Claudenize Pontes da Silva Leal - UFPR · 2011. 8. 25. · O uso de plantas para o preparo de...

Claudenize Pontes da Silva Leal ISOLAMENTO E QUANTIFICAÇÃO DE MARCADORES QUÍMICOS

DE Centella asiatica L. E Cynara scolymus

Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre. Programa de Pós-Graduação em Química, Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do Paraná.

Orientador: Prof. Brás Heleno de Oliveira

CURITIBA 2006

i

Ao meu amado esposo e à minha querida família dedico este trabalho.

ii

Agradecimentos

A Deus, pela certeza que todo esforço vale a pena, pelo amparo e consolo e pelo caminho de luz

que sempre me guiou;

A meu esposo Moacyr Neto pelo amor, paciência e apoio incondicionais, pelas lágrimas

enxugadas e por sempre estar ao meu lado;

Aos meus pais Francisco e Mercedes e irmãos Claudecir e Claudinei pelas orações, incentivo e

apoio constantes à busca do crescimento e realização pessoal;

Aos meus sogros Moacyr e Maria Luiza, pelo apoio constante;

Aos meus demais familiares, pelo apoio e amor;

À amiga Elisa Perez pela ajuda em todos os sentidos e pela amizade incansável;

Aos amigos do laboratório pela ajuda, conversas a fio e, é claro, pelo café das 14:56h: Alexandre

A. de Oliveira, César A. M. Chornobai, Janaína F. Packer, Júlio César Stirmer, Maurício L. Belém

e Patrícia Zancanella;

Aos demais amigos de laboratório que também fizeram parte da minha história: Denise Zelak

Bastos, José Luiz F. da Trindade, Rodrigo L. Magalhães e Tiago Cavassin;

Ao professor Brás Heleno de Oliveira pela oportunidade, confiança e orientação;

Ao programa de pós graduação em Química da UFPR, principalmente à professora Jaísa

Fernandes Soares pelo auxílio incansável e ao secretário Marcelino Câmara;

À professora Beatriz Helena L. N. Sales Maia pelos conselhos, amizade e correções;

Às professoras Sônia F. Zawadski e Jacqueline A. Takahashi pelos conselhos e correções;

Aos colegas Anderson Barisson e Emmanoel Costa pela ajuda com os espectros de RMN;

À indústria Steviafarma de Maringá pelo envio das plantas;

Ao Lactec pelas análises de TGA e Distribuiçao Granulométrica a Laser.

Agradeço a todos que passaram por mim e que de uma forma ou de outra deixaram sua

lembrança. Neste período aprendi que uma amizade sincera pode surgir de onde menos

esperamos, que um “não” pode partir de quem mais acreditamos e que o amor é mais precioso

que qualquer conhecimento.

iii

Sumário

LISTA DE ESQUEMAS....................................................................................................VI

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... VII

LISTA DE TABELAS ....................................................................................................VIII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................IX

RESUMO ............................................................................................................................ X

ABSTRACT .......................................................................................................................XI

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 1

1.1 FITOTERAPIA ................................................................................................................ 1 1.2 CENTELLA ASIATICA L., APIACEAE ............................................................................... 1 1.3 CYNARA SCOLYMUS L., ASTERACEAE ............................................................................ 5 1.4 CROMATOGRAFIA PREPARATIVA EM FASE ESTACIONÁRIA REVERSA ............................ 8

2 OBJETIVO................................................................................................................... 10

2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................................ 10 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 10

3 EXPERIMENTAL ....................................................................................................... 11

3.1 ESPECIFICAÇÕES GERAIS DOS MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ...................................... 11 3.2 FASE ESTACIONÁRIA REVERSA QUIMICAMENTE LIGADA PC-18 ................................. 12 3.2.1 PREPARAÇÃO DAS FASES REVERSAS ........................................................................... 12 3.2.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE FASE REVERSA .................................................................... 12 3.2.3 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA) ..................................................................... 13 3.2.4 ANÁLISE DE DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA A LASER ............................................. 14 3.3 CENTELLA ASIATICA .................................................................................................... 14 3.3.1 MÉTODO DE EXTRAÇÃO ............................................................................................. 14 3.3.2 OBTENÇÃO DOS GLICOSÍDEOS - MÉTODO A................................................................ 15 3.3.3 CROMATOGRAFIA COM PC-18 “FLASH” EM MICRO-ESCALA...................................... 15 3.3.4 EMPACOTAMENTO DE COLUNAS PARA CLAE PREPARATIVA COM PC-18 ..................... 16

iv

3.3.5 OBTENÇÃO DOS GLICOSÍDEOS - MÉTODO B ................................................................ 16 3.3.6 CCDC E RECRISTALIZAÇÃO ....................................................................................... 17 3.3.7 QUANTIFICAÇÃO DO ASIATICOSÍDEO POR CLAE/UV.................................................. 17 3.3.7.1 Otimização do método de extração ........................................................................ 17 3.3.7.2 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 18 3.3.7.3 Curva de calibração ............................................................................................... 18 3.3.8 PREPARAÇÃO DO EXTRATO SECO EM SPRAY DRYER ...................................................... 18 3.3.9 TEOR DE ASIATICOSÍDEO EM EXTRATOS COMERCIAIS .................................................. 19 3.4 CYNARA SCOLYMUS ...................................................................................................... 20 3.4.1 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO ........................................................................................... 20 3.4.2 CROMATOGRAFIA COM PC-18 “FLASH” EM MICRO-ESCALA...................................... 21 3.4.3 CROMATOGRAFIA COM PC-18 “FLASH” EM ESCALA PREPARATIVA ........................... 21 3.4.4 QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLOROGÊNICO POR CLAE/UV......................................... 21 3.4.4.1 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 21 3.4.4.2 Otimização do método de extração ........................................................................ 22 3.4.4.3 Curva de calibração ............................................................................................... 22

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 23

4.1 FASE ESTACIONÁRIA REVERSA QUIMICAMENTE LIGADA PC-18 ................................. 23 4.1.1 PREPARAÇÃO DAS FASES REVERSAS ........................................................................... 23 4.1.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE FASE REVERSA .................................................................... 23 4.1.3 ANÁLISE TERMOGRAVIMÉTRICA (TGA) ..................................................................... 25 4.1.4 ANÁLISE DE DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA A LASER ............................................. 26 4.2 CENTELLA ASIATICA .................................................................................................... 28 4.2.1 OBTENÇÃO DA MISTURA DE GLICOSÍDEOS .................................................................. 28 4.2.2 OBTENÇÃO DO ASIATICOSÍDEO POR CCDC E RECRISTALIZAÇÃO ................................. 29 4.2.3 CARACTERIZAÇÃO DO ASIATICOSÍDEO ....................................................................... 30 4.2.4 QUANTIFICAÇÃO DO ASIATICOSÍDEO POR CLAE/UV.................................................. 33 4.2.4.1 Curva de calibração do asiaticosídeo ..................................................................... 33 4.2.4.2 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 33 4.2.4.3 Otimização do método de extração ........................................................................ 35 4.2.5 PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO SECO NO SPRAY DRYER.......................................... 38 4.2.6 TEOR DE ASIATICOSÍDEO EM EXTRATOS COMERCIAIS .................................................. 41 4.3 CYNARA SCOLYMUS ...................................................................................................... 41 4.3.1 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO ........................................................................................... 41 4.3.2 CARACTERIZAÇÃO DO ÁCIDO CLOROGÊNICO .............................................................. 42 4.3.3 QUANTIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLOROGÊNICO POR CLAE/UV......................................... 43 4.3.3.1 Curva de calibração para o ácido clorogênico ........................................................ 43 4.3.3.2 Otimização das condições analíticas ...................................................................... 44 4.3.3.3 Otimização do método de extração ........................................................................ 46

5 CONCLUSÕES............................................................................................................ 48

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 49

v

7 ANEXOS ...................................................................................................................... 54

7.1 ESPECTRO NO IV PARA O ASIATICOSÍDEO EM KBR .................................................... 55 7.2 ESPECTRO DE RMN DE

1H PARA O ASIATICOSÍDEO .................................................... 56 7.3 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE

1H PARA O ASIATICOSÍDEO............................ 57 7.4 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE

1H PARA O ASIATICOSÍDEO............................ 58 7.5 ESPECTRO DE RMN DE

13C PARA O ASIATICOSÍDEO ................................................... 59 7.6 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE

13C PARA O ASIATICOSÍDEO........................... 60 7.7 EXPANSÕES DO ESPECTRO DE RMN DE

13C PARA O ASIATICOSÍDEO........................... 61 7.8 ESPECTRO DE DEPT 135 PARA O ASIATICOSÍDEO ...................................................... 62 7.9 ESPECTRO DE HSQC PARA O ASIATICOSÍDEO ............................................................ 63 7.10 ESPECTRO DE HMBC PARA O ASIATICOSÍDEO ......................................................... 64 7.11 ESPECTRO NO IV PARA O ÁCIDO CLOROGÊNICO EM KBR......................................... 65 7.12 ESPECTRO DE RMN DE

1H PARA O ÁCIDO CLOROGÊNICO ........................................ 66 7.13 EXPANSÃO DO ESPECTRO DE RMN DE

1H PARA O ÁCIDO CLOROGÊNICO ................. 67

vi

Lista de Esquemas

ESQUEMA 1 - Rota biossintética simplificada para o asiaticosídeo....................................... 4 ESQUEMA 2 - Rota biossintética simplificada para o ácido clorogênico ............................... 7 ESQUEMA 3 – Preparação de extratos de Centella asiatica ................................................ 14 ESQUEMA 4 - Obtenção da mistura de glicosídeos............................................................. 15 ESQUEMA 5 - Cromatografia em fase reversa (PC-18 “CCD”) em escala preparativa para

obtenção dos glicosídeos .............................................................................................. 16 ESQUEMA 6 - Extração Realizada com a Cynara scolymus ................................................ 20 ESQUEMA 7 - Extração com solventes de polaridade crescente .......................................... 20 ESQUEMA 8 - Cromatografia em fase reversa (PC-18) em escala preparativa..................... 21

vii

Lista de Figuras

FIGURA 1 – Foto ilustrativa da planta Centella asiatica .............................................................. 2 FIGURA 2 - Estrutura dos componentes principais da Centella asiatica ............................... 3 FIGURA 3 - Foto ilustrativa da planta Cynara scolymus ........................................................ 5 FIGURA 4 - Estrutura dos componentes principais da Cynara scolymus ................................ 6 FIGURA 5 - Representação esquemática da reação de imobilização de PMODS em sílica

(adaptado de TONHI et al., 2002a)................................................................................. 9 FIGURA 6 – Sistema montado no equipamento a vácuo Vac Elut 20 para fracionamento da

mistura de corantes em coluna de sílica de fase normal e na respectiva PC-18 de fase reversa ......................................................................................................................... 13

