEI Teicoplanina
TET Tetraciclina
SZT Sulfametoxazol/Trimetropin
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Sumário
1. APRESENTAÇÃO ............................................................................................................... 17
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 20
2.1 Staphylococcus aureus .................................................................................................... 20
2.2 Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) .................................................... 20
2.3 Fatores de Virulência ...................................................................................................... 21
2.4 Doenças associadas à MRSA .......................................................................................... 23
2.5 Resistência de Staphylococcus aureus aos antimicrobianos ........................................... 24
2.6 Líquens e Ácido Úsnico .................................................................................................. 27
2.7 Sinergismo entre substâncias naturais e antibióticos ...................................................... 31
3 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 34
3.1 Geral ................................................................................................................................ 34
3.2 Específicos ...................................................................................................................... 34
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 35
4.1 Coleta do Material liquênico ........................................................................................... 35
4.2 Preparação do extrato .................................................................................................. 35
4.3 Identificação e confirmação estrutural do ácido úsnico .................................................. 35
4.3 Microrganismos ............................................................................................................. 35
4.4 Preparação do inóculo .................................................................................................. 36
4.5 Agentes antimicrobianos .............................................................................................. 36
4.6 D eterminação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima ( CBM) ............................................................................................... 37
4.7 Determinação in vitro da atividade sinérgica ............................................................... 38
5. RESULTADOS .................................................................................................................... 40
5.1 Perfil Fitoquímico .......................................................................................................... 40
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5.2 A atividade antimicrobiana do ácido úsnico e agentes antimicrobianos ................... 40
5.3 Interação entre ácido úsnico e agentes antimicrobianos ................................................. 42
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 45
7 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 48
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 49
ANEXOS .................................................................................................................................. 56
Anexo A- Isobologramas revelando o efeito sinérgico do ácido úsnico em associação com
ciprofloxacino frente a Staphylococcus aureus MRSA AM13,AM14, AM21, AM 24 ....... 56
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1. APRESENTAÇÃO
A descoberta dos antibióticos nas primeiras décadas do século XX foi um marco na
história da humanidade tendo revolucionado a medicina e desde então inúmeras vidas tem
sido salvas graças a sua utilização (DAVIES; DAVIES, 2010).
Como consequência da utilização indiscriminada desta nova classe de
medicamentos, um aumento da resistência através da pressão seletiva sobre os
microrganismos tomou proporções epidêmicas com o aparecimento de bactérias com
elevado padrão de resistência (CASELLAS, 2011).
Muitas espécies bacterianas exibem resistência a antibióticos e dentre estas se
destaca o Staphylococcus aureus, bactéria Gram positiva que possui fatores de virulência
relacionados ao estabelecimento de infecção tais como: lipases, exotoxinas, enterotoxinas ,
α-toxina (LI et al., 2011). Por outro lado, esta espécie vem apresentando cada vez mais
resistência aos antibióticos o que levou ao surgimento de uma linhagem denominada
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), identificada inicialmente em cepas
de origem hospitalar (HA-MRSA) e posteriormente em cepas de origem comunitária (CA-
MRSA). Estas cepas são resistentes a quase todos antibióticos utilizados na prática clínica,
exceto ceftaroline (COOMBS et al., 2011, (SARAVOLATZ; STEIN; JOHNSON, 2011).
As cepas MRSA são potentes produtoras de fatores de virulência tais como: proteína
A, proteínas de adesão à fibronectina, proteases, lipases, hemolisina, leucocidina de Panton-
Valentine, e polissacarídeos capsulares e são consideradas um dos grandes desafios para
saúde pública mundial (GOULD et al., 2012).
No Brasil foi identificado um clone denominado clone endêmico brasileiro de
MRSA. Trata-se de uma cepa de origem hospitalar e tipicamente resistente a vários
antibióticos. Os antimicrobianos clindamicina, ciprofloxacino, gentamicina e
sulfametoxazol-trimetropim são efetivos em menos de 10% desses isolados (ROSSI, 2011).
Estas cepas com elevado perfil de resistência aos antimicrobianos acarretam em altos
custos financeiros à sociedade sendo a causa de ausência no trabalho, despesas relacionados
às hospitalizações, sobretudo com o uso de antibióticos de última geração. Estima-se que só
na Europa as despesas atribuídas a hospitalizações por MRSA tenham alcançado valores de
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aproximadamente 63,1 milhões de dólares em 2007 (KRAKER et al., 2011), nos Estados
Unidos da América dados de 2005 indicam valores em torno de 9 bilhões de dólares (KLEIN;
SMITH; LAXMINARAYAN, 2007).
Embora no Brasil as estatísticas não sejam precisas, as infecções nosocomiais por
MRSA são frequentes o que indica consequências econômicas similares ao panorama
mundial. Dados do Programa de Vigilância Epidemiológica-SENTRY registram que no
período de 2005 a 2008 as frequências de isolamentos de Staphylococcus aureus oriundas de
infecção hospitalar foram de 20,2% (bacteremia), 28,1% (pele e tecidos moles) e 24,9%
(pneumonia) (GALES et al., 2009).
A urgência por uma alternativa terapêutica à utilização de antibióticos fez surgir
várias linhas de pesquisas como a supressão da colonização através da utilização de
probióticos, a estimulação da resposta imune do hospedeiro, uso de substâncias inibidoras
de fatores de virulência (PARK; LIU, 2012) e a utilização de efeito sinérgico entre diversos
antibióticos com substâncias naturais (HYLDGAARD; MYGIND; MEYER, 2012).
Vários são os grupos de substâncias naturais que exibem atividade antimicrobiana.
Esta diversidade de moléculas é originária de relações intrínsecas entre os seres vivos e o
meio ambiente através da seleção natural o que aconteceu durante bilhões de anos
conferindo desta forma um mecanismo de defesa eficaz contra microrganismos (SIMÕES;
BENNETT; ROSA, 2009). Alcaloides, flavonoides, isoflavonoides, terpenos,
glicoesteroides, isotiocianatos, polipeptideos, moléculas de origem microbiana, algas,
líquens e muitos outros são metabolitos secundários com reconhecida atividade
antimicrobiana (DAVIDSON; CRITZER; TAYLOR, 2013).
Dentre os vários organismos produtores de substâncias com atividade
antimicrobiana, destacam-se os líquens (DEVARAJA, 2012).
Líquens são organismos singulares caracterizados por uma associação simbiótica
entre fungos filamentosos e algas fotossintetizantes e/ou cianobactérias. Possuem uma taxa
de crescimento lento e são encontrados em vários ecossistemas desde as regiões polares às
regiões tropicais em condições ambientais hostis o que induz a produção de numerosas
moléculas bioativas tais como o ácido úsnico (SHRESTHA; ST. CLAIR, 2013).
