CLUDIA PEREZ TRINDADE

EFEITO DO USO DE GOMA DE MASCAR CONTENDO XILITOL

SOBRE OS NVEIS SALIVARES DE ESTREPTOCOCOS DO GRUPO

MUTANS, SOBRE OS GENTIPOS DE S. MUTANS E SOBRE A

PRESENA DE AMOSTRAS XILITOL-TOLERANTES NA SALIVA

So Paulo

2005

Cludia Perez Trindade

Efeito do uso de goma de mascar contendo xilitol sobre os nveis

salivares de Estreptococos do grupo mutans, sobre os gentipos

de S. mutans e sobre a presena de amostras xilitol-tolerantes na

saliva

Tese apresentada Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo, para obter o ttulo de Doutor, pelo Programa de Ps-Graduao em Odontologia. rea de Concentrao: Odontopediatria Orientador: Profa. Dra. Mrcia Pinto Alves Mayer

So Paulo

2005

FOLHA DE APROVAO

Trindade CP. Efeito do uso de goma de mascar contendo xilitol sobre os nveis salivares de Estreptococos do grupo mutans, sobre os gentipos de S. mutans e sobre a presena de amostras xilitol-tolerantes na saliva [Tese de Doutorado]. So Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2005.

So Paulo, / /2005.

Banca Examinadora

1) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________

Titulao: _________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura:___________________________

2) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________

Titulao: _________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura:___________________________

3) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________

Titulao: _________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura:___________________________

4) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________

Titulao: _________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura:___________________________

5) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________

Titulao: _________________________________________________________

Julgamento: __________________ Assinatura:___________________________

DEDICATRIA

A todos aqueles que um dia foram meus alunos e aos que ainda so, por darem

sentido a todo tempo que vivi dedicando-me ao ensino e docncia. Foi graas

vocs, pela confiana, carinho e apoio que me deram, que obtive motivao durante

todo perodo de elaborao deste trabalho.

A todos aqueles que fazem da docncia e da pesquisa um caminho sem volta de

dedicao, trabalho, esforo e perseverana, muitas vezes com sacrifcios de suas

vidas pessoais, passando por dificuldades e adversidades em muitos aspectos, mas

sempre dando o melhor de si aos seus aprendizes, com dignidade, competncia,

amor e respeito, dedico este trabalho. Em especial a trs grandes mulheres, amigas

e professoras, exemplos reais de tudo que foi dito anteriormente, s quais devo meu

sincero e profundo agradecimento, Professora Dra. Maria Salete Nahs Pires

Corra, Professora Dra. Clia Regina Martins Delgado e Professora Dra. Mrcia

Pinto Alves Mayer.

memria da minha amada av Adelina Perez.

memria de um querido amigo, Prof. Dr. Ricardo Simo Mathias, por tudo que me

ensinou em todos os momentos de agradvel convvio.

AGRADECIMENTOS

minha orientadora, Profa. Dra. Mrcia Pinto Alves Mayer, por dar-me a

oportunidade de tamanho aprendizado em seu laboratrio, pela pacincia,

disponibilidade e carinho dedicado a este trabalho, pela competncia em conduzir a

orientao e realizao deste estudo, pela amizade, pelo companheirismo, pelos

conselhos, por ser to exemplar e admirvel, por tudo!!!! Muito obrigada!

Ao meu querido Professor Dr. Antnio Carlos Guedes-Pinto, que me conduziu at

aqui com sua mo amiga e firme, grande mestre, amigo e companheiro, que tantas

vezes me ajudou a levantar dos tombos! Obrigada pelo respeito, carinho e

compreenso com que sempre me tratou, mesmo nos (poucos) momentos de

discrdia que tivemos. O senhor sabe de todo carinho que lhe tenho e sempre

morar em meu corao.

Aos Professores da Disciplina de Odontopediatria, da minha amada casa e escola,

Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo: Profa. Dra. Clia Regina

Martins Delgado Rodrigues, Profa. Dra. Maria Salete Nahs Pires Corra, Profa.

Dra. Ana Ldia Ciamponi Martins, Profa. Dra. Mrcia Turolla Wanderley, Profa. Dra.

Ana Estela Haddad, Prof. Dr. Marcelo Jos Strazzeri Bnecker, Prof. Dr. Jos Carlos

Petorossi Imparato, pela amizade e convivncia cientfica compartilhada.

Aos QUERIDOS amigos que fiz no Laboratrio de Microbiologia Oral do Instituto de

Cincia Biomdicas II, sem os quais no teria conseguido: Cludia Ota, Francisco

Csar Barbosa, Alessandra Carvalho, Josely Umeda, Dione Kawamoto, Ellen Sayuri,

Amanda Prestia, Tnia Schalch, Josely Umeda, Francisco Pina, Daniel Anzai,

Adriana Ribeiro, Thas Thom, Silvia Teixeira, Irineu Pedron, Vera Fantinatto, e,

especialmente, Fbio Luis Lembo, Ana Carla Robatto e Priscila Larcher Longo

(meus irmos na vida), minha eterna gratido pelo carinho, disposio, colaborao,

apoio cientfico, tcnico e emocional que me dedicaram. Vocs permanecero para

sempre na minha lembrana e em meu corao!

Aos funcionrios do Departamento de Ortodontia e Odontopediatria Viviane, Edna,

Marinalva, Clemncia, Izilda, Marize e, especialmente Conceio (curtindo agora sua

aposentadoria), Julio e Ftima, que me apoiaram sempre!

A todos os funcionrios da FOUSP, da diretoria biblioteca, passando por todos os

departamentos at o bar do Dentinhos, meus agradecimentos pelo apoio,

coolaborao, pacincia e amizade nestes 20 anos de convvio carinhoso!

Cleide Rosana Duarte Prisco pela realizao da anlise estatstica.

bibliotecria Glauci Elaine Damasio Fidelis pela formatao do texto e

normalizao das referncias bibliogrficas.

Ao funcionrio do ICB II Joo Paulo pelo apoio, ensinamentos, coleguismo e

colaborao efetiva neste trabalho.

s minhas grandes e maravilhosas amigas Tnia Corra, Eliete Domingues Almeida

e Eliana Hitomi Kawahara, por tornarem minha vida mais doce nos momentos mais

amargos. Sou muito feliz por t-las sempre por perto.

Aos colegas e professores companheiros de trabalho da Universidade Mogi das

Cruzes (UMC) Elaine Marclio dos Santos, Sandra Kalil Bussadori, Heloisa Helena

Cardoso Guedes, Eliete Almeida e Marcos Augusto do Rego (inesquecvel) pelos

momentos alegres, gratificantes e agradveis no trabalho.

A todos os colegas do Curso de Ps-Graduao em Odontopediatria, pela amizade

e companheirismo, em especial Henrique Ruschel e Symonne Parizotto, e,

principalmente , s amigas Alessandra Nassif e Isa Gontijo, elas sabem o porqu!

Aos meus pais Rui Trindade e Neusa Peres Trindade, meus irmos Osvaldo, Andra

e Ronaldo, meus familiares, em especial minhas tias Djanira Trindade e Ana Lcia

Trindade, por fazerem de mim uma pessoa feliz, contagiando minha vida com bons

exemplos de fora, garra, persistncia, superao, retido de conduta e carter e,

especialmente, de MUITA ALEGRIA!

Aos voluntrios que, com todo desprendimento e disponibilidade, se dispuseram a

participar com seriedade e dedicao deste estudo. Sem vocs este trabalho no

seria possvel. Mais uma vez: muito obrigada!

Aos amigos da odontologia Abdo-Pinheiro: Dra. Miriam Abdo Pinheiro e Dr. Joo

Francisco de Camargo Pinheiro Junior, Dra. Marina Coelho , Rosana Reis, Lcia,

Paula, Edilena e Jane pela pacincia, incentivo, compreenso e apoio durante este

perodo.

Perfetti Van Melle do Brasil pelo fornecimento das gomas de mascar e pelas

informaes sobre o produto.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela

bolsa de estudo oferecida durante parte do curso.

Lecionar tambm ouvir os apelos que ecoam na alma do educando. Mais do que

avaliar as provas e dar notas, o importante ensinar com amor, mostrando que sempre

possvel fazer a diferena.

Autor desconhecido

Spread your wings and get higher and higher... straight up well climb; so, baby

dry your eyes, save all the tears you cry. Oh! Thats what dreams are made of!!!

(Dreams - Van Halen)

Trindade CP. Efeito do uso de goma de mascar contendo xilitol sobre os nveis salivares de Estreptococos do grupo mutans, sobre os gentipos de S. mutans e sobre a presena de amostras xilitol-tolerantes na saliva [Tese de Doutorado]. So Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2005.

RESUMO

Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito do uso de goma de mascar contendo

15% de xilitol, por 30 dias, em 12 indivduos com altos nveis salivares (= 105

u.f.c./ml de saliva) de Estreptococos do grupo mutans (SM) sobre os nveis salivares

de SM, os gentipos de S. mutans e a ocorrncia de amostras xilitol-tolerantes (X R)

na saliva. Os voluntrios foram instrudos a mascarem a goma por 5 minutos, 5

vezes ao dia, durante 30 dias, sem realizarem nenhuma alterao nos hbitos de

higiene ou dieta. Amostras de saliva foram coletadas no incio do experimento (antes

do consumo da goma de mascar), 30 dias aps a utilizao da goma de mascar e 30

dias aps a interrupo do uso da goma. Dois voluntrios foram excludos da ltima

coleta devido ao uso de antibiticos. Os resultados mostraram que ocorreu reduo

acentuada nos nveis salivares de SM. A concentrao mdia de SM no exame

inicial foi de 9,8 x 105 2,61 x 105 UFC/ml de saliva, enquanto este valor foi de 2,17

x 105 1,94 x 105 aps o consumo da goma, sendo a diferena estatisticamente

significante (p < 0,05). Porm este efeito no foi duradouro, no apresentando

diferena estatstica 30 dias aps a interrupo do consumo (3,5 x 105 2,71 x 105),

em relao aos valores iniciais. Foram identificados 17 gentipos distintos de S.

mutans nas amostras salivares de 10 voluntrios, que completaram as 3 etapas do

estudo, pela tcnica de RAPD-PCR, com o iniciador OPA-2. O ensaio de tolerncia

de S. mutans ao xylitol in vitro, em meio BHI e BHI /xilitol 1%, permitiu a identificao

de 12 amostras XR entre 124 amostras estudadas, representantes dos 17 gentipos

distintos. Amostras de S. mutans (XR) foram identificadas nas 3 coletas, inclusive

antes do consumo da goma. Foram identificadas amostras XR e XS com o mesmo

gentipo por RAPD-PCR. A prevalncia de amostras XR no apresentou relao

direta com o uso de xilitol ou com os tipos genotpicos. Baseados nas condies do

presente estudo, os resultados sugerem que o uso regular de gomas de mascar

contendo 15 % de xilitol por 30 dias contribui para a reduo dos nveis salivares de

SM durante o perodo de consumo, porm esta reduo no persiste aps a

interrupo do uso. Alm disso, foi observado que o uso de xilitol no foi fator

determinante na seleo in vivo de determinado gentipo XR.