FIGURA 7 - Estrutura dos corantes utilizados no teste de ação reversa das sílicas PC-18..... 24 FIGURA 8 - Foto ilustrativa mostrando a separação dos corantes nas sílicas de fase normal e

de fase reversa.............................................................................................................. 25 FIGURA 9 – Fórmula estrutural do polímero PMODS......................................................... 26 FIGURA 10 - Representação gráfica da distribuição granulométrica das sílicas antes e depois

de funcionalizadas........................................................................................................ 27 FIGURA 11 - CCD do fracionamento do extrato de Centella asiatica em CLAE Preparativa

com PC-18 “CCD”....................................................................................................... 29 FIGURA 12 - Correlações dadas pelo experimento de HMBC para o asiaticosídeo.............. 31 FIGURA 13 - Curva de calibração do asiaticosídeo.............................................................. 33 FIGURA 14 - Cromatograma de CLAE para o extrato bruto da Centella asiatica ................ 34 FIGURA 15 - Perfil no UV do asiaticosídeo e do mesmo no extrato bruto ........................... 34 FIGURA 16 - Extrações metanol 100% de 100 mg de Centella asiatica............................... 35 FIGURA 17 - Extrações metanol 70% de 100 mg de Centella asiatica ................................ 36 FIGURA 18 –Extrações metanol 100% de 50 mg de Centella asiatica................................. 36 FIGURA 19 - Extrações metanol 70% de 50 mg de Centella asiatica .................................. 36 FIGURA 20 - CCD das frações do extrato Cynara scolymus obtido com coluna PC-18

“FLASH” em escala preparativa*................................................................................. 42 FIGURA 21 - Fórmula estrutural do ácido clorogênico ........................................................ 43 FIGURA 22 - Curva de calibração do ácido clorogênico...................................................... 43 FIGURA 23 - Cromatograma de CLAE do extrato bruto da Cynara scolymus...................... 45 FIGURA 24 - Perfil no UV do ácido clorogênico e do mesmo no extrato bruto.................... 46

viii

Lista de Tabelas

TABELA 1 - Resultados da análise de TGA para as sílicas PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”. 25 TABELA 2 - Porcentagem de carbono nas sílicas PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”............... 26 TABELA 3 - Tamanho médio das partículas das sílicas antes e depois da funcionalização com

polímero....................................................................................................................... 27 TABELA 4 – Comparação dos dados práticos de RMN 13C para o asiaticosídeo com a

literatura (MAEDA et al., 1994)* ................................................................................. 32 TABELA 5 – Resultados do teste de resíduo seco (RS) para cada extração de asiaticosídeo

(mg/ml) da Centella asiatica ........................................................................................ 39 TABELA 6 – Rendimento (g) da secagem em spray dryer das diferentes extrações da

Centella asiatica .......................................................................................................... 39 TABELA 7 – Teor de asiaticosídeo nas diferentes extrações realizadas com a Centella

asiatica e nos respectivos extratos secos gerados no spray dryer .................................. 40 TABELA 8 – Teor de asiaticosídeo em amostras diversas* de Centella asiatica .................. 41 TABELA 9 - Teor de ácido clorogênico (mg) em extratos de Cynara scolymus (100 mg) após

três extrações sucessivas............................................................................................... 47

ix

Lista de Abreviaturas e Siglas

δ - deslocamento químico

µm - micrômetros

λmáx - comprimento de onda (nm) de absorção máxima

CCD - cromatografia em camada delgada

CCDC - cromatografia em camada delgada centrífuga

CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência

d - dubleto

dd - duplo dubleto

D2O - água deuterada

D3COD - metanol deuterado

DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Detector no UV - detector no ultravioleta

DPR% - desvio padrão relativo%

Espectro no IV - espectro no infravermelho

HMBC - heteronuclear multiple bond coherence

HSQC - heteronuclear single quantum coherence

Hz - hertz

J - constante de acoplamento

m - multipleto

Me – Grupo metila

MHz - megaHertz (um milhão de ciclos por segundo)

ppm - parte por milhão

Rf - razão de frente

RMN 13C - ressonância magnética nuclear de carbono-13

RMN 1H - ressonância magnética nuclear de hidrogênio

Rpm - rotação por minuto

s - singleto, t - tripleto

TMS – tetrametilsilano

x

Resumo

O uso de plantas para o preparo de medicamentos é uma prática antiga, porém o

aumento na comercialização dos mesmos fez aumentar a exigência no que diz respeito à

qualidade. Para avaliação da qualidade de fitoterápicos é necessário dispor de marcadores

químicos e, por isso, o isolamento desses é de grande interesse. Um dos objetivos deste trabalho

foi o de testar novas técnicas para obtenção de marcadores químicos, incluindo a preparação e

teste de uma sílica de fase reversa para uso em cromatografia de escala preparativa. Os

marcadores isolados foram o ácido clorogênico e o asiaticosídeo de duas plantas amplamente

usadas comercialmente, Cynara scolymus e Centella asiatica, respectivamente. Os padrões obtidos

foram, então, utilizados para o desenvolvimento de metodologia analítica por cromatografia

líquida de alta eficiência, para a quantificação deles em produtos fitoterápicos. Para o caso da

Centella asiatica foi também preparado um extrato seco, pelo uso da técnica de “spray drying”, e

alguns produtos comerciais de diferentes origens foram comparados. Os resultados mostraram

que eles continham teores significativamente diferentes do princípio ativo.

xi

Abstract

The use of plants for the preparations of medicines is an old practice. However the increase in

commercial availability of those products increased the demands concerning quality. The quality

assurance of phyto remedies requires the respective chemical markers. Therefore the isolation of

those compounds is of great importance. One of the objectives of this work was testing new

techniques for obtaining chemical markers, including the preparation and testing of a reversed

phase silica for preparative scale chromatography. The markers obtained were chlorogenic acid

and asiaticoside from two widely used plants, Cynara scolymus and Centella asiatica, respectively. The

standards obtained were then used for the development of high performance liquid

chromatography methodology, for their quantification em phyto remedies. A dry extract was also

prepared for Centella asiatica, using spray-drying technique, and a few commercial products of

different origin were compared. The results showed that they contained significantly different

concentrations of the active principle.

Introdução

1

1 Introdução

1.1 Fitoterapia

Os medicamentos de origem vegetal, denominados fitoterápicos, estão

relacionados com qualquer exploração tecnológica e econômica de vegetais empregados na

prevenção e no tratamento da cura de distúrbios, de disfunções ou de doenças do homem e

animais (SIMÕES et al., 2000). A utilização de plantas como medicamentos pela

humanidade é tão antiga quanto a história do homem. O processo de evolução da “arte da

cura” deu-se de forma empírica, em processos de descobertas por tentativas, de erros e

acertos. Neste processo, os povos primitivos propiciaram a identificação de espécies e de

gêneros vegetais bem como das partes dos vegetais que se adequavam ao uso medicinal

(CORDELL, 1995). No Brasil, com o pouco que se conhece sobre a biodiversidade das

florestas tropicais, como a da Amazônia, torna-se óbvio que o estudo de plantas medicinais

ainda é escasso.

O aumento na produção e no consumo de produtos fitoterápicos demandam

maior rigor relativo à qualidade destes produtos. No Brasil, a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária tem sido bastante rigorosa e a legislação vigente requer a detecção e a

quantificação dos chamados marcadores químicos que são compostos utilizados como

referência e podem ou não ser os compostos biologicamente ativos. Apesar de muitos deles

serem comerciais, seus preços são geralmente bastante elevados, por isso são importantes

os estudos de otimização da obtenção dos mesmos.

1.2 Centella asiatica L., Apiaceae

Popularmente conhecida como centelha, centella da asia, centela, pata-de-mula,

pata-de-burro ou pé-de-cavalo, a planta (Figura 1) é originária da Ásia Tropical, onde há

mais de 3000 anos os habitantes já a utilizavam no tratamento de lesões cutâneas. Ela

cresce muito bem no Brasil, principalmente nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro,

São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. A planta prefere lugares úmidos e

Introdução

2

sombreados, sendo encontrada em quase todos os ambientes e é obtida por extrativismo

ou por importação (SIMÕES et al., 2000).

FIGURA 1 – Foto ilustrativa da planta Centella asiatica

Fonte: http://www.aquabase.com.br

A Centella asiatica tem sido usada como sedativo e para o tratamento de úlcera e

hanseníase (WANG et al., 2003), lúpus, varicoses e certos eczemas (KIM et al., 2005) além

de vasto uso em indústria cosmética, pois estudos farmacológicos comprovaram que os

extratos purificados de Centella asiatica estimulam a síntese de lipídios e

glucosaminoglicanos, principal constituinte da matriz intersticial e cartilagens.

Suas propriedades farmacológicas são atribuídas às saponinas e triterpenos (Figura

2) como os ácidos madecássico e asiático e seus glicosídeos madecassosídeo e asiaticosídeo

(SIMÕES et al. 2000).

Introdução

3

FIGURA 2 - Estrutura dos componentes principais da Centella asiatica

HO

HOHOH2C R

COOR`

Compostos R R’ Ácido asiático H H Ácido Madecássico OH H Asiaticosídeo H β-glucose-(6-1)-glucose-(4-1)-α-

L-ramnose Madecassosídeo OH β-glucose-(6-1)-glucose-(4-1)-α-

L-ramnose

O asiaticosídeo tem sido apontado como o componente mais ativo na planta e,

em particular, apresenta efeito anti-inflamatório. Ele é usado clinicamente como um agente

cicatrizante de feridas e possui a propriedade de imunomodulador (KIM et al., 2005).

Um esquema simplificado da rota biossintética para o asiaticosídeo está

representada a seguir (Esquema 1) e estudos afirmam (KIM et al., 2005) que a produção

dele na planta é influenciada pela enzima β-amirina sintase responsável pela produção da β-

amirina, um dos intermediários na biossíntese do asiaticosídeo.

Introdução

4

ESQUEMA 1 - Rota biossintética simplificada para o asiaticosídeo

SCoA

o

2 HO2C

OHO

SCoA

β-hidroxi-β-metilglutaril - CoA (HMG - CoA)

acetil-CoA

SCoa

OHHO

HO2C

H

OPP

H H

isopentenil pirofosfato (IPP)

acido mevalonico (MVA)

PPO

farnesil difosfato (FPP)

esqualeno

oxidoesqualeno

H

H

β-amirina

2,3

HO

H C

HO

CH2

H

OH

O

O

O

OH OH

HO

CH3

O

CH2HO

OH

O

H

O

CH2

OH

OH

O

H

H

asiaticosideo

O

Introdução

5

1.3 Cynara scolymus L., Asteraceae

Conhecida popularmente como alcachofra, esta planta (Figura 3) é originária da

região mediterrânea. Hoje, ela é difundida mundialmente principalmente com finalidades

alimentícias. No Brasil, a alcachofra é uma das plantas das quais se produz o maior número

de fitoterápicos.

FIGURA 3 - Foto ilustrativa da planta Cynara scolymus

Fonte: http://www.unioeste.br

Seus fitoterápicos são indicados para o tratamento contra hepatites B e C

(WITTEMER et al., 2003), pois são estimulantes da produção e excreção da bílis. Essas

atividades colerética e colagoga têm sido atribuídas à presença de substâncias antioxidantes

nas folhas de alcachofra (ADZET, 1985). São indicados também para o tratamento de

cálculos renais (SIMÕES et al., 2000). A ocorrência de dermatite alérgica de contato foi

relatada para alcachofra (YUNES et al., 2003) e essa ação é atribuída à presença de lactonas

sesquiterpênicas como a cinaropicrina (Figura 4).

Os componentes principais químicos da alcachofra (Figura 4) são compostos

fenólicos tais como o ácido cafeico, ácido clorogênico, cinarina e luteolina-7-O-glucosídeo

(cinarosídeo).