O ácido úsnico [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3(2H,9bH)-dibenzo-
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furanodiona], isolado primeiramente em 1844, tem sido o mais estudado metabólito
proveniente de líquens e é comercialmente disponível. Ácido úsnico é encontrado
exclusivamente em liquens sendo abundante nos gêneros Alectoria, Cladonia, Usnea,
Lecanora, Ramalina e Evernia. Na sua forma pura é utilizado na formulação de cremes,
creme dental, desodorantes, colutórios, xampus e protetores solares. Em algumas
formulações é utilizado como principio ativo em outras como agente coadjuvante . Esta
molécula apresenta atividade antimicrobiana contra patógenos humanos e fitopatógenos
além de exibir propriedade antiviral, anti-inflamatória, antiprotozoária, antiproliferativa e
analgésica (GUO et al., 2008; INGOLFSDOTTIR, 2002; MOLNÁR; FARKAS, 2010)
Diante do exposto o presente trabalho teve como objetivo em sua primeira
etapa um estudo da atividade antimicrobiana do ácido úsnico extraído de Cladonia substellata
e, posteriormente, a avaliação da sua interação com agentes antimicrobianos frente a
amostras de Staphylococcus aureus multidroga resistentes.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus é um dos mais estudados microrganismos patogênicos tendo
sido relacionado ao surgimento de abcessos por Ogston em 1880 (SHINEFIELD;
NAOMILRUFF, 2009). É a bactéria patogênica mais isolada em humanos podendo ser
responsável por infecções da pele e de tecidos moles, infecções vasculares, pneumonia,
osteomielite, septicemia e infecções relacionadas a corpos estranhos (DAVID; DAUM, 2010).
Pode ser agente etiológico de infecções localizadas de fácil tratamento à infecções graves tais
como: meningite, endocardite e celulite relacionadas a altos índices de morbidade e
mortalidade (MILLER; CHO, 2011).
S. aureus apresenta a morfologia de cocos Gram positivos, imóveis, não forma
esporos, produz coagulase e DNAse o que o distingue de outras espécies do gênero
Staphylococcus (MANDELL; BENNETT; DOLIN, 2010). É anaeróbio facultativo, capaz de
gerar energia através de respiração aeróbica e fermentação. Produz catalase, característica
utilizada no diagnóstico diferencial do gênero Streptococcus que é negativo para esta enzima.
Requer nutrientes complexos como aminoácidos e vitamina B para seu crescimento e tolera
concentrações de cloreto de sódio até 1,7 molar (PLATA; ROSATO; WEGRZYN, 2009).
É de conhecimento da ciência a existência de várias cepas de Staphylococcus aureus
que apresentam variações na produção de fatores de virulência como também na resistência
aos antimicrobianos sendo classificadas como cepas de origem hospitalar e comunitária
(TONG; CHEN; FOWLER JUNIOR, 2012).
2.2 Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA)
A existência de resistência aos antibióticos pelo Staphylococcus aureus tem sido
reportada desde a década 1940 com a identificação de cepas resistentes à penicilina.
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21
Posteriormente, à introdução da meticilina na clínica médica foram identificadas cepas
resistentes a este antibiótico e denominadas Staphylococcus aureus meticilina resistente
(MRSA) que possuem o cassete cromossômico mec I responsável pela resistência. A esta
segunda onda de resistência seguiu-se outra com a identificação em meados da década de
1970, de cepas possuidoras de cassetes mec II e mec III constituindo o seu isolamento no
ambiente hospitalar a pandemia observada nos dias atuais nos hospitais e serviços de saúde.
Por outro lado, o uso de vancomicina para o tratamento de MRSA fez surgir cepas de
resistência intermediária à vancomicina (VISA). Entretanto em meados da década de 1990
surgiram os primeiros casos de MRSA não associados ao ambiente hospitalar e sim à
comunidade denominados CA-MRSA que possuem o cassete mec IV. Por último em 2002
foram identificados os primeiros casos de Staphylococcus aureus resistente à vancomicina
sendo denominados (VRSA) (CHAMBERS; DELEO, 2009).
2.3 Fatores de Virulência
Esta espécie bacteriana possui um verdadeiro arsenal de mecanismos responsáveis por
sua patogenicidade que permite a evasão do sistema imune do hospedeiro como também o
estabelecimento dos processos mórbidos. Tais mecanismos são conhecidos por fatores de
virulência. Estes fatores compreendem polissacarídeos capsulares, proteínas de superfície,
exotoxinas e endotoxinas (TONG; CHEN; FOWLER JUNIOR, 2012).
Polissacarídeos capsulares são exopolissacarídeos que podem impedir a fagocitose por
células polimorfonucleares e ainda promover a adesão às células do hospedeiro e a
dispositivos de próteses (WINN JUNIOR et al., 2008).
Proteínas de superfície tais como: coagulase que se liga a protrombina convertendo o
fibrinogênio em fibrina (MCADOW; MISSIAKAS; SCHNEEWIND, 2012), proteína A
presente praticamente em todas as cepas de Staphylococcus aureus que se liga a região Fc da
imunoglobulina G (IgG) inibindo a opsonização (CLARO et al., 2011), adesinas envolvidas
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22
na aderência à vários fatores do hospedeiro (HIRSCHHAUSEN et al., 2012), fator de
agregação A (clumping factor A) que se liga ao fibrinogênio e confere propriedades anti-
fagocitárias em relação aos leucócitos polimornucleares e macrófagos (CHENG et al., 2011),
fator de agregação B (clumping factor B) associado a infecções respiratórias pois promove a
adesão do S. aureus à citoqueratinas presentes no epitélio nasal (PARKER; PRINCE, 2012).
Em adição a estes fatores S. aureus produz uma série de proteínas e enzimas como
proteases, lipases, elastases e toxinas que favorecem a invasão e dificultam a ação da resposta
imune do hospedeiro (GORDON; LOWY, 2008).
A alfa hemolisina é uma proteína que forma poros na membrana celular permitindo o
fluxo de íons, como o cálcio, induzindo a ativação da piroptose e inflamossoma via caspase 1,
a toxina beta capaz de levar a lise de hemácias, monócitos, linfócitos e neutrófilos, a toxina 1
da síndrome do choque tóxico (TSST-1) considerada um super antígeno, a toxina esfoliativa
também conhecida por toxina da síndrome da pele escaldada induz eritema e esfoliação da
pele, as enterotoxinas que produzem intoxicação alimentar, leucocidinas como a leucocidina
de Panton-Valentine que causa apoptose dos neutrófilos via caspases 3 e 9 cujo papel nas
pneumonias necrosantes ainda está sob investigação (MORELL; BALKIN, 2010; PARKER ;
PRINCE, 2012).
Outro fator de virulência importante é a capacidade de produzir biofilme. De acordo
com Dolan e Costerton (2002), biofilme é uma comunidade imóvel de origem microbiana
caracterizada por células que estão aderidas irreversivelmente a um substrato, superfície ou
entre si, inseridas em uma matriz de polímeros extracelulares produzida por elas mesmas e
que apresentam um fenótipo alterado em relação à taxa de crescimento bem como à
transcrição de genes. Segundo estes mesmos autores a natureza estrutural e as características
dos microrganismos formadores do biofilme conferem a este uma inerente resistência a
agentes anticromicrobianos quer sejam antibióticos, desinfetantes ou germicidas.
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23
S. aureus pode produzir biofilmes e uma vez estabelecidos são resistentes ao
tratamento antimicrobiano e à resposta imunológica do hospedeiro sendo portanto
responsáveis por infecções recorrentes (ARCHER et al., 2011)
2.4 Doenças associadas à MRSA
As apresentações clínicas do MRSA dependem do sítio anatômico onde está
localizada a infecção como também dos fatores de virulência produzidos pela cepa que está
causando a infecção. S. aureus pode levar a infecções da pele que variam desde infecções
simples de serem tratadas à infecções complicadas que podem levar à hospitalizações. Dentro
destes grupos de doenças são relatados casos de impetigo, foliculite/furunculose, abcessos,
polimiosite e fascite necrosante. Estas infecções podem ter efeitos localizados ou mesmo
efeitos sistêmicos devido a possibilidade de que cepas produtoras de toxinas estejam
envolvidas como observado na síndrome da pele escaldada estafilocócica e no impetigo
bolhoso (TANG; STRATTON, 2010).
