Controle de Qualidade em Citometria de Fluxo - gbcflux.com.br · ajustados de m odo a retirar a...

C o n t r o le d e Q u a l id a d e e m C it o m e t r ia d e F lu x o

A n a P a u la d e A z a m b u ja

C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e F lu o r e s c ê n c ia F lu o r e s c ê n c ia

• O c i t ô m e t r o d e f lu x o d e v e d i f e r e n c ia r e n t r e o p ic o f r a c o e a a u to f lu o r e s c ê n c ia n o c a n a l d e f lu o r e s c ê n c ia

• O s c o n ju g a d o s d e f lu o r o c r o m o s :

• Devem ser fortes (bright) • Minima sobreposição (spectral overlap ou spilltover)• AcMo adequados

Chave : Separar Sinais Positivos & Negativos

PMT A

Quais fatores determinam a separação?

Intensidade do Fluorocromo

Relacionado ao Fluorocromo

Emissão de Fótons

Erro na dispersão

Autofluorescência Celular

PMT A

Relacionado ao Citômetro

Detector Dinâmico do Intervalo

Ruído Eletrônico

Poder do Laser

Filtros de qualidade pobre ou impróprios

Chave : Separar Sinais Positivos & Negativos


Chave: Citometros e Reagentes bem caracterizados

Relacionados ao Fluorocromo Relacionados ao CitômetroIntensidade de Fluorescência Detector Dinâmico de intervaloPE, APC mais brilhantes Qualidade fixada, Característica

Autofluorecência Celular Ruído EletrônicoHigher in UV/Violet Region

Emissão de Fótons Poder do LaserBaixa para Fluorocromos vermelhos, Melhor mais altoDetecção imperfeita para baixo sinal.

Erro na Dispersão Filtros Pobres/ImprópriosCaracterística do painel de anticorpos,sinais de outros canais resulta emdetecção imperfeita de baixos sinais.


Chave: Citometros e Reagentes bem caracterizados

Relacionados ao Fluorocromo Relacionados ao CitômetroIntensidade de Fluorescencia Detector Dinâmico de intervaloPE, APC mais brilhantes Qualidade fixada, Característica

Autofluorecência Celular Ruído EletrônicoHigher in UV/Violet Region

Emissão de Fótons Poder do LaserBaixa para Fluorocromos vermelhos, Melhor mais altoDetecção imperfeita para baixo sinal.

Erro na Dispersão Filtros Pobres/Impróprios

Característica do painél de anticorpos,sinais de outros canais resulta emdetecção imperfeita de baixos sinais.


De todas essas coisas voce pode…

Medir

Otimizar

e/ou Trabalhar-melhorias!

Conhecer o citometro, reagentes, e estudar!

Beads padronizadas sao usadas para determinadas funçoes.ALINHAMENTOCOMPENSAÇAOCALIBRAÇAO

DETERMINAÇAO DA PERFORMANCE DO INSTRUMENTOLinearidade, detecçao do threshold, variabilidades de análise

QUANTIFICAÇAO DA INTENSIDADE DE FLORESCENCIA

COMPARAÇAO INTRA-INSTRUMENTO E INTERINSTRUMENTOS


C a l ib r a ç ã o e c o m p e n s a ç ã o d o c i t ô m e t r o d e f lu x o

• O s v a lo r e s d o s d e te c t o r e s d e f lu o r e s c ê n c ia s ã o a ju s t a d o s d e m o d o a r e t i r a r a f lu o r e s c ê n c ia d e fu n d o , a q u a l p o d e r e s u l t a r d e u m a u n iã o n ã o e s p e c í f ic a d e a n t ic o r p o s n o c o n t r o le is o t í p ic o e d a a u to f lu o r e s c ê n c ia d a s c é lu la s .

• A s d e f in iç õ e s d e c o m p e n s a ç ã o s ã o a ju s t a d a s p a r a c o r r ig i r a s o b r e p o s iç ã o e s p e c t r a l e d e p e n d e m d a s v o l t a g e n s d o d e te c t o r e s t a b e le c id a s c o m o c o n t r o le is o t í p ic o .

• A p ó s d e f in i r a s v o l t a g e n s , a c o m p e n s a ç ã o é a ju s t a d a n a s c é lu la s f lu o r e s c e n t e s p o s i t iv a s .