Introdução

6

FIGURA 4 - Estrutura dos componentes principais da Cynara scolymus

Cafeico

COOH

OHOH

Ácido

ClorogênicoÁcido

C

OHOH

O O

OH

HO COOH

OH

OH

OHO

O

HOOH

COOH

O

Cinarina

HO

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

Luteolina o glucosídeo-7- -

OH

CH2O

O

O CH2

OH

CH2

CH2

O

A composição do extrato vegetal em ácidos fenólicos depende da forma de

secagem das folhas e de seu processo extrativo, devido à possibilidade de hidrólise e trans-

esterificações que podem ocorrer em meio aquoso. Por isso, a cinarina, citada usualmente

como componente principal, muitas vezes pode não ser detectada.

O ácido clorogênico é derivado do ácido cafeico e é um dos principais

antioxidantes existentes, encontrados em vários vegetais e frutos. Essas substâncias

auxiliam na prevenção de doenças degenerativas como câncer, doença de Parkinson e

Alzheimer, além de retardar o envelhecimento.

Um esquema simplificado da rota biossintética para o ácido clorogênico está

representado a seguir (Esquema 2). É chamada rota do chiquimato e nela o ácido cinâmico,

um dos intermediários na biossíntese do ácido clorogênico, sofre sucessivas hidroxilações e

metilações, de onde provém uma série de ácidos.

cinaropicrina

Introdução

7

ESQUEMA 2 - Rota biossintética simplificada para o ácido clorogênico

(PEP)

D

O

COOH

P

H

O

PO

HO

OH

DAHP

PO

HO

OH

OHH

COOH

O

Ácido Quínico

COOHHO

OHOHHO

Ácido

COOHHO

OOH

OH

3_ Deidroquínico

Ácido3 _ Deidrochiquímico

COOH

OHOHO

COOH

OHOHHO

Chiquímico

Ácido Ácido Chiquímico

COOH

OHOHPO

Fosfato3 _Éter Vinílico

COOH

COOH

OHOPO

COOH

Ácido Corísmico Ácido Prefênico

H

O

O

COOH

O

OH

Ácido Fenilpirúvico

COOH COOH

NH2

L Fenilalanina_

ÁcidoCinâmico

_p hidroxicinâmicoÁcido

COOH

OH

Cafeico

COOH

OHOH

ÁcidoÁcidoQuínico

OH

HO

HO COOH

OH

COOH

eritrose 4

Fosfoenolpiruvato(DE4P)( )

D arabino heptulosonico 7

Acido

fosfato

COOH

OHO

P

C

OHOH

O OHO

OH

OH

COOH

ÁcidoClrorogênico

Introdução

8

1.4 Cromatografia preparativa em fase estacionária reversa

Dentre as várias técnicas cromatográficas preparativas disponíveis algumas

tornaram-se clássicas, como cromatografia em coluna e em camada delgada. A fase

estacionária mais utilizada nestes casos é a sílica. Porém, a grande dificuldade do uso da

sílica é que, dos inúmeros constituintes de plantas, muitos são fortemente polares,

tornando a separação pouco eficiente devido à forte interação destes compostos com a

sílica. Por isso, nestes casos, são indicadas fases estacionárias de ação reversa obtidas

através da funcionalização da sílica. As mais comuns existentes no mercado são a sílica C-8

e a C-18, entretanto, a utilização das mesmas de separações em escala preparativa são

pouco viáveis devido seus altos custos.

As fases estacionárias para utilização como fase reversa são compostas de óxidos

polares utilizados como suporte com grupos orgânicos apolares introduzidos na sua

superfície. Existem várias formas de se obter as camadas orgânicas apolares sobre a

superfície dos diferentes óxidos. O método mais comum ocorre através da introdução de

monocamadas orgânicas, via reação com reagentes apropriados, produzindo as chamadas

fases quimicamente ligadas (TONHI et al., 2002).

Recentemente foi divulgada uma técnica simples de funcionalização de sílica, com

polímeros do tipo siloxano. Reagindo um polímero, como o polimetiloctadecilsiloxano

(PMODS - 18 carbonos), com um suporte como a sílica, obtêm-se uma fase estacionária

com propriedades semelhantes às de sílica C-18 comercial (Figura 5). A mesma reação pode

ser realizada com o polímero polimetiloctilsiloxano (PMOS - 8 carbonos). Este material foi

utilizado em escala analítica com excelentes resultados (BOTTOLI et al., 2002 e TONHI et

al., 2002a,b).

Pensou-se então que este material, se produzido com sílica de tamanho de

partícula apropriado, poderia então ser potencialmente útil em separações cromatográficas

em escala preparativa de compostos polares.

Introdução

9

FIGURA 5 - Representação esquemática da reação de imobilização de PMODS

em sílica (adaptado de TONHI et al., 2002a)

OSi OH

OSi OH

OSi OH

OSi OH

OSi OH

OSi OH

Silica

Si

O

C18H37H3C

Si

O

C18H37H3C

Si

O

C18H37H3C

Si

O

CH3H37C18

Si

O

C18H37H3C

Si

O

C18H37H3C

Si

O

CH3H37C18

O

Si

O

C18H37H3C

Polimero

OSi O

OSi OH

OSi OH

OSi OH

OSi OH

Si

O

C18H37H3C

Si

O

CH3H37C18

O

Si

O

C18H37H3C

Si

O

C18H37

Si

O

CH3H37C18

Si

O

C18H37

Si

O

C18H37H3C

Si

O

C18H37H3C

OSi CH2

Objetivos

10

2 Objetivo

2.1 Objetivo geral

Obter e quantificar marcadores químicos das plantas Centella asiatica e Cynara

scolymus.

2.2 Objetivos específicos

• Preparar uma fase estacionária reversa para uso em escala preparativa;

• Isolar e caracterizar marcadores químicos das duas plantas usando fase estacionária

reversa sintetizada, entre outros métodos cromatográficos;

• Otimizar metodologias para quantificar, por CLAE, os marcadores isolados nos

materiais vegetais;

• Otimizar a preparação de extrato seco da Centella asiatica em spray dryer;

• Quantificar o asiaticosídeo em diferentes materiais vegetais e no extrato seco.

Experimental

11

3 Experimental

3.1 Especificações gerais dos materiais e equipamentos

• Para as extrações e sistemas cromatográficos foram utilizados solventes de grau

comercial, os quais foram destilados.

• Para o uso em CLAE, foram utilizados metanol e acetonitrila (Merck. art. 2007) e

água ultra-pura obtida por purificador de água marca Millipore, modelo Simplicity

185, destilador de água tipo pilsen marca Fabbe, modelo 106 e destilador (vidro) de

água marca Marte, modelo MB 10.02;

• Sistema de CLAE analítico, marca Varian, composto de bomba quaternária

(modelo 9012Q), detector UV fotodiodo (modelo 9065), injetor automático

(modelo AI200) com coluna Varian Res Elut, fase estacionária C-18 de 150 x 4,6

mm de diâmetro interno, tamanho de partícula 5 mm e tamanho de poro 90 Å;

• Sistema CLAE preparativo marca Rainin (bomba modelo SD-200 e detetor UV

modelo UV-1); coluna C-18 Dynamax (8 um, 21.4 X 250 mm);

• O tipo da fase estacionária para as separações cromatográficas variou de acordo

com o tipo de separação:

• Sílica Si-60 (Merck, art.7744 e 7736), 40-63mm e sílica com partículas

menores que 40mm (Aldrich, 288500) para imobilização com PMODS;

• Para CCDC utilizou-se sílica Si-60 PF254 com sulfato de cálcio (Merck,

art.7749) e os rotores foram preparados com uma camada de sílica de

espessura de 1mm. O equipamento usado foi o Chromatotron®;

• Para CCD, utilizou-se como adsorvente Si-60 F254 (Merck, art.5554) com

espessura de 0,2mm.

• As visualizações dos cromatogramas em CCD foram feitas com ácido

sulfúrico/anisaldeído e o reagente NP-PEG (WAGNER, et al. 1995);

• A CCDC foi realizada em aparelho Chromatotron®, com velocidade de fluxo do

eluente igual a 1mL/min;

Experimental

12

• Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram registrados em aparelho Bruker

Avance 400 de 9,4 Tesla equipado com sonda de 5mm multinuclear, utilizando

como solvente D3COD e D2O tendo como padrão de referência interna o TMS.

Os deslocamentos químicos são indicados em ppm;

• Os espectros no IV foram registrados em aparelho Excalibur série Bio-Rad

FTS3500GX. As amostras foram preparadas na forma de pastilhas de brometo de

potássio e as absorções expressas em número de onda (cm-1);

• Os extratos secos de Centella asiatica foram preparados em mini spray dryer; Bϋchi

modelo B-290, com diâmetro de agulha igual a 0,7mm;

• Banho ultra-sônico (2) marca Unique, modelo USC700;

• Moinho tipo Willye marca Tecnal, modelo TE648 (Piracicaba, Brasil);

Microcentrífuga marca Labnet, modelo Force 7.

3.2 Fase estacionária reversa quimicamente ligada PC-18

3.2.1 Preparação das fases reversas

A sílica em fase reversa, denominada PC-18, foi obtida por meio de metodologia

adaptada (BOTTOLI et al., 2002 e TONHI et al., 2002a,b). Inicialmente a sílica (60 g) foi

ativada a 150º C. O polímero PMODS (40 g) foi dissolvido em hexano (500 mL) e a sílica

foi adicionada aos poucos, com agitação, por 3 horas. O solvente foi então evaporado à

temperatura ambiente e o pó branco obtido foi aquecido a 120º C por 4 horas. O excesso

de polímero foi removido com acetato de etila e depois metanol e o material foi então

deixado secar à temperatura ambiente e depois a 60º C.

3.2.2 Avaliação da ação de fase reversa

Foi preparada uma mistura dos corantes azul brilhante e vermelho ALLURA® na

concentração de 1mg/mL. Duas mini-colunas foram preparadas utilizando seringas de

vidro de 3 mL, uma com sílica fase normal (1 g) e outra com PC-18 (1 g) e as duas foram

adaptadas num sistema a vácuo Vac Elut 20 (Figura 6).

Experimental

13

A coluna de PC-18 foi condicionada com água (5 mL) e a coluna de sílica comum

com acetona (5 mL) e a mistura de corantes (500 mL) (BIDLINGMEYER et al., 1984) foi

aplicada em cada uma das colunas. A coluna de PC-18 foi inicialmente eluída com água (3

mL) e o eluato foi coletado em um tubo de ensaio; após a troca do tubo a coluna foi

novamente eluída com metanol (3 mL). A coluna de sílica comum foi eluída com

acetona/etanol 1:1 v/v (3 mL) e depois com etanol/metanol 1:1 v/v (3 mL) e as duas

frações foram igualmente coletadas em tubos de ensaio diferentes. A ordem de eluição foi

determinada através da comparação das cores dos eluatos.

FIGURA 6 – Sistema montado no equipamento a vácuo Vac Elut 20 para

fracionamento da mistura de corantes em coluna de sílica de fase normal e na respectiva

PC-18 de fase reversa

3.2.3 Análise termogravimétrica (TGA)

A análise termogravimétrica foi realizada de acordo com a literatura (AMERICAN

SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS, 1993), nas seguintes condições:

• Faixa de temperatura: 20 a 850º C;

• 20 a 550º C em atmosfera inerte (N2);

• 550 a 850º C em atmosfera oxidante (O2);

• Taxa de aquecimento: 20º C/min.