Palavras-Chave: xilitol; crie dentria; S.mutans; goma de mascar.

Trindade CP. Effect of xylitol-containing chewing gum consumption on salivary mutans streptococci levels, on genotypes of S.mutans and on the presence of xylitol-resistant strains in saliva [Tese de Doutorado]. So Paulo: Faculdade de Odontologia da USP; 2005.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of xylitol (15%) containing chewing

gum, for 30 days , in 12 subjects with high mutans Streptococci (MS) salivary levels (=

105 c.f.u./ml) on Mutans streptococci (MS) salivary levels, on genotypes and

detection of xilitol tolerant (XR) strains of S. mutans. Volunteers were asked to chew

one lozangle, for 5 minutes, five times per day, for 30 days with no change in their

habitual diet or oral hygiene. Saliva samples were collected at baseline, 30 days after

gum usage and 30 days after the interruption of the consumption. Two subjects were

excluded from the last examination due to antibiotic use. The results showed a

marked reduction in MS salivary levels. The average levels of MS in saliva in

baseline was 9.8 x 105 2.61 x 105 c.f.u./ml saliva and decreased to 2.17 x 105

1.94 x 105 after 30 days of consumption. This difference was statistically significant

(p< 0.05). However this effect was not long lasting, and 30 days after the interruption

of consumption (3.5 x 105 2.71 x 105) there was no statistically difference in relation

to baseline data. Seventeen different genotypes were identified in MS salivary

samples of 10 volunteers that completed the 3 sampling procedures, by RAPD-PCR

using OPA-2 primer. The assay of xylitol tolerance of S. mutans in vitro, in BHI and

BHI/1% xylitol allowed the identification of 12 XR isolates, among 124 tested strains

representing all detected genotypes. XR strains were detected in all sampling steps,

including at baseline, before chewing gum consumption. There were XR and XS

isolates with the same genotypes by RAPD-PCR. The prevalence of XR strains did

not show direct relation to consumption of xylitol neither to genotypes. Based on the

conditions of the present study, the data suggested that the regular use of a chewing

gum containing 15% xylitol for 30 days contributed to decrease MS salivary levels,

however this decrease did not persist after the interruption of the consumption. In

addition, the usage of xilitol was not a determinant to the emergence of a specific XR

genotype in vivo.

Keywords: Xylitol Dental caries mutans streptococci - chewing gum

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

ATP molcula de energia de Adenosina Trifosfato

SM Estreptococos do grupo mutans

u.f.c./ml Unidades formadoras de colnias por mililtro de saliva

PCR Reao de polimerase em cadeia

RAPD-PCR Reao de PCR utilizando iniciadores arbitrrios

AP-PCR Reao de PCR utilizando iniciadores arbitrrios

PFGE Reao de genotipagem utilizando Pulsed field gel eletrophoresis

BHI Meio de cultura Brain Heart Infusion, contendo infuso de clulas de

crebro e corao.

FDA Food and Drug Administration

nm nanmetros

LISTA DE SMBOLOS

oC graus Celsius

l microltro

CO2 gs carbnico

% por cento

Abs 450 nm medida de densidade ptica para turvao de solues utilizando-se

filtro de absorbncia de 450 nanmetros

XR S. mutans xilitol-tolerante

XS S. mutans xilitol-sensvel

SUMRIO

p.

1 INTRODUO ........................................................................................15

2 REVISO DA LITERATURA..................................................................20

2.1 Efeitos preventivos do xilitol e sua ao sobre Streptococcus

mutans........................................................................................................21

2.2 Streptococcus mutans e a tolerncia ao xilitol.....................................36

3 PROPOSIO ........................................................................................48

4 MATERIAL E MTODOS .......................................................................49

5 RESULTADOS ........................................................................................57

6 DISCUSSO ...........................................................................................82

7 CONCLUSES .......................................................................................99

REFERNCIAS ........................................................................................100

ANEXOS...................................................................................................108

15

1 INTRODUO

A crie dentria uma doena infecciosa dieta-dependente atribuda

primariamente presena de bactrias orais. A sacarose, um dissacardeo

constitudo por uma molcula de glicose e outra de frutose, considerada o principal

componente da dieta cariognica. Sua alta freqncia de ingesto leva seleo de

espcies acidricas na placa bacteriana, principalmente Streptococcus mutans (SM).

S.mutans particularmente virulento entre as bactrias orais por sua capacidade em

converter carboidratos fermentveis a cidos, principalmente cido ltico, que, em

contato com as superfcies dentais favorece a dissoluo do esmalte dental e incio

do processo carioso (LOESCH, 1986). Outros mecanismos de virulncia importantes

so a capacidade de sintetizar polissacardeos extracelulares, modificando as

caractersticas fsico-qumicas do biofilme, promovendo a adeso microbiana, bem

como sntese e estoque de polissacardeos intracelulares, utilizados por estas

clulas em perodos de ausncia de substrato energtico no ambiente; por sua

aciduricidade, conseguem sobreviver no meio cido, no sendo, portanto, afetados

pelos produtos de seu prprio metabolismo (MAO; ROSEN, 1980; MOBLEY, 2003).

Um grande nmero de substitutos do acar refinado (sacarose) tem sido

testado e utilizado na tentativa de preveno da crie dentria, sendo o xilitol

reconhecido como o mais promissor entre eles (GERING et al., 1976; ISOKANGAS

et al., 1991; ROGERS et al., 1991; SDERLING et al., 1997; KAKUTA et al., 2003).

O xilitol um lcool-acar natural com 5 carbonos, considerado agente

crie-preventivo. Com poder adoante similar ao acar, contendo 40% menos

calorias que a sacarose, produzido a partir de uma variedade de frutas e vegetais,

16

mas extrado principalmente da Btula e rvores especiais, cuja madeira

utilizada para fabricao de instrumentos musicais, contendo altas concentraes de

xilanos, prprias dos pases escandinavos. Atualmente, a produo mundial de xilitol

ultrapassa 10.000 toneladas por ano e direcionada principalmente confeco de

produtos manufaturados, na indstria alimentcia, farmacutica, cosmtica e de

higiene corporal e oral (LYNCH; MILGROM, 2003; MAGUIRE; RUGG-GUNN, 2003).

Em produtos da dieta, sua adio pode substituir todo ou parte do acar contido em

balas, doces e gomas de mascar (SINTES et al., 2002). Seu poder cariosttico, ou

at anticariognico, est associado a algumas propriedades especficas deste

adoante. O xilitol no fermentado cidos por praticamente nenhum dos

microrganismos orais, incluindo bactrias cariognicas como S.mutans e S.sobrinus,

no provocando queda do pH do biofilme dental, evitando a desmineralizao. Alm

disso, tem sido relatado que o uso de gomas de mascar e pastilhas contendo este

polilcool induz a diminuio da formao de biofilme dental, facilita o retorno do pH

para valores prximos ao neutro, favorece o tampo salivar por alterar a composio

de fosfato no meio bucal, alm de induzir o aumento do fluxo salivar pelo ato da

mastigao e estmulo gustativo, definindo seu efeito cariosttico (KAKUTA et al.,

2003; MOBLEY, 2003). A substituio total ou parcial do acar pelo xilitol na dieta

humana resulta numa considervel reduo na incidncia de crie dentria

(GERING et al., 1976; BECKERS, 1998; MAKKINEN et al., 1996). Em estudos

clnicos com a participao de humanos, seu consumo tem sido associado

reduo significativa de crie em crianas e adultos jovens (ROGERS et al., 1991;

ISOKANGAS et al., 1991; ISOKANGAS et al., 2000).

A transmissibilidade vertical do S.mutans relatada na literatura

(BERKOWITZ; JORDAN, 1975; BERKOWITZ; JONES, 1985; LI; CAULFIELD, 1995;

17

CAULFIELD, 1997; REDMO-EMANUELSSON; LI; BRATTHALL, 1998; SDERLING,

et al., 2000; ROBERTS et al., 2002). Alguns estudos procuram envolver o uso do

xilitol na preveno desta transmisso (HOUTE, 1981; ISOKANGAS et al.,2000;

SDERLING et al., 2000), postergando o estabelecimento da infeco na criana

com o uso de gomas de mascar contendo xilitol pela me, no perodo da janela de

infectividade da criana (SODERLING et al., 2001).

O principal sistema de transporte de hexoses bem demonstrado e conhecido

em S.mutans o Sistema-Fosfotransferase, tambm conhecido como sistema-PTS.

A sacarose, no meio bucal, sofre ao de enzimas salivares, sendo rapidamente

dissociada em dois monossacardeos distintos: frutose e glicose. Cada uma dessas

molculas ser transportada para o interior da clula bacteriana e fosforilada na via

glicoltica pelo seu sistema-PTS especfico, ou seja, sistema frutose-PTS e glicose-

PTS, mecanismos celulares constitutivos da bactria. Aps uma seqncia de

transferncias de grupamentos fosfatos, ao final da via glicoltica, a fosforilao

destes monossacardeos fornecer energia, sob a forma de ATPs e metablitos para

a excreo, sob a forma de cido ltico. O xilitol transportado e fosforilado pelo

sistema do metabolismo ligado fosforilao da frutose, ou seja, o sistema frutose-

PTS (TRAHAN et al.,1981; TRAHAN;MOUTON, 1987; TRAHAN; NRON; BAREIL,

1991).

A hiptese da no utilizao do xilitol como substrato pelos microrganismos

orais para a produo de cidos, em especial pelo S.mutans, baseia-se no fato de

que, ao entrar na clula bacteriana, o xilitol inicia o processo de fosforilao na via

glicoltica formando um composto intermedirio do metabolismo, o xilitol-5-fosfato,

que no metabolizado por nenhuma enzima. Assim, no leva formao de

cidos nem de energia (ATPs) no final da cadeia de fosforilao, mas torna-se um

18

produto txico para a clula. Com o intuito de livrar-se deste metablito, a clula

bacteriana exporta de seu citoplasma o composto formado, com gasto de energia.

Essa captao de xilitol para o interior da clula e posterior transporte do produto

para fora gera um ciclo conhecido como Ciclo Ftil que esgota os recursos

energticos da clula e, em ltima instncia, provoca o desgaste e morte celular por

depleo de energia (ROGERS et al.,1991; TRAHAN, 1995; KAKUTA et al., 2003;

MAGUIRE; RUGG-GUNN, 2003).

Porm, existem relatos de cepas de S.mutans com resistncia ao xilitol.