A m o s t r a s e m a n t ic o r p o

• A ju s ta r o T H R E S H O L D p a r a r e m o v e r a m a io r ia d o s d e b r is s e m c o r t a r a p o p u la ç ã o d e in te r e s s e

• A ju s ta r a s v o l t a g e n s d e F L 1 , F L 2 , F L 3 e F L 4 n a ja n e la D E T E C T O R S /A M P S p a r a s i t u a r a p o p u la ç ã o n e g a t iv a n o q u a d r a n te e s q u e r d o in fe r io r ;

A m o s t r a s c o m a n t ic o r p o

• E m c o n d iç õ e s ó t im a s , a f lu o r e s c ê n c ia F L 1 d e v e s e r d e te c t a d a p o r u m d e te c t o r d e F L 1 ; a F L 2 p o r u m d e te c t o r d e F L 2 ; a F L 3 p o r u m d e te c t o r d e F L 3 e a F L 4 p o r u m d e te c t o r d e F L 4 .

• N o e n t a n t o , q u a n d o a lg u m a n t ic o r p o m o n o c lo n a l m a r c a d o fo r n e c e u m a f lu o r e s c ê n c ia m u it o a l t a , e s t a f lu o r e s c ê n c ia p o d e s e r d e te c t a d a p a r c ia lm e n t e (o u to t a lm e n te ) e m u m d e te c t o r q u e n ã o lh e c o r r e s p o n d a

• V a lo r e s f a ls o p o s i t iv o s o u in f r a c o m p e n s a d o s

• V a lo r e s f a ls o -n e g a t iv o s o u h ip e r c o m p e n s a d o s

C o m p e n s a ç ã o d a s C o m p e n s a ç ã o d a s F lu o r e s c ê n c ia sF lu o r e s c ê n c ia s

TUBO FITC PE PerCP PECy5 PerCP Cy5.5

APC

1 - - - - - -2 8 - - - - -3 - 8 - - - -4 - - 3 - - -5 - - - 8 - -6 - - - - 3 -7 - - - - - 8

C a l ib r a ç ã o c o m B E A D SC a l ib r a ç ã o c o m B E A D S

• D is p o n ib i l id a d e d e m ic r o e s fe r a s c o m u m n ú m e r o p r é -d e te rm in a d o d e m o lé c u la s e q u iv a le n t e s d e f lu o r o c r o m o s f lu o r o c r o m o s s o lú v e is (M E S F ) s o lú v e is (M E S F ) in v e s t ig a l in e a r id a d e e d e f in e o m í n im o d e M E S F d e t e c t á v e l p a r a c a d a f lu o r o c r o m o .

• P a r a v a l id a ç ã o d e s e n s ib i l id a d e e l in e a r id a d e v a l id a ç ã o d e s e n s ib i l id a d e e l in e a r id a d e (v e r i f i c a r a r e s p o s ta d o d e te c t o r) u t i l iz a -s e s é r ie d e b e a d s c o m n í v e is d e In t e n s id a d e d e F lu o r e s c ê n c ia p r é d e f in id o s .

• Q u a n d o - s e m p r e q u e u t i l iz a d o s n o v o s in s t r u m e n to s , e p a r a m a n u t e n ç ã o e r e p a r o .

• P a r a a ju s t a r o s g a n h o s d e a m p l i f ic a ç ã o o u a ju s t a r o s g a n h o s d e a m p l i f ic a ç ã o o u fo t o m u l t ip l ic a d o r e sf o t o m u l t ip l ic a d o r e s , u t i l iz a -s e e s p é c ie s n o rm a is o u b e a d s d e r e f e r ê n c ia p r e d e f in id o s

• Q u a n d o - e m c a s o s d e n o v o s in s t r u m e n to s , m a n u te n ç ã o e r e p a r o , in t r o d u ç ã o d e te s t e s o u m u d a n ç a s n o s p r o t o c o lo s .

C A L IB R IT E – 4 c o r e sC A L IB R IT E – 4 c o r e s

B e a d s d e c o m p e n s a çB e a d s d e c o m p e n s a ç ã o - ã o - C A L IB R IT EC A L IB R IT E

C O M P B e a d s – 8 c o r e sC O M P B e a d s – 8 c o r e s

C o m p e n s a ç ã o M u l t ic o lo r Um fato da vida na citometria de fluxo: sobreposiçao/compensaçao

“Compensação” subtração dessas sobreposições…Melhor determinação usando beads anti-IgK, coloração única

com cada anticorpo, e calcular por software.