Experimental

14

O equipamento utilizado foi uma balança termogravimétrica modelo TG – 209,

fabricante NETZSCH.

3.2.4 Análise de distribuição granulométrica a laser

As medidas da distribuição granulométrica foram efetuadas, em triplicata, em

equipamento marca CILAS modelo 1064 (limites de medida: entre 0,1 µm a 500 µm).

Uma alíquota foi adicionada ao porta-amostras do equipamento, previamente

dispersa mecanicamente com sonicação, em um dispersante. Para a sílica “Flash” (40-63

µm) e para a sílica “CCD” (95% <45 µm) foi utilizada água como dispersante. Já para a

PC-18 “Flash” e para a PC-18 “CCD” foi utilizado etanol comercial.

3.3 Centella asiatica

3.3.1 Método de extração

O pó da planta (20 g) foi deslipidificado com hexano (300 mL), seguido de

extração com metanol/água 7:3 v/v (600 mL; maceração por 24 h). Após filtração, uma

nova extração com metanol foi realizada nas mesmas condições, resultando duas extrações

da mesma tomada de amostra.

ESQUEMA 3 – Preparação de extratos de Centella asiatica

Resíduo (descartado)

Extrato hexânico (descartado)

Extrato hidrometanólico 5,515 g

Extração com Hexano 100%

Extração c/ metanol:água 7:3 v/v

Resíduo

20 g planta seca e moída

Experimental

15

3.3.2 Obtenção dos glicosídeos - Método A

O extrato hidrometanólico obtido no procedimento descrito anteriormente, teve

seu volume reduzido foi levado a partições com solventes de polaridade crescente para uma

pré-separação dos componentes do extrato (KIM, et al., 2002, US 6,417,349)

.

ESQUEMA 4 - Obtenção da mistura de glicosídeos

*Mistura de glicosídeos de interesse.

3.3.3 Cromatografia com PC-18 “FLASH” em micro-escala

Foram preparadas duas mini-colunas uma com sílica PC-18 “Flash” e outra com

PC-18 “FLASH” (500 mg) em seringas de vidro (3 mL) as quais foram adaptadas no

sistema à vácuo Vac Elut 20. Elas foram condicionadas com metanol (5 mL) e depois com

água destilada (10 mL). Aplicou-se a mistura de glicosídeos de interesse (12,5 mg)

dissolvidos em água e a coluna foi eluída com água/metanol nas proporções de 10:0, 90:10,

85:15, 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50 v/v.

Concentrar volume e adicionar acetato de etila; levar à geladeira

Extrato hidrometanólico

Fração hidrometanólica Fração diclorometanica

Extrato n-butanólico

Lavar 3x 100 mL de n-butanol

Lavar 2x 200 mL de diclorometano

*Precipitação

Fração hidrometanólica

Experimental

16

3.3.4 Empacotamento de colunas para CLAE preparativa com PC-18

A fase estacionária PC-18 “CCD” (12,8 g) foi empacotada a seco em uma coluna

de aço inox 22 x 250 mm (Alltech, Part. 96511). Após a conexão dos terminais a um

sistema CLAE preparativa, a coluna foi condicionada através da passagem de água

utilizando a bomba do sistema cromatográfico.

3.3.5 Obtenção dos glicosídeos - Método B

No método B o extrato hidrometanólico, obtido através do procedimento

descrito no ítem 3.3.1, foi levado a uma coluna empacotada com sílica PC-18 “CCD” (ítem

3.3.4) e eluído com água, seguido de uma mistura água/metanol em diferentes proporções.

As condições do equipamento foram:

• Equipamento: CLAE preparativa com detector UV (210 nm);

• Vazão da fase móvel: 10 mL/min;

• Pressão do sistema: 500 psi.

ESQUEMA 5 - Cromatografia em fase reversa (PC-18 “CCD”) em escala

preparativa para obtenção dos glicosídeos

*Mistura de glicosídeos de interesse.

Extrato hidrometanólico (50 mg)

Coluna preparativa para CLAE com 12,8 g de PC-18 “CCD”

Fração 1 100% água

Fração 2 água:metanol

80:20 v/v

*Fração 3 água:metanol

60:40 v/v

Experimental

17

3.3.6 CCDC e recristalização

Estas duas metodologias foram aplicadas na tentativa de separar a mistura de

glicosídeos de interesse.

Para a CCDC: foi utilizada uma placa de vidro esférica contendo uma camada de

sílica de 1mm de espessura. Após aplicação da mistura de glicosídeos (100 mg),

previamente dissolvida em metanol, foi feita eluição com diclorometano/ácido

acético/metanol/água (60:16:6:4 v/v). As frações foram coletadas em tubos de ensaio e

analisadas por CCD.

Para a recristalização: a mistura de glicosídeos (50 mg) foi dissolvida em 50 mL de

diclorometano/acetona/metanol 8:1:1 (v/v), e a mistura foi deixada em repouso até

surgirem os cristais.

3.3.7 Quantificação do asiaticosídeo por CLAE/UV

3.3.7.1 Otimização do método de extração

Dois líquidos extratores diferentes foram testados: 100% metanol (VERMA, et al.,

1999) e metanol/água 7:3 v/v. Para cada replicata (n= 5) o material vegetal (100 mg) foi

pesado em microtubos de polipropileno e nele foi adicionado hexano (1,5 mL), levado a

agitação em vórtex® (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (5 minutos a 10.000 rpm).

O solvente foi retirado, descartado e foi adicionado mais hexano (1,5 mL), repetindo o

procedimento para garantir a total deslipidificação do material. Após isto, o líquido extrator

(1,5 mL) foi adicionado ao extrato insolúvel em hexano, o tubo foi levado a agitação em

vórtex® (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (5 minutos a 10.000 rpm). Uma

alíquota do sobrenadante (1 mL) foi retirada e injetada no cromatógrafo. O procedimento

foi repetido mais duas vezes para o mesmo material vegetal de cada replicata (n= 5),

totalizando três extrações.

O procedimento descrito acima foi repetido utilizando-se 50 mg do material

vegetal para verificar a influência da relação massa do material vegetal por volume de

líquido extrator sobre a eficiência da extração. Neste segundo procedimento, ao invés de

Experimental

18

três foram realizadas cinco extrações no total para o mesmo material vegetal de cada

replicata (n= 5). Os extratos obtidos foram, então, analisados por CLAE.

3.3.7.2 Otimização das condições analíticas

Diferentes proporções de acetonitrila em água (1:9 até 3:7 v/v) foram testadas, de

modo a produzir uma boa separação do analito no extrato bruto. O comprimento de onda

do detector foi fixado em 210 nm e o tempo de retenção e o espectro no UV do pico do

analito foram comparados com o do padrão, obtidos nas mesmas condições.

3.3.7.3 Curva de calibração

Uma solução-estoque de asiaticosídeo foi preparada em acetonitrila/água 1:1 v/v

na concentração de 1,16 mg/mL. A solução-estoque foi diluída no mesmo solvente de

modo a fornecer soluções nas concentrações de 870 mg/mL, 580 mg/mL, 290 mg/mL,

145 mg/mL e 72,5 mg/mL. Cada solução foi injetada no sistema cromatográfico em

triplicata e a curva de calibração foi automaticamente gerada pelo programa gerenciador

(Star versão 5.5), que forneceu também o coeficiente de correlação linear e o desvio-padrão

relativo.

3.3.8 Preparação do extrato seco em spray dryer

Para a preparação do extrato seco no spray dryer foram realizadas algumas

extrações em condições diferentes, partindo-se da mesma quantidade de líquido extrator,

(água, 600 mL) e mesma quantidade do pó da planta (20 g). As extrações foram realizadas

da seguinte forma:

• Extração A: sonicador (1 h), descanso (19 h), filtração a vácuo;

• Extração B: agitador magnético (1 h), descanso (21 h), filtração a vácuo;

• Extração C: agitador magnético a 50º C (1 h), descanso (22 h), filtração a vácuo;

• Extração D: maceração (24 h), filtração a vácuo;

Experimental

19

Uma extração feita nas mesmas condições da extração D, usando metanol/água

7:3 como líquido extrator (chamada de extração M), foi também realizada para verificar o

efeito da presença de solvente orgânico. Esta extração foi realizada com 400mL de líquido

extrator e não 600 mL como as outras extrações.

Para cada extração realizada, foram retiradas alíquotas (2 mL) para análise em

CLAE e 3 alíquotas (5 mL cada) do filtrado que foram colocadas em placas de Petri e secas

em estufa (105º C) para a obtenção do resíduo seco (RS).

Os extratos obtidos nas formas descritas acima tiveram então o solvente

evaporado no spray dryer, e as condições utilizadas no equipamento foram:

• Temperatura de entrada: 150º C;

• Temperatura de saída: 55º C;

• Vazão da bomba peristáltica: 15 mL/min;

• Aspirador: 38 m3/h.

3.3.9 Teor de asiaticosídeo em extratos comerciais

Duas outras amostras de Centella asiatica, provenientes de outros fornecedores e

regiões foram também quantificadas. A amostra SP, proveniente de São Paulo, foi

adquirida na forma de um fino pó, enquanto que a amostra CL, proveniente de Campo

Largo, em folhas secas que foram trituradas em moinho antes da extração. Além disso, foi

analisado também um medicamento comercial (amostra X), na forma de cápsulas,

contendo extrato seco padronizado da planta.

Para as três amostras, foi realizado o mesmo método de extração: o pó da planta

(50 mg) ou o extrato seco (no caso da amostra X) foram pesados em microtubos de

polipropileno, delipidificados com hexano (2 x 1,5 mL). Após isto, o líquido extrator (1,5

mL) foi adicionado ao extrato insolúvel em hexano e o tubo foi levado a agitação em

vórtex (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (5 minutos a 10.000 rpm). Uma alíquota

do sobrenadante (1 mL) foi retirada e injetada no cromatógrafo.

Experimental

20

Lavar 2x 100mL de n-butanol

Extrato Hidrometanólico

Fração Hidrometanólica Fração Diclorometânica

Fração Hidrometanólica

Lavar 2x 100mL de acetato de etila

Lavar 2x 100ml de diclorometano

Fração acetato de etila

Fração butanólica Extrato Hidrometanólico

3.4 Cynara scolymus

3.4.1 Métodos de extração

O pó da planta (20 g) foi deslipidificado com hexano (300 mL), seguido de

extração com metanol/água 7:3 v/v (600 mL; maceração por 24h). Após filtração, uma

nova extração com metanol foi realizada nas mesmas condições, resultando duas extrações

da mesma tomada de amostra.

ESQUEMA 6 - Extração Realizada com a Cynara scolymus

O extrato hidrometanólico “A” foi particionado com solventes de polaridade

crescente para uma pré-separação por classe de compostos (YUNES et al., 2003).

ESQUEMA 7 - Extração com solventes de polaridade crescente

20 g planta seca e moída

Resíduo Extrato hexânico (descartado)

Extrato Hidrometanólico “A” 5,7929g

Extração com hexano

Extração com metanol/água 7:3 v/v

Resíduo

Experimental

21

3.4.2 Cromatografia com PC-18 “FLASH” em micro-escala

O extrato hidrometanólico “B” foi fracionado em micro-escala, conforme

procedimento descrito no ítem 3.3.3. Aplicou-se o extrato hidrometanólico “B” (12,5 mg)

dissolvidos em água e a coluna foi eluída com água/metanol nas proporções de 10:0, 90:10,

85:15, 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50 v/v.