Knuuttila e Mkinen (1975), relataram que S.mutans se desenvolveram em meio de

cultura contendo xilitol aps algumas transferncias das bactrias neste meio, o que

chamaram de tolerncia adaptativa. Gauthier, Vandeboncoeur e Mayrand (1984),

tambm verificaram que a perda da sensibilidade ao xilitol ocorria progressivamente

em cepas de S.mutans cultivadas em laboratrio na presena de xilitol. Este

aparecimento natural e seletivo de uma populao de S.mutans considerada

espontaneamente resistente ao xilitol, ou mutantes naturais, como os autores

chamaram inicialmente , fez com que surgissem os termos amostras xilitol-

resistentes ou xilitol-tolerantes para design-las. Estas amostras com resistncia ao

xilitol tm sido consideradas menos virulentas que as amostras selvagens por

apresentarem menor poder de adeso ao biofilme, menor capacidade de produzir

glucanos insolveis e, especialmente , pela menor produo de cidos, sendo,

portanto, menos virulentas no que diz respeito ao processo da iniciao e evoluo

da crie (BECKER, 1988; TRAHAN et al., 1992; SDERLING et al., 2001).

A hiptese para explicar a resistncia das clulas bacterianas ao xilitol

baseia-se na possvel ausncia ou reduo na atividade do mecanismo de

transporte constitutivo frutose-PTS, responsvel pelo transporte da frutose e do xilitol

19

em S.mutans. Assim, essas bactrias, no transportando a frutose ou o xilitol para o

interior de seu citoplasma, no acumulam o metablito txico, xilitol-5-fosfato,

conferindo-lhes deste modo tolerncia ao polilcool. (TRAHAN, 1981; TRAHAN;

MOUTON, 1987).

A falta ou falha do mecanismo constitutivo da frutose-PTS pode ser

desvantagem ecolgica, pois, na presena de sacarose, estas cepas tornam-se

menos competitivas pela sobrevivncia no ambiente. Por outro lado, isto pode ser

vantajoso num meio onde h oferta de xilitol, pois as cepas sensveis seriam inibidas

pelo polilcool e as resistentes tornariam-se prevalentes, sendo naturalmente

selecionadas.

Esta populao de S.mutans, chamada tolerante, que no tem seu

crescimento diminudo pelo xilitol, pode ser obtida em laboratrio atravs de

passagens progressivas das culturas bacterianas em meio contendo pequenas

concentraes de xilitol (0,5 a 5%) ou atravs da inativao do gene que codifica o

metabolismo da frutose (GAUTHIER; VANBEBONCOEUR; MAYRAND, 1984;

TRAHAN; BOURGEAU; BRETON, 1996; BENCHABANE et al., 2002; TANZER,

2005). Resta ainda saber se essas populaes de S.mutans xilitol-resistentes podem

ser selecionadas in vivo, pelo consumo freqente e regular do xilitol, pois, sendo

menos virulentas, poderiam melhorar a qualidade da populao de S.mutans no

biofilme, sustentando o papel crie-preventivo do xilitol.

20

2 REVISO DA LITERATURA

Muitos estudos so apresentados na literatura com o objetivo de compreender

os diversos mecanismos envolvidos na ocorrncia, diagnstico, desenvolvimento e

tratamento da crie.

Streptococcus mutans um coco gram positivo que foi descrito pela primeira

vez por Clarke (1924). Estudos de Gibbons et al. (1966), Krasse (1966), confirmaram

que estreptococos descritos em crianas crie-ativas eram os mesmos descritos por

Clarke, chamados S.mutans, sendo os microrganismos mais prevalentes e

associados crie em seres humanos (CAUFIELD, 1997)

Khler, Andren e Jonson (1988), mostraram que, quanto mais cedo os

S.mutans so detectados na saliva de um indivduo, maior ser a experincia de crie

comparada aos indivduos que foram colonizados mais tardiamente ou que nunca

foram colonizados e que h forte e clara associao entre nvel salivar de SM com a

prevalncia e experincia de crie (ALALUUSUA; MYLLRNIEMI; KALLIO, 1989;

BOWDEN, 1997).

Diante destes conceitos vrios autores propem a preveno da crie na

adoo de medidas que promovam a queda do nvel salivar de SM. Esta queda pode

ser obtida no prprio indivduo afetado pela doena ou no agente da transmisso

vertical, normalmente considerado como sendo os pais, principalmente a me, de

crianas no perodo da janela de infectividade. (BERKOWITZ; TURNER; GREEN,1980;

DAVEY; ROGERS, 1984; ZICKERT; EMILSON; KRASSE, 1982; LI; CAUFIELD, 1995;

THORILD; LINDAU-JONSON; TWETMAN, 2002).

21

A sacarose no s aumenta o nvel salivar de Streptococcus mutans no

biofilme, como tambm favorece a sntese de glucanos que promovem maior adeso

destes microorganismos s superfcies dentais, aumentando a formao da massa

microbiana, impedindo o tamponamento dos cidos formados no interior do biofilme

ou a eliminao dos mesmos pela saliva (HOUTE, 1994; ALALUUSUA et al., 1996).

Portanto a substituio da sacarose na dieta por adoantes menos cariognicos vem

sendo sugerida por muitos autores, sendo que o xilitol considerado o mais promissor

entre os substitutos do acar (GEHRING et al., 1976; BECKERS, 1988; BIJELA,

ZANELA, 1994; BIRKHED, 1994; HILDEBRANDT; SPARKS, 2000; LYNCH;

MILGROM, 2003).

2.1 Efeitos preventivos do xilitol e sua ao sobre Streptococcus mutans

O xilitol um produto natural produzido comercialmente a partir da casca de

rvores especiais como a Btula e outras madeiras contendo xilano (LYNCH;

MILGROM, 2003). Tambm ocorre naturalmente em frutas e vegetais. Contm 40%

menos calorias que a sacarose e o principal efeito colateral associado ao seu

consumo a diarria osmtica, uma vez que ele muito lentamente absorvido pelo

trato gastro-intestinal, necessitando muita gua para ser diludo. Porm, isso s ocorre

com o consumo de doses de 4 a 5 vezes maiores do que aquela necessria para

preveno da crie dental.

A produo atual de xilitol maior que 10.000 toneladas por ano, direcionada

principalmente confeco de produtos manufaturados e indstria alimentcia,

farmacutica e de higiene oral. No Reino Unido o consumo de xilitol cerca de uma

22

tonelada ao ano, principalmente em chicletes e balas, dentifrcios e medicamentos. Foi

demonstrado que a mancha branca de crie, estgio de pr-cavitao,

remineralizada com o uso de xilitol (MAGUIRE; RUGG-GUNN, 2003). Alguns termos

como no-cariognico, anti-cariognico, cariosttico e anti-cries tm sido

utilizados para descrever a ao deste adoante. Os mecanismos especficos pelos

quais o xilitol vem assumindo este papel seriam:

O desenvolvimento de amostras S.mutans resistente ao xilitol que podem

ser menos virulentas que as amostras selvagens xilitol-sensveis na cavidade

oral.

O aumento de concentrao de aminocidos e amnia na saliva que

neutralizam os cidos na cavidade bucal.

Atua como agente bacteriosttico da seguinte maneira: algumas clulas

bacterianas captam o xilitol e o convertem ao composto no metabolizvel, o

xilitol-5-fosfato, txico para a clula.

Provoca a ocorrncia de um ciclo metablico intil, chamado Ciclo Ftil,

com gasto desnecessrio de energia, pois a clula bacteriana captura o

xilitol, fosforila-o a xilitol-5-fosfato que, no sendo metabolizado, promove o

gasto da energia celular para transport-lo para fora.

Estes fatos sero abordados com mais clareza a medida que avanarmos

nesta reviso de literatura.

Mobley (2003), em uma reviso sobre dieta, afirma que alguns componentes da

dieta promovem o processo de crie, enquanto outros tm potencial protetor e atuam

melhorando o processo de remineralizao. Esses alimentos so referenciados como

anticariognicos ou cariostticos, pois neutralizam os cidos e restauram o esmalte

23

dental, estimulando a salivao com efeitos benficos. Segundo o autor, nos EUA o

FDA autoriza nestes alimentos a utilizao dos termos no promove (does not

promote), til em no promover (useful in not promoting) ou reconhecido por no

promover crie dental (expressly for not promoting dental caries) nos rtulos de

alimentos que contenham um ou mais lcoois-acares na formulao. Os lcoois-

acares nutritivos, incluindo o sorbitol, manitol e xilitol, contm cerca de 40 a 75% do

contedo calrico da sacarose e so reconhecidos como possuidores de um potencial

cariognico muito baixo. Este autor sugere que, aps beber ou se alimentar, os

indivduos utilizem alimentos cariostticos, como gomas de mascar contendo xilitol,

como mtodos de preveno e proteo contra a crie. Bijela e Zanela (1994) afirmam

que o xilitol tem boa solubilidade, inodoro e de sabor agradvel. Usado em chicletes,

promove o estmulo da secreo salivar e aumento da concentrao de certos

eletrlitos; com isto a capacidade tampo da saliva teria um efeito preventivo

especfico. Todos os alcois polihdricos no so totalmente digeridos no intestino. Isto

significa que parte do adoante passa pelo corpo hidratando-se no percurso,

causando diarria osmtica, quando mais de 25 a 50 g de adoante forem

consumidos por dia. A dose recomendada de 150 mg/Kg/dia.

O xilitol aceito universalmente como no-cariognico, mas pode tambm ser

classificado como cariosttico. O termo anticariognico tambm tem sido sugerido,

uma vez que promove a reverso da leso atravs da remineralizao das leses

incipientes. Cariosttico e anticariognico so afirmativas para a teraputica,

enquanto no-cariognico ou saudvel para os dentes so afirmativas para o

controle da sade. Na Finlndia e Sucia permitido o uso de logotipo especial para

24

identificar os produtos que contenham porcentagem de xilitol acima de 50%.

(BIRKHED, 1994).

A utilizao dos adoantes em forma de gomas de mascar, ao invs de

bochechos ou diretamente na dieta, mais indicada, pois alm da quantidade utilizada

ser pequena, a concentrao na cavidade oral em contato com o biofilme pode ser

alta. As balas podem ser to efetivas quanto gomas de mascar como veculos para a

liberao do xilitol, enquanto agente protetor da crie. Produtos alimentcios contendo

xilitol esto disponveis no mercado, mas faz-se necessrio um trabalho considervel

para produzir estes produtos comercialmente, tornando-os viveis e aceitos. De

acordo com os dados disponveis, nos EUA no h veculo para a utilizao do xilitol

em mamadeiras ou para crianas pr-escolares e muito jovens, como alternativa para

as gomas de mascar. Estes produtos podem ser utilizados seguramente por mulheres

grvidas e mulheres que esto amamentando (LYNCH; MILGROM, 2003). Tanzer

(1995) afirma que altos ndices de fluxo salivar, resultante da alimentao ou da

mastigao de gomas, por exemplo, esto associados com o rpido aumento do pH

salivar (para cerca de 7,6 7,8) comparativamente com o pH da saliva em repouso,

em ndices de fluxo baixos (valores menores que 5,5 6,0). No entanto, se esta goma

de mascar contiver sacarose, a produo cida da placa bacteriana imediatamente

induzida e o pH entre a placa e a superfcie dental abaixa rapidamente para valores

prximos a 4,0. Porm, a anlise da literatura no demonstrou, em nenhum estudo, que

o xilitol usado em gomas de mascar induzia formao de leses de cries, em altas

ou baixas concentraes. Pelo contrrio, ocorreu de 30 a 65% de reduo da crie

entre os grupos que utilizaram gomas de mascar com altas concentraes de xilitol. A

goma de mascar, para este autor, parece ser o veculo ideal para liberao de

substncias inibidoras da crie, promovendo uma relao de alta concentrao entre o

25

produto e as superfcies dos dentes, enquanto pequenas quantidades so engolidas.