Por outro lado, certas cepas podem produzir enterotoxinas que podem resultar em
quadros de intoxicação alimentar. Neste casos o efeito dá-se não pela presença da bactéria em
si mas pela ingestão de enterotoxinas produzidas por este microrganismo em alimentos
contaminados. Estas toxinas são termoestáveis não tendo, portanto, sua atividade alterada
pelo cozimento. Esta intoxicação possui um rápido período de incubação e não está associada
à febre mas a náuseas e vômitos seguidos de dor abdominal e diarreia tendo uma duração
entre 6 a 12 horas (BALABAN ; RASOOLY, 2000)
A infecção de regiões mais profundas da derme ou de tecidos moles, pode levar a um
quadro mais severo com implicações sistêmicas como o observado na síndrome do choque
tóxico estafilocócico causada pela resposta do hospedeiro à presença da TSST-1( Toxina da
Síndrome do Choque Tóxico ) que desencadeia a síntese maciça de citocinas tais como o
TNFα (fator de necrose tumoral), IL1 ( interleucina 1) e a IL6 ( interleucina 6) levando à
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24
fragilidade capilar e a um quadro clínico composto por febre alta, cefaleia, confusão,
hiperemia conjuntival, rash cutâneo, edema subcutâneo, vômito, diarreia, hipotensão
refratária, oligúria e insuficiência renal (SOSPEDRA; MAÑES; SORIANO, 2012).
A produção da Leucocidina de Panton-Valentine, por parte de CA-MRSA, está
associada à pneumonia necrosante, uma doença grave. Esta toxina se liga a membrana
plasmática de polimorfonucleares, monócitos e macrófagos promovendo a abertura de canais
de cálcio o que leva ao influxo de cálcio, indução de mediadores da inflamação e apoptose ou
necrose (CUPANE et al., 2012).
Muitas outras doenças estão associadas ao Staphylococcus aureus. Osteomielite
(ULUĞ, AYAZ ; CELEN, 2011), trombose de seios cavernosos e meningite (MUNCKHOF
et al., 2008), endocardite (SLABBEKOORN et al., 2010) e artrite séptica (WAGURI-
NAGAYA et al., 2007).
2.5 Resistência de Staphylococcus aureus aos antimicrobianos
Resistência é um fenômeno pelo qual agentes infecciosos tornam-se refratários às
drogas utilizadas no tratamento e pode ser exibida por parasitas, fungos, vírus e bactérias
(DAVIES, J.; DAVIES, D., 2010). Resistência aos antimicrobianos em bactérias patógenas
foi identificada logo após a introdução dos antibióticos na prática clínica, com raras exceções
(MAZEL; DAVIES, 1999). Estudos indicam entretanto que a resistência bacteriana aos
antibióticos é um processo que está presente nestes microrganismos muito anterior à
descoberta destas substâncias pelo homem, sendo fruto da história evolutiva das bactérias ao
longo de bilhões de anos (SPELLBERG et al., 2008).Vários mecanismos podem ser
responsáveis pelo surgimento de resistência aos antimicrobianos tais como: resistência
intrínseca da espécie, neste caso todas as cepas apresentam resistência a um ou alguns
antimicrobianos ou resistência adquirida na qual uma cepa inicialmente sensível torna-se
resistente, reproduzindo-se e disseminando-se sob a pressão seletiva exercida pelo uso deste
antimicrobiano (TENOVER, 2006).
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Microrganismos podem adquirir genes que codificam enzimas, como betalactamases
que destroem o antimicrobiano antes que este produza algum efeito (TENOVER, 2006),
como por exemplo carbapenemases que conferem resistência a carbapenêmicos e outros
betalactâmicos (MARSIK; NAMBIAR, 2011).
Bactérias podem adquirir genes que levam à síntese de bombas de efluxo que
expulsam o antimicrobiano antes que este atinja a região alvo para produzir seu efeito como a
bomba de efluxo MexXY-OprM apresentada por cepas de Pseudomonas aeruginosa que
confere resistência aos aminoglicosídeos (FERNÁNDEZ; BREIDENSTEIN; HANCOCK,
2011).
Bactérias adquirem genes que levam a alterações metabólicas que alteram a síntese de
sua parede celular reduzindo a ligação do antimicrobiano ao microrganismo, como
apresentado por cepas de Enterococcus sp resistentes ao glicopeptideo vancomicina (ARIAS;
MURRAY, 2012).
Alterações na síntese de porinas ribossomais da região 50S por sua vez, é o
mecanismo de resistência aos macrolídeos (DAVIES; DAVIES, 2010) e é apresentado por
várias espécies bacterianas tais como: Streptococcus pneumoniae (ALTUN et al., 2014),
Mycoplasma pneumoniae (LIU et al., 2013), Staphylococcus aureus (VAN DER MEEREN et
al., 2014), Campylobacter jejunii (KOVAČ et al., 2014), Neisseria gonorrhoeae (LEWIS,
2013) e Pseudomonas aeruginosa .(MARVIG et al., 2012).
Tão rápido quanto os antimicrobianos são introduzidos Staphylococcus aureus tem
desenvolvido mecanismos para neutralizá-los (LOWY, 2003). A resistência à penicilina é
mediada pelo gene BlaZ (LOWY, 2003) e deve-se à produção de betalactamase (penicilinase)
que hidrolisa o anel betalactâmico inativando portanto este antibiótico e também a
amoxicilina e ampicilina (SANTOS et al., 2007).
Alternativamente foi desenvolvida em meados de 1960 a meticilina, uma penicilina
semi-sintética que não era susceptível a ação da betalactamase. Entretanto, cepas de S. aureus
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resistentes à meticilina e também às cefalosporinas começaram a ser isoladas no início da
década de 1970 (SANTOS et al., 2007). Nesta espécie, o mecanismo mais importante
envolvido na resistência à meticilina é a produção de penicllin-binding protein (proteína
ligadora de penicilina) 2a, ou 2’ (PBP2a ou PBP2’), que tem baixa afinidade por
betalactâmicos e catalisa a síntese de parede celular mesmo na presença de penicilinas,
cefalosporinas e carbapenêmicos. Esta proteína é codificada pelo gen mecA que está
localizado em uma região adquirida denominada staphylococcal cassette chromosome mec
(SCCmec), cassete cromossômico estafilocócico mec (MOELLERING JUNIOR, 2012). A
literatura científica descreveu 12 tipos de cassetes cromossômicos mec (MOELLERING
JUNIOR, 2012; GOULD, 2012).
