Disciplina de Biologia Molecular (60 h) Prof. Leonardo Crema.
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Disciplina de Biologia Molecular(60 h)
Prof. Leonardo Crema
Ementa
• EMENTA: 1) Mecanismos moleculares da replicação do
DNA, transcrição e tradução gênica. Características do código genético. Tipos de mutações. Polimorfismos. Organização do genoma. Técnicas de biologia molecular. Bioinformática. Genética forense. Clonagem. Transgenia. Tipos de células tronco. Prática Profissional Integrada.
Bibliografia Básica
• ALBERTS, B.; et al. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed. 2010.
• GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à genética. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002.
• SNUSTAD, P. & SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
Bibliografia Básica• ALBERTS, B.; ANDRADE, A. E. Fundamentos da biologia
celular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.• COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem
molecular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular.
8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 332 p. 2011.• RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. Biologia Vegetal. 7 ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.• SADAVA, D.; HELLER, C.; ORIANS, G.H.; PURVES, W.K.; HILLIS,
D.M. Vida: A Ciência da Biologia - Célula e Hereditariedade. V. 1, 8 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.
Introdução à Biologia Molecular
Prof. Leonardo Crema
ORGANISMO
CÉLULA
NÚCLEO
CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)
- Informação das proteínas e RNAs que serão sintetizadas pelas células do organismo ao longo da sua vida.-Capacidade de se auto- duplicar para originar outras células.
DNADNA
NOS SERES HUMANOSNOS SERES HUMANOS
•1953: Watson and Crick
Estrutura do DNA
Dogma Central da
Biologia Molecular
• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON
• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma
1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA
Sequências sucessivas de três nucleotídeos do DNA (codon) determinam a sequência de aminoácidos de uma proteína
O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!
DNA
1. Regulação transcricional
mRNA 2. Regulação no processamento do RNA primário
3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO
4. Regulação da síntese proteíca
Proteínasintetizada
5. Regulação pós-síntese
A CÉLULA
- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO AMBIENTE
DNACromossoma
Gene
Promotor IntronExon
Núcleo
DNA
ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
Contém toda a informação genética de um organismo
Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro diferentes nucleotídeos:
• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA e RNA
• Timina – encontrada somente no DNA
• Uracila – encontrada somente no RNA
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum:
radical fosfato
pentose
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
As bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos de acordo com sua estrutura:
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
O grupo hidroxil ligado ao carbono 3 da pentose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo
DNA
• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma
• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de hidrogênio entre as bases o que contribui para a estabilidade da dupla hélice
. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio
. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio
DNA
As fitas do DNA estão dispostas em
direções opostas
Antiparalelismo
Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita
Complementariedade
Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas
ou mães servem de molde para cada fita
nova ou filha complementar, que
está sendo sintetizada.
Fita nova
Fita velha
Complementariedade
Fatores que estabilizam a dupla hélice:
• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio
• interações iônicas
Entre as bases nitrogenadas
Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+) presentes na solução fisiológica
A Dupla Hélice
Sulco menor
Sulco maior
A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as
proteínas da cromatina
A Dupla Hélice
Proteínas:níveis de complexidade estrutural
O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA
DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)
A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário
A Dupla Hélice
Propriedades Químicas e Físicas do DNA
REPLICAÇÃO DO DNA
Conservativa ou Semiconservativa?
Unidirecional ou Bidirecional?
REPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958
• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para crescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogênio pesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.
• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N (nitrogênio leve – “light”).
• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.
•The Meselson-Stahl experiment
A replicação é semi-conservativa
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Experimento com SV40 (Simian Virus)
• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.
• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolha chamada bolha de replicação comprovando a existência de um ponto de origem da replicação
Características da origem de replicação:
. estrutura repetitiva
. seqüências ricas em AT
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
ORIGEM Sítio de restrição EcoRI
Cromossomo viral circular
EcoRI
Bolha de replicação
ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Biologia – Campbell & Cols.
Procariontes vs Eucariontes
Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de Replicação”
• Nos eucariontes, a replicação requer “múltiplas origens”, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea.
• Este processo gera “bolhas de replicação”.
Região Gênica É a porção que codifica para
um produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou
um RNA
O DNA é formado por 2 regiões:
Gênicas Intergênicas
Região IntergênicaÉ a porção regulatória, que
sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a
transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a
replicação do DNA
Intergênicas Gênicas
Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
Os mecanismos celulares responsáveis pela replicação do DNA foram descobertos primeiramente em bactérias.
A replicação em eucariotos ocorre através de proteínas análogas e com processos semelhantes à replicação do DNA de E. coli
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)
1. DNA Polimerases2. Endonucleases3. Helicases 4. Topoisomerases5. Primases6. Telomerases
DNA POLIMERASE
• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA
• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente
• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical hidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está se formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no sentido 5’ 3’
Biologia – Campbell & Cols.