Conclui que a extensa literatura sobre o uso do xilitol refora a assertiva que gomas de

mascar, especialmente com alta concentrao de xilitol, so no-cariognicas e,

provavelmente, inibem a crie dentria.

A tentativa de utilizao do xilitol como substituto de parte do acar refinado

consumido na dieta humana, com a finalidade de reduzir o risco de crie, teve como

pioneiros os pases escandinavos, especialmente a Finlndia. No estudo clssico de

Turku, Gehring et al. (1976), verificaram, aps 2 anos de uso crnico do xilitol na dieta,

se ocorreria ou no adaptao ou mutao da microbiota do biofilme, capaz de

degradar o xilitol a cidos. Entre os resultados, os autores observaram que SM

ocorreram de maneira significantemente menor no grupo xilitol do que nos grupos que

usaram sacarose ou frutose. Os resultados tambm indicaram que no houve

adaptao do microorganismo ao xilitol, embora esta adaptao tenha sido observada

em estudos in vitro. Quando se usa concomitantemente xilitol com outros acares

nenhuma das combinaes foi capaz de abaixar o pH do meio para menos de 5,5

aps 7 dias, enquanto com a mistura de sorbitol com os outros acares a queda no

pH tornou-se evidente. Aps 2 anos de uso de goma de mascar contendo xilitol no

houve evidncia de seleo microbiana capaz de metabolizar o xilitol. Com relao

ocorrncia de crie, os autores afirmam ter ocorrido substancial reduo na incidncia

de crie no grupo que usou xilitol, comparado com os outros dois grupos que utilizaram

sacarose e frutose. Em geral, a placa foi incapaz de produzir cido na presena de

xilitol.

26

A partir destas observaes, outros autores desenvolveram novos estudos

tendo os substitutos da sacarose como objeto de suas observaes, sendo que entre

eles, o xilitol destaca-se pelas suas caractersticas, sendo invariavelmente utilizado nas

comparaes com outros adoantes alternativos. Edwardsson, Birkhed e Mejre

(1977), compararam a produo cida de estreptococos e lactobacilos com vrios

tipos de adoantes alternativos, a saber Lycasin (mistura de dextrose com sorbitol),

sorbitol, maltitol, xilitol e glicose em solues na concentrao final de 1%. Observaram

que o manitol no foi fermentado por nenhum estreptococo, mas foi fermentado por

todos lactobacilos. O Lycasin foi fermentado pelos lactobacilos e por alguns

estreptococos, como o sorbitol. Porm nenhum dos estreptococos ou lactobacilos foi

capaz de fermentar o xilitol.

Birkhed et al. (1979), visando determinar se os lcoois-acares com o tempo

tornam-se metabolizveis pelos microorganismos da placa, levando ao aumento da

produo cida e ao maior risco de crie, analisaram nmero de estreptococos

anaerbios facultativos, SM e lactobacilos antes e aps 3 meses do consumo

freqente de pastilhas contendo tais substncias. 110 indivduos, divididos em 5

grupos (controle, sorbitol, maltitol, Licasin e xilitol), foram instrudos a consumirem 2

pastilhas de xilitol, 4 vezes ao dia, por 3 meses. O valor do pH foi medido aps

bochecho por 30 segundos, com 10 ml de soluo, contendo a substncia teste na

concentrao de 50%, uma semana antes do experimento e aps o final de 3 meses

de experimento. A produo cida no foi registrada no biofilme antes ou aps o

consumo das pastilhas para o grupo que fez o bochecho com xilitol, o que no ocorreu

para os outros grupos, porm sem significado estatstico. Os autores concluram que

27

no h evidncia da adaptao da microbiota oral ao xilitol e ao Lycasin (mistura de

dextrose e sorbitol), embora tenha sido relatada tendncia da adaptao da microbiota

ao uso do sorbitol e maltitol. O aumento da produo cida para estes adoantes foi

pequena, sugerindo que consumos mais intensos e por perodos maiores poderiam

revelar maiores mudanas no nmero de estreptococos e lactobacilos na placa.

O efeito de outro adoante, a palatinose, tambm conhecida como isomaltose,

que um acar de baixo potencial cariognico, muito usado no Japo, foi verificado

por Lingstrm et al. (1997). Encontrado naturalmente em pequena quantidade no mel,

produzido industrialmente a partir da converso enzimtica da sacarose. O poder de

doura de 0,35 a 0,45 comparado ao da sacarose. Ao contrrio dos lcoois-

acares (sorbitol e xilitol) no causa o desconforto gastro-intestinal conhecido como

diarria osmtica, pois completamente hidrolizada no intestino. O nvel de glicose

sangnea e a resposta insulnica tambm so baixos, menor que da sacarose, o que

torna a palatinose muito til para pacientes que sofrem de diabetes. Embora tendo

potencial cariognico baixo, a microbiota oral pode se adaptar a este acar. No

entanto, no foi relatada queda no pH do biofilme em seres humanos para valores

inferiores a 6,1 com seu uso. Investigando a formao e o pH da placa aps enxges

freqentes com produtos contendo palatinose e xilitol, comparados com outros

contendo somente a palatinose ou somente o xilitol separadamente, observaram que a

palatinose produziu maior queda do pH da placa, quando comparada ao xilitol

separadamente, com diferena estatstica significativa. Quando a mistura xilitol +

palatinose foi comparada com a sacarose, esta diminuiu mais o pH da placa. Houve

diminuio nos nveis salivares de S.mutans com o uso do xilitol, enquanto pequeno

28

aumento foi verificado com a palatinose, sem significado estatstico. O uso do xilitol

proporcionou menores ndices de placa, com diferena estatstica, quando comparado

com a palatinose.

Mkinen et al. (2001), avaliaram 16 indivduos especiais, na maioria portadores

da Sndrome de Down, divididos em 2 grupos experimentais, um utilizando goma de

mascar contendo xilitol e outro contendo eritritiol, na freqncia de 5 vezes ao dia, por

2 meses. Aps o perodo experimental, o peso da placa e a contagem de S.mutans

foi significantemente menor no grupo que usou xilitol e no se alterou para o grupo do

eritritiol. Em sua concluso, os autores afirmam que, baseados em informaes de

trabalhos bacteriolgicos e vrios outros de triagens clnicas envolvendo o xilitol, este

acar parece realmente ter um efeito bioqumico especfico em certas cepas de

S.mutans.

Wennerholm et al. (1994), realizaram estudo in situ com uso de aparelhos

removveis em 17 indivduos com mais de 105 ufc/ml de saliva, distribudos

aleatoriamente em 4 grupos, cada voluntrio passando por todos os grupos, usando 4

tipos diferentes de gomas de mascar, a saber: com 70% de xilitol, 35% de xilitol e 35%

de sorbitol, 17,5% de xilitol e 52,5% de sorbitol e 70% de sorbitol. Com relao aos

nveis salivares de SM, os resultados demonstraram que uso de goma de mascar com

zero xilitol (70% sorbitol) induziu aumento significante de SM, enquanto o uso do xilitol

levou diminuio. Para a goma contendo 70% de xilitol o valor foi estatisticamente

significante de zero e 17,5%. O uso de xilitol diminuiu SM tanto na placa dental quanto

na saliva.

29

Para os valores de pH, aps o bochecho com sorbitol, o pH final mais baixo foi

detectado para aqueles que utilizaram 70% de sorbitol e o mais alto para o grupo que

usou 70% de xilitol. Quando se fez o bochecho de glicose o pH caia sempre para 5,7,

independente da goma que o indivduo usou.

A perda de mineral ocorreu aps o uso de cada uma das 4 gomas, embora a

menor desmineralizao tenha sido observada com o uso do chiclete com 35% de

xilitol, colocando em questionamento a relao direta dose-resposta atribuda a esse

produto.

Mkinen et al. (1996), avaliaram indivduos com 10 anos de idade, em estudo

longitudinal de 40 meses, investigando o efeito de gomas de mascar na formao de

placa. Os indivduos foram divididos em 9 grupos, sendo um grupo controle (que no

fez uso de goma de mascar) e 8 grupos experimentais, com gomas contendo xilitol,

sorbitol, diferentes misturas desses dois substitutos e sacarose. Os resultados

mostraram que o grupo que recebeu a goma contendo 100% de xilitol, 5 vezes ao dia,

foi o que apresentou menor ndice de placa.

Simons et al. (1997), observaram que o uso de gomas de mascar contendo uma

mistura de xilitol e clorexedina, 2 vezes ao dia, por 14 dias seguidos, promoveu a

reduo do nmero de S.mutans tanto para o grupo teste (que recebeu a goma de

clorexedina) quanto para o controle (s goma contendo xilitol), porm para a goma

teste, contendo clorexedina, a reduo foi maior. Aps 14 dias, foram observadas

manchas extrnsicas no esmalte de alguns pacientes do grupo teste. Interessante notar

que, enquanto a clorexedina um composto sinttico, o xilitol um adoante natural,

podendo ser usado mais de 2 vezes ao dia e, sob tais condies, proporcionar

maiores vantagens para quem o utiliza como agente promotor de sade. Ainda

tentando associar benefcios da terapia com clorexedina e xilitol, Hildebrandt e Sparks

30

(2000), afirmam que nem todas as pessoas respondem favoravelmente terapia

antimicrobiana com clorexedina. Alm disso, logo que o tratamento com clorexedina

interrompido, rapidamente os nveis salivares retornam aos valores apresentados

antes do tratamento, sendo este perodo varivel de indivduo para indivduo, durando

em mdia 3 meses. Para manter esta supresso deve-se procurar terapias

alternativas, uma vez que o uso prolongado da clorexedina no recomendado devido

a efeitos colaterais. Assim, os estes autores conduziram este estudo com a finalidade

de observar a capacidade do xilitol, utilizado em gomas de mascar, manter a

supresso de SM aps o indivduo cessar tratamento com clorexedina. Para isto, 151

indivduos foram divididos e 3 grupos aleatrios: controle, placebo e teste. Todos

faziam bochechos 2 vezes por dia (manh e antes de dormir) com 15 ml de gluconato

de clorexedina 0,12%, durante 2 semanas. Foi comparado o efeito do uso de gomas

de mascar contendo xilitol, com o efeito de gomas placebo. A anlise estatstica

mostrou diferena significante entre o grupo controle (no utilizou goma) e experimental

e entre os grupos placebo e experimental. No houve diferena entre o placebo e o

controle. Os autores concluem que o xilitol pode prolongar a supresso de SM aps a

parada do tratamento com bochechos de clorexedina. Os autores tambm enfatizam

que a proteo do xilitol no est ligada s ao aumento da salivao, pois, se assim

fosse, o placebo tambm funcionaria e em sua concluso sugerem que, como tais

produtos existem no mercado, este protocolo poderia ser imediatamente aplicado

prtica clnica.