Em adição a esses perfis, também são descritos na literatura resistência aos
macrolídeos, lincosamidas e estreptograminas do tipo B (família MSLB), sendo a
clindamicina um dos representantes deste grupo mais usados na prática médica (MERINO-
DÍAZ et al., 2007; SIREESHA; SETTY, 2012). Os mecanismos pelos quais esta resistência é
adquirida é caracterizada por três vias: pela síntese de uma enzima metilase codificada por
uma variedade do gene erm que pode ser constitutiva ( cMLSB) ou induzida ( iMLSB ), pela
ação de uma bomba de efluxo localizada na região citoplasmática da membrana celular
bacteriana codificada pelo gene msr A e por inativação de lincosaminas pela ação do gene inu
A (SIREESHA; SETTY, 2012).
A vancomicina , um glicopeptideo, liberada quase conjuntamente pelo FDA em 1958
com a meticilina e cefalotina, estas com toxicidade bem menor, teve sua utilização reservada
por muitos anos devido ao sucesso da meticilina, tornou-se porém a opção de escolha para os
tratamentos de MRSA. Entretanto em 1997 no Japão foi isolada a primeira cepa de
Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (HIRAMATSU et al., 1997). Os mecanismos
propostos para tal resistência é a existência de uma parede celular mais espessa com mais
camadas de peptideoglicano o que dificulta ou mesmo impede a ação da vancomicina na
membrana citoplasmática (COSGROVE; CARROLL; PERL, 2004) e a presença do gene van
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27
A que embora seja originalmente encontrado em Enterococcus faecalis foi demonstrado sua
transferência a cepas de S. aureus in vitro (NOBLE; VIRANI; CREE, 1992) como também
foi encontrado em cepas oriundas de caso clínico isolado em Michigan nos Estados Unidos da
América (CHANG et al., 2003).
2.6 Líquens e Ácido Úsnico
Líquen é uma associação simbiótica entre fungos filamentosos e uma alga ou
cianobactéria que são os elementos fotossintetizantes do conjunto e em alguns casos
associações destes fungos com bactérias não fotossintetizantes (SELBMANN et al., 2009;
SHRESTHA; ST. CLAIR, 2013). Estas associações permitem que os organismos simbiontes
possuam numerosos mecanismos de resistência tais como: proteção contra um amplo espectro
de microrganismos, animais predadores e competidores vegetais; defesa contra estresse
ambiental como radiações ultravioleta e dessecação; regulação fisiólogica do metabolismo,
como a habilidade de aumentar a permeabilidade da membrana celular da alga que confere a
capacidade de aumentar o fluxo de nutrientes ao elemento fúngico (MOLNÁR; FARKAS,
2010; SHRESTHA; ST. CLAIR, 2013).
Essas características são traduzidas pelo fato dos líquens serem considerados uma das
primeiras formas de vida a surgir no planeta Terra sendo um dos primeiros seres vivos a
habitar novos ecossistemas, tendo sido encontrados evidências de sua existência em fósseis
datados em 600 milhões de anos (YUAN; XIAO; TAYLOR, 2005). Por outro lado, devido à
sua adaptabilidade e diversidade estima-se a existência de aproximadamente 18500 espécies
de liquens nos mais diversos ambientes do planeta, mesmo nos mais inóspitos como no
continente antártico (FEUERER; HAWKSWORTH, 2007).
Líquens podem produzir substâncias ligadas ao metabolismo primário tais como:
aminoácidos, polióis, carotenóides, polissacarideos e vitaminas que tem função estrutural ou
ligada a fisiologia liquênica bem como moléculas do metabolismo secundário que são
produzidas em resposta às condições impostas pelo meio ambiente e compoem-se na maioria
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de substâncias de baixo peso molecular principalmente ácidos como ácido girofórico,
salicílico, lecanórico, crustínico, lobárico, umbilicárico, ovoico, úsnico entre outros
(PODTEROB, 2008).
Ácido Úsnico é produzido em Cladonia (família Cladoniacea), Usnea (Usneaceae),
Lecanora (Lecanoraceae), Ramalina (Ramalinaceae), Evernia e Parmelia (Parmeliaceae),
Alectoria (Alectoriaceae) e em outros gêneros de liquens é, talvez, o metabólito secundário
mais conhecido de líquens (INGOLFSDOTTIR, 2002). É um composto cristalino de cor
amarela, um derivado do dibenzofurano, existindo como dois enantiômeros, diferindo na
posição angular do grupo metil no C (9b) (SOKOLOV; LUZINA; SALAKHUTDINOV,
2012).
Figura 1 – Estrutura dos enantiômeros (-) ácido úsnico e do (+)
ácido úsnico (COLCHIETO, 2002)
Figura 2 – A- Cladonia substellata B- Cristais do ácido úsnico
extraído, isolado e purificado de C.substellata no Laboratório de
Química de Produtos Naturais do Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE . Foto: Márcio Lima
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Vários estudos têm demonstrado as possibilidades terapêuticas do uso do ácido úsnico
como molécula com atividade anti-inflamatoria, antioxidante, antiproliferativa,
antiparasitária, antiviral e antimicrobiana (GUPTA et al., 2012; INGOLFSDOTTIR, 2002;
ZAMBARE; CHRISTOPHER, 2012)
Avaliando o efeito na produção de fator de necrose tumoral (TNFα) e óxido nítrico
pelo ácido úsnico em macrófagos, Jin et al. (2008) encontraram que o ácido úsnico reduziu a
produção de TNFα como também inibiu a produção de óxido nítrico através da inibição da
expressão de RNAm de TNFα como também a supressão da translocação nuclear de NF-κB
p65 indicando forte atividade anti-inflamatória.
Ação antioxidante foi demonstrada em linfócitos humanos mantidos em cultura e
submetidos à exposição à várias concentrações de ácido úsnico. Baixas concentrações (1 a 5
g/mL) de ácido úsnico aumentaram os níveis de capacidade antioxidante total e os níveis de
status oxidativo total não foram alterados em todas as concentrações, exceto em 200 g/mL
(POLAT et al., 2013).
Ácido úsnico mostrou efeitos inibitórios sobre o crescimento e proliferação celular em
linhagens de células de câncer humano: células de câncer de mama (T-47D) e de câncer de
pâncreas (Capan-2) (EINARSDÓTTIR et al., 2010), de melanoma (FemX) e de carcinoma de
cólon (LS174) (RANKOVIĆ et al., 2012), em linhagens de células de câncer do pulmão e
linfócitos (KOPARAL; TÜYLÜ; TÜRK, 2006; SINGH et al., 2013)
Atividade antiparasitária foi demonstrada utilizando-se ácido úsnico isolado de
Cladonia substellata, contra Trypanosoma cruzi, in vitro. A incubação de culturas de células
na forma epimastigota com 5–30 mg/ml deste composto resultou em inibição do crescimento
de forma dose dependente. A análise estrutural mostrou danos à mitocôndria e aumento do
volume do cinetoplasto e vacuolização da matriz mitocondrial e intensa lise das formas
tripoomastigotas também foi observado (DE CARVALHO et al., 2005). Atividade
antiplasmodial foi observada em amostras de Plasmodium berghei através da técnica de
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imunofluorescência tendo sido verificado que o ácido úsnico foi fortemente ativo nas formas
do estágio hepático do parasita mas não no estágio sanguíneo (LAUINGER et al., 2013).
Ação antiviral do ácido úsnico e derivados foi verificada em relação ao vírus influenza
A(H1N1)2009 Sokolov et al (2012). Neste trabalho os autores observaram que o isômero (-)
do ácido úsnico foi mais ativo que a forma (+) e considerando que esta molécula é supressora
de NF-κB p65, os autores sugerem que a ação antiviral do ácido úsnico esteja relacionada a
esta propriedade uma vez que NF-κB p65 é uma molécula importante no ciclo vital do vírus
influenza.