(Policro flow é muito complexo para compensar manualmente por pares!)

Rápido e sem “sujeiras” para contruir um painel trabalhoso:

Usar fluorocromos com alta sobreposição para marcadores que não são co-expressos (CD4/CD8).

Evitar fluorocromos que fazer sobreposição… dotsplot ajuda.

Aplic a tion note: S elec ting R eag ents for M ultic olor Flow C ytometry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T r o t t e r . B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e . S e t/2 0 0 9

Compensação é o processo matemático pelo qual nós corrigimos os dados multiparamétricos do citômetro de fluxo para diminuir a sobreposição espectral.

Esta sobreposição, ou (overlap ou “spillover”) resulta do uso de corantes fluorocromos que sao mensuráveis em mais de um detector.

“The process of compensation is a simple application of linear algebra, with the goal to correct for spillovers of all dyes into all detectors, such that on output, the data are effectively normalized so that each parameter contains information from a single dye.”

Roendenter, Cytometry 45:194–205 (2001)

C o m p e n s a ç ã o M u l t ic o lo r

R eg ra bás ic a : C onheç a s eu ins trumento

• R u le 1 : C h o o s e th e b r ig h te s t s e t o f f lu o r o c h r o m e s fo r y o u r p a r t ic u la r in s t r u m e n t c o n f ig u r a t io n .

• A s e le ç ã o d o s r e a g e n t e s c o m e ç a c o m a c o n f ig u r a ç ã o d o c i t ô m e t r o d e f lu x o .

• O t ip o e o n ú m e r o d e la s e r s e d e te c t o r e s d i t a s e o s is t e m a ó p t ic o p o d e e x c i t a r u m f lu o r o c r o m o e d e te c t a r a p r o p r ia d a m e n te u m a c o m b in a ç ã o d e f lu o r o c r o m o s .

• O d e s ig n d o s is t e m a ó p t ic o e o s ‘in s t r u m e n t s e t t in g s ’, in c lu in d o a s v o l t a g e n s d o s P M T , ta m b é m tê m im p a c to n a e f ic iê n c ia d e u m c o r a n t e p a r t ic u la r .

• E s c o lh a d o s f i l t r o s ó p t ic o s


Fluoroc hromes : G o for the brig ht...

• R u le 2 : C h o o s e f lu o r o c h r o m e s to m in im iz e th e p o t e n t ia l f o r s p e c t r a l o v e r la p .

• D a d a s a s m u it a s d i f e r e n ç a s n a c o n f ig u r a ç ã o d o s in s t r u m e n to s , é im p o s s í v e l e n c o n t r a r o "m e lh o r " f lu o r o c r o m o p a r a u s a r e m c o m b in a ç õ e s d e 6 , 8 , o u m a is c o r e s .

• N o e n ta n t o , p a r a u m c i t ô m e t r o d e f lu x o p a r t ic u la r é p o s s í v e l c la s s i f ic a r c o r a n te s d is p o n í v e is d e a c o r d o c o m s e u b r i lh o s o b r e e s s e in s t r u m e n to (q u a n d o c o n f ig u r a d o c o m u m d e te rm in a d o c o n ju n to d e la s e r s e f i l t r o s ).

• M a s c o m o e x a t a m e n te p o d e m o s d e f in i r e m e d ir o b r i lh o ?

M a e c k e r H T , F r e y T , N o m u r a L E , T r o t t e r J . S e le c t in g f lu o r o c h r o m e c o n ju g a t e s f o r m a x im u m s e n s i t iv i t y . Cytometry A. 2 0 0 4 ;6 2 :1 6 9 .

N ormalized S ig na l/B ac kg round: S ta in Index

S ta in In d e x (S I) = D /W

S ta in I n d e x (S I) = D /W

• O b je t iv o : N o rm a l iz a r o s in a l p a r a r e t i r a r o b a c k g r o u n d (a u to f lu o r e s c ê n c ia ), c o lo r a ç o e s n ã o e s p e c í f ic a s , “e le t r o n ic n o is e ”, e b a c k g r o u n d ó p t ic o d e o u t r o s f lu o r o c r o m o s (in t e r f e r ê n c ia o u s p i l lo v e r).