A glicosiltransferase a enzima responsvel pela sntese de glucanos solveis e

insolveis a partir da sacarose. Existem 3 tipos de enzimas glicosiltransferases

produzidas pelo S.mutans: a GtfB (que sintetiza o glucano insolvel 1,3), GtfD (que

sintetiza o glucano solvel 1,6) e GtfC (que sintetiza uma mistura de glucanos solveis e

31

insolveis). Wunder e Bowen (1999), examinaram 3 classes de compostos qumicos

(metais custicos, reagentes oxidantes e compostos aucarados) e suas capacidades

de atuarem agirem como inibidores da atividade da glicosiltransferase, Entre os

compostos aucarados estavam o xilitol, sorbitol e derivado da sacarose halogenada

(Sucralose). Nenhum dos adoantes, incluindo o xilitol, apresentaram efeito inibitrio

sobre a atividade da glicosiltransferase.

Estudos avaliando o efeito do xilitol tm sido realizados por um grupo de

pesquisadores na Finlndia. Sderling et al. (1991), utilizando voluntrios de estudo

anterior realizado em Ylivieska, separaram indivduos que participaram do primeiro

trabalho em 2 grupos: experimental (usaram o xilitol no estudo anterior denominado

grupo X) e grupo controle (no usaram xilitol no trabalho original - denominado grupo

C). Neste novo experimento, os 2 grupos foram divididos em 2 subgrupos. O grupo

experimental foi constitudo por indivduos que utilizaram xilitol no primeiro estudo e

continuaram consumindo-o at o momento do segundo estudo (denominado subgrupo

XX) e o subgrupo 2 (denominado CX), constitudo por indivduos que no haviam

consumido xilitol no experimento original, mas que iniciaram o consumo por conta

prpria aps o experimento. Da mesma forma, foi subdividido o grupo controle:

subgrupo CC, constitudo por indivduos originalmente do grupo controle (no usaram

xilitol durante o primeiro estudo) e que continuaram no consumindo xilitol e o subgrupo

XC, formado por indivduos que originalmente pertenceram ao grupo experimental

(usou o xilitol pelos 2 anos da pesquisa original) mas que, findada a pesquisa, pararam

de consumir o xilitol por opo prpria. Estes indivduos foram reexaminados e como

resultados, os autores observaram que menor quantidade de biofilme foi encontrada

nos grupos experimentais XX e CX, comparando-se com o grupo controle (CC e XC).

A quantidade de biofilme foi mais baixa no grupo XX e no houve diferena estatstica

32

entre XC e CC, sugerindo que a parada da utilizao do xilitol favorece a

recolonizao. O nmero de SM nas reas proximais tambm foi avaliado e relatado

por Isokangas et al. (1991), sendo significantemente menor nos consumidores

habituais de xilitol (XX) do que nos no usurios (CC). No subgrupo XX no houve

leses de cries nas superfcies estudadas. Os indivduos dos grupos XX, XC, CX

apresentaram ndices de cries proximais menores do que indivduos que nunca

usaram xilitol (CC). Os autores atribuem este fato menor adesividade das cepas

tolerantes ao xilitol e na diminuio do metabolismo celular com a formao do xilitol-5-

fosfato. Concluram que o consumo de xilitol por anos pode levar a preveno tambm

de leses de crie interproximal.

Sderling et al. (1997), avaliaram o efeito de gomas de mascar com xilitol, com

mistura xilitol-sorbitol e gomas placebo sobre a placa e saliva de indivduos

consumidores de xilitol. Todos participantes haviam sido, de uma maneira

descontrolada, consumidores de xilitol pelo perodo mnimo de um ano antes do

estudo. Aps 1 ms privados do consumo de xilitol iniciou-se o perodo experimental,

onde ocorreu o consumo do xilitol, da mistura xilitol/sorbitol e do placebo, atravs do

uso de gomas, que eram utilizadas de 3 a 5 vezes ao dia. Amostras de biofilme dental

e saliva foram coletadas no incio do trabalho e no final de 2 semanas experimentais.

Os valores obtidos entre os grupos no incio no diferiam entre si. Aps o perodo

teste, a mistura xilitol+sorbitol pareceu ter a mesma performance do que o grupo do

xilitol sozinho, com relao a diminuio da quantidade de placa. No entanto, a

proporo de S.mutans diminuiu significativamente no grupo do xilitol.

Na tentativa de utilizar esta ao na reduo de S.mutans promovida pelo xilitol

na preveno da transmisso vertical deste microorganismo, o mesmo grupo de

33

pesquisadores realizou estudo longitudinal envolvendo gestantes e seus filhos.

Sderling et al. (2000), avaliaram 106 pares de mes que possuam altos nveis

salivares de SM (maior que 105 cfu/ml) e seus filhos. Essas mes foram selecionadas

para o estudo ainda gestantes e foram divididas em 3 grupos: o grupo que usou xilitol,

o grupo que recebeu aplicao de flor e o grupo que recebeu tratamento com

clorexedina. Aps o nascimento da criana, os pares mes/filhos eram examinados

quando as crianas tinham 6 meses, 1 ano e 2 anos de idade. No grupo do flor

(Duraphat) e da clorexedina (EC 40%) as mes receberam aplicao de vernizes

aos 6, 12, 18 meses aps o parto. No grupo do xilitol as mes mascavam gomas

contendo 65% de xilitol, 2 a 3 vezes ao dia, durante 2 anos. As crianas no

receberam nenhum tratamento. Ao completarem 1 ano de vida, para as crianas que

mostraram nveis de SM detectveis, os autores obtiveram os seguintes resultados:

6,8% das crianas infectadas eram filhas de mes que pertenciam ao grupo que usou

o xilitol; 18,2% eram filhas de mes que haviam participado do grupo flor e 3,6%

delas eram crianas cujas mes haviam participado do grupo clorexedina (sem

diferena estatstica). Aos 2 anos de idade os nveis detectveis foram: 9,7% para as

crianas de mes participantes do grupo xilitol, 28,6% para crianas de mes

participantes do grupo clorexedina e 48,5% para crianas das mes que participaram

do grupo que usou verniz de flor. Este estudo explora a possibilidade das mes

usurias de xilitol diminurem a transmisso de SM aos filhos e, consequentemente, o

risco de desenvolvimento de crie.

Aps 2 anos do final do experimento anterior, ou seja, quando as crianas

completaram 4 anos, Sderling et al. (2001), realizaram novo estudo nos mesmos

voluntrios. As mes haviam sido instrudas para interrupo do tratamento proposto

pelo estudo anterior quando seus filhos completassem 2 anos e as crianas foram

34

novamente reavaliadas aos 3 e aos 6 anos de idade, sempre com anlise

microbiolgica da saliva. A porcentagem de colonizao foi aumentando a medida que

o tempo foi passand, para as crianas de todos os grupos. Porm, ao exame de 3

anos, no grupo em que as mes haviam usado gomas de mascar com xilitol, apenas

27,6% das crianas haviam sido colonizadas pelo SM; no grupo das mes que usaram

flor 64,5% e no grupo da clorexedina 37%, com diferena estatstica.

No exame das crianas aos seis anos de idade, ou seja, 4 anos aps o

tratamento das mes ter sido interrompido, os valores encontrados para a deteco de

SM na saliva foram 51,6% para os filhos de mes que haviam participado do grupo do

xilitol, 83,9% para o grupo flor e 86,4% para o grupo clorexedina, novamente com

significado estatstico. A concluso que os autores chegaram foi que o xilitol pode

retardar a transmisso e colonizao por SM em crianas por perodo prolongado (at

4 anos), mesmo aps a interrupo do seu consumo pelas mes. Um achado

secundrio deste estudo foi que a ocorrncia de crie nas crianas do grupo xilitol

foram reduzidas em cerca de 70%, comparada com os outros 2 grupos. Este fato foi

publicado por Isokangas et al. (2000). Os resultados revelam que indivduos que aos 2

anos de idade ainda no haviam sido colonizados por SM, apresentavam menor

experincia de crie do que as crianas que haviam sido colonizadas at os 2 anos de

idade e isto em todos os grupos (xilitol, clorexedina e fluoreto). Na idade de 5 anos, os

filhos de mes que estavam no grupo do xilitol apresentavam menor experincia de

crie do que os outros 2 grupos, com diferena estatstica. Esta reduo foi de 71%

ente grupo das mes que utilizaram xilitol e as que utilizaram fluoretos e de 74% entre

as mes dos grupos que usaram xilitol e clorexedina. A diferena entre os grupos para

indivduos que realizaram tratamento com fluoreto e clorexedina no apresentou

diferena estatstica. Concluram que o uso habitual de xilitol pelas mes est

35

associado de maneira estatisticamente significante com a reduo da infeco da

criana e posterior e decorrente reduo da crie dental na dentio decdua.

Embora grande nmero de trabalhos utilize o xilitol como substituto de parte do

acar na dieta, especialmente na forma de gomas de mascar e balas, alguns estudos

investigam a ao do xilitol em outros produtos. Particularmente aqueles envolvendo

pastas dentais so de interesse, pois os dentifrcios so considerados, at o momento,

os maiores agentes preventivos no combate crie, especialmente pelo seu contedo

de fluoreto, sendo este considerado o grande responsvel pela diminuio da

incidncia de leses, possibilitando a remineralizao dental. Surge o questionamento

se a adio de xilitol poderia aumentar, de alguma maneira, o efeito protetor do

dentifrcio na preveno da crie. Assim, Twetman e Petersson (1995), avaliaram 65

crianas, divididas em 2 grupos, 33 delas no grupo experimental e 32 no controle,

instrudas para utilizarem o dentifrcio 2 vezes ao dia, em escovao aps o caf da

manh e antes de dormir durante 2 minutos. As crianas do grupo teste utilizaram

dentifrcio acrescido de 9,7% de xilitol. Em contraste com trabalhos publicados, os

resultados no apresentaram diminuio salivar de SM aps o perodo do estudo,

tanto para o grupo controle como para o experimental. Os autores sugerem que a dose

de xilitol utilizada pode ter sido baixa, (cerca de 0,1 g por dia dividido nas 2

escovaes) j que em gomas de mascar a dose de xilitol diria usada cerca de 50

a 100 vezes maior do que a utilizada neste dentifrcio.