Ácido úsnico obtido de Parmelia caperata mostrou forte efeito antimicrobiano contra
seis cepas de bactérias: Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e dez cepas de fungos
patógenos humanos, animais, fitopatógenos, produtores de micotoxinas e deteriorantes de
alimentos: Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Candida albicans,
Fusarium oxysporum, Mucor mucedo, Paecilomyces variotii, Penicillium purpurescens,
Penicillium verrucosum e Trichoderma harzianum (RANKOVIĆ; MIŠIĆ; SUKDOLAK,
2007).
Analisando a ação antimicrobiana de extrato de plantas e líquens, Weckesser et
al.,(2007) obtiveram resultados indicando uma maior sensibilidade ao ácido úsnico por
Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus meticilina resistente, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,
Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Corynebacterium amycolatu e
Corynebacterium pseudodiphtericum com concentração inibitória mínima variando entre 4 e
16 µg/mL. Estudando a atividade antimicrobiana de ácido úsnico, atranorina e ácido
fumarprotocetrárico frente a cepas de Staphylococcus aureus meticilina sensíveis e meticilina
resistentes isolados de pacientes com fibrose cística Pompilio et al.(2013), encontraram que o
ácido úsnico apresentou forte atividade antimicrobiana tanto nas bactérias em sua forma
planctônica quanto na forma de biofilme.
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Por sua vez, em pesquisa sobre a atividade in vitro de extratos e seus constituintes
químicos obtidos de Ramalina roesleri Nyl frente à cepas de Escherichia coli, Streptococcus
mutans, Streptococcus viridochromogenes e Staphylococcus aureus, Sisodia et al. (2013)
observaram um percentual de inibição pelo ácido úsnico da ordem de 95%, 92%, 90% e 75%,
respectivamente.
Vários trabalhos tem demonstrado atividade antimicrobiana de ácido úsnico contra
bactérias Gram positivas, principalmente do gênero Staphylococccus destacando que a
otimização de sua obtenção e solubilização são fatores importantes para o incremento desta
atividade (FRANCOLINI et al., 2013; GRUMEZESCU et al., 2013; IVANOVIC et al., 2013;
SRIVASTAVA et al., 2013).
2.7 Sinergismo entre substâncias naturais e antibióticos
Do ponto de vista da interação entre substâncias medicamentosas pode haver
indiferença, antagonismo ou sinergismo. Indiferença farmacológica ocorre quando da
associação de dois medicamentos, o mecanismo de ação de um não interfere no mecanismo
de ação do outro, os dois medicamentos não interagem sob nenhum aspecto de sua ação
farmacodinâmica ou farmacocinética (OLIVEIRA, 1986). No antagonismo a resposta
farmacológica de um medicamento é suprimida ou reduzida na presença de outro através de
mecanismos químicos, farmacocinéticos, competição ou mesmo bloqueio de um mesmo
receptor (OLIVEIRA, 1986). No sinergismo existe a associação de dois ou mais
medicamentos, cuja resultante é maior do que a simples soma dos efeitos isolados de cada um
deles, o que pode levar a aumento da eficácia, redução da toxicidade, diminuição dos efeitos
adversos, menor dose terapêutica e redução do avanço da resistência bacteriana aos
antimicrobianos (VAN VUUREN; VILJOEN, 2011).
Vários estudos têm demonstrado o efeito sinérgico entre substâncias naturais e
antibióticos. De acordo com Hemaiswarya, Kumar e Doble, (2008), muitos extratos de plantas
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podem exibir atividade sinérgica com antimicrobianos no combate à infecções por bactérias,
fungos e micobactérias.
Chan et al (2011) utilizando o método do tabuleiro de xadrez, demonstraram que a
baicaleina um flavonoide presente em Scutellaria baicalensis Georgi, pode reverter
significativamente a resistência à ciprofloxacina por Staphylococcus aureus meticilina
resistente (MRSA) possivelmente pela inibição da bomba de efluxo NorA in vitro.
Estudando a atividade sinérgica entre triterpenoides pentaciclicos e os antibióticos
meticilina e vancomicina contra MRSA, Chung et. al.(2011) encontraram que apesar de ter
uma fraca atividade isoladamente, estes terpenos exibiram atividade sinérgica com os
antibióticos. Utilizando o óleo essencial de Melaleuca alternifolia (TeaTree) e a tobramicina
frente a Staphylococcus aureus e Escherichia coli, Arrigo et. al. (2010) também observaram
efeito sinérgico.
O efeito sinérgico pode ser verificado entre substâncias naturais com combinações de
extratos de Alpinia galanga, Rosmarinus officinalis e Eucalyptus staigerana frente à S.aureus,
Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella typhimurium e Clostridium perfringens,
tendo encontrado forte atividade antimicrobiana com as associações exceto em relação ao
Clostridium perfringens, Weerakkody et al.(2011)
Mitchell et al (2012) em estudo de sinergismo in vitro com tomatidina , alcaloide
presente no tomate e antimicrobianos demonstraram que houve efeito sinérgico entre a
tomatidina e aminoglicosídeos mas não encontraram o mesmo efeito em outras classes de
antimicrobianos frente à MRSA.
Bakar, Zin e Basri (2012) estudando a ação sinérgica entre seis flavonoides e os
antimicrobianos vancomicina e oxacilina frente a cepas de Staphyloccus aureus vancomina
intermediários (VISA) encontraram atividade sinérgica entre a flavona e ambos os
antimicrobianos representados por índice da fração inibitória fracionada (FIC) de 0,094 e
0,126 respectivamente.
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Avaliando o efeito sinérgico entre o extrato aquoso de Psidium guineense Swartz
(Araçá-do-campo) e antibióticos, Fernandes et al.(2012) observaram que a associação entre o
extrato e os antibióticos exibiu uma concentração inibitória mínima (CIM) oito vezes menor
do que as substâncias isoladas e FICI entre 0,125 a 0,5.
Sinergismo entre ácido úsnico e antibióticos frente a cepas de Staphylococcus aureus
foi observado por Segatore et al (2012) tendo o ácido úsnico exibido efeito sinérgico com
clindamicina, gentamicina e oxacilina quando analisados pelo método do índice da
concentração inibitória fracionada.
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3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a ação sinérgica entre o ácido úsnico e cinco agentes antimicrobianos frente
a cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistentes (MRSA) .
3.2 Específicos
Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida
mínima (CBM) do ácido úsnico e dos antimicrobianos, ciprofloxacina, oxacilina,
gentamicina e penicilina frente a dez cepas de S. aureus meticilina resistentes;
Avaliar o tipo de interação entre o ácido úsnico e antimicrobianos frente a cinco
cepas de MRSA pelo método do tabuleiro de xadrez.
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Coleta do Material liquênico
Cladonia substellata Vainio foram coletadas por Bruno Rafael Rodrigues Monteiro
em 12 de setembro de 2013 na cidade de Mamanguape, estado da Paraíba (06º 42' 42,4" S
35º 07' 0" O) e identificadas pela bióloga Maria de Lourdes Lacerda Buril. Uma exsicata
foi depositada no herbário prof. Geraldo Mariz, Departamento de Botânica da Universidade
Federal de Pernambuco e registrado sob o número 75705.