M a e c k e r H T , F r e y T , N o m u r a L E , T r o t t e r J . S e le c t in g f lu o r o c h r o m e c o n ju g a t e s f o r m a x im u m s e n s i t iv i t y . Cytometry A. 2 0 0 4 ;6 2 :1 6 9 .

• T e s t e s fe i t o s c o m u m m e s m o A c M o c o n ju g a d o c o m o s d iv e r s o s r e a g e n t e s n u m m e s m o in s t r u m e n to (B D ™ L S R I I)

• R e a g e n t e s s o z in h o s , n ã o p a r t e d e u m ‘c o q u e te l ’

• O b je t iv o e v i t a r ‘S p e c t r a l o v e r la p (o r s p i l lo v e r)’

R u le 3 : R e s e r v e t h e b r ig h t e s t f lu o r o c h r o m e s fo r d im a n t ib o d ie s , a n d v ic e v e r s a .

• Ordenar os Fluoroc romos pos s íveis pelo brilho rela tivo

P E > A P C >P E -C y 7 > P e rC P -C y 5 .5 P E > A P C >P E -C y 7 > P e rC P -C y 5 .5 >A le x a 7 0 0 > P E -T e x a s > P e rC P > >A le x a 7 0 0 > P E -T e x a s > P e rC P >

F IT C > P a c i f ic B lu e > A m C y a n > A P C -F IT C > P a c i f ic B lu e > A m C y a n > A P C -C y 7C y 7


B R ILHO = E FIC IÊ N C IA

R o e d e s r , v e r

• R e g r a B á s ic a (R o e d e r e r ): T H E L O W E R T H E A N T IG E N D E N S IT Y , T H E B R IG H T E R T H E F L U O R O C H R O M E T O B E U S E D

Roederer

R u le 4 : A v o id s p i l lo v e r f r o m b r ig h t c e l l p o p u la t io n s in t o d e te c t o r s r e q u i r in g h ig h s e n s i t iv i t y f o r t h o s e p o p u la t io n s .

• P E -C y ™ 5 é m u i t o fo r t e (a l t o S ta in In d e x ), m a s te m c o n s id e r á v e l “s p i l lo v e r “(o u s e ja , a d ic io n a b a c k g r o u n d ) n o d e te c t o r A P C .

• S e e s s e s d o is f lu o r o c r o m o s s ã o u s a d o s ju n to s , a s e n s ib i l id a d e d e r e s o lu ç ã o n o A P C v a i s e r r e d u z id a , s e c o m p a r a d a p o r e x e m p lo , a u m a c o m b in a ç ã o d e P e rC P -C y 5 .5 e A P C .

• E s te é u m c a s o e m q u e p o d e s e r q u e te n h a m o s q u e s a c r i f ic a r u m a c e r t a q u a n t id a d e d e b r i lh o e n u m d e te c t o r p a r a e v i t a r ‘s p i l lo v e r ’ (e p e r d a d a s e n s ib i l id a d e d e r e s o lu ç ã o ) n o o u t r o .


P E S IG N A L Q U E N C H E D B Y A P C …

COMPBEADS LOADEDWITH PE

COMPBEADS LOADEDWITH PE AND APC

PE

PE

… W IT H O U T F R E T

F R O M P E T O A P C

COMPBEADS LOADEDWITH PE

COMPBEADS LOADEDWITH PE AND APC

APC

APC

R u le 5 : T a k e s te p s to a v o id ta n d e m d y e d e g r a d a t io n , a n d c o n s id e r i t s im p a c t u p o n r e s u l t s .

• P o te n c ia l p a r a d e g r a d a ç ã o d o s c o r a n t e s ta n d e m

• A P C -C y 7 e P E -C y 7 p o r e x e m p lo , p o d e m d e g r a d a r n a p r e s e n ç a d e lu z , f ix a ç ã o , te m p e r a t u r a s e le v a d a s e e m i t i r s in a l n o d e te c t o r “p a i” (A P C o u P E ). E s te p r o c e s s o c o m e ç a e m u m a s u b p o p u la ç ã o c a u s a n d o fa ls o p o s i t iv o s e m A P C o u P E

• E v i t a r e x p o s iç ã o a lu z o u c a lo r , o u c o m

f lu o r o c r o m o s n ã o ta n d e m (A P C H 7).