Sintes et al. (2002), utilizaram 2 tipos de dentifrcios em crianas escolares, um

contendo 0,836% de monofluorfosfato de sdio (1.100 ppm) acrescido de 10% de

xilitol e outro dentifrcio com 0,836% de monofluorfosfato de sdio (1.100 ppm) sem a

adio de xilitol, como controle. Aps 30 meses, a mdia de incremento no CPOD

36

para o grupo que usou a pasta com xilitol foi 13,9% mais baixa do que no grupo das

crianas que usaram pasta sem xilitol, sendo a diferena entre os valores considerada

estatisticamente significante (p

37

que as clulas conseguiam crescer no meio com xilitol, tambm utilizavam mais

efetivamente peptdeos e aminocidos. Estes resultados fizeram os autores concluir

que seria improvvel a hiptese de ocorrer induo de enzimas envolvidas no

metabolismo do xilitol, quando este estivesse presente no meio. No entanto, a

adaptao de clulas para tolerar o xilitol foi observada e, supostamente, poderia ser

por alteraes induzidas no transporte e metabolismo de glicose, aminocidos e

outros compostos.

A idia inicial da ocorrncia da adaptao metablica ao xilitol tambm foi

proposta por Gauthier, Vandeboncoeur e Mayrand (1984). Aps transferncias de

clulas bacterianas para meios de cultura contendo diferentes concentraes de xilitol

(de 0,5 a 2%), perceberam que ocorria o aumento no tempo requerido para as clulas

atingirem a fase estacionria (tempo de gerao bacteriana). Com repetidas

transferncias da cultura ocorria diminuio progressiva do tempo de gerao das

bactrias, indicando, assim, que a perda de sensibilidade ao xilitol seria um fenmeno

progressivo, sugestivo de processo adaptativo. Uma vez obtida esta populao de

clulas insensveis, os autores tambm observaram que ela no voltava ao estgio de

sensibilidade anterior. Os resultados permitiram aos autores descartarem a hiptese

sugerida de haver represso de enzimas pr-existentes que permitiriam clula utilizar

o xilitol. Tambm abandonaram a idia de ocorrer represso de um sistema

enzimtico responsvel pelo fenmeno da inibio, pois as clulas sensveis no

puderam crescer na presena de xilitol e as que cresceram no puderam retornar ao

estado de sensibilidade aps a remoo do xilitol. Outra hiptese proposta pelos

autores, a perda de um plasmdeo codificado por um sistema enzimtico, tambm foi

abandonada, uma vez que nenhum plasmdeo foi encontrado nas clulas sensveis,

levando os autores concluir que a insensibilidade ao xilitol resultaria de um evento

38

mutacional. No entanto, a inibio do crescimento no ocorria quando clulas

bacterianas eram cultivadas em meio contendo xilitol, porm na presena de frutose,

sugerindo que a utilizao do xilitol poderia estar ligada ao sistema de transporte da

frutose, uma vez que esta preveniria a captao de xilitol.

Birkhed (1994), discutiu se o consumo de xilitol poderia resultar na progressiva

perda de sensibilidade pela bactria ao produto. Este autor alerta que esta

adaptao do xilitol no deve ser erroneamente interpretada como podendo levar ao

risco do aumento da produo cida novamente, ou ao aumento do nmero de SM,

como ocorre com o sorbitol. No h evidncias que estas cepas consigam crescer

com o consumo de xilitol, gastando-o ou utilizando-o de alguma forma, ou que

produzam cidos a partir dele. Desta forma, conclui que no foi observada adaptao

da flora ao uso do xilitol, at o momento.

Trahan, Bourgeau e Breton (1996), com propsito de saber se clulas com

resistncia ao xilitol poderiam ser selecionadas a partir de crescimento in vitro em

meio com frutose, sacarose, lactose e glicose, estudaram o comportamento de 3

colnias de S.mutans laboratoriais e 3 clnicas. Transferiram essas 6 amostras

repetidas vezes para os 4 meios experimentais, com os 4 acares na ausncia e

presena do xilitol. Dependendo do acar estudado a presena do xilitol ajudou a

selecionar cepas resistentes, mas no necessariamente em todos os grupos. As 6

colnias rapidamente se tornaram xilitol resistentes no meio glicose + xilitol. Os 3

isolados clnicos tambm tornaram-se resistentes aps 9 a 16 transferncias do meio

frutose + xilitol e/ou no meio sacarose +xilitol, enquanto nenhuma das 3 colnias

laboratoriais tornaram-se resistentes, aps 16 transferncias, em nenhum dos meios.

39

O transporte e a fosforilao do xilitol pelo sistema fosfotransferase em

S.mutans tornou-se proposta de estudo para muitos trabalhos. Trahan et al. (1981),

avaliaram se este sistema de transporte poderia estar envolvido com o transporte do

xilitol. Xilitol marcado com Carbono 14 radioativo foi imediatamente acumulado no

citoplasma de S.mutans ao mesmo tempo que a inibio do crescimento era

observada. Comparando-se os valores para o acmulo de Carbono 14 em cepas

sensveis e resistentes, estes dois fenmenos no foram verificados nas cepas

resistentes. Assim, concluram que h correlao entre a captao de xilitol e inibio

do crescimento bacteriano e sugeriram que a existncia de alguma falha no

mecanismo constitutivo do transporte da frutose poderia ser a causa da ocorrncia do

tipo fenotpico da clula xilitol-insensvel.

Somente em 1987, que as clulas demonstrando tolerncia ao xilitol,

denominadas inicialmente clulas-xilitol por Knuuttila e Mkinen (1975) e clulas xilitol-

insensveis por Trahan et al. (1981), receberam a denominao de clulas xilitol-

resistentes sugeridas por Trahan e Mouton (1987). Avaliando a sensibilidade ao xilitol,

em meio glicosado, sem ou com a adio de 0,5% de xilitol, as curvas de crescimento

bacteriano revelaram a presena de uma diviso entre os isolados, pois o crescimento

de algumas cepas foi reduzido quando o xilitol era acrescentado ao meio de cultura. As

cepas que apresentaram restrio no crescimento foram consideradas xilitol-sensveis

(XS). As cepas, cujos padres de crescimento eram idnticos em meio com e sem

xilitol, foram denominadas xilitol-resistentes (XR). A maioria dos isolados para

consumidores crnicos de xilitol foi considerada xilitol-resistente (87%), enquanto nos

indivduos do grupo controle, no consumidores, esse valor foi de apenas 10%. O

crescimento nas cepas XS foi de 17 at 68% menor do que nas tolerantes. Observao

40

semelhante foi verificada por Trahan et al. (1992). Estudando biofilme dental e saliva

de indivduos determinaram a proporo de cepas S.mutans XR no grupo experimental

(que usou chiclete com xilitol por 2 anos) e controle (que no usou o xilitol). A proporo

de S.mutans XR na saliva dos no usurios de xilitol foi significativamente muito mais

baixa (35%) do que a proporo de XR nos indivduos usurios de xilitol (79%). Os

resultados sugerem que o consumo de xilitol modifica a distribuio de SM entre placa

e saliva, sendo os S.mutans XR mais captados na saliva do que na placa e, uma vez

estabelecida a populao de XR, esta se mantm por at 4 anos aps a remoo do

agente de seleo, ou mantendo seu uso mnimo e irregular.

A ocorrncia de mutao, sugerida por Gauthier, Vandeboncoeur e Mayrand

(1984), foi considerada improvvel por Trahan e Mouton (1987), uma vez que o xilitol e

seus metablitos no so mutagnicos e que sua adio no meio resulta na seleo

espontnea de uma populao bacteriana naturalmente resistente, com mecanismo

constitutivo frutose-PTS negativo. Os autores sugerem que este fato pode ser devido

existncia de formas alternativas (alelos) de um mesmo gene. Assim, 2 gentipos de

S.mutans poderiam coexistir na flora oral do homem moderno e que a toxicidade

provocada pelo xilitol foi, provavelmente, responsvel pela eliminao progressiva de

cepas XS e reposio das cepas XR nos indivduos avaliados. Da mesma forma, com

relao possibilidade de existirem diferenas genotpicas entre as formas XR e XS,

Sato, Yamamoto e Kizaki (2000), isolaram o gene gbpC, que codifica a protena

glucanoC, envolvida no processo de agregao dextrano-dependente em S.mutans. A

expresso deste gene fica elevada em condies de estresse, como a que ocorre em

clulas cultivadas repetidamente na presena de xilitol. A persistncia da expresso

constitutiva do gene gbpC em cepas XR, mesmo aps 10 transferncias seriadas em

41

meio sem xilitol, pode sugerir que a emergncia destes clones seja resultado de uma

mutao para obter um ganho de funo e, assim, sobreviver. No entanto, quando

clulas resistentes foram submetidas ao seqenciamento direto do DNA atravs de

PCR, as seqncias de nucleotdeos se apresentaram exatamente idnticas s das

cepas sensveis. Portanto, o aparecimento da resistncia no pde ser explicado por

uma mutao, sugerindo que o envolvimento de outros fatores sejam mais provveis.

Concluem que h necessidade de investigar se estas cepas resistentes j existem na

cavidade de usurios habituais de xilitol.

Roberts et al. (2002), estudando cepas de crianas que consumiram lanches

contendo xilitol por 4 semanas, avaliaram SM e analisaram a resistncia ao xilitol,

atravs do estudo das curvas de crescimento. As cepas resistentes foram

consideradas as que cresciam da mesma maneira na ausncia ou presena de xilitol a

0,5% no meio. Foi utilizado o mtodo de anlise biomolecular do PFGE para verificar

similaridade genotpica antes e aps xilitol. De 7 crianas avaliadas, 6 apresentaram o

mesmo gentipo no incio e aps o experimento; apenas uma apresentou um gentipo

no incio e outro aps exposio ao xilitol. Em todas 7 crianas os SM ficaram mais

tolerantes aps o consumo de xilitol, pois cresciam em gar com 15% de xilitol.

O modo pelo qual o xilitol e outros acares so ou no captados para o

interior da clula comeou a ser investigado com o propsito de definir sua associao

a um sistema especfico de transporte. O efeito de vrios acares foi estudado por

Trahan e Mouton (1987), para determinar que mecanismo acar-PTS era responsvel

pela fosforilao do xilitol. Foi relatado que a presena de frutose ou sacarose no meio

abolia a fosforilao do xilitol, porm a presena de xilitol no meio no afetava a

fosforilao da glicose em cepas XR ou XS, mas parecia diminuir a fosforilao da

frutose em cepas XS. Verificaram, tambm, que cepas que apresentavam fosforilao

42

baixa ou ausente para o xilitol, tinham atividade frutose-PTS constitutiva extremamente

pequena ou mecanismo frutose-PTS constitutivo negativo. O efeito do xilitol sobre a

inibio do crescimento celular bacteriano aparentemente pode ser devido falta de

produo de xilitol-desidrogenase pelo S.mutans (ROGERS et al., 1991). Esta enzima

est envolvida no metabolismo do composto xilitol-5-fosfato, o produto de transporte do

xilitol pelo sistema frutose-fosfotransferase (frutose-PTS). A formao deste produto

deve inibir o metabolismo dos acares teis, que levam falta do substrato e

incapacidade de produo de energia celular, alm do gasto energtico para exportar

o produto insolvel resultante para fora da clula. Este ciclo ftil ocorre s custas de

gastos de energia suplementar da clula, que resultaria num processo de

bacteriostase. A tolerncia ao xilitol tem sido demonstrada aps exposio prolongada

in vitro e falta do mecanismo celular constitutivo da frutose-PTS pode ser responsvel

pela tolerncia ou resistncia da bactria ao xilitol (TRAHAN, 1995; KAKUTA et al.,

2003).