4.2 Preparação do extrato
O talo de C. substellata, 12,76g foi triturado e submetido à extração por esgotamento
a frio com éter etílico P.A. (Sigma Aldrich). O extrato obtido foi em seguida concentrado
até a secura em rotaevaporador acoplado a banho-maria a 40 ºC. O extrato etéreo de C.
substellata foi purificado em coluna de sílica gel (Merck, de porosidade 70-230 mesh ).
Eluída com o sistema de solvente composto por clorofórmio: n-hexano (80:20 v/v) conforme
a metodologia descrita por Odabasoglu et al. (2006).
4.3 Identificação e confirmação estrutural do ácido úsnico
A identificação do ácido úsnico e sua confirmação estrutural foi realizada através da
análise por espectrometria de infravermelho em espectrômetro modelo IF566 usando discos
de KBr marca Bruker Fourier, ressonância magnética nuclear marca Varian Unity Plus 300
4.3 Microrganismos
Neste trabalho foram utilizadas cepas de Staphylococcus aureus (n=10) isoladas
de amostras clínicas, bem como duas cepas padrão obtida do “American Type Culture
Collection”, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e ATCC 33591.
O fenótipo de resistência destas cepas foi obtido através do método de difusão em
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meio sólido para diversos agentes antimicrobianos, betalactâmicos, fluoroquinolônicos, e
aminoglicosídeos, tetraciclina e sulfa. Estas cepas foram mantidas a – 80 °C em caldo
Brain Heart Infusion – BHI (Acumedia Manufacturers®, USA), contendo 20% v/v
glicerol. A reativação destas culturas foi realizada a cada experimento.
4.4 Preparação do inóculo
As culturas de Staphylococcus aureus foram preparadas em caldo Mueller Hinton e
incubadas por 24 horas. Após o período de incubação estas culturas foram padronizadas
em 108
UFC/mL, utilizando o tubo 0,5 da escala de Mac Farland, e em seguida diluídas
em soro fisiológico a fim de obter um inóculo final de 107
UFC/mL.
4.5 Agentes antimicrobianos
Os agentes antimicrobianos foram adquiridos juntos as seguintes empresas:
Laboratório Teuto brasileiro S/A - penicilina, Novafarma Indústria Farmacêutica - oxacilina
Hipolabor Farmacêutica LTDA - gentamicina, Eurofarma Laboratório do Brasil LTDA –
ciprofloxacino.
Ciprofloxacino (CIP), gentamicina (GEN), oxacilina(OXA) e penicilina G (PEN)
tiveram potência determinada através de compêndio oficial (United States of America
Pharmacopea). A resistência a estes antimicrobianos das cepas de Staphylococcus aureus
utilizadas neste estudo foi definida para cada caso : ciprofloxacino ( CIP, CIM ≥ 4μg/mL);
gentamicina (GEN, CIM 8μg/mL); oxacilina (OXA, CIM 4μg/mL) e penicilina G (PEN,
CIM 0,25μg/mL) de acordo com os critérios estabelecidos pelo Clinical Laboratory
Standard Institute (CLSI,2012).
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4.6 D eterminação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida
Mínima ( CBM)
Para determinação da CIM foi utilizado o método de microdiluição, modificado
(CLSI, 2010). Este ensaio foi realizado em placas de microdiluição, com 96 poços de
fundo em forma de “U”.
O ácido úsnico e os agentes antimicrobianos foram pesados analiticamente e
depois solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) e água destilada esterilizada de forma
a obter uma solução de 1280 µg/mL para o ácido úsnico e 2048 µg/mL para os agentes
antimicrobianos. Destas soluções, 200 µL foram pipetados nos orifícios de 1 a 12 da linha
A. Os demais poços foram preenchidos com 100 µL de caldo Mueller Hinton. Uma
alíquota de 100 µL do conteúdo de cada orifício da linha A foi transferido para a linha B,
e este procedimento foi repetido até a linha H, a fim de obter concentrações que variaram
de 32 a 0,125 µg/mL para o ácido úsnico e de 512 a 0,06 µg/mL para os agentes
antimicrobianos
Um volume de 5 µL (5X107 UFC/mL) das culturas padronizadas de S. aureus foi
inoculado em todos os orifícios. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35°C
por 24 horas.
A inibição do crescimento bacteriano foi demonstrada pela adição a cada um dos
orifícios da microplaca d e 20 µL de uma solução aquosa de rezasurina a 0,002% e
reincubadas por duas horas a 35°C (Figura 3).Em meio ácido, a rezasurina que tem cor azul
é reduzida a rezofurina passando à coloração rosa (MANN; MARKHAM, 1998).
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Figura 3 – Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do ácido
úsnico e agentes antimicrobianos
A este experimento foi adicionado uma placa de microdiluição como controle
do crescimento das cepas de S. aureus.
A CIM foi definida como a menor concentração do agente antimicrobiano capaz
de inibir o crescimento visível das cepas de S.aureus.
A determinação da CBM foi realizada de acordo com os valores da CIM. Dessa
forma concentrações mais altas que a CIM foram semeadas em Mueller Hinton Agar e
incubadas por 24 horas a 37˚C. A CBM foi definida como a menor concentração do ácido
úsnico ou agente antimicrobiano capaz de matar 99,9% das cepas de S. aureus.
4.7 Determinação in vitro da atividade sinérgica
O estudo da interação entre o ácido úsnico e antimicrobianos foi realizado de acordo
com o método do tabuleiro de xadrez (checkerboard method) (LORIAN, 2005).
Com base nos valores da CIM foram preparadas soluções em caldo Mueller Hinton
de ácido úsnico e dos agentes antimicrobianos de forma a obter concentrações que variaram
de 0,5xCIM a 0,016xCIM e de 0,5xCIM a 0,002xCIM, respectivamente. Nos orifícios das
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placas de microdiluição, foram pipetados 100 µL do ácido úsnico e 100 µL do agente
antimicrobiano (Figura 4).
Figura 4 – Representação do método do tabuleiro de xadrez (Checkerboard method).
Cada poço foi inoculado com 5 µL da suspensão bacteriana contendo 107
UFC/mL
das seguintes cepas, AM 13, AM18, AM 21, AM 24 e ATCC 33591.
A interpretação destas interações foi realizada através do cálculo Índice da
Concentração Inibitória Fracionada (FICI) pela seguinte equação FICI = (CIM da
associação ácido úsnico e agente antimicrobiano/CIM de ácido úsnico) + (CIM da
associação agente antimicrobiano e ácido úsnico/CIM do agente antimicrobiano). Valores
do FICI ≤ 0,5 foram interpretados como uma interação sinérgica total; 0,5 < FICI ≤ 0,75
um sinergismo parcial. Uma interação indiferente quando os valores do FICI foram entre
0,75 < FICI ≤ 2,0 e um efeito antagônico quando FICI foi maior que 2,0 (FADLI et al.,
2012)
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40
5. RESULTADOS
5.1 Perfil Fitoquímico
A partir de 12,76 gramas de talo de Cladonia substellata foi obtido um pó de
coloração amarelo de odor suis generis e com rendimento de 2,42%.