3.4.3 Cromatografia com PC-18 “FLASH” em escala preparativa

O extrato hidrometanólico “B” (50 mg), obtido através do procedimento descrito

no ítem 3.4.1, foi levado a uma coluna empacotada com sílica PC-18 “FLASH” (8 g) e

eluído com água, seguido de uma mistura água/metanol em diferentes proporções.

ESQUEMA 8 - Cromatografia em fase reversa (PC-18) em escala preparativa

• Coluna: seringa de 20 mL;

• Equipamento: sistema a vácuo Vac Elut 20.

3.4.4 Quantificação do ácido clorogênico por CLAE/UV


Extrato hidrometanólico “B” (50 mg)

Coluna preparativa com 8g de PC-18 “FLASH”

Fração 1 100% água

Fração 2 Água:metanol

90:10 v/v

Fração 3 água:metanol

80:20 v/v

Experimental

22

Diferentes proporções de metanol em água (1:1 até 1:4 v/v) foram testadas de

modo a produzir uma boa separação do analito no extrato bruto. O comprimento de onda

do detector foi fixado em 230 nm e o tempo de retenção e o espectro no UV do pico do

analito foi comparado com o do padrão obtido nas mesmas condições.


Diferentes proporções de metanol em água (7:3 até 10:0 v/v), além de água pura

foram testados como líquidos extratores. Para cada teste (n= 5) o pó da planta (100 mg) foi

pesado em microtubos de polipropileno, o líquido extrator (1,5 mL) foi adicionado e o

tubo foi levado a agitação em vórtex® (1 min), sonicação (10 min) e centrifugação (10 min.

a 10.000 rpm). Uma alíquota do sobrenadante (0,1 mL) foi retirada, diluída na fase móvel

definida no método (0,75 mL) e a solução foi injetada no cromatógrafo. O procedimento

foi repetido mais três vezes para o mesmo material vegetal.

3.4.4.3 Curva de calibração

Uma solução-estoque de ácido clorogênico foi preparada em metanol/água 1:1

v/v na concentração de 1 mg/mL. A solução-estoque foi diluída no mesmo solvente de

modo a fornecer soluções nas concentrações de 120 mg/mL, 60 mg/mL, 30 mg/mL, 15

mg/mL e 7,5 mg/mL. Cada solução foi injetada no sistema cromatográfico em replicata

(n=3) e a curva de calibração foi automaticamente gerada pelo programa gerenciador (Star

versão 5.5) que forneceu o coeficiente de correlação linear e o desvio-padrão relativo.

Resultados e Discussão

23

4 Resultados e Discussão

4.1 Fase estacionária reversa quimicamente ligada PC-18

4.1.1 Preparação das fases reversas

A modificação da superfície da sílica, com a introdução de uma camada

quimicamente ligada ao suporte, tem como objetivo principal unir, em um só material, as

propriedades químicas do polímero com a rigidez e a estabilidade térmica da sílica (TONHI

et al., 2002).

Para que tal reação aconteça, é importante fazer a ativação da sílica através de

aquecimento para remover as moléculas de água ligadas à superfície da mesma por ligações

de hidrogênio. Por isso, é importante também o uso de hexano anidro.

A funcionalização da sílica realizada através da reação térmica com

polimetiloctadecilsiloxano (PMODS) foi aplicada a dois tipos de sílica com tamanho de

partículas diferentes: sílica “Flash” (43-70 mm) e sílica para “CCD” (90% <40 mm). Após

funcionalizadas, as sílicas foram denominadas, respectivamente, PC-18 “Flash” e PC-18

“CCD”.

4.1.2 Avaliação da ação de fase reversa

Uma vez preparadas, foi necessário verificar se as fases estacionárias possuíam as

características de uma fase reversa. Um teste simples baseado na separação de corantes de

polaridades diferentes, o azul brilhante e o vermelho alluraâ (Figura 7) foram utilizados

(BIDLINGMEYER et al., 1984). Para isto, foram preparadas duas mini-colunas, uma com

a sílica de fase normal e outra com a respectiva PC-18 preparada.


24

FIGURA 7 - Estrutura dos corantes utilizados no teste de ação reversa das sílicas

PC-18

N N

HOOCH3

NaO3S

CH3

SO3Na

Os resultados mostraram que, na coluna de fase normal o corante azul foi eluído

primeiro e o vermelho ficou mais retido na sílica por ser mais polar. Na coluna de PC-18 a

ordem de eluição foi oposta confirmando que a fase obtida tinha as características

esperadas (Figura 8). O teste foi realizado com a PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”.

CH3CH2O NH

C

N

CH2CH3

CH2

SO3-

CH3

N CH2

SO3NaCH2

CH3

CH3

AZUL BRILHANTE

VERMELHO ALLURA®


25

FIGURA 8 - Foto ilustrativa mostrando a separação dos corantes nas sílicas de

fase normal e de fase reversa

4.1.3 Análise termogravimétrica (TGA)

As duas fases obtidas foram submetidas à análise termogravimétrica (TGA) para

determinar a porcentagem de carbono. O teor de carbono é uma variável importante em

sílicas funcionalizadas pois ele tem influência na eficiência das colunas preparadas a partir

delas. Os resultados, resumidos nas Tabelas 1 e 2, estão próximos daqueles descritos na

literatura para sílicas de 13 e 5 µm respectivamente: 20,7 e 14,5% (BOTTOLI et al., 2002 e

TONHI et al., 2002a).

TABELA 1 - Resultados da análise de TGA para as sílicas PC-18 “Flash” e PC-18

“CCD”

Amostras Água ou materiais voláteis (%) Material orgânico (%)

PC-18 “Flash” 2,21 31,37

PC-18 “CCD” 2,81 29,34

Obtida a porcentagem de material orgânico para cada fase e tendo como base a

estrutura do polímero (Figura 9) e seu peso molecular (11000 u.m.a.), foi possível calcular o

Fase Normal Fase Reversa

Fase Normal Fase Reversa


26

número de unidades contendo a cadeia lateral octadecila (n= 312) e a porcentagem de

carbono (Tabela 2).

FIGURA 9 – Fórmula estrutural do polímero PMODS

Si

CH3

H3C

CH3

O Si

CH3

C18H37

O Si

CH3

CH3

CH3

n

TABELA 2 - Porcentagem de carbono nas sílicas PC-18 “Flash” e PC-18 “CCD”

Amostras Carbono (%)

PC-18 “Flash” 22,79

PC-18 “CCD” 21,32

4.1.4 Análise de distribuição granulométrica a laser

Uma análise de distribuição granulométrica a laser também foi realizada com os

dois tipos de sílica antes e depois de funcionalizadas (Figura 10). O tamanho das partículas

da fase estacionária está relacionado com a eficiência dela. Quanto menor o tamanho da

partícula mais eficiente será a coluna. Além disso, a uniformidade do tamanho também é

importante; fases com distribuição granulométrica uniforme são mais eficientes. Isto

explica a grande eficiência das fases utilizadas em CLAE analítica, pois elas possuem

partículas de pequeno tamanho (5 mm) com distribuição muito uniforme em torno do

valor nominal.


27

FIGURA 10 - Representação gráfica da distribuição granulométrica das sílicas

antes e depois de funcionalizadas

TABELA 3 - Tamanho médio das partículas das sílicas antes e depois da

funcionalização com polímero

Amostras Tamanho Médio de Partículas (µµµµm)

SÍLICA “Flash” 56,12

PC-18 “Flash” 75,23

SÍLICA “CCD” 18,63

PC-18 “CCD” 50,56

Os resultados mostram que, nos dois casos, a funcionalização resulta em aumento

do tamanho médio das partículas. No caso da sílica “Flash”, a funcionalização resultou em

uma sílica PC-18 mais uniforme quanto à distribuição do tamanho das partículas. Do ponto

de vista cromatográfico este é um efeito positivo, uma vez que quanto mais uniforme o

SÍLICA “Flash” PC-18 “Flash”

SÍLICA “CCD” PC-18 “CCD”

100

0

0

100

500

500


28

tamanho das partículas, melhor será a homogeneidade do recheio de uma coluna e maior

sua eficiência.

A sílica “CCD”, após funcionalização resultou em uma sílica PC-18 menos

uniforme, ou seja, com uma maior variação de tamanho entre suas partículas, mas com

tamanho médio menor e, por este motivo, ela foi escolhida para o recheio das colunas

preparativas para CLAE.

As análises de TGA e de Distribuição Granulométrica a Laser foram realizadas

nos laboratórios do Lactec – Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento - em

Curitiba, Paraná no campos do Centro Politécnico da UFPR.

4.2 Centella asiatica

4.2.1 Obtenção da mistura de glicosídeos

Após a preparação do extrato bruto hidrometanólico da Centella asiatica, duas

metodologias foram utilizadas para a obtenção da mistura dos dois glicosídeos.

A primeira delas foi baseada em uma metodologia patenteada (KIM, K., et al.,

2002). Ao adicionar acetato de etila ao extrato butanólico concentrado final, houve

precipitação de cristais brancos que, em CCD, observou-se que, possivelmente, tratava-se

da mistura dos glicosídeos madecassosídeo e asiaticosídeo, sendo que o último encontrava-

se em maior quantidade. Porém, esta mistura continha ainda outras impurezas em menor

quantidade.

A segunda metodologia envolvia o fracionamento do extrato bruto

hidrometanólico em coluna de CLAE preparativa, empacotada com sílica PC-18 “CCD”.

Experimentos prévios em micro-escala foram realizados, com o objetivo de definir que

proporção de sílica deveria ser usada em relação ao extrato, bem como definir a

composição da fase móvel. Análises realizadas por CCD mostraram que a relação 1/40

(massa do extrato por massa de fase estacionária) era adequada e que a eluição com 1:9, 2:8

e 4:6 de metanol em água (v/v) era suficiente para separar os glicosídeos de outros

componentes do extrato bruto.

Ao analisar as frações coletadas com a fase móvel água/metanol 60:40 v/v,

observou-se que elas continham uma mistura provavelmente formada por madecassosídeo


29

e asiaticosídeo (Figura 11). O resultado mostrou, portanto, que a fase preparada foi

adequada para o fracionamento prévio do extrato bruto. Esta segunda metodologia

utilizada, mostrou-se mais eficiente tendo como principal vantagem o número menor de

etapas e a consequente rapidez para realizá-la, além de reduzir consideravelmente o uso de

solventes orgânicos.

FIGURA 11 - CCD do fracionamento do extrato de Centella asiatica em CLAE

Preparativa com PC-18 “CCD”

• MANCHA 1: Extrato bruto;

• MANCHA 2: Fração eluída com metanol 10%;

• MANCHA 3: Fração eluída com metanol 20%;

• MANCHA 4: Fração eluída com metanol 40%.

A substância presente na fração 2 eluída com água/metanol (1:9 v/v), foi

purificada e, quando analisada por RMN, apresentou apenas sinais de açúcares.