Esta idia tambm sugerida em metabolismo de outros estreptococos

como afirma Tapiainen et al. (2001). A partir do postulado que o xilitol nas

concentraes de 1 a 5 % em meio de crescimento inibe o crescimento do S.

pneumoniae, estes autores realizaram estudo avaliando o efeito do xilitol na presena

de frutose e sorbitol. Foi detectada marcante inibio do crescimento bacteriano na

presena de 5 % de xilitol, em meio bsico com 0,2% de glicose. A inibio do

crescimento induzida pelo xilitol foi prevenida por todas as concentraes de frutose

utilizadas (1, 2,5 ou 5% de frutose), enquanto a adio de 1% de glicose, 1% de

galactose ou 1% de sacarose no alterou o efeito do xilitol e a inibio de crescimento

foi detectada. O sorbitol na concentrao de 1, 2,5, e 5% no teve nenhum efeito no

43

crescimento dos pneumococos. O xilitol na concentrao de 2,5% foi efetivo sozinho e

combinado com o sorbitol. O mecanismo de ao do xilitol na inibio do crescimento

dos pneumococos pode ser semelhante ao demonstrado em S.mutans, dando suporte

hiptese que esta inibio devida ao envolvimento do sistema frutose-PTS e

formao do composto insolvel intracelular, o xilitol-5-fosfato, de maneira similar que

acontece na inibio do crescimento dos SM.

S.sobrinus (ATCC27352) e sua mutante xilitol-resistente foram cultivados em

meio contendo frutose. Nas clulas XR a atividade do mecanismo frutose-PTS

constitutivo praticamente desprezvel ou inexistente. Ao contrrio, as cepas XS tm o

mecanismo frutose-PTS constitutivo bastante funcional, que capta o xilitol acumulando

xilitol-fosfato e apresentando inibio do crescimento quando 1% de xilitol acrescido

no meio, exceto quando a frutose est presente de forma predominante, pois a clula

d preferncia para a captao de frutose. Porm neste trabalho de Trahan, Nron e

Bareil (1991), foi verificado que algumas clulas XR cresceram no meio com frutose,

porm no acumularam o xilitol-5-fosfato no seu interior. Estes resultados levaram os

autores a sugerir que a via metablica alternativa, que utiliza o mecanismo frutose-PTS

indutivo, pode levar estas clulas a metabolizarem a frutose, porm que esta mesma

via seja incapaz de transportar o xilitol.

Benchabane et al. (2002), isolaram e caracterizaram o cdigo gentico para o

mecanismo constitutivo da frutose-PTS em S.mutans. Para isso estudaram o gene

fxpC, que codifica o mecanismo constitutivo frutose/xilitol-PTS. Como resultado

obtiveram que a mutante defeituosa para o gene fxpC foi completamente resistente ao

xilitol e nenhuma diferena foi vista no tempo de gerao na presena ou ausncia do

xilitol. A inativao do fxpC resulta na cepa resistente ao efeito txico do xilitol. Outro

44

achado interessante a presena de seqncias deste gene no genoma de outros

estreptococos, incluindo o S. pneumoniae.

Com relao ao argumento de que cepas de S.mutans XR possam ser menos

virulentas que as suas correspondentes XS, Beckers (1988), avaliou a influncia do

xilitol no estabelecimento e cariogenicidade de S.mutans em ratos. Desenvolveu

cepas S.mutans XR (GAUTHIER; VANDEBONCOUER; MAYRAND, 1984) e comparou

com sua homloga sensvel (XS), cuja taxa de crescimento e produo cida eram

inibidas pela adio de xilitol na presena de glicose. No foi encontrada diferena

estatstica para o estudo da aderncia in vitro entre as cepas XS e XR. Ratos

submetidos dieta de glicose/xilitol apresentaram menor ocorrncia de leses em

dentina, quando comparados ao grupo que usou dieta somente base de glicose, com

diferena estatstica. Estes resultados permitiram ao autor concluir, portanto, que,

cepas XR podem ser consideradas menos virulenta do que suas correspondentes

selvagens XS.

Sderling et al. (2000), sugerem que o consumo rotineiro de xilitol pode trazer,

como conseqncia na maioria das mes, a seleo de cepas xilitol-resistentes dentro

de poucos meses do incio do consumo. Estas cepas parecem ser mais facilmente

dispersas na saliva, a partir da placa, do que as cepas xilitol-sensveis. O efeito do

xilitol na composio da microflora oral, especialmente na porcentagem de S.mutans

XR, tem sido estimado durar por muitos meses ou mesmo anos, aps cessar o

consumo habitual de xilitol e prope o uso deste como forma alternativa ao uso de

clorexedina na preveno da transmisso de SM de me para filho.

Em contrapartida, Assev, Stig e Scheie (2002), compararam o metabolismo de

glicose, frutose e produo de polissacardeos extracelulares (PEC) utilizando istopos

45

de Carbono 14, em clulas de S.mutans XR e XS. Aps a adio de xilitol no meio BHI,

o crescimento bacteriano nas clulas sensveis foi diminudo em aproximadamente

40%, sendo que o xilitol no produziu efeito sobre o crescimento de clulas XR. Com

relao ao metabolismo de xilitol, s foi encontrada a presena do metablito xilitol-5-

fosfato nas clulas sensveis, mas no nas resistentes. Os resultados destes autores

no confirmam que cepas XR so menos cariognicas do que clulas XS. Pelo

contrrio, neste trabalho as clulas XR produziram mais cido do que as XS e o

potencial para produzir PEC foi igual nas duas culturas, o que sugere que o potencial

menos adesivo das cepas XR no est relacionado com formao de PEC. Assim, se

assumirmos que S.mutans XR, selecionados atravs do consumo de xilitol, sejam

menos virulentos que S.mutans XS, esta reduo da virulncia deve estar relacionada

a outros fatores, que no a formao cida a partir da glicose e de polissacardeos a

partir da sacarose.

Hrimech et al. (2000), mostraram que clulas marcadas com aminocidos e

Carbono 14 foram analisadas com relao produo de duas protenas em situao

de estresse celular, HSP-60 e HSP-70. Em ambos fentipos, XR e XS, o estresse

provocado pelo aumento de temperatura levou ao aumentou da quantidade de HSP-60

e HSP-70 e diminuiu a intensidade de outras protenas formadas. A exposio ao xilitol

por sua vez, diminuiu em 50% a produo destas duas protenas sob o estresse ao

calor (HSP-60 e HSP-70) nas cepas XS, mas no nas cepas XR. Isto s aconteceu com

o uso do xilitol, embora os autores tenham testado outros polilcoois. Outras alteraes

na produo de protenas tambm foram verificadas nas cepas XS, enquanto nas

cepas XR as alteraes no ocorreram. Os resultados sugerem que o xilitol possa ser

um forte inibidor do metabolismo bacteriano e que, aparentemente, no produz efeito

46

na produo de protenas nas cepas XR, mas afeta sobremaneira o metabolismo

proteico nas XS. A concentrao inibitria do xilitol ainda controversa na literatura,

variando de 0,1 a 2%.

Sderling, Trahan e Lenader-Lumikari (1998), compararam o padro de

crescimento de 5 pares de cepas clnicas (saliva) e laboratoriais de S.mutans XR e 5

pares XS (cepas clnicas e laboratoriais) e estudaram a diferena na habilidade destas

cepas hidrolizarem peptdeos e protenas da saliva. Utilizando 2 tipos de saliva

humana, com bom complemento de glicose e outra com complemento deficiente, os

padres de crescimento entre XR e XS diferiram muito discretamente, sem diferena

estatstica, sendo, em ambos, menores que a referncia usada, Streptococus sanguis.

Com relao ao metabolismo de protenas, todas os pares XR e XS das amostras

clnicas e laboratoriais mostraram atividade protease e peptidase baixa e bastante

similar. Isto sugere que a capacidade intracelular de utilizar peptdeos entre cepas XR e

XS seja muito semelhante.

Entre os mtodos de reaes biomoleculares mais utilizados para identificar e

genotipar diferentes amostras de microorganismos, Li e Caufield (1998), comparando

o mtodo AP-PCR com tipagem de DNA em genoma de S.mutans, encontraram

grande concordncia entre os mtodos, afirmando que o AP-PCR pode ser usado na

genotipagem de bactrias em estudos epidemiolgicos e taxonmicos, sendo capaz

de detectar polimorfismos entre os diferentes isolados de S.mutans e que o mtodo

confivel, reprodutvel e informativo. Tambm mostra-se vantajoso para estudos

epidemiolgicos de prevalncia, estudos de virulncia/no-virulncia e tipos clonais de

SM. Ainda, o AP-PCR tem potencial de permitir o processamento de grande nmero

47

de isolados de SM obtidos, por exemplo, em estudos de transmisso longitudinal. Foi

verificada tambm, a possibilidade de reprodutibilidade do mtodo, quando usado

para deteco de cepas do mesmo indivduo coletadas em diferentes momentos,

tornando-o assim um mtodo til para estudos de identificao e diversidade de

genomas. Verificaram tambm que houve grande similaridade com o ndice padro de

bandas formado para o mtodo AP-PCR do que com o mtodo controle, sugerindo

que os padres de banda formados com o AP-PCR (8 a 12 bandas) mostram menos

diversidade do que aqueles apresentados pela tipagem do DNA cromossmico,

sendo, portanto, o uso do AP-PCR mais fcil. Estes relatos foram confirmados pelos

trabalhos de Longo, Mattos-Graner e Mayer (2003) e Lembo (2005).

Grnroos e Alaluusua (2000), consideram o AP-PCR confivel e eficiente para

distinguir isolados de S.mutans. Com o uso de AP-PCR, segmentos sortidos de DNA

para um organismo alvo so ampliados com o uso de primers de seqncias

arbitrrias. A maior vantagem do mtodo AP no haver necessidade do

conhecimento prvio do seqenciamento do DNA do organismo pesquisado.

relativamente fcil e rpido de ser realizado comparado com outras tcnicas, o que

torna o mtodo mais atraente (SAARELA et al., 1996). Estes autores estudaram se o

mtodo AP-PCR poderia ser usado para diferenciao dentro da mesma espcie,

sorotipos e clones de isolados clnicos de SM e compararam o poder discriminatrio

do mtodo com tcnicas de ribotipagem mais trabalhosas. Como resultados obtiveram

que a habilidade discriminatria do AP-PCR foi levemente inferior ribotipagem e que

a habilidade do AP-PCR detectar heteriogeneidade de isolados de S.mutans no

mesmo indivduo foi considerada muito boa.