As análises dos espectros de Infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de
Prótons (RMNH1), confirmaram a estrutura química do ácido úsnico de acordo com os
seguintes resultados:
Cristais amarelo sólidos,
ponto de fusão : 201 – 203 °C, [α]D a 25 °C + 495° (CHCl3 c, 1,00)
IV (KBr, ƛmax cm-1
): 3007, 2930, 1692, 1632, 1542, 1453, 1375, 1357, 1340, 1330,
1290, 1230, 1190, 1145, 1118, 1070, 1039, 959, 940, 840, 818, 600
RMNH1 (300 MHz, DMSO-d6, δ): 1,74 (3H; s, CH3-13), 2,00 (3H; s, CH3-16), 2,59
(3H; s, CH3-15), 2,67 (3H; s, CH3-18), 6,31 (1H; s, C-4-H), 11,30 (1H; s, C-10-OH), 13,39
(1H; s, C-8-OH), 18,90 (1H; s, C-3-OH)
5.2 A atividade antimicrobiana do ácido úsnico e agentes antimicrobianos
Os valores da CIM e CBM do ácido úsnico e do ciprofloxacino (CIP),
gentamicina(GEN), oxacilina (OXA) e penicilina G (PEN) contra doze cepas de
Staphylococcus aureus estão apresentados na tabela 2.
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41
Tabela 1 - CIM e CBM do ácido úsnico e de agentes antimicrobianos frente a cepas de
Staphylococcus aureus com diferentes perfis de resistência
Staphylococcus
aureus
CIM / CBM (µg/ml) Fenótipo de resistência Origem
AU PEN OXA CIP GEN
ATCC 25923 16/16 0.125/0.125 0.125 /
0.25
0.125 /
0.125 0.25 / 0.25 Cepa controle (MSSA) ATCC
ATCC 33591 8/16 32/32 128/128 0.125 /
0.125 0.5/1 Cepa controle (MRSA) ATCC
AM04 16/16 0.125/0.125 0.25/0.,25 0.125 /
0.125
0.125 /
0.125 CFX; AMP; AZI; OXA
Secreção
vaginal
AM13 16/16 32/64 512/512 64/128 64/64 CFX; CIP; AMP; AZI;
OXA Sangue
AM18 8/16 64 / 64 512/512 64/128 128 / 256 CFX; OXA; AMP; AZI Sangue
AM19 8/16 8 / 16 64 / 128 0.25 / 0.5 0.25 / 0.5 CFX; OXA; CIP;
SZT; AMP; AZI; AMC
Secreção
traqueal
AM20 8/16 16 / 16 16 / 16 64/128 0.25 / 0.25 CFO; OXA; CIP; GET;
SZT; AMP; AZI; AMC Sangue
AM21 8/16 16 / 16 16 / 16 64/128 0.25 / 0.5 CFO; OXA; AMP; AMC Sangue
AM24 8/16 16/16 256 / 256 64/128 256 / 512 CFO; OXA; CIP; AMP;
AZI
Secreção
traqueal
IC17 8/16 4/4 4/4 0.25/0.5 4/8 CFO; OXA; CIP; AMP;
AZI
Secreção
traqueal
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42
O ácido úsnico mostrou forte atividade contra todas as cepas de S. aureus com CIM
valores entre 8 e 16 µg/mL. As cepas de S. aureus revelaram um perfil de resistência contra
a maioria dos agentes antimicrobianos testados. Os valores da CIM para penicilina G
variaram de < 0,125 - 64 µg/mL e oxacilina de < 0,125 – 512 µg/mL, que mostraram ser
menos eficazes contra as cepas de S. aureus testadas. Entre todas as cepas de S. aureus
testadas, cinco mostraram-se resistentes ao ciprofloxacino com valores de CIM de 64
µg/mL. Para a gentamicina os valores CIM variaram de
-
43
aditivo (FICI 1,0) em todas as cepas com exceção da cepa AM13. Nesta cepa a associação
entre o ácido úsnico (CIM individual 16 µg/mL) e penicilina G (CIM individual 32 µg/mL)
reduziu a CIM para 8 µg/mL e 0,0156 µg/mL respectivamente FICI (0,5).
A associação gentamicina (CIM individual 0,5-512 µg/mL) e ácido úsnico (CIM
individual 8-16 µg/mL) apresentou efeito sinérgico nas cepas AM 18, AM 21e AM 24 com
redução da CIM da gentamicina para 0,125- 256 µg/mL ( 1/2 x CIM) FICI (0,5) e efeito
indiferente nas cepas ATCC33598 e AM 13 FICI (1,0)
Em todas as associações com os antibióticos houve redução da CIM do ácido úsnico
(CIM individual 8-16 µg/mL) para até 1/128 x CIM (CIM associação 0,063 -8µg/mL).
-
44
Tabela 2 Interação do ácido úsnico com agentes antimicrobianos
CIM: Concentração Inibitória Mínima; FIC: Concentração Fracionária Mínima; ; % redução CIM: (CIM individual– CIM combinação) x100/CIM individual CIP: Ciprofloxacino; GEN: Gentamicina; OXA: Oxacilina; PEN: Penicilina G; AU: Ácido Úsnico; LFBM: Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Micro-organismos
Staphylococcus
aureus Associação
CIM Individual
(µg/mL)
Associação
CIM (µg/mL)
FIC
Individual
FICI
Efeito Redução da
CIM (%)
ATCC 33591
AU+CIP
AU+GEN
AU+OXA
AU+PEN
8/0.125
8/0.5
8/128
8/32
0.063/0.062
0.125/0.5
0.063/64
0.063/32
0.0078/0.5
0.0156/1.0
0.0078/0.5
0.0078/1.0
0.5
1.0
0.5
1.0
Sinérgico
Indiferente
Sinérgico
Indiferente
99.2/50.0
98.4/0
99.2/50.0
99.2/0
AM13
AU+CIP
AU+GEN
AU+OXA
AU+PEN
16/64
16/64
16/512
16/32
4/8
0.125/64
0.125/128
8/0.0156
0.25/0.125
0.0078/1.0
0.0078/0.25
0.5/0.0005
0.37
1.0
0.25
0.5
Sinérgico
Indiferente
Sinérgico
Sinérgico
75.0/87.5
99.2/0
99.2/75.0
50/99.9
AM18
AU+CIP
AU+GEN
AU+OXA
AU+PEN
8/64
8/0.25
8/512
8/64
4/0.031
0.063/0.125
0.063/256
0.063/64
0.5/0.0005
0.0078/0.5
0.0078/0.5
0.0078/1.0
0.5
0.5
0.5
1.0
Sinérgico
Sinérgico
Sinérgico
Indiferente
50.0/99.9
99.2/50.0
99.2/50.0
99.2/0
AM21
AU+CIP
AU+GEN
AU+OXA
AU+PEN
8/64
8/0.25
8/8
8/16
4/0.031
0.063/0.125
4/4
4/8
0.5/0.0005
0.0078/0.5
1/1
0.5/0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
Sinérgico
Sinérgico
Indiferente
Indiferente
50.0/99.9
99.2/50.0
50.0/50.0
50.0/50.0
AM24
AU+CIP
AU+GEN
AU+OXA
AU+PEN
8/64
8/512
8/256
8/16
4/0.031
0.063/256
0.063/128
0.063/16
0.5/0.0005
0.0078/0.5
0.0078/0.5
0.0078/1.0
0.5
0.5
0.5
1.0
Sinérgico
Sinérgico
Sinérgico
Indiferente
50.0/99.9
99.2/50.0
99.2/50.0
99.2/0
-
45
6 DISCUSSÃO
Os líquens são organismos simbióticos que são compostos de fungos e algas. Os
líquens têm sido utilizados em vários campos, especialmente como fonte de drogas naturais
na indústria farmacêutica e suplemento alimentar. Seus metabólitos têm revelado
propriedades antitumorais, antivirais, antimicrobianas, antiinflamatórias e antioxidantes
(DEVARAJA, 2012)
A composição química dos líquens é bastante variada e apesar de seu uso ser bastante
conhecido na medicina tradicional e de suas potencialidades terapêuticas reconhecidas, a
indústria farmacêutica moderna não tem explorado totalmente estas propriedades dada a
grande dificuldade em se obter culturas puras e condições para um crescimento rápido,
essenciais para o uso em larga escala (DEVARAJA, 2012).