4.2.2 Obtenção do asiaticosídeo por CCDC e recristalização

A CCDC apresentou bons resultados na separação, porém a dificuldade

encontrada foi na evaporação da fase móvel, uma vez que ela continha uma grande

quantidade de ácido acético e, em se tratando de glicosídeos, o meio ácido pode facilmente

hidrolisá-los. Para contornar esta dificuldade o ácido acético das frações reunidas foi

imediatamente removido em rota-evaporador através da formação de mistura azeotrópicas

com tolueno (PERRIN et al., 1998) ou com hexano.

A recristalização da mistura de glicosídeos apresentou melhores resultados, porém

a desvantagem é que apenas o glicosídeo encontrado em maior quantidade, o asiaticosídeo,

pode ser obtido na forma pura. Sua estrutura foi confirmada por comparação dos dados

espectroscópicos obtidos com os encontrados em literatura (MAEDA et al., 1994;

MATSUDA et al., 2001).


30

4.2.3 Caracterização do asiaticosídeo

O composto isolado caracterizou-se como um sólido branco, em forma de

agulhas, quando recristalizado em diclorometano/acetona/metanol 8:1:1 v/v.

O espectro de absorção na região do infravermelho (Anexo 7.1), mostrou bandas

em 1637 e 1619 cm-1, características de funções de éster carbonílico e olefina,

respectivamente, e bandas com fortes absorções em 3414 e 1096 cm-1 sugerindo uma

estrutura de um oligoglicosídeo (MATSUDA et al., 2001).

A análise dos espectros de RMN de uni e bidimensionais, evidenciou 48 carbonos,

sendo 7 metílicos (CH3), 11 metilênicos (CH2), 23 metínicos (CH) e 7 carbonos

quaternários, sendo um de éster carbonílico (d 178,0) e um olefínico (d 139,4)

A análise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, D3COD) mostrou sinais para

dois esqueletos glucopiranosila:

• d 5,29 (d, J = 8,1 Hz, 1’-H), e d 4,37 (d, J = 7,9 Hz, 1’’-H);

Um esqueleto raminopiranosila:

• d 1,27 (d, J = 6,3 Hz, 6’’’-H3);

Juntamente, com sinais compatíveis com a estrutura do asiaticosídeo (MAEDA et

al., 1994):

• d 0,97 (d, J = 6,9 Hz, 30-H3) e 0,89 (d, J = 6,2 Hz, 29-H3), 1,12, 1,28, 0,83, 0,69 e

1,05 (s, 27, 23, 26, 24 e 25 - H3), 2,23 (d, J = 11,3 Hz, 18-H), 3,57 (d, J =11,39 Hz,

3-H), 4,86 (m, 6-H2), 5,24 (dd, J = 3,4 e 3,7 Hz, H-12).

A estrutura oligoglicosídica e suas correlações com o esqueleto do ácido asiático

foram determinadas pelo experimento de HMBC (Anexo 7.6) e evidenciou correlações a

longa distância entre o hidrogênio 1’ e o C-28 (d 178,0 – COOR), entre o hidrogênio 1’’ e o

C-6’ (d 69,6) e entre o hidrogênio 1’’’ e o C-4’’ (d 72,3) (Figura 12).

A análise do espectro de RMN de 13C (100 MHz, D3COD), revela valores de

deslocamentos (Tabela 4) que foram comparados com valores da literatura (MAEDA et al.,

1994). Vale ressaltar que estes valores da literatura foram obtidos em equipamento também

de 100 MHz, porém usando piridina deuterada como solvente. Isto explica o fato de alguns

valores de deslocamentos serem diferentes.


31

A partir dos dados de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais juntamente dados da

literatura (MAEDA et al., 1994), confirma-se que o composto isolado é o asiaticosídeo.

FIGURA 12 - Correlações dadas pelo experimento de HMBC para o asiaticosídeo

HO

HO

CH2

OH

H H

C

O

H 1 '

H O

O

CH2O

H

O H

O H

O

CH2HO

O

H

OHO

C H3

O HO H

HO

28

1''

6'

1'''

4 ''

24

12

25

3

1213

8

6

27

26

23

22

21

30

29

15

17

19

18

20

179

5 7

25

14

11

10


32

TABELA 4 – Comparação dos dados práticos de RMN 13C para o asiaticosídeo

com a literatura (MAEDA et al., 1994)*

Carbono

Valores práticos

Valores da literatura*

Carbono Valores práticos

Valores da literatura*

C-1 46,5 47,8 Glucose’ Glucose’

C-2 68,9 68,9 C-1’ 95,8 95,6

C-3 80,5 78,1 C-2’ 73,7 73,9

C-4 42,7 43,6 C-3’ 77,9 77,9

C-5 49,2 48,1 C-4’ 70,6 70,9

C-6 18,5 18,4 C-5’ 78,1 77,1

C-7 32,8 33,1 C-6’ 69,6 69,3

C-8 39,7 40,2

C-9 47,6 48,0 Glucose’’ Glucose ‘’

C-10 38,3 38,3 C-1’’ 104,5 104,8

C-11 23,3 23,8 C-2’’ 76,7 75,3

C-12 125,4 126,0 C-3’’ 76,9 76,4

C-13 138,4 138,5 C-4’’ 72,3 78,6

C-14 42,3 42,5 C-5’’ 75,3 78,2

C-15 28,2 28,7 C-6’’ 61,9 61,3

C-16 24,4 24,5

C-17 48,2 48,4 Ramnose Ramnose

C-18 53,0 53,2 C-1’’’ 102,9 102,6

C-19 39,2 39,3 C-2’’’ 79,5 72,5

C-20 39,0 39,0 C-3’’’ 72,2 72,7

C-21 30,8 30,8 C-4’’’ 73,8 73,7

C-22 36,8 36,8 C-5’’’ 70,9 70,2

C-23 70,4 66,4 C-6’’’ 17,9 18,4

C-24 13,0 14,3

C-25 17,1 17,6

C-26 17,2 17,8

C-27 23,9 23,7

C-28 178,2 176,3

C-29 17,3 17,3

C-30 21,3 21,3


33

4.2.4 Quantificação do asiaticosídeo por CLAE/UV

4.2.4.1 Curva de calibração do asiaticosídeo

Para a curva de calibração (Figura 13), a equação da reta é y = 2,555782.102x –

1,754834.103, coeficiente de correlação 0,995197, desvio padrão relativo (RSD%) 4,472%.

O intervalo foi definido entre 20,53% e 246,38% da concentração teórica do teste, visto

que a concentração de asiaticosídeo na planta pode sofrer variações (sazonalidade,

estabilidade por exemplo).

FIGURA 13 - Curva de calibração do asiaticosídeo


A fase móvel escolhida foi água/acetonitrila 70:30 v/v pois esta proporcionou a

melhor resolução do pico com menor tempo de retenção (Figura 14).


34

FIGURA 14 - Cromatograma de CLAE para o extrato bruto da Centella asiatica

Os espectros no UV correspondentes aos picos do asiaticosídeo padrão e do

mesmo no extrato bruto (figura 15), confirmam a identidade dele bem como seu

comprimento de onda de absorção máxima (210 nm).

FIGURA 15 - Perfil no UV do asiaticosídeo e do mesmo no extrato bruto

ASIATICOSÍDEO NO EXTRATO BRUTO

ASIATICOSÍDEO PADRÃO


35


De acordo com a literatura (VERMA et al., 1999), dentre vários líquidos

extratores testados (clorofórmio, acetato de etila, metanol, etanol e água), a extração mais

eficiente do asiaticosídeo da planta teria sido com metanol. Naquele trabalho o

procedimento utilizado foi deslipidificação com hexano (3 x 20 mL) do pó seco da planta

(1 g) seguido de extrações com metanol (3 x 20 mL; 4h). O líquido extrator foi filtrado e

teve seu volume reduzido. O extrato foi re-suspendido em metanol (3 mL), novamente

filtrado e analisado em CLAE.

Para facilitar as operações de agitação, sonicação e centrifugação, foi reduzida a

escala da extração que foi feita em microtubos de polipropileno. Dessa forma o tempo

necessário para preparação das amostras foi menor do que aquele descrito em literatura.

Durante a extração do material vegetal para isolamento dos princípios ativos,

verificou-se que a mistura metanol/água 7:3 apresentava bons resultados. Por isso,

resolveu-se testar esta mistura de solventes para extração do asiaticosídeo e posterior

quantificação. Foram realizadas três extrações sucessivas do mesmo material vegetal (100

mg, n= 5) tanto com metanol puro (Figura 16) como com metanol/água 7:3 v/v (Figura

17).

FIGURA 16 - Extrações metanol 100% de 100 mg de Centella asiatica

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5

Replicatas

ug

de

as

iati

co

síd

eo

ex

tra

ído

de

10

0 m

g d

e

pla

nta

primeira

extração

segunda

extração

terceira

extração


36


0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5

Replicatas

ug

de

as

iati

co

síd

eo

ex

tra

ído

de

10

0 m

g d

e

pla

nta

primeiraextraçãosegundaextraçãoterceiraextração

De acordo com os resultados acima, pode-se concluir que três extrações

sucessivas não são suficientes para fazer a extração completa do asiaticosídeo. Além disso,

o método não foi reprodutível, ou seja, os valores obtidos para a mesma extração nas cinco

replicatas foram muito díspares. Uma possível causa para estes valores erráticos, poderia ser

a relação entre a massa de material vegetal e o volume do líquido extrator. Na tentativa de

obter resultados mais reprodutíveis, a quantidade de amostra foi reduzida de 100 mg para

50 mg, mantendo-se a mesma quantidade de líquido extrator (1,5 ml). Foram realizadas

cinco extrações consecutivas de cada replicata (n= 5) (Figuras 18 e 19).

FIGURA 18 –Extrações metanol 100% de 50 mg de Centella asiatica

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5

Replicatas

ug

de a

sia

tico

síd

eo

extr

aíd

o d

e

50 m

g d

e p

lan

ta



37

0

50

100

150

200

250

300

350

1 2 3 4 5

Replicatasu

g d

e a

sia

tico

síd

eo

extr

aíd

o d

e

50 m

g d

e p

lan

ta

primeiraextraçãosegundaextraçãoterceiraextraçãoquartaextraçãoquintaextração

O teor de asiaticosídeo obtido nas cinco extrações realizadas com metanol/água

7:3 v/v foi de 1,06 mg% (DPR = 6,34 %), enquanto que o teor do analito em metanol

100% foi de 0,906 mg% (DPR = 2,81 %). Estes resultados indicam que as extrações

realizadas com metanol/água 7:3 v/v foram mais eficientes do que aquelas com metanol

puro. A primeira extração, das cinco realizadas com metanol/água 7:3 v/v, extraiu

aproximadamente 87% de todo asiaticosídeo da amostra e três extrações foram suficientes

para extrair todo o analito, diminuindo o número de etapas na metodologia. Já a primeira

extração, das cinco realizadas com metanol puro, extraiu aproximadamente 78% de todo

asiaticosídeo da planta, sendo necessárias quatro extrações para extrair todo o analito. O

procedimento testado, portanto, produziu melhores resultados do que aqueles descritos na

literatura (VERMA et al.,1999).

Os resultados acima mostram a importância de dois parâmetros para a extração de

metabólitos de matrizes vegetais. O primeiro é a relação massa da amostra/volume do

líquido extrator. Para que o analito seja solubilizado é necessário que haja uma boa difusão

do solvente para o interior da matriz. Caso o volume do solvente seja inferior ao ideal, o

contato com a matriz é prejudicado dificultando a solubilização do analito de forma

homogênea e reprodutível. A proporção 33,3 mg/ml, utilizada no segundo experimento,

foi a mais adequada.