48

3 PROPOSIO

Os propsitos deste estudo foram:

Verificar se h ocorrncia na diminuio dos nveis salivares de

S.mutans em indivduos aps a utilizao freqente e regular, mas por

curto perodo de tempo (30 dias), de gomas de mascar contendo

pequena concentrao de xilitol (15%).

Verificar se os valores obtidos com a utilizao do xilitol se mantm

depois de 30 dias aps a suspenso do uso do produto.

Verificar a similaridade genotpica de S.mutans no mesmo indivduo

nos 3 diferentes momentos do estudo: antes do experimento, 30 dias

aps o uso do xilitol e 30 dias aps a suspenso da utilizao deste

adoante.

Verificar se h ocorrncia in vivo de cepas S.mutans xilitol-tolerantes.

49

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 Seleo dos voluntrios

Indivduos adultos, estudantes de odontologia do curso de graduao e ps-

graduao da Faculdade de Odontologia do ICB da Universidade de So Paulo,

foram selecionados como voluntrios. O presente estudo foi aprovado pela

Comisso de tica em pesquisa sem seres humanos da FOUSP (Anexo A). Foi

obtido consentimento por escrito de cada voluntrio (Anexo B), aps a informao

oral e por escrito dos objetivos e mtodos empregados nesta pesquisa.

Aps a assinatura do termo de consentimento para participao, foram

selecionados 12 indivduos, que possussem nveis salivares de SM maiores ou

iguais a 105 u.f.c./ml, com idade adulta, portadores de dentio completa, que no

apresentassem perda de dentes, doena periodontal, cavidades de crie,

restauraes provisrias ou de m qualidade. A determinao dos nveis salivares

de SM foi realizada pelo teste da esptula (KHLER; BRATTHALL, 1979). Foram

excludos indivduos que estivessem realizando qualquer tipo de tratamento dentrio

ou ortodntico, ou que tivesse sido submetido ao uso de antibiticos por perodo de

at 3 meses antes do incio do estudo. Os voluntrios foram instrudos a no

utilizarem anti-spticos orais no perodo do estudo longitudinal (60 dias). Nenhuma

orientao foi dada com a finalidade de modificar hbitos de higiene ou dieta usuais

destes voluntrios.

50

Na fase experimental os voluntrios selecionados foram submetidos a uso

de goma de mascar (Happydent xylit, Perfect Van Melle, Vinhedo, SP, Brasil)

contendo 15% de xilitol, por perodo mnimo de 5 minutos, 5 vezes ao dia, durante

30 dias ininterruptamente. Cada goma tem o peso de 1,35 g, contendo,

aproximadamente 0,20 g de xilitol, totalizando o consumo de 1,0 g de xilitol, por dia,

para cada voluntrio. A goma de mascar utilizada est representada pela figura 4.1.

Figura 4.1 Fotografia da goma de mascar Happydent xylit, da Perfect Van Melle, contendo 15% de xilitol, utilizada pelos voluntrios

4.2 Coleta de saliva

A coleta da saliva de cada voluntrio foi realizada em 3 momentos distintos:

um dia antes do incio da fase experimental, imediatamente aps a fase

experimental (30 dias a partir do incio do uso do xilitol) e 30 dias aps a interrupo

do uso do xilitol (60 dias a partir do incio do perodo experimental).

Para a coleta da amostra salivar os voluntrios foram orientados a no

realizarem higiene oral por pelo menos 2 horas antes da procedimento e a se

dirigirem ao laboratrio de Microbiologia Oral, ICB, USP. Saliva estimulada foi obtida

51

pela mastigao de 1g de parafina mastigvel (Orion Diagnostica, Helsink, Finlndia)

por 1 minuto. A saliva foi dispensada periodicamente no interior de um tubo de vidro.

4.3 Cultura e contagem bacteriana e estimativa dos nveis salivares

A seguir, alquota de 1 ml de saliva foi imediatamente submetida diluies

seriadas em gua peptonada e alquotas de 100 l de cada diliuio foram

semeadas em triplicata, na superfcie de placas de Petri, contendo o meio gar Mitis

Salivarius, (Difco, Sparks, MD, EUA) acrescido de 15% de sacarose e 69 UI de

bacitracina (GOLD et al., 1973). As placas foram incubadas em atmosfera de 5% de

CO2 em estufa (ShelLab, mod.2123, Cornelius, OR, EUA) a 37oC durante 48 horas.

Aps a incubao, realizou-se a contagem numrica simples das colnias

caractersticas de SM nas placas que apresentassem at 300 colnias, com auxlio

de lupa 10 x (Hellige, Garden City, NY, EUA). Foi estimada, assim, a mdia do

nmero de u.f.c de SM/ml de saliva para cada voluntrio. A seguir, foram

selecionadas entre 50 a 100 colnias de S.mutans por voluntrio atravs das

caractersticas morfolgicas e transferidas para as superfcies das placas de gar

BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Sparks, MD, EUA). Aps a incubao por 24 hs em

atmosfera de 5% de CO2, as colnias foram raspadas com alas plsticas estreis

de 1l e armazenadas individualmente em tubos para centrfuga de 1,5l contendo

glicerol a 20%, identificadas por nomes formados pela combinao de letras e

nmeros e mantidas em freezer temperatura de -80 oC (mod. ULT 2586-3-D35,

Revco, Asheville, NC, EUA) at o momento de seu uso.

52

4.4 Identificao da espcie e genotipagem

A identificao definitiva da espcie foi realizada por PCR usando iniciadores

espcie-especficos (OHO et al., 2000) e a seguir as cepas foram genotipadas por

AP-PCR (LI et al., 2001). As cepas utilizadas para controle positivo foram ATCC

25175 e GS-5.

4.5 Extrao do DNA

Inicialmente foram selecionadas para o estudo 24 amostras identificadas

como S.mutans pelas caractersticas morfolgicas. Alquotas de 100L do estoque

congelado em freezer foram semeadas em gar BHI, seguindo-se incubao por 24

horas, em estufa a 37C, em atmosfera de 5% de CO2. Aps o desenvolvimento das

colnias e confirmao da pureza, foi realizada a extrao do DNA empregando a

tcnica descrita por Alam et al. (1999). Colnias foram removidas da superfcie do

gar com auxlio de alas bacteriolgicas descartveis calibradas (1L), 5L foram

ressuspendidas em 300L de gua MilliQ em tubos para centrfuga de 1,5 ml e a

suspenso agitada por 20 segundos em agitador mecnico de tubos (mod. 220-B2,

Quimis, So Paulo, SP, Brasil). As clulas foram submetidas lise atravs da

imerso dos tubos em gua fervente por 10 minutos. Os restos celulares foram

53

precipitados por centrifugao a 14.000 rpm durante 10 minutos em centrfuga

refrigerada (mod. Centrifuge 5402, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e o

sobrenadante foi transferido para outro tubo de 1,5 ml e armazenado em freezer a -

80oC at o momento do uso.

4.6 Identificao de S.mutans

Para determinar identidade das cepas de S. mutans foi realizado o mtodo

descrito por Oho et al. (2000), e confirmado por Hoshino et al. (2004). Este mtodo

amplifica parte do gene gtfB, atravs do uso de iniciadores especficos para espcie

S. mutans, resultando em um nico amplicom de 517pb.

Os iniciadores utilizados para esta etapa do estudo foram o GTFB-F (5

ACTACACTTTCGGGTGGCTTGG 3) e o GTFB-R (5

CAGTATAAGCGCCAGTTTCATC 3). Cada reao de PCR foi realizada com a

utilizao de 1M de cada iniciador (Invitrogen, So Paulo, SP, Brasil), 50M de

cada desoxinucleotdeo (DNTPs A,T,C,G, Invitrogen), 5l de tampo para PCR 10x

(Invitrogen), 1,5mM MgCl2, 1U de Taq polimerase (Invitrogen) e 3l de DNA total, em

reao de 25 l.

Para a reao de PCR foram realizados 30 ciclos em termociclador (Peltier

Termal Cycler, mod.PTC-200, Watertown, MA, EUA). nas seguintes condies:

desnaturao a 95oC/30seg, anelamento a 59oC/30seg e extenso a 72oC/1min. O

controle negativo foi realizado com a adio da mistura padro de PCR com o

volume de DNA molde substitudo por gua. O controle positivo foi constitudo da

54

mistura padro de PCR acrescida de 3l de DNA molde da amostra ATCC 25125.

Os amplicons foram submetidos separao eletrofortica em gel de agarose 1%

(Invitrogen) em tampo TAE (Tris acetato 40mM, EDTA 2mM, pH 8,5) e corados

com brometo de etdeo (cat. n. E-8751, Sigma, Saint-Louis, MI, EUA). Como

referncia foi utilizado o marcador de peso molecular 100 bp (Invitrogen). Os gis de

agarose foram visualizados em transiluminador de luz ultravioleta (Amersham mod.

UV-20, Pharmacia Biotech, So Francisco, CA, EUA), documentados para estudo e

fotografados pelo sistema de fotografia digital Photo PC 3100Z (EPSON Hemel-

Hempstead, Inglaterra) e analisados pelo programa Syngene-GeneTools Analysis

Software verso 3.03.03 (Syn Gene, Cambridge, Inglaterra).

4.7 Genotipagem

Quinze amostras por coleta para cada paciente, identificadas como

S.mutans pela reao anteriormente descrita, foram selecionadas aleatoriamente

para a genotipagem, pela tcnica de RAPD-PCR. Para esta reao foi utilizado o

primer OPA 2 ( LI et al. 2001) (5 TGCCGAGCTG 3). Como controle, em todas as

reaes, foi utilizada a amostra de S. mutans ATCC 25175. A reao foi realizada

segundo os seguintes parmetros: 5ul de DNA molde, 50 pmol do iniciador OPA-2

(Invitrogen), 200mM de DNTPs, 3,5U de Taq polimerase, MgCl2 na concentrao de

1,75 mM, 2,5l de soluo tampo 10x em volume total de 25l. A amplificao foi

realizada em termociclador de acordo com os seguintes parmetros: desnaturao

55

inicial 94C por 5 minutos, seguida de 45 ciclos de 94C/30seg, 36C/30seg,

72C/1min e extenso final de 5 minutos a 72C.

Aps reao em termociclador, os amplicons foram submetidos separao

eletrofortica em gel de agarose a 2% em tampo TAE, e corados com brometo de

etdeo. Em seguida visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e

documentados para estudo. Como referncia tambm foi usado o marcador de peso

m