Dentre os compostos liquênicos bem caracterizados, o ácido úsnico é o mais estudado,
sendo utilizado pela indústria em cosméticos, antissépticos, produtos de higiene pessoal,
xampus, desodorantes, creme dental (POLAT et al., 2013)
Ácido úsnico possui atividade antimicrobiana comprovada principalmente em
bactérias Gram positivas. Vários estudos tem demonstrado ação do ácido úsnico contra
Staphylococcus aureus meticilina resistentes (ELO; MATIKAINEN; PELTTARI, 2007;
GUPTA et al., 2012; POMPILIO et al., 2013; SEGATORE et al., 2012)
A avaliação de atividade antimicrobiana através do sinergismo entre substâncias é
uma metodologia estabelecida e vem sendo utilizada como um recurso adjuvante no
tratamento de microrganismos que apresentam elevada resistência aos antimicrobianos como
S. aureus MRSA (HEMAISWARYA; KUMAR; DOBLE, 2008; LANGEVELD;
VELDHUIZEN; BURT, 2014; WOLSKA; GRZES; KUREK, 2012)
Neste estudo, um efeito sinérgico do ácido úsnico contra cepas de S. aureus MRSA,
foi observado para as associações com beta-lactâmicos, fluoroquinolonas e aminoglicosideos
tendo a associação entre ácido com ciprofloxacino exibido efeito sinérgico sobre todas as
cepas avaliadas.
-
46
Ácido úsnico é altamente lipofílico em ambas as formas neutra e aniônica devido aos
seus grupos cetônicos que absorvem a carga negativa do anion levando à estabilização da
molécula por ressonância. Segundo a teoria quimiosmótica, estas moléculas se difundem
facilmente através das membranas biológicas em suas formas carregadas e neutras, o que
resulta na quebra ou desacoplamento de gradientes de íons. Desta forma, em eucariotos o
ácido úsnico pode passar através das membranas internas das mitocôndrias por difusão
passiva para a matriz, onde é ionizado, libertando um próton . O anion usnato resultante pode,
em seguida, voltar e difundir-se no espaço inter-membranar, onde se liga a um próton na
membrana interna para então voltar a forma ácida difundindo-se para o interior da matriz. O
ciclo resultante faz com que ocorra uma liberação de prótons que desestabiliza o gradiente de
prótons da membrana interna interrompendo o forte acoplamento entre o transporte de
elétrons e a síntese de adenosina trifosfato (ATP). Este caráter lipofílico do ácido úsnico e do
anion usnato permite ao ácido úsnico se comportar portanto, como um desacoplador de
membrana de um modo semelhante ao 2,4-dinitrofenol (GUO et al., 2008).
A atividade antimicrobiana do ácido úsnico contra uma grande variedade de bactérias
gram-positivas, independentemente do seu fenótipo de resistência, tem sido relacionada a sua
propriedade de desacoplamento de membrana.(GUO et al., 2008; JOSEPH et al., 2009)
Estudando a ação antimicrobiana do L-(-)-ácido úsnico sobre Staphylococcus aureus
meticilina resistentes Gupta et al (2012) utilizando as técnicas de Time Kill Curve, citometria
de fluxo e índice de tolerância ao sal, reportaram que a exposição das cepas de S.aureus
MRSA ao ácido úsnico reduziu o número de células viáveis sem alterações na parede celular
indicando claramente que a ação ocorreu através de um dano na fisiologia da membrana
celular.
Considerando os dados obtidos neste trabalho, o sinergismo entre o ácido úsnico e os
antimicrobianos beta-lactâmicos pode ser explicado pelo fato de que o mecanismo de ação
destes agentes ocorre através da lise da parede celular (VON NUSSBAUM et al., 2006)
enquanto que o ácido úsnico desestrutura a membrana celular e consequentemente a síntese
de ATP.
A atividade sinérgica entre a gentamicina e o ácido úsnico pode ser justificada pela
passagem deste aminoglicosídeo ser facilitada pela ação do ácido úsnico na membrana celular
-
47
e esta etapa é fundamental para ação deste antimicrobiano na sub-unidade 30S dos
ribossomos dos procariotos (AVENT et al., 2011).
Ciprofloxacino age nas enzimas DNA girase e topoisomerase IV (CHENG et al.,
2013). Estas enzimas em conjunto auxiliam na manutenção da integridade e topologia do
DNA bacteriano. A girase primariamente introduz superenovelamento negativo no DNA, e a
topo IV, embora intimamente relacionada com a girase, preferencialmente desencadeia o
DNA plasmidial e relaxa o superenovelamento positivo, funções essenciais para a replicação
e transcrição do DNA(PAPILLON et al., 2013). O ácido úsnico atuando na desestruturação da
membrana celular bacteriana através de desacoplamento de prótons dificulta a síntese de ATP
que é essencial para os processos de replicação, transcrição e tradução do DNA tendo uma
ação sinérgica com ciprofloxacino.
No único estudo publicado até o momento avaliando a ação sinérgica do ácido úsnico
e antimicrobianos frente a S. aureus multidroga resistentes, Segatore et al (2012) encontraram
sinergismo significativo com oxacilina e gentamicina apenas, enquanto que a combinação do
ácido úsnico com levofloxacino foi considerada indiferente pelo método do FICI e antagônico
pelo método de ΔΕ, neste método o efeito das drogas em associação é calculado a partir do
efeito das drogas individuais e é comparado com os obtidos experimentalmente . Entretanto
estes autores não esclarecem as possíveis causas para este achado uma vez que é raro observar
antagonismo entre agentes fluoroquinolônicos e outros antibióticos.
.
-
48
7 CONCLUSÕES
Efeitos sinérgicos resultantes da combinação de agentes antimicrobianos com
substâncias de origem não sintética têm sido documentados em vários estudos. Dados da
literatura, bem como nossos resultados revelam o potencial do ácido úsnico para o
tratamento terapêutico. Portanto, mais estudos precisam ser conduzidos para busca de
formas farmacêuticas adequadas e avaliação da toxicidade in vivo.
O efeito antibacteriano do ácido úsnico e o efeito sinérgico deste metabólito
secundário em associação com os antimicrobianos beta-lactâmicos, fluoroquinolônicos e
aminoglicosídeos pode ser uma alternativa viável para o tratamento de doenças infecciosas
causadas por Staphylococcus aureus multidroga resistentes.
-
49
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