THE SCORPION TAIL OF TANDEM DYES

EMISSION

PE-TR PE-CY5.5 PE-CY7PE

R e g r a s p a r a e s c o lh a d o s r e a g e n t e s

• R e g r a 1 : E s c o lh a o s f lu o r o c r o m o s c o n fo rm e s e u in s t r u m e n to .

• R e g r a 2 : E s c o lh a o s f lu o r o c r o m o s p a r a m in im iz a r o p o te n c ia l d e s o b r e p o s iç ã o (spectral overlap).

• R e g r a 3 : R e s e r v e o s f lu o r o c r o m o s m a is fo r t e s p a r a o s a n t ic o r p o s m a is f r a c o s , e v ic e v e r s a .

• R e g r a 4 : E v i t a r spillover d e p o p u la ç o e s c e lu la r e s d e u m d e te c to r e m o u t r o (P E c y 5 x A P C )

• R e g r a 5 : E v i t a r d e g r a d a ç ã o d o s a n t ic o r p o s ta n d e m , e c o n s id e r a r n o s r e s u l t a d o s .

R e fe r ê n c ia sR e fe r ê n c ia s

• R o e d e r e r , M . C y t o m e t r y 4 5 :1 9 4 -2 0 5 (2 0 0 1 )

• M a e c k e r H T , F r e y T , N o m u r a L E , T r o t t e r J . S e le c t in g f lu o r o c h r o m e c o n ju g a t e s f o r m a x im u m s e n s i t i v i t y . Cytometry A. 2 0 0 4 ;6 2 :1 6 9 .

• M a n u a l d o F A C S C a l ib u r (B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e , C a l i f o r n ia , E U A ).

• B IO , C T . T r e in a m e n t o p a r a Q u a n t i f i c a ç ã o d e L in f ó c i t o s T C D 4 /C D 8 . B D B io s c ie n c e s .

• M a n e jo D e l C i t ó m e t r o d e F lu jo (C T F ) m o d e lo F A C S c a n d e B e c t o n D ic k in s o n . P r o t o c o lo s e n I n m u n o lo g í a C e lu la r , S a la m a n c a , E s p a n h a .

• G u ia d o E q u ip a m e n to e G u ia d e S o f tw a r e (C e l l Q u e s t P r o ) B D F A C S C a l ib u r .

• W o o d B . 9 -C o lo r a n d 1 0 -C o lo r F lo w C y t o m e t r y in th e C l in ic a l L a b o r a t o r y . A r c h P a t h o l L a b M e d 2 0 0 6 ;1 3 0 6 8 0 -6 9 0

• R o e d e r e r M . C o m p e n s a t io n . In : R o b in s o n J P , D a r z y n k ie w ic z Z , D e a n P N , D r e s s le r L G , R a b in o v i t c h P S , S t e w a r t C C , T a n k e H J , W h e e le s s L L , e d i t o r s . C u r r e n t P r o t o c o ls in C y to m e t r y . N e w Y o r k : J o h n W ile y & S o n s , I n c .; 1 9 9 9 .

• S h a p ir o H M , P e r lm u t t e r N G , S te in P G : A F lo w C y t o m e t e r D e s ig n e d fo r F lu o r e s c e n c e C a l ib r a t io n . C y t o m e t r y 3 3 :2 8 0 – 2 8 7 (1 9 9 8 ).

• H o f fm a n R A a n d C h a s e E S , R e s o lu t io n o f D im ly F lu o r e s c e n t P a r t ic le s : A P r a c t ic a l M e a s u r e o f F lu o r e s c e n c e S e n s i t iv i t y . C y to m e t r y 3 3 :2 6 7 – 2 7 9 (1 9 9 8 ).

• B a g w e l l C B a n d A d a m s E G . F lu o r e s c e n c e s p e c t r a l o v e r la p c o m p e n s a t io n f o r a n y n u m b e r o f f lo w c y t o m e t r y p a r a m e te r s . A n n N Y A c a d S c i 1 9 9 3 ;6 7 7 :1 6 7 – 1 8 4 .

• H e r z e n b e r g L A , T u n g J , M o o r e W A , H e r z e n b e r g L A , P a r k s D R . I n t e r p r e t in g

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