O segundo parâmetro importante é a natureza do líquido extrator. A mistura

metanol/água utilizada, mais polar, foi mais eficiente do que metanol puro para a extração

do asiaticosídeo, que é uma substância muito polar.


38

4.2.5 Preparação do extrato bruto seco no spray dryer

A técnica do spray dryer é um método mecânico no qual uma solução ou dispersão

é atomizada em uma câmara de evaporação, causando a rápida solidificação da superfície

das gotículas atomizadas originando partículas (GONÇALVES, 1999). Muito utilizada

industrialmente a técnica é também empregada na microencapsulação de moléculas

bioativas como enzimas e fármacos (ALVES et al., 2004). Trata-se de um método de fácil

manejo, inclusive para obtenção de extrato seco de plantas, na forma de um fino pó,

provenientes de extração com solvente. Neste caso, a padronização do pó é facilitada, visto

que a matéria-prima é sólida e livre dos componentes da matriz vegetal podendo, inclusive,

apresentar maior prazo de validade, auxiliando na fabricação de medicamentos.

Para a preparação do extrato seco da Centella asiatica, foram realizadas quatro

extrações do seu pó usando água como solvente. As extrações foram feitas com métodos

distintos e tinham como objetivo analisar qual método extrairia mais asiaticosídeo (Tabela

6). Em paralelo, foi realizada também, uma extração com metanol/água 7:3 v/v (chamada

de extração M), porém antes de levá-la à secagem no spray dryer foi necessário retirar todo o

metanol, uma vez que o equipamento utilizado não comporta o uso de solventes orgânicos.


39

TABELA 5 – Resultados do teste de resíduo seco (RS) para cada extração de

asiaticosídeo (mg/ml) da Centella asiatica

Replicatas (n= 3) Extração A

Extração B

Extração C

Extração D

Extração M

1 13,90 11,46 12,10 14,120 49,643

2 13,94 11,48 13,40 14,440 49,641

3 13,66 11,68 12,20 14,180 49,637

Total extraído (média) 13,833 11,540 12,567 14,247 40,640

Os resultados mostram que a extração M apresentou maior rendimento do

resíduo seco gerado, contendo maior quantidade de substâncias polares, como açúcares,

por exemplo. Entretanto, isto não significa que o asiaticosídeo estará em maior quantidade

na extração M.

O rendimento da secagem no spray dryer (Tabela 7) foi calculado através de

comparação da massa de extrato seco obtido e o valor teórico. Este parâmetro é

importante, pois durante o processo de spray dryer há perda de pó. O valor teórico foi

calculado a partir da determinação do resíduo seco (RS), que é obtido através da

evaporação, até peso constante, de um volume determinado de extrato aquoso. O

experimento foi realizado em replicata (n=3) (Tabela 6).

TABELA 6 – Rendimento (g) da secagem em spray dryer das diferentes extrações

da Centella asiatica

Extrações Valor Teórico Spray dryer

A 8,301 4,3524

B 6,924 5,5278

C 7,540 5,6682

D 8,547 5,5395

M 16,256 2,4490


40

Os resultados mostram que, apesar da extração M ter apresentado um maior

rendimento no teste do resíduo seco, ela foi a extração que apresentou mais perdas durante

o processo do spray dryer. Uma explicação possível para o fato é que esta metodologia

possivelmente extraiu mais lipídeos que as outras e os mesmos permanecem mais

“grudados” na vidraria do equipamento.

Para verificar em qual das extrações existe mais asiaticosídeo e para verificar a

estabilidade do mesmo quanto às condições utilizadas no spray dryer (150 ºC), o glicosídeo

foi quantificado antes e após a obtenção dos extratos secos (Tabela 8).

TABELA 7 – Teor de asiaticosídeo nas diferentes extrações realizadas com a

Centella asiatica e nos respectivos extratos secos gerados no spray dryer

Teor de Asiaticosídeo (mg%) Extrações

Antes do spray dryer Depois do spray dryer

A 0,721 0,206

B 0,773 0,198

C 0,622 0,231

D 0,657 0,246

M 1,297 0,786

Estes resultados mostram que, dentre as metodologias utilizadas, a metodologia

da extração M é a mais adequada para a extração do asiaticosídeo e que todos os extratos

secos gerados após a secagem em spray dryer, apresentaram uma perda no teor de

asiaticosídeo: nas extrações aquosas a perda, em média, foi de 68% e na extração com

metanol 70% (extração M) a perda foi de aproximadamente 20%. Essa diminuição pode

estar relacionada com a instabilidade do analito frente a altas temperaturas, uma que no

processo do spray dryer, ela foi mantida a 150 ºC.


41

4.2.6 Teor de asiaticosídeo em extratos comerciais

A análise de três amostras comerciais de Centella asiatica permitiu avaliar o método

analítico e comparar o teor de asiaticosídeo em amostras de origens diversas.

Dentre as três amostras (SP, CL e X) usadas para quantificação, a amostra X,

obtida na forma de cápsulas, contendo extrato seco padronizado da planta apresentava em

cada cápsula 50,47 mg de extrato seco sendo 6 mg uma mistura de asiaticosídeo e

madecassosídeo. Os valores do teor de asiaticosídeo encontrado em cada uma estão

apresentados a seguir (Tabela 5).

TABELA 8 – Teor de asiaticosídeo em amostras diversas* de Centella asiatica

Amostras Teor de Asiaticosídeo (mg%)

SP 0,097

CL 0,582

X 4,689

*SP= fino pó; CL= planta seca; X = cápsulas contendo extrato seco padronizado

Comparando estes valores com os da literatura (VERMA et al.,1999) que é de

0,36% e com o obtido neste trabalho (1,06%), pode-se concluir que o teor de asiaticosídeo

na planta depende da sazonalidade, bem como do método de secagem, uma vez que o

método de extração foi o mesmo aplicado nas diferentes amostras. Um outro fator a ser

levado em conta é a contaminação do material vegetal com o princípio ativo.

4.3 Cynara scolymus

4.3.1 Métodos de extração

O extrato hidrometanólico “A” da Cynara scolymus foi submetido a partição com os

solventes de polaridade crescente (YUNES et al., 2003). Após análise das frações por CCD,

foi possível concluir que o ácido clorogênico estava presente, em maior quantidade, na


42

fração hidrometanólica “B”. Esta fração foi concentrada e fracionada em uma coluna de

fase reversa PC-18.

Foram realizados experimentos iniciais em micro-escala, com o objetivo de definir

as condições a serem utilizadas em escala preparativa.

Analisando a CCD (Figura 20) da separação realizada em escala preparativa pode-

se observar que a eluição com 100% água produziu o ácido clorogênico quase puro. O

produto obtido foi refracionado, nas mesmas condições, o que levou ao isolamento do

ácido clorogênico (7 mg) como um sólido amarelado.

FIGURA 20 - CCD das frações do extrato Cynara scolymus obtido com coluna PC-

18 “FLASH” em escala preparativa*

• Mancha 1: extrato bruto;

• Manchas 2-4: frações eluídas com água;

• Manchas 5-6: frações eluídas com

água/metanol 9:1.

* fase estacionária= sílica; fase móvel = acetato de

etila/água/ácido acético/ácido fórmico 10:2,3:1,1:1,1;

visualização = UV 365 nm.

4.3.2 Caracterização do ácido clorogênico

O espectro no IV (Anexo 7.7) mostrou bandas largas em 3414 e 3172 cm-1,

características de estiramento de ligação O-H de ácidos carboxílicos, e uma forte absorção

em 1600 cm-1 típica de deformação axial de ligação C=O. Observou-se ainda bandas em

1400 e 1357 cm-1 típicas de sistema aromático, assim como bandas de estiramento de

ligação C-O em 1278, 1158 e 1121 cm-1 (SILVERSTEIN; BASSLER; MORRIL, 1994).

A análise do espectro de RMN de 1H evidenciou, quando comparado com dados

da literatura (BERREGI et al., 2003), conformidades com os deslocamentos químicos do

composto ácido clorogênico (Anexo 7.8). Os sinais do ácido clorogênico são indicados na

região do espectro expandido (anexo 7.9), pelos deslocamentos químicos de d 7.19, 6,93 e


43

7,12 (m, 2, 5 e 6-H), d 6,37 (d, J = 15,58 Hz, 2’-H) e d 7,67 (d, J = 15,58 Hz, 1’-H). Valores

iguais de deslocamento químico para os dois dubletos dos hidrogênios 1’ e 2’, indicam que

estes hidrogênios da ligação dupla estão acoplando um com o outro e valores de

deslocamento químico da ordem de 15 indicam que estão na posição E.

FIGURA 21 - Fórmula estrutural do ácido clorogênico

C

OHOH

O OHO

OH

OH

COOH

ÁcidoClrorogênico

A partir dos dados de RMN de 1H, espectro no infravermelho juntamente com

dados da literatura, verificou-se que o composto isolado trata-se do ácido clorogênico

(ácido 5-O-cafeoilquinico).

4.3.3 Quantificação do ácido clorogênico por CLAE/UV

4.3.3.1 Curva de calibração para o ácido clorogênico

Para a curva de calibração (Figura 22), a equação da reta é de y = 3,785778.103 x –

7,275649.103, coeficiente de correlação 0,999644, e RSD = 9,105%. O intervalo foi

definido entre 14,62% e 233,88% da concentração teórica do teste, visto que a

concentração de ácido clorogênico na planta pode sofrer variações (sazonalidade,

estabilidade por exemplo).

FIGURA 22 - Curva de calibração do ácido clorogênico

2’

2

1’

6

5


44

Com os dados acima foi possível calcular a concentração de ácido clorogênico na

planta. Este valor é 0,654% enquanto que na literatura (SCHUTZ et al., 2004) o valor

encontrado foi 0,314%.


De acordo com a literatura (SUÁREZ et al., 2005) a fase móvel utilizada para

quantificação de polifenóis, incluindo o ácido clorogênico, é água/metanol em gradiente

linear de metanol/água 0:100 a 45:55 v/v em 55 minutos e em seguida no modo isocrático

por 20 minutos. Nestas condições, o tempo de retenção do ácido clorogênico é de

aproximadamente 40 min.

Como um dos objetivos do presente trabalho era a quantificação do ácido

clorogênico, a fase móvel escolhida foi água/metanol 77:23 v/v. A escolha dela baseou-se

na melhor resolução do pico do analito com o menor tempo de retenção,

aproximadamente 7 minutos (Figura 23). A otimização do tempo de retenção é muito

importante, pois além de proporcionar menor tempo de análise, favorece também uso de

menor quantidade de solvente.


45

FIGURA 23 - Cromatograma de CLAE do extrato bruto da Cynara scolymus

Os espectros no UV correspondentes aos picos do ácido clorogênico padrão e do

mesmo no extrato bruto (Figura 24) confirmam a identidade dele bem como seu

comprimento de onda de absorção máxima (330 nm).


46

ÁCIDO CLOROGÊNICO PADRÃO

ÁCIDO CLOROGÊNICO NO EXTRATO BRUTO

FIGURA 24 - Perfil no UV do ácido clorogênico e do mesmo no extrato bruto


Dentre os líquidos extratores testados, a água foi a que apresentou maior tamanho

de pico com menor número de interferentes. Observou-se que a primeira extração retirou

aproximadamente 80% do ácido clorogênico e a partir da quarta extração não foi

visualizado mais o pico do composto. O teor de ácido clorogênico extraído por extração e

por replicata (n= 3) estão expressos na tabela a seguir.