DNA Polimerases
• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo
• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início – alongamento
• 3 tipos principais : I, II e III; existem pelo menos 11 I : importante no sistema de reparo III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)
Adição de nucleotídeos
1
2
3
FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita contínua“leading”
FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita descontínua I“Lagging”
FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita descontínua II• “Lagging”
OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO
HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula.
SSB (“single-strand-binding”- proteínas de ligação à fita simples) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.
PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.
TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos
FITA “LEADING” – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação
FITA “LAGGING” – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3’ 5’
FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores
• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase.
• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.
•DNA polimeraseI remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua
ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE
MOLÉCULAS LINEARES DE DNA
ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE
MOLÉCULAS LINEARES DE DNA
TELOMERASE
• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros
• A síntese da fita “leading” continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita “lagging” não é digerida.
• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.
• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.
TELOMERASE
REGULAÇÃO
-única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;
-afetada pela metilação de DNA
-DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental
Gene
RNA polimerase
hnRNA
mRNA
Citoplasma
Transcrição
Processamento
Núcleo
Tradução
proteína
O RNA ou ARN
• O açúcar é uma Ribose;• É formado, geralmente, por
uma fita simples que pode enrolar-se;
• Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila.
• Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA em três aspectos básicos:
A-UU-AG-CC-G
A-TT-AG-CC-G
DNA
RNA
RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )).
A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.
1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX:
T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um ! ! ! ! ! ! conjunto de bases uma proteína.
A - U - GA - U - G - A - C - U RNAmCódon início códon proteínaaa A aa B
Tipos de RNA
Síntese Protéica
• A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’.
• Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C.
• Ao final da transcrição a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.
A TranscriçãoA Transcrição
Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA
A T A C A T G G G C T A G A A
UU U U U UGG C C CC AAA
Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina.
DNA
RNARNAm
2-RNA transportador (RNAt) - é produzido nos cromossomos a partir de DNA especiais. É uma molécula cadeia curta, (é o menor RNA) que transporta os aa que estão dispersos no citoplasma até os ribossomos. O RNAt tem formato de “folhas de trevo” e contém outros tipos de bases, além das comumente encontradas nos outros RNAs. Cada RNAt é capaz de reconhecer um determinado aa determinado códon, no RNAm. Todo RNAt tem um filamento livre de sua molécula composta pela seguinte seqüência de bases: ACC. É nesse local que ocorre a associação com o aa. Em cada região da molécula existe uma seqüência de 3 bases denominadas anticódon, que reconhece a posição do aa no RNAm.
Tipos RNAs (2/2)
RNA TRANSPORTADORRNA TRANSPORTADOR
3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre em maior quantidade nas células. Esse RNA é encontrado no nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma, associado às proteínas, formando os ribossomos.
Tipos de RNA• RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a
“mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.
• RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.
• RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.
SÍNTESE DE PROTEÍNAS:
A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAt que estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína.
Núcleo
DNA RNAm RNAm Transcrição Proteínas TraduçãoNúcleoDNA-RNAm
A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmoRNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.
Os Íntrons e os Éxons
Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré-RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma.
A
Éxon Íntron Éxon ÉxonÍntron Íntron
Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro
Síntese Protéica• O RNAm transcrito no núcleo
chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.
• O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.
• O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.
• Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.
• Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.
A TraduçãoA Tradução
O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados
4. Terminação
Dogma Central da Biologia Molecular
• Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick.• Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à
Proteína – fluxo unidirecional da informação.• O DNA é o “molde” para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este
por sua vez é o “molde” para formação das proteínas (tradução).• Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o
RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira.
• Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas.• Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central
sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína.
• Projeto Proteômico.
Diferenças entre RNA e DNAO RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas.
Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo).
As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA.
DNA
RNA
Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas.
DNA (ácido desoxirribonucléico) RNA (ácido ribonucléico)
Se localiza somente no núcleo Se localiza no núcleo e no citoplasma
Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas
Apresenta apenas uma fita
É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose
É formado com a pentose ribose
Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G
Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G
DNA e RNA
Código Genético
Codon que dá origem à síntese dequalquer proteína
Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964)No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína.
Genoma Conjunto de moléculas de DNA
Oração do DNA
Creio no DNA todo poderosocriador de todos os seres vivos,creio no RNA,seu único filho,que foi concebido por ordem a graça do DNA polimerase.Nasceu como transcrito primáriopadeceu sobre o poder das nucleases, metilases e poliadenilases.Foi processa, modificado e transportado.Desceu do citoplasma e em poucos segundos foi traduzido à proteína.Subiu pelo retículo endoplasmático e o complexo de Golgi E está ancorado à direita de uma proteína GNa membrana plasmáticaDe onde há de vir a controlar a transdução de sinaisEm células normais e apoptóticasCreio na Biologia MolecularNa terapia gênica e na biotecnologiaNo seqüenciamento do genoma humanoNa correção de mutaçõesNa clonagem da DollyNa vida eterna.Amém