47

TABELA 9 - Teor de ácido clorogênico (mg) em extratos de Cynara scolymus (100

mg) após três extrações sucessivas.

Replicatas 1a Extração 2a Extração 3a Extração Total

1 0,5443 0,0949 0,0359 0,6752

2 0,5173 0,0882 0,0321 0,6376

3 0,5621 0,1061 0,0315 0,6997

4 0,4837 0,0994 0,0328 0,6160

5 0,5049 0,1063 0,0310 0,6422

Média 0,5225 0,0990 0,0327 0,6542

Desvio Padrão 2,4436 0,6022 0,1519 2,5974

Desvio Padrão

Relativo% 5,9631 7,7540 5,9249 5,0623

Conclusões

48

5 Conclusões

Os resultados descritos neste trabalho mostraram que é viável a preparação de

uma fase estacionária reversa, PC-18, utilizando infra-estrutura simples. A aplicação bem

sucedida da fase preparada foi confirmada no isolamento de dois metabólitos secundários,

o asiaticosídeo e o ácido clorogênico de Centella asiatica e Cynara scolymus, respectivamente,

pois além das substâncias isoladas apresentarem propriedades químicas diferentes

(polaridade, grupo funcional, etc), o método utilizado em cada caso também foi

diferenciado e ambos apresentaram ótimos resultados. Vale ressaltar também que

utilizando a PC-18 para isolamentos, diminuiu-se o uso de solventes orgânicos, uma vez

que a fase móvel utilizada baseia-se na água como fase móvel.

A metodologia analítica, principalmente com relação ao método de preparação da

amostra, desenvolvida para a quantificação do asiaticosídeo em Centella asiatica, mostrou-se

superior àquela descrita em literatura, uma vez que através dela foi possível quantificar

produtos de diferentes origens por uma metodologia que requer um menor número de

etapas, uso de menor quantidade do material de partida e solvente mais adequado para

extração do princípio ativo, tornando a análise mais rápida e com menores custos. Os

produtos de diferentes origens analisados, apresentaram teores significativamente

diferentes de asiaticosídeo.

Além da metodologia para isolamento do ácido clorogênico ter apresentado

ótimos resultados, pois trata-se de um composto de alta polaridade e de grande interesse

comercial, a metodologia analítica empregada para a quantificação do mesmo em Cynara

scolymus também foi muito satisfatória, principalmente no que diz respeito a fase móvel

utilizada, pois a mesma pode oferecer um menor tempo de retenção do que os encontrados

em literatura apresentando uma boa definição do pico, o que garante uma análise mais

rápida, evitando o uso excessivo de solvente orgânico grau HPLC diminuindo também o

custo do processo.

Referências Bibliográficas

49

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Disponível em: http://unioeste.br. Acesso em 18jun. 2006

Anexos

54

7 Anexos

Anexos

55

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

10

20

30

40

50

60

70

472

611

1096

1384

1619

1637

2920

34823552

3414

% t

ransm

itância

número de onda (cm-1)

7.1 Espectro no IV para o asiaticosídeo em KBr

HO

HO

CH2

O H

H H

C

O

H 1 '

H O

O

CH2O

H

OH

OH

O

CH2HO

O

H

O HO

CH3

OHOH

HO

28

1''

6'

1 '''

4''

24

12

25

3

1213

8

6

27

26

23

22

21

30

29

15

17

19

18

20

179

5 7

25

14

11

10

C=O C=C

O-H

C-O

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

10

20

30

40

50

60

70

472

611

1096

1384

1619

1637

2920

34823552

3414

% t

ransm

itância


C=O C=C

O-H

C-O

Anexos

56

p p m ( f1 )0 .01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .0

5.3

00

0

5.2

79

9

5.2

52

3

5.2

44

0

4.6

17

2

4.3

81

1

4.3

61

4

3.5

16

7

3.4

84

3

3.4

78

9

3.4

56

2

3.4

33

2

3.4

03

5

3.3

13

8

3.3

09

8

3.3

05

7

3.3

01

7

3.2

97

6

1.3

46

4

1.2

96

5

1.2

84

9

1.2

72

6

1.2

57

0

1.1

23

4

1.0

52

8

0.9

72

9

0.9

06

6

0.8

90

6

0.8

31

1

0.6

93

3

3.0

0

2.7

83

.69

3.8

32

.90

3.1

9

2.3

33

.79

13

.53

5.9

6

1.4

0

10

.80

2.4

0

7.2

7

1.1

71

.13

1.0

4

1.2

71

.16

0.9

1

7.2 Espectro de RMN de 1H para o asiaticosídeo

Espectro adquirido em metanol deuterado a 400 MHz.

HO

HO

CH2

O H

H H

C

O

H 1 '

H O

O

CH2O

H

OH

OH

O

CH2HO

O

H

O HO

CH3

OHOH

HO

28

1''

6'

1 '''

4''

24

12

25

3

1213

8

6

27

26

23

22

21

30

29

15

17

19

18

20

179

5 7

25

14

11

10

Anexos

57

7.3 Expansões do espectro de RMN de 1H para o asiaticosídeo


ppm (f1 )1 .001.50

1.3

46

4

1.2

96

5

1.2

84

9

1.2

72

6

1.2

57

0

1.1

23

4

1.0

52

8

0.9

72

9

0.9

06

6

0.8

90

6

0.8

31

1

0.6

93

3

3.0

0

2.7

8

3.6

9

3.8

3

2.9

0

3.1

9

2.3

3

3.7

9

13

.53

Anexos

58

7.4 Expansões do espectro de RMN de 1H para o asiaticosídeo


ppm (f1 )4 .505 .00

5.3

00

0

5.2

79

9

5.2

52

3

5.2

44

0

4.6

17

2

4.3

81

1

4.3

61

4

1.0

4

1.2

7

1.1

6

0.9

1

Anexos

59

7.5 Espectro de RMN de 13C para o asiaticosídeo


HO

HO

CH2

O H

H H

C

O

H 1 '

H O

O

CH2O

H

OH

OH

O

CH2HO

O

H

O HO

CH3

OHOH

HO

28

1''

6'

1 '''

4''

24

12

25

3

1213

8

6

27

26

23

22

21

30

29

15

17

19

18

20

179

5 7

25

14

11

10

ppm (f1)050100150200

21

0.2

0

17

7.9

9

13

9.3

6

12

6.9

6

10

4.4

8

10

2.8

8

95

.84

79

.50

78

.18

77

.90

76

.86

76

.71

75

.29

73

.80

73

.76

72

.44

72

.23

70

.98

70

.65

69

.71

69

.63

66

.29

61

.90

54

.10

49

.45

49

.23

49

.02

48

.81

48

.59

44

.15

43

.42

40

.98

40

.42

40

.25

39

.01

37

.63

33

.61

31

.72

30

.72

29

.30

25

.26

24

.55

24

.03

21

.61

19

.11

18

.09

17

.95

17

.87

14

.01

C-28

C-13

C-29

C-12 C-1’

C-1’’

C-1’’’

Anexos

60

7.6 Expansões do espectro de RMN de 13C para o asiaticosídeo


p p m (f1 )1 5 .02 0 .025 .030 .03 5 .04 0 .045 .0

44

.15

43

.42

40

.98

40

.42

40

.25

39

.01

37

.63

33

.61

31

.72

30

.72

29

.30

25

.26

24

.55

24

.03

21

.61

19

.11

18

.09

17

.95

17

.87

17

.69

14

.01

C-25

C-29

C-27

C-24

C-26 C-6’’’

Anexos

61

7.7 Expansões do espectro de RMN de 13C para o asiaticosídeo


ppm ( f1 )55 .06 0 .06 5 .07 0 .075 .080 .0

79

.50

78

.18

77

.90

76

.86

76

.71

75

.29

73

.80

73

.76

72

.44

72

.23

70

.98

70

.65

69

.71

69

.63

66

.29

61

.90

54

.10

C-23 C-6’’

C-6’

C-3

C-2 C-4’’

Anexos

62

7.8 Espectro de DEPT 135 para o asiaticosídeo


C-11

21

ppm (f1)050100

12

6.9

5

10

4.4

7

10

2.8

7

95

.83

79

.45

78

.14

77

.89

76

.85

76

.70

75

.28

73

.78

73

.75

72

.44

72

.21

70

.94

70

.64

69

.70

69

.60

66

.22

61

.88

54

.09

48

.89

48

.15

48

.10

40

.41

40

.25

37

.62

33

.60

31

.72

30

.72

29

.29

25

.25

24

.55

24

.03

21

.61

19

.09

18

.08

17

.95

17

.87

17

.70

14

.02

-0.0

00

00

C-6’’ C-6’ C-22 C-23

C-1 C-6

7

15

16

Anexos

63

7.9 Espectro de HSQC para o asiaticosídeo


p p m (f2 )1 .0 01 .5 02 .0 0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

p p m ( f1 )

Anexos

64

7.10 Espectro de HMBC para o asiaticosídeo

Espectro adquirido em metanol deuterado a 100 MHz. As correlações estão em destaque.

p pm ( f2 )0 .01 .02 .03 .04 .05 .0

0

50

10 0

15 0

20 0

pp m ( f1 )

H-1’/C-28

H-1’’/C-6’ e C-1’’

H-1’’’/C-4’’ e C-1’’’

Anexos

65

7.11 Espectro no IV para o ácido clorogênico em KBr

C

OHOH

O OHO

OH

OH

COOH

ÁcidoClrorogênico

3900 3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1500 1200 900 600

20

30

40

50

60

70

80

90

100

604

672

775

985

1121

11

58

127

8135

71

400

160

0

3172

341

4


% tra

nsm

itâ

ncia

2’

2

1’

6 5

O-H

C-O

C=O

Anexos

66

7.12 Espectro de RMN de 1H para o ácido clorogênico

Espectro adquirido em água deuterada a 200 MHz.

C

OHOH

O OHO

OH

OH

COOH

ÁcidoClrorogênico

5

pp m ( f1 )0 .02 .55 .07 .5

7.6

72

4

7.6

33

1

7.1

95

9

7.1

53

4

7.1

35

3

7.1

19

8

6.9

50

6

6.9

45

6

6.9

35

0

6.4

13

3

6.3

74

7

1.0

0

2.6

9

1.3

5

0.8

0

2’

2

1’

6 5

2 2’ 1’ 6

Anexos

67

p p m ( f1 )6 .0 06 .2 56 .5 06 .7 57 .0 07 .2 57 .5 07 .7 58 .0 0

7.6

72

4

7.6

33

1

7.1

95

9

7.1

53

4

7.1

35

3

7.1

19

8

6.9

50

6

6.9

45

6

6.9

35

0

6.4

13

3

6.3

74

7

1.0

0

2.6

9

1.3

5

0.8

0

2’

2

1’

6 5

1’ 2 6

5 2’

7.13 Expansão do espectro de RMN de 1H para o ácido clorogênico

Espectro adquirido em água deuterada a 200 MHz.

C

OHOH

O OHO

OH

OH

COOH

ÁcidoClrorogênico

Claudenize Pontes da Silva Leal - UFPR · 2011. 8. 25. · O uso de plantas para o preparo de...

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